फॉरवर्ड जेनेटिक्स पहचानें मैक्रोफेज का प्रयोग स्क्रीन * These authors contributed equally

Immunology and Infection
 

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Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

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Abstract

Introduction

Toxoplasma gondii (टी gondii) एक लाचार इंट्रासेल्युलर, protozoal रोगजनक है। यह टोक्सोप्लाज़मोसिज़ की प्रेरणा का एजेंट, प्रतिरक्षा में अक्षम व्यक्तियों में एक स्वास्थ्य के लिए खतरा है। यह भी क्रिप्टोस्पोरिडियम और Cyclospora सहित मनुष्यों को संक्रमित है कि अन्य apicomplexan रोगजनकों के लिए मॉडल प्रणाली है। टोक्सोप्लाज़मोसिज़ सबसे सामान्यतः परजीवी की bradyzoite या oocyst मंच के साथ दूषित भोजन या पानी की घूस के माध्यम से हासिल किया जाता है। घूस पर, इन चरणों मेजबान कोशिकाओं के भीतर replicates और प्रणालीबद्ध प्रसार कि परजीवी की tachyzoite चरण के लिए परिवर्तित। टी कोशिकाओं, IFN-γ और, एक हद तक कम करने, नाइट्रिक ऑक्साइड 1-4 करने के लिए, संक्रमण के नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण हैं, लेकिन tachyzoites के अनुपात के रूप में, रोग को नष्ट करने में सक्षम नहीं हैं ऊतक अल्सर के भीतर रक्षा कर रहे हैं कि bradyzoite चरण में कन्वर्ट एक लंबे समय रहते पुराने संक्रमण में जिसके परिणामस्वरूप। वास्तव में, कोई चिकित्सा विज्ञान पुरानी पुटी के खिलाफ प्रभावी रहे हैंरोग के Tage। गंभीर टोक्सोप्लाज़मोसिज़ प्राथमिक और तीव्र संक्रमण की तेजी से नकल tachyzoite चरण विशेषता वापस करने के लिए परिवर्तित परजीवी की bradyzoite मंच के साथ होने के कारण लगातार संक्रमण के पुनर्सक्रियन करने के लिए सबसे अधिक बार है।

सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के चेहरे में जल्दी अस्तित्व परजीवी पर्याप्त परजीवी संख्या तक पहुंचने के लिए, साथ ही पुराने संक्रमण की स्थापना के सक्षम करने के लिए, बाहर का साइटों तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है। टी gondii संभावना दोहराने के लिए और संक्रमण में जल्दी प्रसार करने के लिए अपनी क्षमता में योगदान कि मेजबान रक्षा तंत्र प्रतिक्रिया करने के लिए रणनीतियों को विकसित किया गया है। सबसे पहले, टी gondii अन्य इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ों 5-9 की तुलना में मेजबान सेल के endocytic और exocytic प्रक्रियाओं से काफी हद तक अलग है कि परजीवी आक्रमण के दौरान एक अद्वितीय पी.वी. रूपों। इसके अलावा, सभी सफल इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ों टी की तरह gondii च एक अनुमोदक माहौल बनाने के लिए अपने मेजबान सेल को संशोधितया विकास। यह सेल सक्रियण 10-15 के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण उन सहित मेजबान सेल प्रतिलेखन कारक बदलकर reprogramming के मेजबान सेल जीन की अभिव्यक्ति भी शामिल है। ROP16 16-19, GRA15 20, GRA16 21 और GRA24 22 सभी टी से संक्रमित मेजबान कोशिकाओं के cascades ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया को विनियमित करने और सेल संकेत में महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है gondii। अलग phenotypes के साथ परजीवी उपभेदों के बीच आनुवंशिक पार का उपयोग करते हुए हाल के अध्ययनों से उन्मुक्ति संबंधित GTPases (IRGs) 16,19,23-26 की चोरी सहित परजीवी जीनोटाइप निर्भर लक्षण आबाद कि परजीवी जीनों की पहचान करने में अत्यधिक उत्पादक किया गया है। बहुत ज़हरीले प्रकार मैं जीनोटाइप murine IRGs से बचने के लिए तंत्र विकसित किया है, जबकि चूहों में, उन्मुक्ति संबंधित GTPases (IRGs) प्रकार द्वितीय के नियंत्रण और परजीवी के तृतीय जीनोटाइप के लिए महत्वपूर्ण हैं। हालांकि, यह परजीवी रोगाणुरोधी मीडिया से बचने के लिए तंत्र विकसित किया गया है कि यह भी स्पष्ट हैइन तंत्रों में से कुछ IRGs करने के लिए और कहा कि इसके अलावा में tors परजीवी जीनोटाइप 27,28 भर में संरक्षित किया जा सकता है। इसके अलावा, बहुत कम टी के खिलाफ सेल स्वायत्त उन्मुक्ति के महत्वपूर्ण मध्यस्थों के बारे में जाना जाता है मानव टोक्सोप्लाज़मोसिज़ दौरान gondii। Tachyzoite भी मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से चालू किया जा सकता है, जो रूपांतरण bradyzoite करने के दौरान सेल स्वायत्त उन्मुक्ति के मध्यस्थों के प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण परजीवी जीनों भी अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। उदाहरण के लिए, उच्च स्तर पर नाइट्रिक ऑक्साइड संक्रमित मैक्रोफेज में परजीवी प्रतिकृति को दबा सकते हैं, लेकिन यह भी पुटी उत्पादन 30-32 में जिसके परिणामस्वरूप रूपांतरण bradyzoite को tachyzoite उत्तेजित कर सकते हैं।

ToxoDB टी के लिए एक कार्यात्मक जीनोमिक डेटाबेस है gondii कि समुदाय सहित एनोटेशन प्रकाशित और अप्रकाशित जीनोमिक पैमाने आंकड़ों के अनुक्रम परजीवी जीनोम के लिए जानकारी और पहुंच उपलब्ध कराने के मामले में क्षेत्र के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन के रूप में काम करता है, जीन ऍक्स्प ression और प्रोटिओमिक्स डेटा 33। कई protozoal रोगजनकों के लिए इसी प्रकार, जीनोम का बहुमत उनके संभावित कार्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जीन समरूपता के आधार पर उपलब्ध कोई जानकारी के साथ काल्पनिक जीनों के होते हैं। इस प्रकार, आगे आनुवंशिकी प्रतिरक्षा चोरी, पुटी रूपांतरण और परजीवी रोगजनन के लिए के रूप में अच्छी तरह से अलग विकास के चरणों के बीच रूपांतरण के लिए महत्वपूर्ण अन्य कार्यों के लिए महत्वपूर्ण उपन्यास परजीवी जीनों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। आगे आनुवंशिकी का एक अतिरिक्त ताकत यह प्रतिरक्षा चोरी और पुटी गठन सहित रोगजनन में विशिष्ट कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं कि जीन के रूप में परजीवी से पूछताछ करने के लिए एक अपेक्षाकृत गैर पक्षपातपूर्ण दृष्टिकोण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। उत्परिवर्तनीय रूपरेखा के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण में हाल ही के सुधार यह रासायनिक और insertional दोनों उत्परिवर्तजनन 34-37 का उपयोग करते हुए आगे आनुवंशिकी के अध्ययन से जिम्मेदार परजीवी जीनों की पहचान करने के लिए पसंद की एक विधि बना दिया है।

ntent "> यह विशेष रूप से भी प्रतिरोधी पुटी चरण के खिलाफ सक्रिय हो सकता है कि उन। इस उद्देश्य की ओर, एक में इन विट्रो murine परजीवी के खिलाफ सेल स्वायत्त प्रतिरक्षा तंत्र की प्रभावशीलता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि टी gondii में कमजोरियों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है बृहतभक्षककोशिका संक्रमण और सक्रियण मॉडल विशेष रूप से भोले मैक्रोफेज में संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता नहीं बल्कि निम्न टी gondii फिटनेस ख़राब है कि परजीवी में म्यूटेशन की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था। इस बृहतभक्षककोशिका स्क्रीन करने के क्रम में टी gondii insertional म्यूटेंट के एक पुस्तकालय से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया गया था अंततः नाइट्रिक ऑक्साइड 27,28 के प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण टी gondii जीनों की पहचान। संक्रमित मैक्रोफेज, नाइट्रिक ऑक्साइड के लिए विशेष रूप से उल्लेखनीय संवेदनशीलता की सक्रियता को बिगड़ा प्रतिरोध के साथ टी gondii म्यूटेंट के एक पैनल के अलगाव, की पहचान करने के लिए स्क्रीन की उपयोगिता साबित प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण परजीवी जीनोंmurine IRGs 28 के लिए वर्णित प्रतिरोध तंत्र के अलावा अन्य सेल स्वायत्त उन्मुक्ति के मध्यस्थों के लिए। Insertional mutagenesis के सिद्धांत में यादृच्छिक प्रत्येक परजीवी क्लोन में परिवर्तन और, उत्परिवर्तन की साइट की आसान पहचान की सीमित संख्या को पैदा करने के मामले में रासायनिक उत्परिवर्तजनन से अधिक लाभ है। हालांकि, टी में प्लाज्मिड प्रविष्टि के जीनोमिक साइट की पहचान gondii insertional म्यूटेंट, व्यवहार में, कई मामलों में 37 में आश्चर्यजनक रूप से मुश्किल हो गया है। एक जीन में एक प्लाज्मिड की प्रविष्टि भी आम तौर पर एकल nucleotide परिवर्तन में यह परिणाम है कि रासायनिक mutagenesis के लिए इसके विपरीत में एक जीन का कार्य बाधित होने की संभावना है। यह कई एकल nucleotide बहुरूपताओं बनाता है के रूप में हालांकि, रासायनिक उत्परिवर्तजनन एन एथिल-एन-nitrosourea (ENU) या ethylmethane सल्फ़ोनेट (ईएमएस) के साथ या तो (insertional उत्परिवर्तजनन की तुलना में, परजीवी जीनोम के एक बड़े हिस्से का विश्लेषण करने के लिए एक वृद्धि की क्षमता प्रदान कर सकता है उत्परिवर्ती 34 प्रति 10 -100) का अनुमान38। इसके अलावा, पूरे जीनोम प्रोफाइलिंग में हाल के अग्रिमों यह संभव है एक उत्परिवर्तित परजीवी 34,38 की पहचान phenotype के लिए जिम्मेदार सबसे अधिक संभावना उम्मीदवार जीन की पहचान करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करने के लिए बनाया गया है। भले ही mutagenesis के दृष्टिकोण से, बृहतभक्षककोशिका सक्रियण के लिए प्रतिरोध में परजीवी जीन की भूमिका की पुष्टि अंततः आणविक कोच के तत्वों को पूरा करने के लिए जीन विलोपन और पूरक की आवश्यकता है।

परजीवी और बृहतभक्षककोशिका दोनों के आनुवंशिक हेरफेर से एक जीन के समारोह काटना करने की क्षमता टी में आगे आनुवंशिकी के माध्यम से पहचान जीनों में से कई के रूप में महत्वपूर्ण है gondii है, साथ ही अन्य रोगज़नक़ों, अभी तक ज्ञात कार्यों के साथ अन्य प्रोटीन के लिए कोई अनुक्रम अनुरूपता लिए थोड़ा के साथ काल्पनिक जीन के रूप में की विशेषता है। वर्तमान कागज एक उत्परिवर्ती में बाधित जीन एक ज्ञात या करने के लिए प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण है कि क्या पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सामान्य दृष्टिकोण की रूपरेखासेल स्वायत्त उन्मुक्ति के अज्ञात मध्यस्थ। मेजबान रोगाणुरोधी कारकों के प्रारंभिक विश्लेषण जंगली प्रकार और inducible नाइट्रिक ऑक्साइड सिन्थेज़ (iNOS), जीपी-91 phox (एनएडीपीएच ओक्सीडेस) में विशिष्ट जीन विलोपन के साथ उन लोगों की तुलना में जंगली प्रकार चूहों से मैक्रोफेज में उत्परिवर्ती परजीवी के अस्तित्व के मूल्यांकन के द्वारा प्रदर्शन किया है, और विशिष्ट उन्मुक्ति संबंधित GTPases (IRGs)। पहचान परजीवी जीनों नाइट्रिक ऑक्साइड, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन मध्यवर्ती या उन्मुक्ति संबंधित GTPases 28 क्रमशः या एक अज्ञात प्रतिरक्षा तंत्र शामिल है के लिए प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण हैं, तो यह तय करेंगे। वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित IFN-γ और LPS दोनों से संक्रमित मैक्रोफेज, की सक्रियता मुख्य रूप से नाइट्रिक ऑक्साइड से 28 के प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण परजीवी जीनों का अलगाव में यह परिणाम है। बृहतभक्षककोशिका सक्रियण के अभाव में नाइट्रिक ऑक्साइड को प्रेरित है कि औषधीय एजेंटों के उपयोग (नाइट्रिक ऑक्साइड दाताओं) की पहचान की जीन का बहुमत पुनः के लिए महत्वपूर्ण थे कि इस बात की पुष्टिनाइट्रिक ऑक्साइड के बजाय बृहतभक्षककोशिका सक्रियण 28 के साथ जुड़े अतिरिक्त मध्यस्थों के साथ संगीत कार्यक्रम में नाइट्रिक ऑक्साइड के लिए विरोध।

एक और दो ​​के लिए इन विट्रो में संक्रमित अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज की सक्रियता के बाद एक फिटनेस दोष के साथ परजीवी म्यूटेंट को अलग-थलग करने के लिए डिज़ाइन आगे आनुवंशिकी स्क्रीन का वर्णन कदम। एक परजीवी प्रतिकृति कम कर देता है, लेकिन पूरी तरह से जंगली प्रकार टी की प्रतिकृति को बाधित नहीं करता बृहतभक्षककोशिका सक्रियण के लिए उपयोग करने के अनुभव से IFN- γ और LPS की एक खुराक निर्धारित करने के लिए एक खुराक अनुमापन विश्लेषण का वर्णन कदम परजीवी म्यूटेंट के पुस्तकालय के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है कि gondii पैतृक तनाव। दो कदम 96 अच्छी तरह से प्लेट में मैक्रोफेज में उत्परिवर्ती क्लोन के आगे आनुवंशिक स्क्रीन का वर्णन है। तीन कदम प्रत्येक उत्परिवर्ती में दोष परजीवी अस्तित्व को प्रभावित करता है, चाहे प्रतिकृति का मूल्यांकन करने के लिए और 96 अच्छी तरह से प्लेटों की स्क्रीन में पहचान की प्रत्येक उत्परिवर्ती के phenotype पुष्टि करने के लिए एक दृष्टिकोण की रूपरेखा,बृहतभक्षककोशिका सक्रियण के जवाब में या पुटी उत्पादन। चरण चार परजीवी उत्परिवर्ती विशेष रूप से अतिसंवेदनशील है, जो करने के लिए प्रतिरक्षा मध्यस्थों की पहचान के लिए विशिष्ट रोगाणुरोधी रास्ते में विलोपन के साथ चूहों से अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज के उपयोग का वर्णन है। चरण पांच संक्रमित चूहों के दिमाग में पुटी उत्पादन द्वारा मूल्यांकन के रूप में एक परजीवी उत्परिवर्ती भी इन विवो रोगजनन के लिए समझौता किया है, तो यह निर्धारित करने के लिए एक दृष्टिकोण की रूपरेखा।

Protocol

नोट: जानवरों के इस्तेमाल को शामिल कि सभी प्रोटोकॉल न्यूयॉर्क मेडिकल कॉलेज के पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया।
नोट: कमजोर पड़ने 38, murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज 39 के अलगाव, टी के विकास को सीमित करके रासायनिक उत्परिवर्तजनन 38, परजीवी के अलगाव के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल मानव चमड़ी तंतुप्रसू में gondii (HFF) मैक्रोफेज में कोशिकाओं और पुटी उत्पादन और बुनियादी immunofluorescence विश्लेषण (यूके), 32 संदर्भित कर रहे हैं। (10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 2 मिमी एल glutamine, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक Dulbecco संशोधित उच्च ग्लूकोज ईगल मध्यम) D10 के मीडिया में 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर सभी सेल संस्कृति के लिए बाहर ले । सेल isolations और सेल संस्कृति भर बाँझ सभी अभिकर्मकों रखें।

IFN-γ और concentr निर्धारण करने के लिए LPS 1. खुराक अनुमापनations फॉरवर्ड जेनेटिक्स स्क्रीन के लिए संक्रमित मैक्रोफेज सक्रिय करने के लिए उपयोग करने के लिए

  1. संस्कृति murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज हे / एन चैम्बर प्रति D10 मीडिया के 250 μl में 3 × 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में आठ चैम्बर गिलास स्लाइड में। अस्थि मज्जा से अलगाव के बाद मैक्रोफेज दो सप्ताह के लिए एक का उपयोग करें।
    नोट: चैंबर स्लाइड बढ़ाने रुपये धोने के एक विकास है कि खरीदी कर रहे हैं।
  2. एक T25 टिशू कल्चर फ्लास्क में उगाई मानव चमड़ी तंतुप्रसू (HFF) कोशिकाओं से काटा जंगली प्रकार के परजीवी गिनती करने के लिए एक hemocytometer का प्रयोग करें। D10 के मीडिया में मिलीलीटर प्रति 5 एक्स 10 5 जंगली प्रकार के परजीवी के एक एकाग्रता में परजीवी Resuspend। मैक्रोफेज हे / एन proliferated होगा 1: यह एकाग्रता लगभग 1 के संक्रमण की बहुलता में परिणाम होगा। Polypropylene के लिए परजीवी के रूप में चिपक परजीवी के साथ सभी जोड़तोड़ के लिए polystyrene या पीईटी ट्यूब का उपयोग करें।
  3. चैम्बर स्लाइड्स में D10 मीडिया निकालें और के 250 μl के साथ की जगहजंगली प्रकार के परजीवी का निलंबन। धीरे यह प्रत्येक कक्ष के भीतरी चेहरा नीचे प्रवाह करने की अनुमति देकर स्लाइड के प्रत्येक कक्ष के लिए परजीवी निलंबन जोड़ें। मैक्रोफेज प्रोटोकॉल के दौरान किसी भी बिंदु पर बाहर सुखाने के लिए अनुमति न दें।
  4. चार घंटे के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में चैम्बर स्लाइड कवर और जगह के साथ परजीवी से संक्रमित कवर चैम्बर स्लाइड्स पर आक्रमण और एक पी.वी. स्थापित करने के परजीवी के लिए समय की अनुमति है।
  5. खुराक अनुमापन के लिए बाँझ ट्यूबों में D10 के मीडिया के एक मिलीलीटर में LPS और IFN-γ की dilutions बनाओ। खुराक के लिए अनुमापन LPS या IFN- एकाग्रता निरंतर या तो रखने के लिए और अन्य प्रोत्साहन 40 बदलती हैं।
    1. उदाहरण के लिए, एमएल प्रति 10 एनजी LPS में LPS स्थिर रखने और IFN- γ (0, 1 यूनिट / एमएल, 10 इकाइयों / एमएल, 100 इकाइयों / मिलीलीटर, 1000 इकाइयों / एमएल) की एकाग्रता बदलती हैं। IFN- एमएल 100 इकाइयों / पर निरंतर γ और LPS (0, 0.1 एनजी / एमएल, एक एनजी / एमएल, 10 एनजी / एमएल, 100 एनजी / एमएल) की एकाग्रता के लिए अलग अलग रखें। 2 मिनट के बिना के लिए संक्षेप में sonicate LPS के शेयरकमजोर पड़ने के लिए पहले एक स्नान sonicator (नहीं के साथ एक टिप sonicator) में हीटिंग।
      नोट: Sonication कोशिकाओं की मेजबानी करने के लिए ठीक से बाध्य नहीं कर सकता है कि LPS द्वारा गठित मिसेल समुच्चय को बाधित करने की सिफारिश की है।
  6. 4 घंटे कक्ष स्लाइड में परजीवी और पक्षपाती मैक्रोफेज के बीच सह-संस्कृति की दीक्षा के बाद, प्रत्येक कक्ष में D10 मीडिया त्यागने और D10 के मीडिया में IFN- γ और LPS के उपयुक्त dilutions की 300 μl के साथ बदलें। बृहतभक्षककोशिका सक्रियण के अभाव में परजीवी प्रतिकृति का मूल्यांकन करने के लिए केवल D10 के मीडिया के साथ एक नियंत्रण शामिल हैं।
  7. 24 से 30 अतिरिक्त घंटे के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में चैम्बर स्लाइड कवर और जगह के साथ फिर से कवर चैम्बर स्लाइड।
    नोट: ऊष्मायन समय परजीवी तनाव के आधार पर 6-12 घंटे से लेकर कर सकते हैं कि जंगली प्रकार परजीवी तनाव की दुगनी समय पर निर्भर करता है। एक समय बिंदु भोले मैक्रोफेज के lysis परजीवी से पहले चुना जाता है, लेकिन काफी देर तक कम से कम 3-4 दोगुनी सक्षम करने के लिएBling बार।
  8. है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 2.5% formaldehyde के समाधान करें। चैम्बर स्लाइड में मीडिया त्यागें और 2.5% formaldehyde समाधान के 300 μl के साथ बदलें। आरटी पर 20 मिनट के लिए ठीक करें।
  9. दो बार चैम्बर प्रति पीबीएस के 300 μl से कुल्ला स्लाइड (एस)। प्रत्येक कुल्ला के लिए, स्लाइड में पीबीएस त्यागें और स्लाइड का पालन मैक्रोफेज में खलल न डालें से बचने के लिए प्रत्येक स्लाइड चैंबर के भीतरी चेहरा नीचे धीरे नए पीबीएस जोड़ें। धुंधला करने से पहले बाहर सुखाने से स्लाइड को रोकने के लिए चैम्बर स्लाइड पर चैम्बर और जगह कवर प्रति पीबीएस के 300 μl जोड़ें।
    नोट: स्लाइड्स पूर्व धुंधला करने के लिए इस बिंदु पर 3 दिनों के लिए 4 सी में रखा जा सकता है।
  10. टी के लिए धुंधला प्रोटोकॉल immunofluorescence माइक्रोस्कोपी (यूके) द्वारा gondii का पता लगाने।
    1. पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 समाधान (permeabilization के बफर) बनाते हैं। ट्राइटन X-100 के समाधान में चला जाता है सुनिश्चित करने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान और संक्षेप में भंवर में यह एक ट्यूब में समाधान रखें। छोड़नापीबीएस चैम्बर स्लाइड्स में और permeabilization के बफर के 300 μl के साथ बदलें। 30 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें।
    2. पीबीएस (अवरुद्ध समाधान) में 10% बकरी सीरम का समाधान करें। स्लाइड में permeabilization के बफर त्यागें और चैम्बर प्रति अवरुद्ध समाधान के 300 μl के साथ बदलें। 30 मिनट के लिए आरटी पर छोड़ दें।
      नोट: भ्रूण बछड़ा सीरम सब धुंधला प्रोटोकॉल में बकरी सीरम के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    3. टी करने के लिए एक fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी के 1,000 कमजोर पड़ने: एक एक कदम आइएफए धुंधला प्रोटोकॉल के लिए, एक एक कर अवरुद्ध समाधान में gondii। स्लाइड से अवरुद्ध समाधान निकालें और चैम्बर प्रति एंटीबॉडी समाधान के 150 μl जोड़ें। बाहर सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए चैम्बर स्लाइड पर कवर स्लाइड बदलें। आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
      नोट: एंटीबॉडी एकाग्रता अनुभव से स्रोत पर निर्भर करता है निर्धारित किया जाना चाहिए। एंटीबॉडी सीधे एक fluorochrome संयुग्मित या उपयोगकर्ता द्वारा एक fluorochrome संयुग्मित खरीदा जाता है।
      1. एक दो कदम आइएफए धुंधला के लिएटी करने के लिए एक विसंयुग्मित एंटीबॉडी के साथ प्रोटोकॉल gondii और एक fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी, टी के खिलाफ विसंयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के 150 μl के साथ दाग स्लाइड आरटी पर 1 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध में gondii। 300 पीबीएस के μl प्लस 1% बकरी सीरम (धो बफर) के साथ 3x कुल्ला।
      2. प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए मूल की प्रजातियों के लिए विशिष्ट fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 150 μl जोड़ें। बाहर सुखाने से कोशिकाओं को रोकने के लिए चैम्बर स्लाइड पर कवर स्लाइड बदलें। आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    4. कुल्ला स्लाइड्स पीबीएस प्लस 1% बकरी सीरम (धोने बफर) के साथ 3x। प्रत्येक कुल्ला के लिए, उसकी सामग्री बाहर डंपिंग द्वारा चैम्बर स्लाइड्स में समाधान निकालने और वाशिंग बफर के 300 μl के साथ बदलें।
    5. कुल्ला स्लाइड्स पीबीएस के 300 μl के साथ 2x।
    6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार चैम्बर स्लाइड से चैम्बर निकालें।
    7. माउंट DAPI युक्त मीडिया बढ़ते (4'6-diamidino-2-फिनाइल के साथ स्लाइड्सइण्डोल, dilactate) और एक 22 मिमी x 50 मिमी coverslip के।
  11. चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्लाइड जांच करते हैं। अच्छी तरह से चैम्बर प्रति 100 पीवी की एक न्यूनतम परीक्षण करके रिक्तिका प्रति परजीवी की औसत संख्या का निर्धारण करते हैं। स्क्रीन के लिए IFN- γ और LPS के चुने हुए खुराक, जंगली प्रकार के परजीवी (चित्रा 1 देखें) की प्रतिकृति को दबाने के लिए पर्याप्त होने की जरूरत है, लेकिन रोकने के लिए नहीं।

संक्रमित मैक्रोफेज की एक फिटनेस दोष के बाद सक्रियण के साथ परजीवी म्यूटेंट के 2. अलगाव

नोट: रैंडम टी के एक पुस्तकालय gondii म्यूटेंट आगे आनुवंशिकी स्क्रीन के लिए आवश्यक है। टी के यादृच्छिक mutagenesis gondii रासायनिक (ENU / ईएमएस) या insertional उत्परिवर्तजनन 27,28,38 के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। कमजोर पड़ने सीमित है और D10 मीडिया 32,38 के 200 μl की एक मात्रा में पक्षपाती HFF कोशिकाओं से युक्त 96 अच्छी तरह प्लेटों में व्यक्तिगत क्लोन बढ़ने से उत्परिवर्तजनन, क्लोन परजीवी के बाद।यह माइक्रोस्कोपी द्वारा मैक्रोफेज में परजीवी की स्क्रीनिंग के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें सूक्ष्म स्क्रीनिंग सक्षम करने के लिए ऑप्टिकल पैंदा है कि महत्वपूर्ण है। स्क्रीनिंग के लिए चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 96 अच्छी तरह प्लेटें चरण विपरीत 4, 10, 20 या लंबे समय तक काम दूरी के लिए सुसज्जित 40x उद्देश्य के साथ एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की आवश्यकता दाग। एक 4x उद्देश्य पूरे अच्छी तरह से देख रहा है, लेकिन परजीवियों का बेहतर समाधान 20X उद्देश्य के साथ हासिल की है के लिए उपयोगी है।

  1. दो में 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में मिला हुआ HFF कोशिकाओं में उगाया tachyzoite म्यूटेंट का स्थानांतरण 50 μl D10 मीडिया के 100 μl में (1-2 सप्ताह के अलगाव के बाद) murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज युक्त 96 अच्छी तरह से प्लेटों को दोहराने।
    नोट: अच्छी तरह से प्रत्येक प्रति हस्तांतरित परजीवियों की संख्या गिनने के लिए होने से बचने के लिए परजीवी संस्कृति की मात्रा के आधार पर परजीवी की 96 अच्छी तरह से प्लेट में प्रारंभिक स्क्रीन प्रदर्शन करते हैं। इस प्रकार, 2.6 में माइक्रोस्कोपी विश्लेषण wheth पर गुणात्मक आधारित हैएर परजीवी आम तौर पर दोहराया दोहराया है या नहीं है। चरण 3 मैक्रोफेज संक्रमित करने के लिए जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती परजीवी के बराबर संख्या का उपयोग कर चैम्बर स्लाइड्स में म्यूटेंट के phenotype पुष्टि करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन है।
    1. सीधे अच्छी तरह से प्रत्येक में पहले से ही D10 के मीडिया के लिए परजीवी जोड़ें। परजीवी नकल के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार tachyzoites साथ दो कुओं को संक्रमित।
  2. परजीवी कोशिकाओं पर आक्रमण और उनकी पीवी बनाने के लिए समय की अनुमति के लिए चार घंटे के लिए एक मशीन (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) में संक्रमित कोशिकाओं रखें।
  3. थाली की सामग्री डंपिंग द्वारा एक थाली से मीडिया निकालें। परजीवी के लिए एक साबुन cidal युक्त त्यागें बेसिन में थाली में मीडिया डंप करने के लिए कलाई की एक भी फ्लिप का उपयोग करें।
    1. मीडिया और एक multichannel विंदुक के लिए एक बाँझ बेसिन का उपयोग करते हुए "बृहतभक्षककोशिका सक्रियण मीडिया" के 100 μl जोड़ें। मैक के लिए चरण 1 से निर्धारित इष्टतम LPS की एकाग्रता और IFN-γ का प्रयोग करेंrophage सक्रियण मीडिया। इसी प्रकार डुप्लिकेट नियंत्रण थाली से मीडिया को दूर करने और D10 मीडिया के 100 μl के साथ बदलें।
  4. एक अतिरिक्त 24-30 घंटे के लिए एक मशीन (2 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ) में संक्रमित कोशिकाओं रखें।
  5. आइएफए के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए धुंधला प्रोटोकॉल।
    1. थाली में मीडिया त्यागें और पीबीएस में 2.5% formaldehyde के 100 μl के साथ बदलें। आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। Formaldehyde और एक multichannel विंदुक के लिए एक बाँझ बेसिन का प्रयोग करें।
    2. थाली में formaldehyde समाधान त्यागें और थाली से formaldehyde के कुल्ला करने के लिए 100 μl पीबीएस जोड़ें।
    3. थाली में समाधान त्यागें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए (0.2% ट्राइटन X-100 के साथ पीबीएस) permeabilization के बफर के 100 μl जोड़ें। आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. थाली में समाधान त्यागें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए (10% बकरी सीरम के साथ पीबीएस) अवरुद्ध समाधान के 100 μl जोड़ें। आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. पी में समाधान त्यागेंदेर। जोड़ें / अच्छी तरह से एक fluorescently संयुग्मित विरोधी टी के 50 μl gondii एंटीबॉडी एक पतला: पीबीएस में 1000 प्लस 1% बकरी सीरम। पर और एक घुमाव पर थाली कवर के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
      1. वैकल्पिक रूप से टी के खिलाफ एक विसंयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग gondii 1.10.3.1 में वर्णित के रूप में एक fluorescently संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला द्वारा पीछा किया।
    6. थाली में एंटीबॉडी समाधान त्यागें और 100 μl / अच्छी तरह से पीबीएस के प्लस 1% बकरी सीरम के साथ बदलें। अकेले पीबीएस के साथ दो अतिरिक्त rinses के द्वारा पीछा इस कुल्ला 3x प्रदर्शन करते हैं। प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 200 μl छोड़ दो और सूखने से कुओं को रोकने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली पर कवर की जगह।
      नोट: parafilm में लिपटे और माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण करने से पहले ऊपर से 3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है पर कवर के साथ प्लेट।
  6. एक 20-40X उद्देश्य का उपयोग एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की जांच। NA एंड में दोहराने का चयन करें कि म्यूटेंट# 239; बृहतभक्षककोशिका थाली है, लेकिन मुख्य रूप से "सक्रिय मैक्रोफेज" में एक परजीवी / रिक्तिका परे दोहराने के लिए असफल हो या कि अनाकार या "सक्रिय मैक्रोफेज" में अपमानित दिखाई देते हैं।
    नोट: रिक्तिका प्रति जंगली प्रकार के परजीवी की संख्या आदर्श IFN-γ और इस्तेमाल LPS की खुराक पर निर्भर करती है लेकिन रिक्तिका के अनुसार लगभग चार परजीवी है; विकास दमन नहीं बल्कि सक्रियण प्रोत्साहन द्वारा प्रतिकृति के पूर्ण निषेध को दर्शाता है कि एक नंबर।

दोष संक्रमित मैक्रोफेज के सक्रियण के बाद परजीवी अस्तित्व के स्तर या प्रतिकृति पर है 3. यदि निर्धारित करने के लिए म्यूटेंट का मूल्यांकन

  1. स्थानांतरण HFF कोशिकाओं से युक्त T25s करने के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट (पूरे अच्छी तरह की सामग्री) से परजीवी म्यूटेंट चयनित और नकल अनुमति देते हैं।
  2. संस्कृति अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज हे / एन D10 मीडिया के 250 μl में 3 × 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में 8 चैम्बर गिलास स्लाइड में। देहात तुलना करने के लिए एक स्लाइड तैयार करेंभोले मैक्रोफेज में rasite प्रतिकृति और एक अतिरिक्त स्लाइड संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता निम्नलिखित परजीवी प्रतिकृति तुलना करने के लिए।
  3. हार्वेस्ट tachyzoite परजीवी और एक hemocytometer में गिनते हैं। 5 × 10 4 टी जोड़ें gondii अच्छी तरह से 4 घंटे के लिए D10 मीडिया और संस्कृति में मैक्रोफेज युक्त चैम्बर के लिए परजीवी। एक नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार पैतृक परजीवी के साथ एक अच्छी तरह से शामिल करें। भोले मैक्रोफेज में परजीवी की प्रतिकृति पर नजर रखने के क्रम में सक्रियण मीडिया प्राप्त नहीं होगा कि एक ही परजीवी क्लोन के साथ एक समान दोहराने स्लाइड टीका लगाना।
  4. दोहराने के चैम्बर स्लाइड्स की एक से D10 मीडिया त्यागें और "सक्रियण मीडिया" के 250 μl के साथ बदलें। अन्य दोहराने के चैम्बर स्लाइड से D10 मीडिया त्यागें और D10 मीडिया के 250 μl के साथ बदलें। पर चैम्बर स्लाइड कवर के साथ "सक्रिय" और "भोले" बृहतभक्षककोशिका स्लाइड दोनों सेते एक additi के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 परonal 24-30 घंटा।
  5. चरण 1 में वर्णित के रूप में बरकरार कक्षों के साथ आइएफए धुंधला प्रदर्शन करना, फिक्स Permeabilize, और आइएफए धुंधला और परजीवी के विश्लेषण के लिए ब्लॉक स्लाइड।
    1. टी करने के लिए झिल्ली जुड़े एक (LAMP1) या Lysotracker और एंटीबॉडी lysosomal करने के लिए एक एंटीबॉडी के साथ सह-दाग कोशिकाओं संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता लाइसोसोम (चित्रा 4) के साथ उत्परिवर्ती पीवी का फ्यूजन आरंभ कर रहे हैं gondii मूल्यांकन करने के लिए।
    2. जल्दी बृहतभक्षककोशिका सक्रियण 28 निम्नलिखित स्पष्ट कर रहे हैं कि परजीवी उत्परिवर्ती में परिवर्तन की पहचान के लिए आइएफए द्वारा धुंधला के लिए परजीवी / पी.वी. भीतर विशिष्ट डिब्बों / organelles के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करें।
      नोट: इस तरह के परिवर्तन बृहतभक्षककोशिका सक्रियण निम्नलिखित उत्परिवर्ती की कमी अस्तित्व / प्रतिकृति underlies कि तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।
  6. एक 100X चरण तेल उद्देश्य और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग स्लाइड जांच करते हैं।
    1. निर्धारित करने से परजीवी प्रतिकृति का मूल्यांकन100 यादृच्छिक रिक्तिकाएं में पीवी प्रति परजीवी की संख्या। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए 100 रिक्तिकाएं प्रत्येक के कम से कम दो मायने रखता प्रदर्शन करते हैं।
    2. सामान्य दोनों प्रतिदीप्ति विश्लेषण का उपयोग परजीवी आकृति विज्ञान के साथ ही चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का मूल्यांकन। चरण 100x उद्देश्य के तहत देखें परजीवी। स्वस्थ परजीवी परजीवी कसकर एक करीबी ढाले parasitophorous रिक्तिका भीतर संलग्न है। चरण घने रिम्स या अनाकार परजीवी के साथ अनाकार विशाल रिक्तिकाएं है कि परजीवियों परजीवी मौत बजाय प्रतिकृति में सिर्फ एक दोष (आंकड़े 1 और 3) सुझाव देते हैं।

4. संक्रमित मैक्रोफेज के सक्रियण के लिए उत्परिवर्ती परजीवियों की संवेदनशीलता ज्ञात विरोधी माइक्रोबियल मध्यस्थों के साथ जुड़ा हुआ है कि क्या मूल्यांकन

  1. / - - Gp91-phox - जंगली प्रकार C57 / BL6 चूहों से iNOS अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज पृथक / - या Irgm1 / Irgm3 - / - चूहों 32।
  2. संस्कृति संबंधित अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैकrophages हे / D10 मीडिया के 250 μl में 3 × 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में 8 चैम्बर गिलास स्लाइड में एन।
  3. चरण 3 में वर्णित के रूप में परजीवी चुनौती, आइएफए धुंधला हो जाना, और विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।
  4. जीवित रहने के लिए और संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता निम्नलिखित को दोहराने के लिए उत्परिवर्ती परजीवी की क्षमता GTPases 28 संबंधित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन या नाइट्रोजन प्रजाति या विशिष्ट उन्मुक्ति के अभाव में बहाल है अगर निर्धारित करते हैं।
  5. विशिष्ट विरोधी माइक्रोबियल मध्यस्थों वे केवल मैक्रोफेज सक्रियण 28 के अन्य मध्यस्थों के साथ मिलकर काम करते हैं अगर HFF कोशिकाओं या भोले मैक्रोफेज में उत्परिवर्ती परजीवी ख़राब या करने के लिए स्वयं द्वारा पर्याप्त हैं कि क्या मूल्यांकन करने के लिए, इस तरह के नाइट्रिक ऑक्साइड दाताओं के रूप में औषधीय एजेंटों, का प्रयोग करें।

5. मूल्यांकन उत्परिवर्ती परजीवी समझौते पुराने संक्रमण में दोष है कि क्या

  1. T25s सह में बड़े जंगली प्रकार, उत्परिवर्ती या लक्षित जीन नष्ट कर दिया परजीवी से tachyzoites पृथकHFF कोशिकाओं ntaining। परजीवियों हौसले HFF संस्कृतियों से lysed किया जाना चाहिए।
  2. एक hemocytometer का उपयोग परजीवी गणना। Intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) द्वारा 200 μl में दिया परजीवी की एक उप-घातक खुराक के लिए मिलीलीटर उपयुक्त प्रति एकाग्रता में हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HbSS) में Resuspend परजीवी।
  3. एक 200 μl मात्रा intraperitoneally (आईपी) के साथ परजीवी इंजेक्षन करने के लिए एक 1 मिलीलीटर टुबरकुलीन सिरिंज और 25 जी सुई का प्रयोग करें। खुराक परजीवी के जंगली प्रकार तनाव और माउस जीनोटाइप पर निर्भर करता है।
    नोट: परजीवी के प्रकार मैं जीनोटाइप की परवाह किए बिना परजीवी खुराक के संक्रमण की तीव्र चरण के दौरान चूहों के लिए घातक हैं और टी के लिए रसायन चिकित्सा के अभाव में जीर्ण संक्रमण के अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हैं gondii परजीवी प्रतिकृति को दबाने के लिए।
  4. तीस दिनों के परजीवी चुनौती के बाद, एक मानक आकार माउस पिंजरे अधिक से अधिक 5 मी शामिल कर सकते हैं (एक uncrowded कक्ष में एक दबाव टैंक से सीओ 2 की साँस लेना द्वारा चूहों का बलिदानबर्फ ग्रीवा अव्यवस्था के बाद)।
  5. स्थापित प्रक्रियाओं 41-43 का उपयोग करते हुए माउस से मस्तिष्क पृथक।
    1. इसके सामने की ओर माउस निर्धारित करना। क्षेत्र बाँझ 70% इथेनॉल के साथ सिर स्प्रे।
    2. ब्रेन स्टेम के माध्यम से कटौती करने के लिए तेज कैंची का प्रयोग करें। फिर एक उथले आसपास सही पार्श्व में कटौती और ब्रेन स्टेम के आधार से शुरू खोपड़ी के बाईं ओर बनाने के लिए विदारक कैंची का प्रयोग करें। धीरे मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी वापस छील संदंश का प्रयोग करें।
    3. धीरे मस्तिष्क को मुक्त करने की घ्राण तंत्रिका कटौती करने की खोपड़ी के मस्तिष्क और आधार के बीच मस्तिष्क और जगह कैंची उठा। बाँझ संदंश या बाँझ पीबीएस के 10 मिलीलीटर युक्त एक जीवाणु पेट्री थाली में एक रंग और जगह के साथ मस्तिष्क लिफ्ट से बाहर।
  6. सही और बाएँ गोलार्द्धों के बीच केंद्र के माध्यम से एक बाँझ स्केलपेल के साथ आधे में मस्तिष्क कट।
  7. पीबीएस के 1 मिलीलीटर युक्त एक छोटे से मोर्टार के लिए मस्तिष्क के आधे से जोड़ें। के लिए मोर्टार और मूसल का प्रयोग करेंएक विस्तृत बोर 20-200 μl विंदुक टिप के माध्यम से पारित कर सकते हैं कि मस्तिष्क के ठीक एक ऊतक निलंबन बनाते हैं।
    नोट: ऊतक वर्गों ऊतकविकृतिविज्ञानी के लिए आवश्यक हैं अगर मस्तिष्क के अन्य आधा एक घंटे के लिए 2.5% formaldehyde के में तय की जानी चाहिए।
  8. एक 1.7 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में मस्तिष्क lysate के 100 μl रखें। धुंधला के लिए मस्तिष्क निलंबन तय करने के लिए मस्तिष्क lysate युक्त ट्यूब में पीबीएस में 2.5% formaldehyde के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  9. एक microcentrifuge में 5 मिनट के लिए 8000 XG पर lysate अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  10. Lysate (10% बकरी सीरम, पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100) के लिए permeabilization / अवरुद्ध बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  11. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 8000 XG पर lysate और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  12. FITC संयुग्मित dolichos biflorus agglutin (यूके) के 200 μl जोड़ें। पीबीएस में लेक्टिन प्लस 10% बकरी सीरम के 100 कमजोर पड़ने: एक एक का प्रयोग करें। धीरे pipetting द्वारा lysate resuspend। सेनाआरटी पर 1 घंटे के लिए।
    नोट: डीबीए परजीवी सिस्ट दीवार पर CST1 को बांधता है कि एक ligand है।
  13. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 8000 XG पर lysate और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। गोली पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। पीबीएस धोने 3x दोहराएँ। एक विंदुक का उपयोग अंतिम धोने के बाद सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  14. एक खुर्दबीन स्लाइड पर दाग मस्तिष्क lysate और जगह के 5 μl को आकर्षित करने के लिए एक विस्तृत बोर 20-200 μl विंदुक टिप का उपयोग करें। मस्तिष्क lysate के एक गीला माउंट बनाने के लिए एक 25 x 25 मिमी कवर पर्ची के साथ स्लाइड माउंट। मस्तिष्क के 5 μl प्रत्येक lysate का उपयोग कर 3 को दोहराने स्लाइड बनाओ।
  15. एक 10x उद्देश्य (चित्रा 6) का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्येक 5 μl विभाज्य प्रति अल्सर की संख्या की गणना।
    नोट: कुछ अल्सर कुछ (पुटी प्रति 1-2 परजीवी) बहुत छोटे हैं, जबकि बड़े (8 या उससे अधिक परजीवी लगभग) कर रहे हैं। छोटे अल्सर की संख्या बनाम बड़े से प्रत्येक स्लाइड लेकिन दस्तावेज़ संख्या प्रति अल्सर की कुल संख्या की गणना।
  16. अल्सर डेट की संख्या में जोड़ेंected (केवल मस्तिष्क के आधे से एक lysate में बनाया गया था) कुल कमजोर पड़ने कारक एक्स 2 से तीन अलग-अलग 5 μl aliquots और गुणा में मस्तिष्क प्रति कुल अल्सर की संख्या का अनुमान लगाने के लिए।

Representative Results

Toxoplasma gondii भोले मैक्रोफेज में स्वतंत्र रूप से replicates और 6-12 घंटा परजीवी के तनाव पर निर्भर करता है के बीच दोहरीकरण का समय दिया है। एक सक्रिय अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज बनाम भोले में प्रतिनिधि परजीवी पता चलता है। चित्रा 2 HFF में परजीवी के जनरल आकारिकी से पता चलता है 2, 4, 8, 16 और 32 परजीवी / पीवी पर कोशिकाओं की मेजबानी। वर्तमान प्रोटोकॉल में, परजीवी भोले मैक्रोफेज आक्रमण और संक्रमित मैक्रोफेज करने के लिए एक शक्तिशाली सक्रियण प्रोत्साहन, LPS और IFN- की डिलीवरी करने से पहले एक नवजात parasitophorous रिक्तिका (पीवी), स्थापित करने के लिए अनुमति दी है। इस मॉडल में, जंगली प्रकार के परजीवी की प्रतिकृति धीमा है, लेकिन परजीवी प्रतिकृति अभी मैक्रोफेज परजीवी प्रतिकृति बाधा पर उत्तरोत्तर अधिक माहिर हो, जो समय के दौरान लगभग 24 घंटे के लिए आय। स्क्रीन शक्तिशाली बृहतभक्षककोशिका एक के लिए आवश्यक समय के बीच एक संशोधित प्रतियोगिता मॉडल के रूप में कार्य करने के लिए डिज़ाइन किया गया हैजंगली प्रकार परजीवी या परजीवी उत्परिवर्ती अपनी पी.वी. भीतर दोहराने के लिए जारी रख सकते हैं जो समय के दौरान बनाम ctivation। स्क्रीन में पहला कदम LPS की एक खुराक का चुनाव है और IFN- संक्रमित मैक्रोफेज के क्रियान्वयन के लिए प्रयोग की जाने वाली γ। खुराक अनुभव से LPS सांद्रता की एक सीमा या IFN- सांद्रता (चरण 1) की एक सीमा के साथ LPS की एक निरंतर खुराक के साथ संयोजन में IFN- γ की एक निरंतर खुराक के साथ या तो सक्रिय मैक्रोफेज में परजीवी प्रतिकृति के मूल्यांकन के द्वारा निर्धारित किया जाता है। सक्रियण उत्तेजनाओं की खुराक रासायनिक या insertional mutagenesis के द्वारा परजीवी म्यूटेंट के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया पैतृक जंगली प्रकार के परजीवी के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए। आदर्श रूप में LPS और IFN- γ की खुराक भोले मैक्रोफेज में पीवी प्रति 8-16 परजीवी की तुलना में सक्रियण के बाद पीवी 24-30 घंटा प्रति 2-8 परजीवी के एक औसत करने के लिए परजीवी प्रतिकृति की अनुमति होगी (आंकड़े 1 और 2)।

LPS और IFN- की उचित एकाग्रता एक बार ^7; निर्धारित किया जाता है, म्यूटेंट 96 अच्छी तरह से ऑप्टिकल नीचे टिशू कल्चर प्लेट में जांच कर रहे हैं। पारंपरिक टिशू कल्चर प्लेटों के लिए प्रयोग किया जाता है कि प्लास्टिक में अनियमितताओं यह मुश्किल चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा परजीवी स्क्रीन करने के लिए उचित समाधान प्राप्त करने के लिए बनाता है क्योंकि प्लेटों में ऑप्टिकल नीचे महत्वपूर्ण है। 96 अच्छी तरह से प्लेटों के चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी भी चरण विपरीत 4, लंबे समय तक काम दूरी के लिए सुसज्जित 10, 20 या 40x उद्देश्य के साथ एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की आवश्यकता है। म्यूटेंट murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज युक्त दोहराने प्लेटों में जांच कर रहे हैं। परजीवी म्यूटेंट के साथ चुनौती के बाद, एक थाली के कुओं में संक्रमित मैक्रोफेज संक्रमित मैक्रोफेज युक्त अन्य थाली केवल D10 के मीडिया में सुसंस्कृत है, जबकि LPS और IFN- γ साथ सक्रिय कर रहे हैं। प्लेट्स LPS और IFN- γ के अलावा के बाद 24-30 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में incubated रहे हैं। ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं फाई रहे हैंxed, परजीवी के लिए दाग और प्रतिदीप्ति और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी दोनों का उपयोग कर आइएफए द्वारा विश्लेषण किया। म्यूटेंट सामान्य परजीवी संख्या और भोले मैक्रोफेज में प्रतिकृति लेकिन कम परजीवी या सक्रिय कर रहे हैं कि संक्रमित मैक्रोफेज में कम परजीवी के साथ छोटे रिक्तिकाएं है कि चुने गए हैं। म्यूटेंट वे उच्च आवर्धन पर परजीवी आकृति विज्ञान के विश्लेषण (100x उद्देश्य और तेल) सक्षम करने के लिए और वे भोले मैक्रोफेज में सामान्य प्रतिकृति है कि पुष्टि करने के लिए दो स्वतंत्र प्रयोगों में मैक्रोफेज भोले में चैम्बर स्लाइड्स (चरण 3) में rescreened और सक्रिय होना चाहिए चुने जाने के बाद लेकिन प्रतिकृति / अस्तित्व में एक दोष बृहतभक्षककोशिका सक्रियण के बाद।

संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता के लिए प्रतिरोध में दोष के साथ म्यूटेंट के phenotypes के लिए आम तौर पर दो व्यापक श्रेणियों में गिरावट: आकृति विज्ञान बरकरार दिखाई देते हैं लेकिन पीवी प्रति एक परजीवी परे नकल करने में असमर्थ हैं कि परजीवी; और दिखाई देते हैं कि परजीवी degrad किया जाना हैएड और भी अनाकार विशाल पीवी (आंकड़े 1 और 3) में हो सकता है। आकृति विज्ञान और परजीवी के फैटी और पीवी सबसे अच्छा एक 100X उद्देश्य और तेल का उपयोग स्लाइड्स पर और प्रतिदीप्ति विश्लेषण के साथ संयुक्त चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जाता है। लाइसोसोमल जुड़े झिल्ली प्रोटीन-1 (LAMP1) के लिए एक एंटीबॉडी के साथ आइएफए के लिए परजीवियों का धुंधला उत्परिवर्ती में दोष लाइसोसोम के साथ फ्यूजन को रोकने के लिए पी.वी. की अक्षमता के साथ जुड़ा हुआ है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए उपयोगी है। मेजबान सेल (LAMP1 नकारात्मक) की endocytic प्रणाली से काफी हद तक अलग है कि एक पी.वी. में है कि एक परजीवी बनाम एक phagolysosome (LAMP1 सकारात्मक) के भीतर एक परजीवी चित्रा 4 में दिखाया गया है। phagolysosome पूरे परजीवी के आसपास दबाव LAMP1 की एक सतत ठोस रिम से स्पष्ट है। इसके विपरीत, एक पी.वी. अक्सर आसपास के क्षेत्र में लाइसोसोम organelles लेकिन इसकी परिधि के चारों ओर LAMP1 धुंधला की कोई सतत रिम है। टी के भीतर परिभाषित संरचनाओं / organelles के लिए एंटीबॉडी का उपयोगवह परजीवी और / या पीवी संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता के साथ जुड़े प्रत्येक उत्परिवर्ती में विसंगतियों की पहचान के लिए आइएफए पढ़ाई अनुवर्ती कार्रवाई में उपयोगी होते हैं। एंटीबॉडी के साथ इस तरह की पूछताछ के एक उत्परिवर्ती में प्रतिकृति / अस्तित्व दोष आबाद है कि तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 5 टी पता चलता है gondii mitochondrion मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 5F4 विरोधी एफ 1 ATPase बीटा सबयूनिट (पीटर ब्राडली से एक तरह का उपहार) जंगली प्रकार के परजीवी या परजीवी म्यूटेंट से संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता के बाद 24 घंटा के साथ दाग। टी gondii एक मोनोक्लोनल विरोधी टी के साथ सह-सना हुआ था gondii एंटीबॉडी। जंगली प्रकार टी gondii परजीवी की परिधि के चारों ओर फैली हुई है कि एक एकल mitochondrion है। संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता निम्नलिखित जंगली प्रकार के परजीवी में परजीवी का एकमात्र mitochondrion उत्परिवर्ती परजीवी में एक खंडित mitochondrion की तुलना में बरकरार था। माइटोकॉन्ड्रिया विखंडन न केवल अपमानित / बेढब में स्पष्ट किया गयापरजीवी लेकिन यह भी चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन के रूप में सामान्य आकृति विज्ञान प्रदर्शित कि परजीवी में। यह परजीवी उत्परिवर्ती में दोष बृहतभक्षककोशिका सक्रियण द्वारा प्रेरित सेल मध्यस्थों की मेजबानी के लिए परजीवी mitochondrion का खतरा बढ़ सकता है।

मौजूदा मॉडल संक्रमित मैक्रोफेज सक्रिय करने के लिए IFN- γ और LPS का एक संयोजन का उपयोग करता है। IFN- γ प्रतिलेखन कारक STAT1 उत्तेजित करता है। LPs, टीएनएफ-α की तरह, प्रतिलेखन कारक एनएफ-κB उत्तेजित करता है। टी के खिलाफ सेल स्वायत्त उन्मुक्ति में महत्वपूर्ण निर्भर रोगाणुरोधी मध्यस्थों γ जाना जाता है IFN- gondii अन्य एजेंटों के अलावा एक IFN- γ निर्भर उन्मुक्ति संबंधित GTPases की सरणी (IRGs, Gbps) और प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन और ऑक्सीजन प्रजातियों में शामिल हैं। अगर निर्धारित करने के क्रम में एक उत्परिवर्ती में दोष विशेष रूप से -inducible रोगाणुरोधी मध्यस्थों γ जाना जाता IFN- के उत्पादन के साथ जुड़ा हुआ है, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज से अलग कर रहे हैंiNOS - / -, जीपी 91 phox - / - या विशिष्ट IRG / जीबीपी जीन हटाए गए चूहों और उत्परिवर्ती परजीवी के खिलाफ गतिविधि के लिए assayed। संक्रमित मैक्रोफेज सक्रिय करने के लिए IFN- γ और LPS के संयोजन को प्राथमिकता जंगली प्रकार 28 परजीवी की तुलना में नाइट्रिक ऑक्साइड को बढ़ाया संवेदनशीलता के साथ म्यूटेंट में यह परिणाम है।

संक्रमित मैक्रोफेज के सक्रियण tachyzoites से ऊतक अल्सर में शामिल हैं जो bradyzoites करने के परजीवी के मंच भेदभाव पैदा कर सकते हैं। इस तरह के अल्सर पुराने संक्रमण के लक्षण हैं। इस प्रकार, संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता निम्नलिखित प्रतिकृति / अस्तित्व के लिए खराब कर रहे हैं कि परजीवी म्यूटेंट भी vivo में संक्रमण के दौरान अल्सर के लिए रूपांतरण के लिए खराब हो सकता है। पुराने संक्रमण के दौरान पुटी उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए, चूहों पैतृक परजीवी तनाव का एक गैर घातक खुराक या उत्परिवर्ती क्लोन के साथ intraperitoneally (आईपी) को चुनौती दी है। कम से कम 10 से आकार में मस्तिष्क रेंज में अल्सर _6;। अधिक से अधिक से अधिक 50 माइक्रोन के लिए व्यास में एम चित्रा 6 में दिखाया गया है आइएफए से दोनों बड़े और छोटे अल्सर की संख्या की गणना, लेकिन परजीवी उत्परिवर्ती कुल पुटी उत्पादन के लिए या सिर्फ स्थापना के लिए बिगड़ा हुआ है अगर मायने रखता है यह निर्धारित करने के क्रम में अलग रखना बड़े अल्सर की और रखरखाव।

चित्र 1
चित्रा 1. भोले murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज टी की प्रतिकृति के लिए अनुमोदक हैं gondii लेकिन IFN- γ साथ सक्रियण और LPS काफी प्रतिकृति को रोकता है। (ए) जंगली प्रकार टी के ए parasitophorous रिक्तिका (पीवी) gondii 24 भोले murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज के आक्रमण के बाद घंटा। (बी) जंगली प्रकार टी के एक पी.वी. gondii संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता के बाद रिक्तिका 24 घंटा प्रति चार परजीवी से मिलकर परजीवी।(सी) एक परजीवी / पीवी संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता के बाद 24 घंटे में अभी भी नकल करने में असमर्थ है और एक उत्परिवर्ती परजीवी का एक उदाहरण है। (डी) संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता के बाद एक अनाकार पीवी 24 घंटा के भीतर अपमानित प्रतीत होता है कि एक उत्परिवर्ती परजीवी का एक उदाहरण । शीर्ष पंक्ति परजीवी के चरण छवियों से पता चलता है और नीचे पंक्ति टी के खिलाफ एक पॉलीक्लोनल विरोधी सीरम का उपयोग कर फ्लोरोसेंट छवियों से पता चलता है gondii। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. परजीवी प्रतिकृति पी.वी. प्रति परजीवी की संख्या से मूल्यांकन किया है। तस्वीरें 2, 4, 8, 16 और HFF कोशिकाओं में पी.वी. प्रति 32 परजीवी दिखा। प्रत्येक तस्वीर एक विलय चरण छवि वें हैपर लाल रंग में परजीवी और नीला (DAPI) में HFF नाभिक की पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी धुंधला से पता चलता है। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. म्यूटेंट संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता निम्नलिखित phenotypes की एक रेंज दिखा रहे हैं। बाईं तरफ के स्तंभ मैक्रोफेज में परजीवी के एक चरण छवि है, केंद्र स्तंभ टी करने के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट छवि है gondii, और सही कॉलम चरण और फ्लोरोसेंट छवि का एक मर्ज है। परजीवी, हरे और नीले रंग में बृहतभक्षककोशिका नाभिक में दिखाया गया है। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के संस्करण।

चित्रा 4
चित्रा 4. LAMP1 धुंधला phagolysomes युक्त परजीवी से पीवी अलग। परजीवियों एक पॉलीक्लोनल विरोधी टी के साथ दाग रहे हैं mAb 1D4B (हरा) के साथ gondii एंटीबॉडी (लाल) और LAMP1। एक तीर लाइसोसोम के साथ जुड़े हुए है कि एक परजीवी पी.वी. के निशान। तीर बिना परजीवी लाइसोसोम के साथ जुड़े हुए नहीं किया गया है कि एक parasitophorous रिक्तिका (पीवी) में है। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. जंगली प्रकार के परजीवी mitochondri जबकि एक अक्षुण्ण mitochondrion बनाए रखने केसंक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता निम्नलिखित परजीवी म्यूटेंट में अपमानित किया जाता है पर। तीन अलग अलग उत्परिवर्ती टी की तुलना में जंगली प्रकार के परजीवी में mitochondrion (हरा) (शीर्ष पैनल) gondii गिरावट (नीचे तीन पैनल) के विभिन्न चरणों संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता के बाद 24 घंटे में परजीवी। पैमाने पर पट्टी 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
लेक्टिन biflorus FITC संयुग्मित dolichos का उपयोग कर मस्तिष्क में परजीवी अल्सर की चित्रा 6. जांच। लेक्टिन के साथ लेबल पुटी दीवार हरे रंग में दिखाया गया है। पैमाने बार 50 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। एक बड़ा versio देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के एन।

Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज और टी को अलग-थलग करने के लिए आगे आनुवंशिकी की सक्रियता का उपयोग करता है कि एक गैर पक्षपातपूर्ण दृष्टिकोण प्रदान करता है उनकी क्षमता में एक दोष के साथ gondii म्यूटेंट संक्रमित मैक्रोफेज की सक्रियता जीवित रहने के लिए। म्यूटेंट निम्नलिखित बृहतभक्षककोशिका सक्रियण के phenotype आम तौर पर दो व्यापक श्रेणियों में से एक में गिर जाता है: 1) परजीवी बरकरार दिखाई देते हैं लेकिन पीवी प्रति एक परजीवी परे दोहराने के लिए असफल हो; 2) परजीवी अपमानित दिखाई देते हैं और विशाल, अनाकार पीवी में हो सकता है। म्यूटेंट सक्रियण के अभाव में भोले मैक्रोफेज में जंगली प्रकार के परजीवी की तरह एक phenotype तथ्य यह है कि प्रोटोकॉल विशेष रूप से विशेष रूप से बृहतभक्षककोशिका सक्रियण विरोध करने के लिए अपनी क्षमता में प्रभावित कर रहे हैं कि म्यूटेंट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है साबित होता है। प्राथमिक अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग स्क्रीन के लिए रॉ 264.7 मैक्रोफेज सेल लाइन बनाम सिफारिश की है क्योंकि VACU प्रति परजीवी और परजीवी संख्या की आकारिकीOLE अधिक आसानी से अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज में कल्पना कर रहे हैं।

आगे आनुवंशिकी के साथ संयुक्त वर्णित स्क्रीन परजीवी जीन और सेल स्वायत्त उन्मुक्ति के विशिष्ट मध्यस्थों के प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण अंततः आनुवंशिक रास्ते काटना करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण प्रदान करता है। इस तरह आगे आनुवंशिकी के अध्ययन के लिए इन विट्रो में और रोगजनन दौरान दोनों विशिष्ट रोगाणुरोधी मध्यस्थों विरोध के लिए महत्वपूर्ण परजीवी रास्ते unraveling शुरू करने के लिए एक स्ट्रिंग की तरह पीछा किया जा सकता है कि परजीवी जीनों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। आगे आनुवंशिक दृष्टिकोण के साथ पिछले एक कठिनाई प्रत्येक उत्परिवर्ती में बाधित कुंजी जीन की पहचान की थी। टी में Cosmid पुस्तकालय complementation gondii कोशिका विभाजन म्यूटेंट के कार्यात्मक पूरक के लिए काफी प्रभावी किया गया है। हालांकि, जंगली प्रकार के परजीवी की प्रतिकृति भी सिर्फ म्यूटेंट की तुलना में एक हद तक कम करने IFN-γ और LPS के द्वारा दबा कर रहे हैं तथ्य यह है कि, कार्यात्मक complementation अधिक कठिन था बनाता हैकोशिका विभाजन म्यूटेंट के लिए एन। टी में रासायनिक और insertional म्यूटेंट दोनों के लिए पूरे जीनोम उत्परिवर्तनीय रूपरेखा gondii हाल ही में एक उत्पादक के रूप में उभरा है, और भी आगे आनुवंशिकी स्क्रीन 34,36,37,44 में म्यूटेंट के phenotypes के लिए जिम्मेदार जीन की पहचान करने के लिए प्रभावी, एवेन्यू लागत है। नतीजतन, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करते हुए पूरे जीनोम उत्परिवर्तनीय रूपरेखा टी की रासायनिक उत्परिवर्तजनन की क्षमता का उपयोग करता बढ़ाया गया आगे आनुवंशिक अध्ययनों में gondii विशिष्ट कार्यों के लिए महत्वपूर्ण जीनों की पहचान करने के लिए। वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में इस तरह के एक आगे आनुवंशिकी दृष्टिकोण टी के जीनोम के अधिकांश के रूप में महत्वपूर्ण हैं gondii प्रतिरक्षा चोरी के लिए महत्वपूर्ण उम्मीदवार परजीवी जीनों की पहचान करने में सहायता कर सकता है कि अन्य जीन या कार्यात्मक डोमेन के लिए कोई अनुरूपता होने की भविष्यवाणी की जीन के बहुमत के साथ काल्पनिक बनी हुई है।

96 अच्छी तरह से प्लेटों के आइएफए विश्लेषण आम तौर पर मुलाकात की एक उच्च throughput प्रदर्शन नहीं माना जाता हैविभागाध्यक्ष। एक व्यक्ति को एक दिन में 10 से 96 अच्छी तरह प्लेटें या लगभग 960 म्यूटेंट दाग और स्क्रीन करने के लिए हमारे अनुभव में यह उचित है। Skariah एट अल। द्वारा पत्र में, लगभग 8000 म्यूटेंट विश्लेषण किया गया और 14 स्वतंत्र म्यूटेंट काफी सक्रिय नहीं बल्कि भोले मैक्रोफेज 28 में अस्तित्व / प्रतिकृति के लिए बिगड़ा गया कि अलग थे। म्यूटेंट का बिगड़ा अस्तित्व में मुख्यतः नाइट्रिक ऑक्साइड के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता का परिणाम था। समग्र विधि में सीमा मुख्य रूप से परजीवी के एकल क्लोन प्राप्त करने के बजाय 96 अच्छी तरह से प्लेट में प्रारंभिक स्क्रीन गुणात्मक और यथोचित तेजी के रूप में माइक्रोस्कोपी द्वारा स्क्रीनिंग के स्तर पर है। 96 अच्छी तरह से थाली की स्क्रीन में पहचान म्यूटेंट के phenotype की पुष्टि चैम्बर स्लाइड्स में मैक्रोफेज का उपयोग कर मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण द्वारा चरण 3 में और जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती परजीवी के बराबर संख्या जोड़कर पीछा कर रहा है। अन्य विश्लेषणात्मक स्क्रीनिंग तरीकों का उपयोगऐसे परजीवी की कुल जनसंख्या के स्तर पर fluorometry के रूप में, बल्कि माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन के रूप में व्यक्तिगत परजीवी स्तर की तुलना में, अपमानित परजीवी के रूप में कई टी के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग मौजूदा प्रोटोकॉल में समस्याग्रस्त हैं gondii के रूप में मजबूती के रूप में उत्परिवर्ती fluoresence तीव्रता के स्तर पर मात्रात्मक और अधिक से अधिक गुणात्मक होने में अंतर के साथ जंगली प्रकार के परजीवी। इसके अलावा, IFN-γ और बाद में समय बिंदुओं पर यद्यपि जंगली प्रकार के परजीवी का दबा प्रतिकृति में संक्रमित मैक्रोफेज परिणामों की सक्रियता के लिए प्रतिरोध में एक दोष के साथ म्यूटेंट को अलग-थलग करने के लिए आवश्यक LPS की खुराक। इसलिए, luminescent के परजीवी के उपयोग सहित आगे आनुवंशिकी स्क्रीन के लिए कुल परजीवी संख्या का माप समस्याग्रस्त है। हालांकि, यह रासायनिक या insertional mutagenesis के लिए इस्तेमाल किया पैतृक परजीवी क्लोन एक विधान या inducible फ्लोरोसेंट या लूसिफ़ेर व्यक्त अगर धुंधला प्रोटोकॉल स्क्रीनिंग चरण में समाप्त किया जा सकता है संभव हैएएसई मार्कर। 96 अच्छी तरह से प्लेट में मैक्रोफेज की आइएफए और माइक्रोस्कोपी स्क्रीनिंग का उपयोग कर वर्णित प्रोटोकॉल सक्रिय मैक्रोफेज में अस्तित्व / प्रतिकृति के लिए दोषपूर्ण म्यूटेंट के अलगाव के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी स्पष्ट रूप से प्राप्त 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप के रूप में उपयोग करते हुए सीमित सूक्ष्म संकल्प की वजह से कुछ संभावित म्यूटेंट याद करते हैं इस प्रस्ताव पर परजीवी प्रतिजन के लिए दाग कि अनाकार सूजन रिक्तिकाएं एक सामान्य पी.वी. भीतर स्वस्थ नकल परजीवी के लिए गलत हो सकता है। 96 अच्छी तरह से कवर गिलास प्लेट, बजाय एक ऑप्टिकल सतह के साथ 96 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रतिस्थापन, 96 अच्छी तरह से प्लेट में संक्रमित मैक्रोफेज की स्क्रीन के दौरान अधिक से अधिक संकल्प को प्राप्त करने की संभावना है।

परजीवी आक्रमण निम्नलिखित मैक्रोफेज सक्रिय करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल में IFN-γ और LPS का उपयोग पहचान म्यूटेंट के विशाल बहुमत के नाइट्रिक ऑक्साइड 28 से खुद को बचाने के लिए अपनी क्षमता में एक दोष है। इस संबंध में, स्क्रीन गैर पक्षपाती होने का इरादा है, हालांकि,सक्रियण की स्थिति, प्रकार और मैक्रोफेज की प्रजातियों और स्क्रीन के लिए चुना जाता है कि बृहतभक्षककोशिका सक्रियण के लिए परजीवी आक्रमण रिश्तेदार के समय के आधार पर विशिष्ट रोगाणुरोधी मध्यस्थों के लिए बढ़ा संवेदनशीलता के साथ परजीवी म्यूटेंट के अलगाव के लिए समृद्ध हो सकता है। इस प्रकार स्क्रीन और लागू सक्रियण उत्तेजनाओं के लिए चुना सहज प्रतिरक्षा सेल परिणामी परजीवी म्यूटेंट अतिसंवेदनशील होने की संभावना है, जो करने के लिए रोगाणुरोधी मध्यस्थों के प्रकार के प्रभाव है कि महत्वपूर्ण मानकों हैं। परजीवी के जीनोटाइप भी प्रकार द्वितीय और तृतीय जीनोटाइप 26,45,46 अधिक अतिसंवेदनशील होते हैं, जबकि मैं परजीवी की जीनोटाइप IFN-γ के जवाब में प्रेरित उन्मुक्ति संबंधित GTPases (IRGs) करने के लिए अपेक्षाकृत प्रतिरोधी रहे हैं प्रकार के रूप में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। वर्णित प्रोटोकॉल में, मैक्रोफेज परजीवी आक्रमण के बाद सक्रिय कर रहे हैं। प्रकार द्वितीय जीनोटाइप हालांकि, वर्णित स्क्रीन में इस्तेमाल Prugnaud तनाव, प्रतिरक्षा संबंधित GTPases की कार्रवाई करने के लिए अतिसंवेदनशील है, एकपरजीवी मैक्रोफेज आक्रमण करने के लिए llowing के पहले IRGs से भरा प्रेरण से पहले जंगली प्रकार के परजीवी की प्रतिकृति सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यह IRGs वे आक्रमण और नकल की दीक्षा परजीवी बाद मैक्रोफेज में प्रेरित कर रहे हैं अगर परजीवी के खिलाफ प्रभावी रहे हैं कि स्पष्ट नहीं है।

वर्णित प्रोटोकॉल-IFN γ निर्भर सेल स्वायत्त उन्मुक्ति, विशेष रूप से नाइट्रिक ऑक्साइड के मध्यस्थों के प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण परजीवी जीनों की पहचान करने के लिए मैक्रोफेज का उपयोग करता है। नाइट्रिक ऑक्साइड के लिए एक उल्लेखनीय संवेदनशीलता के साथ ही नाइट्रिक ऑक्साइड निर्भर mitochondrial विखंडन का एक साझा फेनोटाइप का हिस्सा है कि परजीवी म्यूटेंट का एक पूल के अलगाव नाइट्रिक ऑक्साइड को और समझने के लिए परजीवी जीन और प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण रास्ते की पहचान करने के लिए उपकरणों का एक अनूठा सेट प्रदान करता है टी के खिलाफ और अधिक मोटे तौर पर नाइट्रिक ऑक्साइड की कार्रवाई gondii और मामूली संशोधनों के साथ अन्य यूकेरियोटिक pathogens.The वर्णित प्रोटोकॉल आगे आनुवंशिकी पढ़ाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसेल स्वायत्त उन्मुक्ति के विभिन्न मध्यस्थों के प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण परजीवी जीनों की पहचान करने के लिए। संभावित संशोधनों आक्रमण परजीवी से संक्रमित मेजबान सेल के प्रकार, सक्रियण उत्तेजनाओं, या सक्रियण रिश्तेदार के समय में फेरबदल शामिल हैं। उदाहरण के लिए, परजीवी के अलावा पहले IFN-γ साथ murine मैक्रोफेज की पूर्व सक्रियण उन्मुक्ति संबंधित GTPases की सक्रियता पर नतीजा होगा। टी की तरह की एक मॉडल के प्रकार में परजीवी जीनों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मैं जीनोटाइप gondii उन्मुक्ति संबंधित GTPases 24,25 को ROP18 और ROP5 द्वारा मध्यस्थता प्रतिरोध में योगदान कर सकते हैं। टी के खिलाफ सेल स्वायत्त उन्मुक्ति के मध्यस्थों मानव सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं में gondii के रूप में अच्छी तरह से कृन्तकों में के रूप में परिभाषित नहीं कर रहे हैं। इस प्रकार, मानव परिधीय रक्त monocytes के उपयोग टी के रासायनिक म्यूटेंट स्क्रीन करने के लिए gondii सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं में मानव संक्रमण के साथ ही के लिए मानव में महत्वपूर्ण तंत्र के दौरान अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण दोनों परजीवी जीनों की पहचान हो सकती हैटी आर रोगाणुरोधी प्रतिरोध gondii। ऐसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन या नाइट्रोजन प्रजाति के रूप में औषधीय एजेंटों को संक्रमित मेजबान कोशिकाओं का जोखिम जीवित करने में असमर्थ म्यूटेंट अलग से पहचाना जा सकता है विशिष्ट रोगाणुरोधी मध्यस्थों के प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण परजीवी जीनों। इसी प्रकार प्रोटोकॉल सक्रियण 47-49 या बृहतभक्षककोशिका purinergic रिसेप्टर्स 50 एटीपी उत्तेजना inflammasome के लिए बढ़ा संवेदनशीलता के साथ परजीवी म्यूटेंट को अलग-थलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।

साथ में ले ली, प्रोटोकॉल टी के लिए महत्वपूर्ण परजीवी म्यूटेंट को अलग-थलग करने के लिए आगे आनुवंशिकी और सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं का उपयोग कर एक दृष्टिकोण का वर्णन gondii प्रतिरोध IFN-γ पर निर्भर करने के लिए सेल स्वायत्त उन्मुक्ति। महत्वपूर्ण बात है, दृष्टिकोण प्रस्तुत किया बहुमुखी है और आसानी से मेजबान कोशिकाओं या शर्तों encounte तनाव के लिए प्रतिरोध के विशिष्ट प्रकार में विशिष्ट रोगाणुरोधी मध्यस्थों, परजीवी अस्तित्व बच रहा है के लिए महत्वपूर्ण परजीवी जीन को अलग-थलग करने के लिए संशोधित किया जा सकता हैटोक्सोप्लाज़मोसिज़ के दौरान लाल। इसके अलावा, कई मामलों में मेजबान सेल सक्रियण विरोध के लिए महत्वपूर्ण परजीवी जीनों भी संक्रमण के दौरान vivo में पुटी उत्पादन में प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से एक भूमिका निभा सकते हैं।

Materials

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