フォワード遺伝学は、識別するためのマクロファージを使用した画面 * These authors contributed equally

Immunology and Infection
 

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Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

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Abstract

Introduction

トキソプラズマトキソプラズマ(トキソプラズマ)は偏性細胞内、原生動物病原体である。それは、トキソプラズマ症の原因物質、免疫無防備状態の個体における健康被害である。また、 クリプトスポリジウム及びシクロスポラ含むヒトに感染する他のアピコンプレクサの病原体についてのモデル系である。トキソプラズマ症は、最も一般的に寄生虫ブラディゾイトまたはオーシスト段階で汚染された食物または水の摂取を介して取得される。摂取時には、これらのステージは、宿主細胞内で複製し、全身に広める寄生虫のタキゾイトステージに変換する。 T細胞は、IFN-γ、および、より少ない程度に、窒素酸化物1-4は 、感染症の制御に重要であるが、タキゾイトの割合が組織嚢内で保護されブラディゾイト期に変換するように、疾患を排除することができない長命の慢性感染症になる。実際には、全く治療薬は慢性シストSに対して効果はありません病気の田下。重度のトキソプラズマ症は、プライマリおよび急性感染の急速複製タキゾイト段階特性に戻って変換する寄生虫のブラディゾイト期で、起因する持続感染の再活性化に最も頻繁にある。

先天性免疫応答の面で初期の生存は、寄生虫が十分な寄生虫数に到達するため、ならびに慢性感染症の確立を可能にするために、遠位部位に到達させることが重要である。T.トキソプラズマは、おそらく複製し、感染の早期普及する能力に貢献する宿主防御機構に対抗するための戦略を発展させてきました。まず、T。トキソプラズマは、他の細胞内病原体5-9と比べて、宿主細胞のエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスのプロセスから大幅に偏析する寄生虫の侵入時にユニークなPVを形成している。また、成功したすべての細胞内病原体のようなT.トキソプラズマは、許容される環境fを作成するために、その宿主細胞を修飾するまたは成長。これは、細胞活性化10-15を調節するための重要なものを含む宿主細胞の転写因子を変更することによって再プログラミング宿主細胞遺伝子発現を含む。 ROP16 16-19は 、GRA15 20、GRA16 21とGRA24 22はすべてT.感染した宿主細胞のシグナル伝達カスケード転写応答及び細胞の調節に重要であることが示されているトキソプラズマ 。明確な表現型を有する寄生虫株の間遺伝的交雑を用いた最近の研究では、免疫関連GTPアーゼ(IRGs)16,19,23-26の回避などの寄生虫の遺伝子型に依存する特性の基礎となる寄生虫の遺伝子の同定に生産性の高いされている。非常に毒性の強いタイプIの遺伝子型は、マウスIRGsを回避する機構を進化させてきたが、マウスでは、免疫関連GTPアーゼ(IRGs)は、寄生虫のタイプIIおよびIIIの遺伝子型の制御のために重要である。しかし、寄生虫抗菌メディアを回避する機構を進化させていることも明らかであるIRGsに加えて、これらのメカニズムのいくつかは、寄生虫の遺伝子型27,28を越えて保存されるよう役。また、非常に少ないが、Tに対する細胞自律的な免疫の重要なメディエーターについてはほとんど知られていない人間のトキソプラズマ症の間にトキソプラズマ 。細胞自律的な免疫のメディエーターへの抵抗のために重要な寄生虫の遺伝子はまた、宿主の免疫応答によってトリガすることが可能な変換をブラディゾイトするタキゾイト中に生存のために重要であるかもしれない。例えば、高いレベルでの一酸化窒素は、感染したマクロファージにおける寄生虫の複製を抑制することができるが、それはまた、嚢胞の生産30-32、結果の変換をブラディゾイトするタキゾイトを刺 ​​激することができる。

ToxoDBはT.のための機能的なゲノムデータベースですトキソプラズマ 、そのコミュニティの注釈を含む公開され、未発表のゲノムスケールのデータにシーケンス寄生虫ゲノムの情報およびアクセスを提供するという点でフィールドの重要なリソースとして機能し、遺伝子EXP ressionとプロテオミクスデータ33。多くの原生動物の病原体と同様に、ゲノムの大半は彼らのポテンシャル関数への洞察を提供するために、遺伝子の相同性に基づいて、利用可能な情報がないとの仮定の遺伝子からなる。このように、フォワード遺伝学は免疫回避、嚢胞変換や寄生虫病因に重要な他の機能のためだけでなく、個別の発達段階との間の変換のための重要な新規寄生虫遺伝子を同定するための強力なツールです。フォワード遺伝学のさらなる長所は、免疫回避及び嚢胞形成を含む病因における特定のタスクのために重要な遺伝子のような寄生虫を調べるために、比較的偏りのないアプローチとして使用することができることである。突然変異プロファイリングのための次世代の配列決定における最近の改善は、化学的および挿入突然変異34-37の両方を用いた順遺伝学研究から責任寄生虫遺伝子を同定するための選択方法で行った。

ntent ">それは、寄生虫に対する細胞自律的な免疫機構にも耐性の嚢胞段階に対して活性であり得ることを特にの実効性を高めるために活用することができトキソプラズマの脆弱性を特定することが重要である。この目的に向けて、in vitroでネズミマクロファージ感染と活性化モデルは、具体的にナイーブマクロファージ内で感染したマクロファージの活性化に続いてではなく、 トキソプラズマの適応度を損なう寄生虫に変異を同定するために開発されました。このマクロファージ画面は、最終的にするために、 トキソプラズマ挿入変異体のライブラリーを調べるために使用された一酸化窒素27,28への抵抗のための重要なトキソプラズマ遺伝子を同定する。感染したマクロファージの活性化に損なわれた抵抗性を有するトキソプラズマ変異体パネルの単離、一酸化窒素に特に顕著な感度は、識別するために、画面の有用性を証明した抵抗のための重要な寄生虫の遺伝子ネズミIRGs 28について記載した耐性機構以外の細胞自律的な免疫のメディエーターに。挿入変異誘発は、制限されたそれぞれの寄生虫クローンにおけるランダム変異の数と、理論的には、突然変異の部位をより容易に識別を生成するという点で化学的突然変異誘発を超える利点を有している。しかし、Tのプラスミド挿入のゲノム部位を特定するトキソプラズマ挿入変異体は、実際には、多くの場合、37で、驚くべきことには困難であった。遺伝子へのプラスミドの挿入は、典型的には、単一のヌクレオチド変化をもたらす化学的突然変異誘発とは対照的に、遺伝子の機能を破壊する可能性がある。それは、複数の一塩基多型を作成しかし、化学的突然変異誘発は、N-エチル-N-ニトロソウレア(ENU)、またはエチルメタンスルホン酸(EMS)のいずれかで(、挿入突然変異と比較して、寄生虫のゲノムの大部分を分析する能力の増加を提供することができる突然変異体34あたり10 -100)と見積もら、38。また、全ゲノムプロファイリングの最近の進歩により、変異した寄生虫34,38の識別された表現型に関与する可能性が最も高い候補遺伝子を同定するために、次世代シークエンシングを使用するようになった。かかわらず、変異誘発アプローチの、マクロファージ活性化に抵抗の寄生虫遺伝子の役割の確認は最終的に、分子コッホの仮説を満たすために遺伝子欠失および相補性を必要とします。

寄生虫とマクロファージの両方の遺伝子操作によって遺伝子の機能を分析する能力は、Tに前進遺伝学を経由して同定された遺伝子の多くが同様に重要であるトキソプラズマ原虫、ならびに他の病原体は、まだ既知の機能を有する他のタンパク質と全く配列相同性をほとんどと仮定的遺伝子として特徴づけられる。現在の紙は、変異体において破壊された遺伝子は、既知のまたはそれに抵抗するために重要であるかどうかを識別するために使用できる一般的なアプローチを概説細胞自律的な免疫の未知の仲介者。ホスト抗菌因子の初期分析は、野生型および誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)のgp-91 phoxの(NADPHオキシダーゼ)における特定の遺伝子欠失を有するものに対して、野生型マウス由来のマクロファージにおける変異寄生虫の生存を評価することによって行われ、特異免疫関連分子量GTPase(IRGs)。識別された寄生虫の遺伝子は、一酸化窒素、反応性酸素中間体または免疫関連分子量GTPase 28それぞれまたは未知の免疫機構が関与している場合への抵抗のために重要である場合、これが決定されます。現在のプロトコルに記載されてIFN-γ及びLPSの両方に感染したマクロファージの活性化は、主に一酸化窒素28への抵抗のために重要な寄生虫遺伝子の単離をもたらす。マクロファージ活性化の非存在下で一酸化窒素を誘導する薬理学的薬剤の使用は、(一酸化窒素供与体)が同定された遺伝子の大部分は再ために重要であることが確認されたマクロファージ活性化28に関連する追加メディエーターと協調して一酸化窒素のではなく、一酸化窒素にsistance。

ステップ1と2は、in vitroで感染した骨髄由来マクロファージの活性化に続いてフィットネスの欠陥とは寄生虫の変異体を分離するために設計されたフォワード遺伝学の画面について説明します。第一段階は、寄生虫複製を減少させるが、完全に野生型Tの複製を阻害しないマクロファージの活性化のために使用することが経験的にIFN-γの用量を決定するために、用量滴定分析を説明し、LPS寄生虫の変異体のライブラリーを作成するために使用されるトキソプラズマ親株。ステップ2は、96ウェルプレート中のマクロファージにおける変異クローンのフォワード遺伝子スクリーニングを説明しています。ステップ3は、96ウェルプレートのスクリーニングで同定された各変異体の表現型を確認し、各変異体に欠陥が寄生虫の生存に影響を及ぼすかどうかを評価するために、複製アプローチを概説マクロファージ活性化に応答して、または嚢胞製造。ステップ4つの寄生虫変異体が特に影響を受けやすいれる免疫メディエーターを同定するための特定の抗菌経路の欠失を有するマウスからの骨髄由来マクロファージの使用を記載している。ステップ5は、感染したマウスの脳内シスト生産によって評価される寄生虫の変異体はまた、インビボ病因のために危険にさらされているかどうかを判断するためのアプローチの概要を説明します。

Protocol

注:動物の使用を含むすべてのプロトコルは、ニューヨーク医科大学の動物実験委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。
NOTE:38希釈、マウス骨髄由来マクロファージ39の単離、T.の成長を制限することにより、化学的突然変異誘発38、寄生虫の単離のための詳細なプロトコール線維芽細胞ヒト包皮におけるトキソプラズマ (HFF)細胞および嚢胞生産マクロファージにおける基本的な免疫蛍光分析(IFA)32が参照される。 (10%ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法高グルコースイーグル培地)をD10培地中で、5%CO 2中37℃ですべての細胞培養を行う。細胞単離および細胞培養を通して無菌の全ての試薬を保管してください。

Concentrを決定するために、IFN-γおよびLPSの1用量滴定フォワード遺伝学の画面用に感染マクロファージを活性化するために使用する管理ポイント

  1. 培養マウス骨髄由来マクロファージO / N室あたりD10培地250μlの中で3×10 5細胞/ mlの濃度で8チャンバースライドガラスにおいて。骨髄から分離した後、二週間後にマクロファージのいずれかを使用します。
    注:チャンバースライドは、RSの洗浄を強化成長を持っていることが購入されています。
  2. T25組織培養フラスコ中で増殖させたヒト包皮線維芽細胞(HFF)細胞から採取した野生型寄生虫をカウントする血球計数器を使用してください。 D10培地1ml当たり5×10 5野生型寄生虫の濃度で寄生虫を再懸濁する。マクロファージは、O / Nを増殖しているでしょうとして1:この濃度は、約1の感染多重度になります。ポリプロピレンへの寄生虫スティックなどの寄生虫を持つすべての操作のためにポリスチレンやPETチューブを使用してください。
  3. チャンバースライドにD10メディアを取り出して、250μlのと交換してください野生型寄生虫のサスペンション。静かに、各チャンバの内面を流下させることにより、スライドの各チャンバへ寄生虫懸濁液を加える。マクロファージは、プロトコル中の任意の時点で乾燥させないでください。
  4. 4時間、5%CO 2で37℃のインキュベーターにチャンバースライドカバーと場所との寄生虫に感染したカバーチャンバースライドに侵入し、PVを確立する寄生虫のための時間を可能にする。
  5. 用量滴定のための滅菌チューブでD10培地1ミリリットル中のLPSおよびIFN-γの希釈液を作る。用量について滴定はLPSまたはIFN-集中定数のいずれかを保持し、他の40の刺激変わる。
    1. 例えば、1ml当たり10 ngのLPSでLPSを一定に維持し、IFN-γ(0、1単位/ ml、10単位/ ml、100単位/ mlの1000単位/ ml)の濃度を変化させる。 IFN-mlの100単位/時定数γ及びLPS(0、0.1 ng / mlで、1 / mlの、10 ng / mlで、100ng / mlの)の濃度を変化させる保つ。 2分間簡単に言うと超音波処理LPS在庫なし希釈前の風呂超音波処理(しないと先端超音波処理)で加熱。
      注:超音波処理して細胞をホストするために適切に結合しないことが、LPSによって形成されたミセル凝集体を崩壊させることをお勧めします。
  6. チャンバースライド内寄生虫と接着性のマクロファージの間の共培養開始後4時間、各チャンバー内D10メディアを破棄し、IFN-γとD10メディアにおけるLPSの適切な希釈液300μlのと交換してください。マクロファージ活性化の非存在下で寄生虫の複製を評価するための唯一のD10メディアとの制御を含む。
  7. 24~30追加の時間、5%CO 2、37℃でインキュベーター中にチャンバースライドカバーと場所での再カバーチャンバースライド。
    注:インキュベーション時間は、寄生虫株に応じて6~12時間の範囲であることができる野生型寄生虫株の倍加時間に依存する。時点は、ナイーブマクロファージの溶解を寄生虫の前に、少なくとも3~4堂を可能にするのに十分な長さに選択されるブリンブリン回。
  8. ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の2.5%ホルムアルデヒド溶液を作る。チャンバースライドでメディアを破棄し、2.5%ホルムアルデヒド溶液300μlで交換してください。室温で20分間固定してください。
  9. 室あたりPBS300μlのリンススライド(S)を2回。各すすぎのために、スライドにPBSを破棄して、スライドに付着したマクロファージの中断を避けるために、各スライドチャンバーの内面まで優しく新しいPBSを追加。染色前に乾燥からスライドを防止するために、チャンバースライド上室と場所カバーあたり300μlのPBSを追加します。
    注:スライドを染色前に、この時点で3日間まで4℃に置くことができる。
  10. T.ための染色プロトコル免疫蛍光顕微鏡(IFA)によるトキソプラズマ検出。
    1. PBS中0.2%トリトンX-100溶液(透過化緩衝液)を行う。トリトンX-100溶液になることを確認するために37℃の水槽と簡単にボルテックスその中にチューブ内の溶液を配置します。捨てるチャンバースライドでPBSおよび透過化バッファー300μlで交換してください。室温で30分間のままにしておきます。
    2. (ブロッキング溶液)PBS中10%ヤギ血清の溶液を作る。スライドで透過化バッファを破棄し、室あたりのブロッキング溶液300μlで交換してください。室温で30分間のままにしておきます。
      NOTE:ウシ胎児血清は、全ての染色プロトコルでヤギ血清の代わりに使用することができる。
    3. Tに、蛍光標識抗体の千希釈:1ステップIFA染色プロトコルの場合、1を作るブロッキング溶液中でトキソプラズマ 。スライドからブロッキング溶液を除去し、室あたりの抗体溶液150μlを添加する。乾燥から細胞を防ぐために、チャンバースライド上のカバースライドを取り付けます。室温で1時間インキュベートする。
      (注)抗体濃度は経験的にソースに応じて決定されなければならない。抗体は、直接蛍光色素にコンジュゲートし、ユーザが蛍光色素にコンジュゲート購入される。
      1. 二段階IFA染色用Tにコンジュゲートしていない抗体を用いたプロトコルT.に対する非標識一次抗体を150μlとトキソプラズマと、蛍光結合二次抗体、染色スライドRTで1時間ブロッキング緩衝液でトキソプラズマ 。 300のPBSμlの+ 1%ヤギ​​血清(洗浄バッファー)で3回洗浄します。
      2. 一次抗体のための起源の種に特異的な蛍光結合二次抗体を150μlを追加します。乾燥から細胞を防ぐために、チャンバースライド上のカバースライドを取り付けます。室温で1時間インキュベートする。
    4. リンススライドをPBS + 1%ヤギ​​血清(洗浄バッファー)で3倍。各すすぎのために、その内容をダンプすることでチャンバースライド内の溶液を除去し、洗浄バッファーを300μlと交換してください。
    5. リンススライドをPBS300μlの2倍。
    6. 製造元の指示に従ってチャンバースライドからチャンバを削除します。
    7. マウントは、DAPIを含むメディアをマウント(4'6ジアミジノ-2-フェニルと摺動インドール、ジラクテート)と22ミリメートル×50 mmのカバースリップ。
  11. 位相コントラストおよび蛍光顕微鏡を用いてスライドを調べます。ウェルチャンバー100のPVの最小値を調べることにより、空胞あたりの寄生虫の平均数を決定します。スクリーンのためのIFN-γ及びLPSの選択された投与量は、野生型原虫( 図1参照)の複製を抑制するのに十分である必要があるが、防止できない。

感染マクロファージのフィットネス欠陥に続いて活性化にパラサイト変異体の2の分離

注:ランダムT.のライブラリトキソプラズマ変異体はフォワード遺伝学の画面に必要です。 Tのランダム突然変異誘発トキソプラズマは、化学(JPN / EMS)または挿入突然変異27,28,38により行うことができる。限界希釈法による変異導入、クローン寄生虫に従い、D10培地32,38の200μlの容量で付着HFF細胞を含む96ウェルプレートの個々のクローンを成長させる。これは、顕微鏡によるマクロファージにおける寄生虫のスクリーニングのための96ウェルプレートは、微細なスクリーニングを可能にする光学底部を有していることが重要である。スクリーニングのための位相コントラストおよび蛍光顕微鏡は、96ウェルプレートを染色し、長い作動距離を備えた位相コントラスト4、10、20または40倍対物レンズを有する倒立蛍光顕微鏡を必要とする。 4Xの目的は、全体をよく見てするのに便利ですが、寄生虫の優れた分解能は20倍の対物レンズを用いて達成される。

  1. 転送は、二つに96ウェル組織培養プレート中コンフルエントHFF細胞中で増殖させタキゾイト変異体の50μlをD10培地100μl中のマウス骨髄由来マクロファージ(単離後1~2週間)を含む96ウェルプレートを複製。
    注:各ウェルごとに転送寄生虫の数をカウントすることを避けるために寄生虫の培養物の容量に基​​づいて、寄生虫の96ウェルプレートで初期画面を行います。したがって、2.6で顕微鏡分析はwhethに定性的基づいていますER寄生虫は一般に複製または複製されていません。ステップ3は、マクロファージを感染させるために、野生型または変異寄生虫の等しい番号を使用してチャンバースライド内の変異体の表現型を確認するためのアプローチについて説明します。
    1. 直接各ウェルにすでにD10メディアに寄生虫を追加します。寄生虫複製のための陽性対照として、野生型タキゾイトとの2つのウェルに感染する。
  2. 寄生虫の細胞に侵入し、そのPVを作成するための時間を可能にするために4時間、インキュベーター(37℃、5%CO 2)に感染した細胞を置く。
  3. プレートの内容をダンプすることで1プレートからメディアを取り出します。寄生虫のための殺洗剤を含んだ廃棄盆地にプレート内のメディアをダンプする手首のシングルフリップを使用してください。
    1. メディアのための滅菌流域およびマルチチャンネルピペットを使用して「マクロファージ活性化媒体」100μlのを追加。 Mac用のステップ1から決定された最適LPSの濃度及びIFN-γを使用してくださいrophage活性化媒体。同様に、重複した制御板からメディアを削除し、D10メディア100μlで交換してください。
  4. 追加の24〜30時間のためのインキュベーター(37℃、5%CO 2)に感染した細胞を置きます。
  5. IFAのために96ウェルプレート用の染色プロトコル。
    1. プレート内のメディアを破棄し、PBS中の2.5%ホルムアルデヒド100μlで交換してください。室温で20分間インキュベートする。ホルムアルデヒドとマルチチャンネルピペット用の無菌の流域を使用してください。
    2. プレート内のホルムアルデヒド溶液を捨て、プレートからのホルムアルデヒドをすすぐために100μlのPBSを追加します。
    3. プレート内の溶液を捨て、各ウェルに(0.2%トリトンX-100を含むPBS)透過化緩衝液100μlを追加します。 RTで30分間インキュベートする。
    4. プレート中の溶液を捨て、各ウェルにブロッキング溶液を100μl(10%ヤギ血清を含むPBS)を追加します。 RTで30分間インキュベートする。
    5. P内の溶液を捨て、後半。 50μl/ウェルの蛍光結合抗Tを追加トキソプラズマ抗体が1に希釈:PBS中千+ 1%ヤギ血清。上のロッカー上のプレートカバーで室温で1時間インキュベートする。
      1. 代わりにT.に対する非標識一次抗体を使用する1.10.3.1で説明したように、蛍光標識二次抗体で染色したトキソプラズマ
    6. プレート内の抗体溶液を捨て、100μl/ウェルのPBS + 1%ヤギ​​血清と交換します。単独のPBSで2追加のリンスに続いてこのすすぎ3回実行します。各ウェルに200μlのPBSのままにして、乾燥から井戸を防ぐために、96ウェルプレートにカバーを交換。
      注:パラフィルムで包み、前顕微鏡による分析まで4℃で3日間置くことができる上にカバープレート。
  6. 20-40X対物レンズを用いて、倒立蛍光顕微鏡下で細胞を調べます。 &NA中で複製変異体を選択#239;マクロファージプレートVEのが、主に「活性化マクロファージ」の1寄生虫/液胞を超えて複製したり、それが「活性化マクロファージ」のアモルファスまたは劣化表示されない。
    注:空胞あたりの野生型寄生虫の数は理想的にIFN-γおよび使用LPSの投与量に依存するが、ウィルは液胞あたり約4寄生虫です。成長抑制ではなく、活性化の刺激による複製の完全な阻害を反映している数。

欠陥が感染マクロファージの活性化に続いてパラサイト生存または複製のレベルにあるかを判別するために3変異体を評価

  1. 転送は、HFF細胞を含む96ウェルプレート(ウェル全体の内容)からT25sの寄生虫の変異体を選択し、複製を可能にする。
  2. 培養骨髄由来マクロファージO / N D10培地250μlの中で3×10 5細胞/ mlの濃度の8チャンバースライドガラスにおいて。 PAを比較するために1スライドを準備ナイーブマクロファージおよび感染したマクロファージの活性化以下の寄生虫の複製を比較するための追加のスライドでrasite複製。
  3. 収穫タキゾイト寄生虫と血球計数器でカウントされます。 5×10 4 Tを追加よく4時間D10メディアと文化のマクロファージを含むチャンバに寄生虫をトキソプラズマ 。対照として、野生型親の寄生虫を持つつのウェルを含めます。ナイーブマクロファージにおける寄生虫の複製を監視するために、活性化メディアを受信しません同じ寄生虫クローンと同一の複製スライドを接種する。
  4. 複製チャンバースライドの1からD10メディアを破棄し、「活性化メディア」を250μlと交換してください。他の複製室スライドからD10メディアを破棄し、D10メディア250μlのと交換してください。上のチャンバースライドカバーを「活性化」と「ナイーブ」マクロファージスライドの両方をインキュベートadditi 37℃、5%CO 2で角項24〜30時間。
  5. ステップ1で説明したように、完全な室でIFA染色を実行し、修正透過性、およびIFA染色および寄生虫の分析のためのブロックをスライド。
    1. Tに膜結合1(LAMP1)またはリソトラッカーと抗体をリソソームする抗体との共染色細胞感染したマクロファージの活性化はリソソーム(図4)との突然変異体のPVの融合を引き起こしているかどうかを評価するためのトキソプラズマ
    2. 初期のマクロファージ活性化28以下明らかである寄生虫の変異体の変化を識別するために、IFAによる染色のための寄生虫/ PV内の特定の区画/オルガネラに対する抗体を使用してください。
      注:このような変化は、マクロファージ活性化に続いて、変異体の欠損生存/複製の根底にあるメカニズムへの洞察を提供することができる。
  6. 100X相油目的と蛍光顕微鏡を用いてスライドを調べます。
    1. 決定することにより、寄生虫の複製を評価100ランダム液胞におけるPVあたりの寄生虫の数。統計分析のために100液胞それぞれの少なくとも2カウントを実行します。
    2. 蛍光分析ならびに位相差顕微鏡の両方を用いた一般的な寄生虫の形態を評価する。相100X客観下に表示寄生虫。健康的な寄生虫は寄生虫がしっかりとぴったり寄生虫液胞内に封入されています。相密なリムやアモルファス寄生虫を有するアモルファス広々とした空胞を持っている寄生虫は寄生虫の死ではなく、複製中だけの欠陥(図1、図3)を提案する。

4.感染マクロファージの活性化に変異寄生虫の感受性が公知の抗微生物メディエーターに関連付けられているかどうかを評価

  1. 野生型C57 / BL6マウスからの骨髄由来マクロファージを分離し、iNOSの- / - 、gp91-phoxの- / -またはIrgm1 / Irgm3 - / -マウス32。
  2. 文化それぞれの骨髄由来のMACrophages O / D10培地250μlの中で3×10 5細胞/ mlの濃度の8チャンバースライドガラスにおいてN。
  3. ステップ3で説明したように寄生虫のチャレンジ、IFA染色、および分析を進めてください。
  4. 生き残るためには、感染したマクロファージの活性化を下記複製する突然変異体の寄生虫の能力はGTPアーゼ28関連活性酸素や窒素種または特異的免疫のない状態で復元されたかどうかを確認します。
  5. 特定の抗菌性メディエーターは、彼らが唯一のマクロファージの活性化28の他のメディエーターと協調して行動した場合HFF細胞またはナイーブマクロファージにおける変異体の寄生虫を損なうかに自分自身では十分であるかどうかを評価するために、そのような酸化窒素供与体としての薬理学的薬剤を使用します。

5.ミュータントパラサイト妥協慢性感染症の欠陥かどうかを評価します

  1. T25s共同で成長させた野生型、変異体または標的遺伝子削除された寄生虫からタキゾイトを隔離HFF細胞をntaining。寄生虫は、新たにHFF培養物から溶解しなければならない。
  2. 血球計数器を用いて寄生虫を数える。腹腔内(IP)注射により200μlの配信寄生虫のサブ致死量mlの適切なあたり濃度のハンクス平衡塩溶液(HBSS)に再懸濁寄生虫。
  3. 200μlのボリュームを腹腔内(IP)との寄生虫を注入する1ミリリットルのツベルクリン注射器と25 G針を使用してください。投与量は、寄生虫の野生型株およびマウスの遺伝子型に依存します。
    注:寄生虫のタイプIの遺伝子型に関係なく、寄生虫線量の感染の急性期の間、マウスに致死的であるとT.のための化学療法の非存在下での慢性感染症の研究のために適切ではありませんトキソプラズマは、寄生虫の複製を抑制することができる。
  4. 三十日寄生虫チャレンジ後、標準サイズのマウスケージは超えない5メートルを含むことができる(混雑していないチャンバー内で加圧タンクからのCO 2の吸入によりマウスを犠牲に氷)頸椎脱臼が続く。
  5. 確立された手順41-43を用いてマウスから脳を分離します。
    1. その前面側にマウスを置きます。領域を滅菌するために70%エタノールでスプレーヘッド。
    2. 脳幹を切断するために、鋭いハサミを使用してください。その後浅い右の周りに横方向にカットし、脳幹のベースから始まる頭蓋骨の左側を作るために解剖ハサミを使用してください。優しく脳を露出するために頭蓋骨をバック剥離する鉗子を使用してください。
    3. 静かに脳を解放するために嗅覚神経を切断するために頭蓋骨の脳とベースとの間脳と場所ハサミを持ち上げる。滅菌ピンセットまたは滅菌PBSの10ミリリットルを含む細菌学ペトリプレートのヘラと場所との脳を持ち上げます。
  6. 右と左半球間の中心を通って滅菌メスで半分に脳をカット。
  7. 1mlのPBSを含む小さな乳鉢に脳の半分を追加します。に乳鉢と乳棒を使用してください広い口径20〜200μlのピペットチップを通過することができる脳の細かい組織懸濁液を作る。
    注:組織切片を組織病理のために必要とされる場合、脳の他の半分は、1時間、2.5%ホルムアルデヒドで固定しなければならない。
  8. 1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに脳溶解物の100μlのを置きます。染色のために、脳のサスペンションを修正するための脳溶解物を含むチューブにPBS中の2.5%ホルムアルデヒドの1ミリリットルを追加します。室温で30分間インキュベートする。
  9. マイクロ遠心中で5分間8000×gで、溶解物を遠心し、慎重に上清を捨てる。
  10. 溶解液(10%ヤギ血清、PBS中の0.2%トリトンX-100)に透過化/ブロッキング緩衝液の1ミリリットルを追加。室温で30分間インキュベートする。
  11. 5分間8000×gで遠心し溶解物および上清を除去。
  12. FITC結合ドリコスbiflorus agglutin(DBA)の200μlのを追加します。 PBS中レクチン+ 10%ヤギ血清の1:100希釈を使用してください。静かにピペッティングにより溶解液を懸濁します。インキュベートRTで1時間。
    注:DBAは寄生虫の嚢胞壁にCST1に結合するリガンドである。
  13. 5分間8000×gで遠心し溶解物および上清を捨てる。ペレットに1mlのPBSを追加します。室温で5分間インキュベートする。 PBS洗浄3回繰り返します。ピペットを用いて最終洗浄後の上清を取り除きます。
  14. 顕微鏡スライド上に染色された脳の溶解物および場所の5μLを策定する広い口径20〜200μlのピペットチップを使用してください。脳溶解物の湿ったマウントを作成するために25×25mmのカバースリップでスライドをマウントします。脳溶解物5μlの各々を用いて3複製スライドを作成します。
  15. 10倍の対物レンズ(図6)を使用して、蛍光顕微鏡で各5μlのアリコート当たり嚢胞の数を数えます。
    注:いくつかは(嚢胞あたり1-2寄生虫)非常に小さいながら、いくつかの嚢胞は(8個以上の寄生虫約)大きい。小嚢胞の数に対する大の各スライドが、文書番号あたりの嚢胞の合計数をカウントします。
  16. 嚢胞DETの数を追加します。脳あたりの総嚢胞の数を推定するために(脳の半分のみが溶解液にした)三つの異なる5μlのアリコートで精製カートリッジ及びx 2、総希釈率を掛けます。

Representative Results

トキソプラズマはナイーブマクロファージ内で自由に複製し、寄生虫の株に依存6-12時間の間の倍加時間を持っています。 図1活性化した骨髄由来マクロファージに対してナイーブで代表的な寄生虫を示している。 図2は、HFFで寄生虫の一般的な形態を示す/ PV 2、4、8、16、32寄生虫で宿主細胞。現在のプロトコルでは、寄生虫はナイーブマクロファージに侵入し、感染したマクロファージの強力な活性化刺激、LPSおよびIFN-の配信に先立って発生期の寄生虫液胞(PV)を、確立するために許可されている。このモデルでは、野生型寄生虫の複製は遅くなりますが、寄生虫の複製はまだマクロファージが徐々に寄生虫複製を阻害でより熟達その時間の間、約24時間にわたって進行する。画面は強力なマクロファージAに必要な時間の間に変更された競争モデルとして機能するように設計されている野生型寄生虫や寄生虫の変異体は、そのPV内で複製し続けることができる時間対ctivati​​on。画面の最初のステップは、感染したマクロファージの活性化のために使用されるLPSおよびIFN-γの用量を選択することである。投与量は、経験的にLPS濃度の範囲またはIFN-濃度(工程1)の範囲のLPSの一定用量と組み合わせて、IFN-γの一定用量のいずれかで活性化マクロファージにおける寄生虫複製を評価することによって決定される。活性化刺激の投与量は、化学的または挿入突然変異による寄生虫変異体の作成に使用する親の野生型寄生虫のために評価される必要がある。理想的には、LPSおよびIFN-γの用量は、ナイーブマクロファージにおけるPVあたり8-16寄生虫(図1と図2)に比べて24〜30時間活性化した後にPVあたり2-8寄生虫の平均値に寄生虫の複製を可能にする。

LPSおよびIFN-γの適切な濃度一度^7;決定され、変異体は、96ウェルオプティカルボトム組織培養プレート中でスクリーニングされる。従来の組織培養プレートのために使用されるプラスチックの凹凸が困難位相コントラストおよび蛍光顕微鏡によって寄生虫をスクリーニングするために適切な解像度を実現することができるので、プレートの光底が重要である。 96ウェルプレートの位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡検査も長い作動距離を備えた位相コントラスト4、10、20、または40×対物レンズを有する倒立蛍光顕微鏡を必要とする。変異体は、マウス骨髄由来マクロファージを含むレプリケートプレートでスクリーニングされる。寄生虫変異体によるチャレンジ後に、一方のプレートのウェル中の感染マクロファージは、感染したマクロファージを含む他のプレートは、D1​​0培地中で培養しながら、LPSおよびIFN-γを用いて活性化される。プレートを、LPSおよびIFN-γの添加後24-30時間、37℃、5%CO 2でインキュベートする。インキュベーション後、細胞を第あるXED、寄生虫のために染色し、蛍光および位相差顕微鏡の両方を用いてIFAによって分析した。変異体を、通常の寄生虫番号やナイーブマクロファージでの複製より少ない寄生虫または活性化されている感染したマクロファージにおけるより少ない寄生虫と小さい液胞を持っているものが選択される。変異体が選択されると、それらは、高倍率(100倍対物レンズおよび油)で寄生虫の形態の分析を可能にし、それらがナイーブなマクロファージにおける通常の複製を持っていることを確認するために、2つの独立した実験において、ナイーブ及び活性化マクロファージにおけるチャンバースライド(ステップ3)に再スクリーニングされるべきしかし複製/生存の欠陥は、マクロファージ活性化後。

感染したマクロファージの活性化への抵抗に欠陥を持つ変異体の表現型は、一般的に2つのカテゴリに分類されます。形態学的に無傷で表示されますが、PVごとに単一の寄生虫を越えて複製することができない寄生虫。と思われる寄生虫はdegradする編とする非晶質広々のPV(図1および図3)であってもよい。形態および寄生虫の超微細構造とPVは、最高100倍の対物レンズおよび油を用いてスライド上に、蛍光分析と組み合わせた位相差顕微鏡によって観察される。リソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)に対する抗体を用いたIFAのために寄生虫の染色は、変異体における欠陥は、リソソームとの融合を防止するためにPVができないことに関連しているかどうかを決定するために有用である。 図4に示されている大部分は、宿主細胞(LAMP1負)のエンドサイトーシス系から分離されているPVである寄生虫に対してゴリソソーム(LAMP1正)内の寄生虫である。ファゴリソソームは、全体の寄生虫の周りに緊張LAMP1の連続固体リムによって明らかである。これとは対照的に、PVは、多くの場合、付近にリソソーム内小器官が、その周囲にLAMP1染色の連続的な縁を持っています。 T内に定義された構造/細胞小器官への抗体の使用彼は寄生虫および/またはPV感染したマクロファージの活性化に関連する各変異体の異常を識別するためにIFA研究をフォローアップするのに有用である。抗体を用いたこのような取り調べは変異体において複製/生存の欠陥の根底にあるメカニズムへの洞察を提供してもよい。たとえば、 図5は、T 示しているトキソプラズマミトコンドリアは、モノクローナル抗体5F4抗F1 ATPアーゼβサブユニット(ピーター·ブラッドリーからの親切な贈り物)は、野生型寄生虫や寄生虫の変異体に感染したマクロファージの活性化後24時間で染色した。T.トキソプラズマモノクローナルT.で共染色したトキソプラズマ抗体。野生型T.トキソプラズマ原虫寄生虫の周囲に延びる単一のミトコンドリアを有する。感染したマクロファージの活性化に続いて、野生型寄生虫における寄生虫の唯一のミトコンドリアは、変異体の寄生虫で断片化されたミトコンドリアに比べて無傷であった。ミトコンドリアの断片化だけではなく、劣化/アモルファスで明らかであった寄生虫も、位相差顕微鏡により評価される正常な形態を示した寄生虫である。これは、寄生虫変異体における欠陥は、マクロファージの活性化によって誘導される細胞メディエーターをホストする寄生虫ミトコンドリアの感受性を高めることを示唆している。

現在のモデルは、感染したマクロファージを活性化するために、IFN-γとLPSの組み合わせを使用しています。 IFN-γは、転写因子STAT1を刺激する。 LPSは、TNF-αのように、転写因子NF-κBを刺激する。 T.に対する細胞自律的な免疫における重要な既知のIFN-γ依存性の抗菌性メディエータートキソプラズマは、他のエージェントに加えて、IFN-γ依存性の免疫関連GTPアーゼの配列(IRGs、Gbps)の反応性窒素と酸素種を含む。各変異体の欠陥は、具体的に骨髄由来マクロファージから単離される、誘導性抗菌性メディエーターγ既知のIFN-γの産生と関連しているかどうかを決定するためにiNOSの- / - 、GP 91 PHOX - / -または特定のIRG / GBP遺伝子欠損マウスと変異寄生虫に対する活性についてアッセイした。感染したマクロファージを活性化するためのIFN-γとLPSの組み合わせは、優先的に、野生型寄生虫28に比べて一酸化窒素に強化された感受性を有する突然変異体になる。

感染したマクロファージの活性化は、タキゾイトから組織嚢に含まれるブラディゾイトへの寄生虫の段階の分化を誘導することができる。このような嚢胞は慢性感染症の特徴である。このため、感染したマクロファージの活性化に続いて複製/生存のために欠陥がある寄生虫の変異体はまた、インビボ感染の間嚢胞への変換のために欠陥がある可能性があります。慢性感染中嚢胞産生を評価するために、マウスを、親の寄生虫株または変異体クローンの非致死量の腹腔内(ip)にチャレンジする。 10未満の大きさの脳の範囲内嚢胞_6;50μmを超えると、直径メートル、図6に示すようにIFAによって大小嚢胞の数を数えるが、寄生虫の変異体は、総嚢胞生産のためか、単に確立のために損なわれているかどうかを判断するために区切るカウントを保つと大きな嚢胞のメンテナンス。

図1
図1.ナイーブマウス骨髄由来マクロファージは、Tの複製を許容するトキソプラズマが、IFN-γで活性化およびLPSは、実質的に複製を阻害する。(A)野生型Tの寄生体胞(PV)ナイーブマウス骨髄由来マクロファージの浸潤後にトキソプラズマ·24時間(B)野生型TのPV感染したマクロファージの活性化の後に液胞24時間ごとに4つの寄生虫からなるトキソプラズマ寄生虫。(C)は 、1つの寄生虫/ PV感染したマクロファージの活性化後24時間でまだ複製することができ及び変異寄生虫の例(D)に感染したマクロファージの活性化後にアモルファスPV 24時間以内に分解見える変異寄生虫の例。一番上の行は、寄生虫の位相画像を示し、下段はT.に対するポリクローナル抗血清を用いた蛍光画像を示すトキソプラズマ 。スケールバーは5μmで表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
PVあたりの寄生虫の数で評価し、図2パラサイト·レプリケーション。写真は、HFF細胞におけるPVあたり2、4、8、16、32寄生虫を示している。各画像は、マージされた位相画像番目ですATは、赤で寄生虫と青(DAPI)でHFF核のポリクローナル抗体染色を示す。スケールバーは5μmで表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3変異体は、感染したマクロファージの活性化後の表現型の範囲を示す。左側の列は、マクロファージにおける寄生虫の位相画像であり、中央の列はT.に対する抗体を用いた蛍光画像であるトキソプラズマ原虫 、右の列は、位相と蛍光画像のマージです。寄生虫は、緑と青マクロファージ核に示されている。スケールバーは5μmで表しています。 拡大表示するには、ここをクリックしてくださいこの図のバージョン。

図4
図4. LAMP1染色はphagolysomes含有寄生虫からのPVを区別する。寄生虫は、ポリクローナル抗Tで染色されるトキソプラズマ抗体(赤)およびmAb 1D4B(緑)とLAMP1。矢印はリソソームと融合している寄生虫PVをマークします。矢印のない寄生虫はリソソームと融合していない寄生虫液胞(PV)である。スケールバーは5μmで表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5.野生型寄生虫はmitochondriしばらくそのままミトコンドリアを維持感染したマクロファージの活性化以下の寄生虫の変異体で分解される上。三つの異なる変異体Tに比べ、野生型寄生虫におけるミトコンドリア(緑)(上のパネル)感染したマクロファージの活性化の24時間後に劣化の異なる段階で寄生虫トキソプラズマ (下の3つのパネル)。スケールバーは5μmで表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
レクチンbiflorus FITC結合ドリコスを使用して、脳内の寄生虫の嚢胞の図6.検出。レクチンで標識された嚢胞壁は緑で表示されます。スケールバーは、50μmを表します。 より大きな版?を見るにはこちらをクリックしてくださいこの図のnである。

Discussion

記載されたプロトコルは、Tを分離するために、マウス骨髄由来マクロファージおよびフォワード遺伝学の活性化を使用して偏りのないアプローチを提供彼らの能力の欠陥とトキソプラズマ変異体は、感染したマクロファージの活性化を生き残るために。マクロファージ活性化に続いて突然変異体の表現型は、一般的に2つのカテゴリのいずれかに分類されます。1)寄生虫はそのまま表示されますが、PVあたり1寄生虫を超えて複製することができない。 2)寄生虫が劣化表示され、広々とした、アモルファスのPVであってもよい。変異体は、活性化の非存在下でナイーブなマクロファージにおける野生型寄生虫のような表現型を持っているという事実は、プロトコルは、特異的にマクロファージ活性化に抵抗する能力が損なわれている突然変異体を同定するために用いることができることを証明。一次骨髄由来マクロファージの使用は、画面用のRAW 264.7マクロファージ細胞株に対して推奨されますので、バキュあたり寄生虫や寄生虫の数の形態オレフィンは、より容易に、骨髄由来マクロファージにおいて可視化される。

フォワード遺伝学と組み合わせて説明した画面には、寄生虫の遺伝子と細胞自律的な免疫の特定のメディエーターへの抵抗のための重要な最終的に遺伝的経路を分析するための多目的なツールを提供しています。このようなフォワード遺伝学の研究は、 インビトロおよび発病中の両方で特定の抗菌性メディエーターに抵抗するための重要な寄生虫経路の解明を開始する文字列のように続くことができる寄生虫の遺伝子を同定するために重要である。フォワード遺伝的アプローチを用いた以前の難しさは、各変異において破壊キー遺伝子の同定した。 Tのコスミドライブラリーの相補性トキソプラズマは、細胞分裂変異体の機能的相補性のために非常に有効であった。しかし、野生型原虫の複製はまた、単に変異体より少ない程度にIFN-γ及びLPSによって抑制されているという事実は、機能的相補性はより困難になる股関節細胞分裂変異体用のn。 Tの化学的および挿入変異体の両方の全ゲノム変異的プロファイリングトキソプラズマは最近生産性として浮上し、さらにはフォワード遺伝学の画面34,36,37,44における変異体の表現型に関与する遺伝子を特定するために効果的な、大通りコストしている。このため、次世代シーケンシングを使用して全ゲノム変異的プロファイリングは、Tの化学的変異誘発の潜在的な使用を強化しました特定の機能のために重要な遺伝子を同定することを楽しみに遺伝的研究でトキソプラズマ 。現在のプロトコルに記載されているようなフォワード遺伝学的ア ​​プローチは、Tのゲノムの中で最も重要なようであるトキソプラズマは、免疫回避のための重要な候補寄生虫遺伝子の同定を支援する可能性のある他の遺伝子または機能ドメインへの相同性を有していないと予測遺伝子の大部分を持つ仮想的なままである。

96ウェルプレートのIFA解析は、一般的に満たし、ハイスループットスクリーニングとはみなされないHOD。一人が一日または約960変異体では10 96ウェルプレートを染色し、画面する我々の経験では、それは合理的である。 Skariah らの論文では、約8000の変異体を分析し、14の独立した突然変異体はかなりアクティブ化ではなく、ナイーブマクロファージ28で生存/複製のために損なわれたことを単離した。突然変異体の減損生存率は主に一酸化窒素に対する感受性の増加の結果であった。全体的な方法には​​限界が主に寄生虫の単一クローンを得るのではなく、96ウェルプレートの最初の画面は、定性的かつ合理的に迅速であるように、顕微鏡によってスクリーニングのレベルである。 96ウェルプレートの画面で特定された変異体の表現型の確認は、チャンバースライド中のマクロファージを用いた定量的および定性的な分析によって、ステップ3で野生型または変異寄生虫の等しい数を追加することによって追跡される。他の分析のスクリーニング方法の使用そのような寄生虫の総人口レベルではなく、個々の寄生虫レベルでの蛍光測定などの顕微鏡法によって評価されるよう、T.に対するポリクローナル抗体を用いた劣化した寄生虫染色のような多くの現在のプロトコルに問題がある変異体の差がfluoresence強度のレベルでの定量的よりも定性的なものと同様に、確実に、野生型寄生虫としてトキソプラズマ 。また、後の時点ではあるが、野生型寄生虫の抑制複製で感染したマクロファージの活性化への抵抗の欠陥を有する変異体を分離するために必要なIFN-γおよびLPSの投与量。したがって、発光寄生虫の使用を含むフォワード遺伝画面の総寄生虫数の測定には問題がある。しかし、化学的または挿入突然変異のために用いる親寄生虫クローンは、構成的または誘導性蛍光またはルシファーを発現した場合に、染色プロトコルがスクリーニング工程で取り除くことができることが可能であるマーカーASE。 96ウェルプレート中のマクロファージのIFAと顕微鏡スクリーニングを用いて説明したプロトコルは、活性化マクロファージにおける生存/複製に欠陥のある変異体の単離を可能にするが、それはまた、明らかに実現可能な96ウェルプレートフォーマットなどを使用して制限された微細な解像度のためにいくつかの潜在的な変異体を外すこの解像度で寄生虫抗原を染色アモルファス腫れ空胞は正常なPV内の健全な複製寄生虫と間違われることがあります。 96ウェルカバーガラス板の代わりに、光学面96ウェルプレートの置換は、96ウェルプレート中で、感染マクロファージの画面中に高い解像度を達成する可能性がある。

寄生虫侵入次マクロファージを活性化するために記載されたプロトコルでIFN-γ及びLPSを用いて同定された変異体の大部分は、酸化窒素28から自らを保護する能力の欠陥を有している。この点において、スクリーンは、非バイアスされることを意図しているが、活性化条件、タイプ、およびマクロファージの種及びスクリーンのために選択されるマクロファージ活性化に寄生虫侵入の相対的なタイミングに応じて、特定の抗菌性メディエーターに対する増加した感受性を持つ寄生虫変異体の単離のために濃縮することができる。このように適用される画面と活性化刺激のために選択された先天性免疫細胞は、得られた寄生虫の変異体が影響を受けやすい可能性が高いために、抗菌性メディエーターの種類に影響を与える重要なパラメータである。寄生虫の遺伝子型は、寄生虫の私は遺伝子型タイプとしても重要なパラメータでタイプIIおよびIII遺伝子型は26,45,46より受けている間、IFN-γに応答して誘導免疫関連分子量GTPase(IRGs)に比較的耐性がある。記載されているプロトコルでは、マクロファージは寄生虫の侵入後に活性化されている。タイプIIの遺伝子型が、記載画面で使用Prugnaud株は、免疫関連GTPアーゼの作用を受けやすい、llowingマクロファージに侵入する寄生虫は最初IRGsの完全な誘導前の野生型寄生虫の複製を可能にする。また、IRGsそれらが浸潤及び複製の開始寄生虫に続いてマクロファージにおいて誘導される場合に寄生虫に対して有効であることは明らかではない。

記載されているプロトコルは、細胞自律的な免疫、特に一酸化窒素のIFN-γ依存性メディエーターへの抵抗のために重要な寄生虫遺伝子を同定するためにマクロファージを使用しています。一酸化窒素に著しい感受性だけでなく、一酸化窒素に依存するミトコンドリアの断片化の共有表現型を共有する寄生虫変異体のプールの単離は、一酸化窒素に対する抵抗性と理解のための重要な寄生虫遺伝子および経路を特定するためのツールのユニークなセットを提供します一酸化窒素の作用をより広範にT.に対してトキソプラズマと小さな修正を加えて他の真核pathogens.The記載のプロトコルは、順遺伝studieに使用することができ細胞自律性免疫の別のメディエーターに対する耐性の重要な寄生遺伝子を同定するための。潜在的な変更は、侵略を寄生虫に感染した宿主細胞の種類、活性化刺激、または活性化の相対的なタイミングを変更することを含む。例えば、寄生虫の添加前に、IFN-γとマウスマクロファージの事前活性化は免疫関連GTPアーゼの活性化をもたらすでしょう。このようなモデルは、TのタイプIの遺伝子型における寄生虫遺伝子を同定するために使用することができる免疫関連GTPアーゼ24,25にROP18とROP5によって仲介抵抗に寄与する可能性がトキソプラズマT.に対する細胞自律的な免疫のメディエーター人間の自然免疫細胞におけるトキソプラズマは、同様に、げっ歯類のように定義されていない。したがって、ヒト末梢血単核球の使用は、T.の化学的変異体をスクリーニングするトキソプラズマは、寄生虫の自然免疫細胞におけるヒト感染時の生存のために重要な遺伝子ならびにFOヒトでの重要なメカニズムの両方を識別可能性がありますTにR抗菌薬耐性トキソプラズマ 。特定の抗菌性メディエーターに対する抵抗性のための重要な寄生虫の遺伝子は、例えば、反応性酸素または窒素種のような薬理学的物質に感染した宿主細胞の暴露に耐えることができない変異体を単離することによって同定することができる。同様に、プロトコルが活性化47-49またはマクロファージプリン受容体50のATP刺激をソームに対する感受性の増大で寄生虫の変異体を分離するために変更することができます。

総合すると、プロトコルは、T。のために重要な寄生虫の変異体を単離するためのフォワード遺伝学と先天性免疫細胞を用いたアプローチを説明IFN-γ依存性細胞自律的な免疫にトキソプラズマ抵抗。重要なことに、このアプローチは、条件encounteを強調するために汎用性があり、容易に特定の抗菌性メディエーターを回避するための重要な寄生虫遺伝子を単離するために変更することができ、宿主細胞または抵抗の特定の種類の寄生虫の生存出すトキソプラズマ症の間に赤い。さらに、多くの場合、宿主細胞の活性化に抵抗するための重要な寄生虫の遺伝子はまた、感染の間にインビボで嚢胞生産に直接的または間接的な役割を果たし得る。

Materials

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Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab Fitzgerald Industries International 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

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References

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