Array sigillabile Femtoliter camera di Biologia gratis-Cell

Bioengineering
 

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Norred, S. E., Caveney, P. M., Retterer, S. T., Boreyko, J. B., Fowlkes, J. D., Collier, C. P., Simpson, M. L. Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology. J. Vis. Exp. (97), e52616, doi:10.3791/52616 (2015).

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Abstract

Sistemi cell-free forniscono una piattaforma flessibile per sondare le reti specifiche di reazioni biologiche isolate dalla condivisione delle risorse complesso (ad esempio, l'espressione genica globale, la divisione cellulare) incontra all'interno di cellule viventi. Tuttavia, tali sistemi, utilizzati in macro-scala reattori massa tradizionali, spesso non riescono a mostrare i comportamenti dinamici e le efficienze caratteristici delle loro controparti micro-scala di vita. Capire l'impatto della struttura cellulare interna e la scala sulla dinamica di reazione è cruciale per comprendere reti geniche complesse. Qui riportiamo un dispositivo microfabbricazione che limita le reazioni cell-free dei volumi scala cellulare, consentendo caratterizzazione flessibile del sistema molecolare chiuso. Questo poli multistrato (dimetilsilossano) (PDMS) dispositivo contiene camere di reazione femtoliter dimensioni su una membrana elastomerica azionabile (aperto e chiuso). Quando azionato, le camere di confinare proteine ​​della cellula-Free Sintesi (CFPS) reazioniesprimendo una proteina fluorescente, permettendo la visualizzazione della cinetica di reazione nel tempo utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse. Qui mostriamo come tale dispositivo può essere utilizzato per misurare la struttura di rumore di reazioni CFPS in un modo che è direttamente analogo a quelli utilizzati per caratterizzare sistemi cellulari, consentendo così l'impiego di tecniche di biologia rumore utilizzate in sistemi cellulari di caratterizzare circuiti gene CFPS e loro interazioni con l'ambiente privo di cellule.

Introduction

Sistemi cell-free offrono una piattaforma semplificata e flessibile per la visualizzazione di reazioni biologiche privo di fattori di complicazione, come il fitness, la divisione, e mutazione che sono inevitabili nello studio delle cellule viventi. Tali approcci sono stati impiegati per studiare sistemi cellulari compresa la caratterizzazione delle proteine ​​di membrana 1, l'ispezione delle interazioni proteina 2, e l'esplorazione degli aspetti fondamentali della traduzione 3-7. Recentemente sistemi cell-free hanno cominciato a prendere piede come piattaforme praticabili per la biologia sintetica 8-10. L'appello di questi approcci è che liberano biologia sintetica dalla condivisione delle risorse e 'il rumore estrinseco' che colpisce dinamica di reazione nelle cellule viventi. Tuttavia non è ancora chiaro come l'ambiente fisico in cui le reazioni cell-free sono incorporati influenza la progressione e l'esito della reazione. Ambienti di reazione senza cellulare - biente particolarmente limitatiEnt che si avvicinano volumi cellule rilevanti - rimangono poco caratterizzati. Protein Cell-libero Synthesis (CFPS) è convenzionalmente pensiero di come 'gratuito scala,' esibendo cinetica equivalenti in tutta una serie di microlitri per volumi di reazione litro scala 11. Tuttavia, confinanti reazioni a volumi scala cellulare ha dimostrato di influenzare in modo significativo i tassi di espressione proteica 12.

La natura stocastica di reazioni cell-free - soprattutto in quanto questi approccio di sistema o anche andare sotto femtoliter volumi - possono essere di particolare importanza. Rumore in espressione genica è una struttura fortemente influenzato dal confinamento come piccoli volumi cellulari e alta densità di componenti forzare molte delle molecole importanti da livelli molto bassi di popolazione - per esempio Escherichia coli confini all'interno di un volume 1 fl ben 4.300 differenti polipeptidi sotto il controllo inducibile di diverse centinaia di diversi promotori 13. Questo rumore intrinseco è stato implicato come una forza trainante centrale in numerosi processi biologici, tra cui chemiotassi 14, la decisione di HIV tra la replicazione attiva e la latenza 15, la decisione di λ fago tra lisi e lisogenia 16,17, e la decisione di Bacillus subtillus tra competenza e sporulazione 17. Senza cellulare biologia sintetica fornisce quindi sia la possibilità di esplorare le proprietà stocastiche dei circuiti genici cellulari e reti, e manipolare questi comportamenti per raggiungere obiettivi tecnologici specifici. Mentre il comportamento di rumore dei sistemi cellulari è stato ben studiato 18-27, c'è stato poco esplorazione del comportamento acustico fondamentale dei sistemi acellulari 8, in particolare a livello cellulare.

Qui vi presentiamo una piattaforma per lo studio degli effetti stocastici in cell-free biologia sintetica. Questa piattaforma microfabbricazione contiene femtoliter scala reazione cHambers che possono essere rapidamente la transizione tra aperto (libera diffusione in e fuori dalla camera) e chiusi (reagenti confinati all'interno della camera) stati. Nello stato di chiusura, ci limitiamo cellule-Free sintesi proteica (CFPS) reagenti che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP), e seguiamo espressione genica utilizzando time-lapse microscopia a fluorescenza 28 (Figura 1). Abbiamo caratterizzare questo ambiente privo di cellule misurando la struttura delle fluttuazioni stocastiche nell'espressione genica in modo direttamente analogo a quelli utilizzati per caratterizzare cellule 25. Metodi non microfabbricazione per confinare reazioni cell-free sono vescicole e liposomi 29-32, emulsioni acqua in olio, 12 e 33 mezzi porosi. Tuttavia, mentre questi metodi possono fornire un controllo sulla distribuzione delle dimensioni dei volumi confinati 34, metodi di microfabbricazione creano caratteristiche altamente riproducibili con dimensioni strettamente specificate, anche su scala nanometrica.Inoltre, queste strutture rigide possono essere facilmente monitorati nel tempo senza essere suscettibile di evaporazione o cambiamenti nell'ambiente esterno. Disegni container microfabbricati utilizzati nel precedente 8,35 lavoro non può sigillare rapidamente le camere di reazione seguente reazione iniziazione, complicando la chiara attribuzione del tempo in cui è stata avviata la reazione (tempo zero). Utilizzando il metodo qui presentato, solo 4-5 min sono necessari tra l'inizio e la visualizzazione della reazione sul dispositivo, fornendo così una ben definita "tempo zero". I seguenti protocolli descrivono i metodi di fabbricazione e collaudo di questo dispositivo, compresa la litografia ottica, il montaggio del dispositivo, il test del dispositivo, e metodi per l'analisi delle immagini.

Protocol

1. litografia ottica Masters dispositivo

  1. Disidratare wafer di silicio puliti su un piatto caldo a ~ 250 ° C per almeno 1 ora.
    NOTA: E 'buona norma utilizzare più di un wafer durante la preparazione di un maestro, in caso di errore dell'utente.
  2. Preparare aliquote photoresist. Preparare aliquote di entrambi SU-8 2015 photoresist e una diluizione di SU-8 2015 photoresist in rapporto 2: 1 usando SU-8 diluente come diluente.
    NOTA: Circa 1 ml di photoresist è necessaria per-spin rivestimento uno wafer.
  3. Preparare tre modelli di maschera per la produzione di questi maestri. Per la membrana Maestro, preparare due maschere: una patterning il canale di membrana e l'altra patterning le camere di reazione. Per il maestro valvola di controllo, di preparare un solo modello di maschera.
    NOTA: Per ulteriori dettagli sulle tecniche litografiche, tra cui maschera patterning, vedi Ito e Okazaki, 2000. 36 Cfr Fowlkes e Collier, 2013 per una descrizione più dettagliata del design del dispositivo 37.
  4. Preparare la membrana Maestro
    1. Spin-coat 2: 1 SU-8 diluizione 2015 photoresist su wafer a 1.000 rpm per 45 sec.
    2. Wafer cuocere morbide a 95 ° C per 2 min. Utilizzando un assetto contatto, esporre wafer con modello di canale a membrana per 10 secondi, ed eseguire una cottura post-esposizione per 2 minuti a 95 ° C.
    3. Sviluppare wafer in SU-8 sviluppatore per 1 min, o fino residui photoresist viene rimosso. Risciacquare wafer con isopropanolo, muovendo dall'alto verso il basso. Wafer lavaggio con azoto, ancora muovendo dall'alto verso il basso. Wafer Cuocere in forno a 180 ° C per 4 min.
    4. Spin-coat modellato wafer di nuovo con 2: 1 SU-8 di diluizione a 2.000 rpm per 45 sec.
    5. Morbido bake modellato wafer per 2 minuti a 95 ° C. Utilizzando contatto assetto, allineare wafer fantasia con pattern camera di reazione, ed esporre per 10 sec. Eseguire post-esposizione cuocere per 2 minuti a 95 ° C.
    6. Sviluppare wafer come descritto al punto 1.4.3. Dopo aver sviluppato e asciugatura wafer, wafer infornare a 180 ° C per 4 minuti.
      NOTA: I wafer possono essere sviluppati nello stesso sviluppatore che è stato utilizzato nel passaggio precedente.
  5. Preparare la valvola di controllo principale
    1. Spin-coat non diluito SU-8 photoresist su wafer pulite a 2.000 rpm per 45 sec.
    2. Morbido bake wafer a 95 ° C per 6 min. Utilizzando un assetto contatto, esporre wafer con pattern valvola di controllo per 10 sec. Eseguire una cottura post-esposizione a 95 ° C per 6 min.
    3. Sviluppare wafer in SU-8 Sviluppatore per 2 minuti, o fino a residuo viene rimosso. Risciacquare con isopropanolo, muovendo dall'alto verso il basso. Wafer a secco con azoto e infornare a 180 ° C per 4 minuti.

2. PDMS di fabbricazione del dispositivo

  1. Silanizzare tutti i maestri con ~ 0,2 ml trimetilclorosilano tramite deposizione di vapore.
    1. Racchiudere rapidamente il maestro in un contenitore ermetico a temperatura ambiente, con qualche goccia di agente silanizzante.
      NOTA:. Altri protocolli silanizzanti possono essere accettabili 38 Se properl eseguitay, il PDMS sarà facile da rimuovere.
  2. Mescolare un poli commerciale (dimetilsilossano) (PDMS) base e induritore in diversi rapporti per entrambe le membrane e gli strati di controllo della valvola del dispositivo, come è stato dimostrato in valvola multistrato simili disegni 39. Usa 20: 1 e 5: 1 rapporti di Base: il catalizzatore per gli stampi delle valvole a membrana e di controllo, rispettivamente.
    1. Per lo stampo membrana, mescolare 10 g di base con 0,5 g di induritore.
      NOTA: Questo volume sarà spin-rivestito sul maestro membrana.
    2. Per lo stampo valvola di controllo, mescolare la base e il catalizzatore in un rapporto di 5: 1. La quantità di PDMS necessarie per modellare la valvola di controllo dipenderà dal contenitore utilizzato per tenere master valvola di controllo; riempire il serbatoio in modo tale che il maestro è rivestita con ~ 1 cm di PDMS.
  3. Miscelare accuratamente sia PDMS preparati, e li de-gas in una camera a vuoto fino a quando non bolle d'aria sono visibili. Posizionare il maestro valvola di controllo in una resistente al calore,contenitore, ad esempio un piatto di vetro. Versare con cautela 5: 1 rapporto di PDMS sul maestro, e de-gas il contenitore una seconda volta.
  4. Mentre il contenitore di controlli PDMS valvola viene degassati, spin-coat 20: 1 rapporto di PDMS sul master membrana versando accuratamente la miscela PDMS sul maestro membrana per minimizzare la formazione di bolle d'aria, poi spin-coating il maestro a 1.000 rpm per 45 sec.
  5. Parzialmente curare sia master in un forno a 80 ° C per 6 minuti per il master membrana 15 min per il master valvola di controllo.
    NOTA: quando parzialmente indurito, il PDMS dovrebbero tenere la sua forma, ma il materiale sarà leggermente appiccicoso. Se PDMS non è ancora guarito, cuocere di nuovo in incrementi di pochi minuti alla volta fino a quando il materiale mantiene la sua forma quando viene premuto.
  6. Tagliare PDMS rettangolari stampi da padrone valvola di controllo, peeling gli stampi dolcemente. Punch fori di ingresso attraverso il componente stampato utilizzando una foratura 0,75 millimetri.
    NOTA: Il foro può essere pulito con l'inserimento di un blun 23 gauget punta dell'ago, e l'esterno dello stampo possono essere puliti con nastro adesivo, se necessario.
  7. Utilizzando un microscopio ottico per individuare le camere di reazione sul master membrana, allineare il componente stampo valvola di controllo con le caratteristiche della membrana camera di reazione e posizionare il componente valvola di controllo direttamente sopra master membrana. Orientare della valvola di controllo verso l'angolo in basso a sinistra del dispositivo, e assicurarsi che le camere di reazione e il canale del maestro membrane sono visibili all'interno della valvola di controllo rettangolare.
  8. Cuocere i componenti stampo allineati a 80 ° C per 2 ore.
    NOTA: Le membrane e controllo stampi valvole saranno ora essere sigillati insieme, e manipolati come uno stampo.
  9. Tagliare il stratificata stampo PDMS dal master membrana, sbucciatura lo stampo dal master molto delicatamente per non perforare la membrana.
  10. Punch ingresso e di uscita fori per l'ingresso estratto cellulare utilizzando una foratura 0,75 millimetri. Punch buchi attraverso entrambi gli strati,e pulirli nello stesso modo come descritto al punto 2.6.
  11. Utilizzando un pulitore plasma accoppiato induttivamente, trattare plasma sia lo stampo (lato membrana up) e un bicchiere coprioggetto No. 0 a 10,5 W per 20 sec. Rimuovere immediatamente il coprioggetto e stampo dal pulitore plasma e strato componenti, lato membrana verso il vetro, cercando di minimizzare sacche d'aria tra il vetro e lo stampo. Non premere direttamente sul canale di ingresso di membrana, o la membrana può ricuocere al vetro, rendendo difficile riempire il canale con reagenti.
    1. Prestare particolare attenzione quando si maneggiano i dispositivi assemblati per evitare di rompere lo strato di vetro. Utilizzare vetrini sottili come il dispositivo deve essere ripreso con il vetrino di vetro con obiettivi ad immersione in olio ad alto ingrandimento - se il vetro è troppo spesso, le caratteristiche dei dispositivi potrebbero non essere visibili.
  12. Infine, curare i dispositivi completati a 80 ° C per 2 ore.

3. Setup sperimentale foR Protein libera-Cell Synthesis reazione

  1. Idrato un dispositivo per ebollizione in acqua deionizzata per 1 ora.
    NOTA: L'apparecchio deve avere un aspetto torbido quando completamente idratata. Dispositivo può anche essere lasciata O / N in acqua sterile a temperatura ambiente per idratare esso.
  2. Utilizzando un microscopio invertito con una camera di incubazione, impostare la temperatura ambiente a 30 ° C.
    NOTA: Questa temperatura è stata scelta per ottimizzare l'espressione di GFP con un promotore T7, quindi le temperature ottimali per altre reazioni possono variare 40.
  3. Dispositivo Mount per microscopio titolare palco con nastro adesivo e avvolgere bordi dispositivo con la carta velina bagnata per mantenere l'idratazione locale.
  4. Utilizzare due a circuito chiuso trasduttori di tensione-pressione alta precisione per modulare la pressione del gas di azoto per l'azionamento della valvola di controllo e l'ingresso del reagente.
    NOTA: Questo protocollo è stato testato solo con azoto a bassa purezza, anche se possono essere utilizzati altri gas inerti.
    1. Collegare il primo trasduttore da24-gauge PTFE tubo ad un serbatoio di acqua contenuta in un flacone di vetro 4 ml con un coperchio setto. Collegare il serbatoio a monte della valvola di controllo con un secondo tubo terminato da un 23 gauge punta smussa dell'ago.
      NOTA: Entrambi i tubi penetrano il setto serbatoio con due taglienti 23 aghi calibro.
    2. Collegare il secondo trasduttore da tubi in PTFE 24-gauge collegato a un maschio maschio-connettore Luer-lok. Collegare ad un Luer-lok 23 gauge connesso con un tubo con un altro 23 calibro punta smussa dell'ago, che viene assemblata singolarmente per ogni dispositivo. Questo ago collega al canale di reazione della membrana; utilizzarla per irrigare l'acqua dal canale di reazione e reagenti di ingresso.
  5. Utilizzando un sistema di espressione proteica cell-free, assemblare i componenti per la reazione CFPS su ghiaccio, secondo le istruzioni del produttore. Ridurre al minimo il tempo trascorso in possesso di reagenti CFPS su ghiaccio e mettere la reazione nel dispositivo immediatamente dopo il montaggio.
    NOTA: Questo dispositivo è statoutilizzato con un E. commerciale estrarre coli kit espressione proteica e un plasmide costitutivamente esprime GFP. Il volume totale di reazione è stata scalata a 25 microlitri - può essere possibile utilizzare un volume ancora più basso per reagenti, se desiderato. Come reagenti CFPS tendono ad essere sensibili al gelo-disgelo, può essere utile per rendere aliquote dei reagenti al volume appropriato prima dell'esperimento. Altri reagenti possono essere aggiunti alla miscela di reazione, ma la reazione deve essere completamente assemblato prima di essere applicata al dispositivo.
    1. Montare la reazione, aggiungendo l'ingresso DNA ultima.
      NOTA: Una volta assemblato in un tubo Eppendorf, la reazione CFPS inizierà se non tenuta sul ghiaccio. Dal momento che il tempo necessario per applicare i reagenti al dispositivo e iniziare l'esperimento può variare, è utile avviare un timer, una volta la reazione è assemblato e miscelato - ciò manterrà i tempi tra esperimenti coerenti, e gli aiuti nella risoluzione dei problemi.
  6. Utilizzando iltubi e l'ago del connettore descritto nel punto 3.4.2, ritirare la reazione assemblato nel tubo utilizzando una siringa da 1 ml. Inserire la punta dell'ago smussata nella presa camera di reazione. Staccare il connettore ago dalla siringa e collegarlo al connettore maschio-maschio utilizzata per il trasduttore camera di reazione.
  7. Applicare pressione (<10 psi) per reagenti CFPS per riempire il canale. Rimuovere l'ago quando la reazione è riempito.
  8. Inserire il tubo smussato dall'altro trasduttore nella presa valvola di controllo. Non pressurizzare ancora la valvola di controllo.
  9. Posizionare il dispositivo montato sul palco. Utilizzando immagini chiaro, individuare le camere di reazione con un obiettivo ad immersione in olio 100X.
  10. Azionare la valvola di controllo pressurizzando trasduttore valvola di controllo a 20 psi; un cambiamento visibile nella membrana sarà evidente quando la valvola di comando viene azionato. Focus sulle fondo delle camere di reazione.
  11. Iniziare l'acquisizione delle immagini; crescita in fluorescenza will è visibile all'interno ed intorno all'esterno delle camere di reazione, anche se sarà probabilmente non evidente nelle prime fasi della reazione. Cattura immagini ogni 1-3 minuti fino a quando la reazione raggiunge una fluorescenza stato stazionario. Se una fase di messa a fuoco automatica non è disponibile, brevemente riorientare ogni immagine prima di essere adottate le immagini.
    NOTA: Mentre si verificherà qualche photobleaching, gli effetti sulle relative fluorescenza a causa di photobleaching possono essere contabilizzati fino a quando il tasso di photobleaching è noto. Questo tasso photobleaching può essere stimato esponendo uno standard fluorescente, quale una concentrazione nota di GFP o una miscela fluoroforo, per costante photobleaching per un periodo di tempo.
  12. Registrare il tempo trascorso dal gruppo reazione alla prima immagine acquisita.
    NOTA: Questo genere dura 4-5 minuti.

4. Immagine Analisi ed elaborazione dati

  1. Usando un'immagine software di analisi come ImageJ, selezionare ilall'interno delle camere di reazione come una ROI. Acquisire il valore di intensità media di fluorescenza del ROI per tutte le immagini.
    NOTA: Questa è la traccia intensità di fluorescenza raw.
    1. Eseguire questa operazione in ImageJ usando i plugin Time Series Analyzer e ROI Manager - Usa Time Series Analyzer per scegliere le regioni di interesse intorno l'interno di ogni camera di reazione. Impostare "AutoROIProperties" per una zona che corrisponde all'interno di ciascuna camera di reazione, selezionare "Add On Click", e selezionare ciascuna camera.
      NOTA: Questo passaggio può essere fatto anche con lo strumento Ellisse per disegnare un ROI intorno alla camera fluorescente. Questa dimensione ROI corrisponde solitamente ad un'ellisse 30 x 30 pixel per una camera 10 micron di diametro visualizzazione con un obiettivo 100X.
    2. Evidenziare tutti ROI nel ROI Manager. Utilizzare la funzione "Multi Measure" per determinare la media intensità di fluorescenza di ogni ROI attraverso l'intera serie di immagini.
      NOTA: Un plugin di nome StackReg può essere utilizzata per allineare la pila di immagini, se necessario.
  2. Dopo aver acquisito le prime tracce di intensità di fluorescenza per tutte le celle di un esperimento, determinare la componente deterministica della reazione considerando una media inter-sperimentale in tutte le tracce, e sottraendo la media da singole tracce prime. Utilizzare il software di analisi dei dati come Igor o MS Excel per questa analisi.
    NOTA: Ciò fornisce rumore traccia per ogni camera di reazione.
  3. Analizzare il rumore di espressione genica di queste camere di reazione utilizzando gli stessi metodi utilizzati per analizzare il rumore espressione genica derivati ​​da cellule 25.

Representative Results

Il vantaggio di questa piattaforma microfabbricazione è nell'applicazione della elastomerico "valvola di controllo" controllabile che viene azionato in modo indipendente al fine di limitare le reazioni CFPS (Figura 2A). Quando il dispositivo viene azionato, le camere di membrana vengono premuti contro il vetrino per confinare i reagenti fluorescenti in un array di camere di reazione (Figura 2C). Al fine di verificare che le camere limitano affidabile la reazione attraverso la durata dell'esperimento, una base FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) test è stato condotto 37. Un fluoroforo (AF 555) è stata applicata al dispositivo, e la valvola di controllo è stato azionato; utilizzando l'apertura dell'otturatore del microscopio, un singolo pozzo confinare il fluoroforo è stato isolato e fotodecolorate singolarmente (Figura 2D). La scelto bene è diventato buio e non ha recuperato in luminosità fino a quando la valvola di controllo è stata depressurizzata 20 min60; in seguito, rilasciando la camera dal vetro. Questo test verifica che tali camere di reazione rimangono ben sigillata per tutta la durata dell'esperimento.

In condizioni ottimali, una reazione CFPS esprimere una proteina facilmente visualizzate (ad esempio GFP o luciferasi) esprime proteine ​​rilevabile in pochi minuti di essere applicato a questo dispositivo. Durante la durata della reazione, la sintesi proteica in interni ed esterni delle camere di reazione viene esposta e quantificata unità di intensità di fluorescenza di misura all'interno di ciascuna camera (Figura 3A). Intensità di fluorescenza, corrispondente alla concentrazione di proteina, può essere mappato nel tempo per ciascuna camera di reazione (Figura 3D).

Espressione genica è un processo intrinsecamente stocastico che introduce le fluttuazioni (rumore) ad ogni passo molecolare (sintesi, la degradazione, legame proteina-DNA, ecc) 20. Un ramo della biologia rumore si concentra suil valore probatorio del gene rumore circuito di 41. Espressione in sistemi acellulari avrà effetti acustici estrinseci derivanti da interazioni tra macchinario molecolare di espressione e le superfici che definiscono i confini dei recipienti di reazione. Questi effetti estrinseci probabilmente diventerà più pronunciato come reazioni cell-free sono confinati in camere di reazione ancora più piccoli. La possibilità di effettuare time-lapse imaging di molteplici reazioni CFPS ristretti quindi permette l'attenta analisi della struttura del rumore (ampiezza e dinamica) in sistemi cell-free confinati in modo direttamente analogo a metodi che sono stati segnalati per sistemi cellulari 25. Figura 3C e 3D mostrano relativi tempi di espressione costitutiva GFP da un promotore T7 in una micropiastra 384 pozzetti standard con un volume di ben 15 microlitri, rispetto al camere di reazione PDMS 10 micron di diametro, corrispondenti a volumi di solo circa 300 fl, su un ordine di settes di grandezza inferiore. La variabilità nel proteina tassi espressione nei 10 micron camere di reazione è molto più elevata che nelle misurazioni ben piastriformi, avvicinandosi quelli osservati nelle cellule.

Reazioni Multiplexed eseguite sul dispositivo mostrano cinetiche simili a reazioni CFPS effettuate alla rinfusa su un lettore di micropiastre (Figura 3B), dove c'è un rapido aumento della fluorescenza che plateau, spesso presume essere causata da limitazione di risorse all'interno del volume di reazione 42,43 . Questo comportamento deterministico crescita, anche se altalenante, è in generale coerente in tutti camere di reazione, e tra gli esperimenti - la media tracce tra le camere attraverso esperimenti, il trend deterministico può essere sottratto da valori di traccia, lasciando solo i componenti di rumore della reazione (Figura 4A) . La figura 4B mostra il rumore espressione GFP dopo la rimozione del deterministico, componente transitoria (top), E l'autocorrelazione del rumore (basso), mentre la Figura 4A mostra le corrispondenti tracce nei 10 micron camere di reazione. La distribuzione nei mezze tempi delle tracce autocorrelazione dà la dipendenza dalla frequenza del rumore durante il tempo zero lag delle tracce autocorrelazione dà le grandezze del rumore, la varianza.

Figura 1
Figura 1. Cellulari-Free reagenti sintesi proteica sono confinati in camere di reazione scala femtoliter ai fini della misurazione del rumore genica. Reagenti da un sistema di espressione proteica cell-free commerciali vengono utilizzati per costitutivamente espresso GFP all'interno confinato camere di reazione PDMS. Una serie di queste camere può essere visualizzato con time-lapse microscopia a fluorescenza per caratterizzare l'espressione della proteina e il rumore di espressione genica. L'intensità di fluorescenza of ogni camera di reazione nel corso del tempo può essere tracciata come un individuo traccia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Realizzazione di due strati dispositivo microfluidica con camere sigillabile femtoliter scala. (A) layout e esploso di strati di dispositivi. Il dispositivo è composto da due strati PDMS e un vetrino coprioggetto. La membrana PDMS, sigillata tra gli strati di vetro e di controllo della valvola, mantiene le camere di reazione. (B) Immagine SEM della camera di reazione PDMS. Il diametro interno è di 10 micron. (C) Schema di canali di ingresso nel dispositivo. Proteine ​​delle cellule-Free Synthesis (CFPS) reagenti sono volato attraverso il canale di reazione. L'acqua viene pressurizzata nel controllovalvola per comprimere le camere di reazione contro il vetrino, sigillare le camere di 37. Tratto da Ref. 37 con il permesso di The Royal Society of Chemistry. (D) Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) prova su un singolo pozzo utilizzando FITC indica camera è ben sigillata, contro l'ambiente esterno. Il fluoroforo è stato catturato nelle camere (immagine in alto) e un singolo pozzo è stato fotodecolorate (immagine in basso). Nessun recupero di fluorescenza è stato visto nella camera fotodecolorate fino a quando la valvola di controllo è stato rilasciato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. EGFP Expression in Confinati Reaction Cell-libero. (A) le immagini di fluorescenza di sigillato reazione c Hambers in momenti scelti nella reazione. Produzione di proteine ​​può essere visto sia all'interno delle camere di reazione e fuori le camere nel canale principale. (B) EGFP è stato clonato in un vettore Pet3a, fornendo un promotore T7 polimerasi e terminatore e un sito di legame forte ribosoma (RBS). (C) misure di fluorescenza normalizzati di espressione costitutiva di EGFP in una reazione cell-free di massa eseguita in un lettore di micropiastre. Reazioni CFPS solito producono proteine ​​rapidamente prima di rallentare a una fluorescenza 'stato stazionario' - questo è associato con limitazione delle risorse 43. Trattini neri indicano la traccia media. (D) di fluorescenza normalizzato di 51 prime tracce di fluorescenza di intensità letti da 51 camere di reazione su diversi esperimenti. Trattini neri indicano la traccia media su diversi esperimenti, che illustrano la componente deterministica dell'espressione proteica./52616/52616fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. individuali Tracce rumore e rumore di autocorrelazione di un sistema cellulare e Cell-Free. (A) Da Austin et al., 2006. Rumore di espressione GFP (in alto) e funzioni di autocorrelazione normalizzati (in basso) acquisiti da monitoraggio produzione GFP nei batteri 25 vivente. Ristampato da permesso da Macmillan Publishers Ltd: [Nature] 25 (Vol. 439), diritto d'autore (2006). (B) Noise nell'espressione GFP (in alto) e funzioni di autocorrelazione normalizzati (in basso) acquisite dalla produzione GFP sistema cell-free, rintracciato in camere di reazione del dispositivo di microfluidica. Cliccate quiper visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L'espressione genica nelle cellule è intrinsecamente rumorosa a causa di piccoli volumi cellulari e basso numero di copie di reagenti importanti. Biologia rumore spesso si concentra sulle fonti, la lavorazione, e le conseguenze biologiche delle fluttuazioni delle popolazioni, concentrazioni, posizioni, o stati di molecole che controllano i circuiti e le reti di 44 geni. La maggior parte di questo lavoro è stata eseguita in sistemi cellulari, che ha il vantaggio di vedere il rumore di un circuito di gene nel contesto naturale delle reti genetiche all'interno della cellula. Tuttavia, i sistemi acellulari permettono la caratterizzazione delle fluttuazioni intrinseche di un circuito singolo gene senza gli effetti estrinseci confondenti 18 che non possono essere evitati in sistemi cellulari. Analisi del rumore può offrire importanti spunti fisici in modo genetica circuiti sono strutturati e il loro funzionamento, ed è stato utilizzato in sistemi cellulari di caratterizzare negative 25 e positivo 18, e trascrizionale di rottura 45,46. Qui si descrive lo studio di un sistema di espressione di cellule in dispositivi microfluidici che consentono il controllo simultaneo di dimensioni del reattore e la reazione iniziazione volte, al fine di comprendere meglio il ruolo che parto e spiazzamento 47,48 hanno sulla intrinseca rumore espressione della proteina senza complicazioni associate con le cellule viventi.

La chiave che permette caratteristica del progetto è l'integrazione di array di femtoliter volume (micron scala) camere di reazione utilizzati per confinare i reagenti di un sistema di espressione proteica cell-free, con una membrana elastomerica "valvola di controllo" in PDMS che intrappola il reagenti in un ben definito, "tempo zero" per reazione apertura (figura 1). Questo controllo permette la cinetica delle reazioni coinvolte nella sintesi proteica da FOLLdovuto in tempo reale ad alta precisione. Come tale, è importante gestire reagenti privi di cellule in modo che la variabilità inter-sperimentale è minimizzato il più possibile. Questo controllo permette di valutare la struttura di rumore dei circuiti genetici privi di cellule in un modo che è analogo a tecniche precedentemente usati per valutare l'espressione genica nelle cellule viventi.

Come reagenti usati nei sistemi CFPS possono essere sensibili al gelo-disgelo, è importante mantenere i reagenti freddi e minimizzare il tempo di reagenti trascorrono scongelamento su ghiaccio. È buona norma verificare periodicamente l'espressione del sistema CFPS in massa per identificare cambiamenti nei livelli di espressione nel tempo - ciò può essere fatto in una reazione di 10-15 ml in un tubo Eppendorf, o in un dispositivo come un lettore di micropiastre , che esegue più letture nel tempo per catturare cinetica di reazione. Notando i tempi di età e disgelo dei reagenti per ogni esperimento vi aiuterà durante la risoluzione bassa espressione lEvels. Inoltre, nel montaggio reagenti CFPS, è importante notare che la reazione inizia una volta che è completamente assemblato e rimosso dal ghiaccio. Per mantenere un "tempo zero" coerente, è utile per registrare il tempo dopo l'avvio della reazione CFPS dopo l'aggiunta finale del DNA di ingresso, e di applicare la reazione più rapidamente possibile al dispositivo incubate. Questo processo dovrebbe richiedere circa 4-5 minuti, e la fluorescenza non dovrebbe ancora essere visibile all'interno delle camere di reazione. Questo controllo assicura che il tempo disponibile per visualizzare la porzione di crescita della curva di reazione è massimizzata.

Prima di eseguire reazioni CFPS sul dispositivo, si consiglia di eseguire i test di controllo qualità per verificare non vi siano perdite dalle camere. Un test FRAP può essere eseguita (come nella Figura 2D) applicando un fluoroforo al dispositivo ed esponendo un pozzo individuo fino pozzo è completamente sbiancato. Se le camere sonoben sigillata,, nessun recupero dovrebbe essere visibile all'interno del pozzo - ci dovrebbe essere un netto contrasto tra le pareti del vano e gli spazi interni ed esterni. Se il recupero fluorescenza è evidente o le pareti della camera di reazione non sono ben definiti, la pressione sulla valvola di controllo deve essere aumentato o il dispositivo dovrebbe essere controllato per perdite o delaminazione dal vetrino.

Questo protocollo è stato testato con reagenti CFPS da E. commerciale Kit coli cell-free espressione della proteina (scala a 25 ml), anche se possono essere utilizzati altri sistemi robusti CFPS. È possibile utilizzare i volumi molto inferiore 25 microlitri nell'applicare reazioni al dispositivo, che può essere utile quando il costo reagente è un fattore limitante in esperimenti. Una volta reagenti vengono aggiunti al dispositivo e le camere di reazione sono sigillate, non è possibile aggiungere reagenti alla soluzione senza la valvola di controllo de-azionamento - quindi questo dispositivo non sia adattoLe reazioni che richiedono l'aggiunta di reagenti durante il corso della reazione. Questo dispositivo non è inoltre ottimizzato per osservare le reazioni CFPS che possono circolare più di 3 ore - gli effetti della disidratazione e l'essiccazione del dispositivo dopo questo periodo di tempo non sono state valutate. Se si desiderano tempi di reazione più lunghi, questi effetti possono essere mitigati sigillando il dispositivo per impedire l'evaporazione, cambiando la temperatura di incubazione, o utilizzando una camera umida. Le modifiche al progetto del dispositivo, come ad esempio le strutture nanoporose nelle pareti della camera di 49,50 o l'inserimento di uno strato di membrana porosa, rappresentano alcuni metodi che potrebbero consentire lo scambio dei reagenti e allungare tempi di reazione così.

Compartimenti di reazione microfabbricati volume uniforme sono utili per mantenere le dimensioni coerenti in tutta esperimenti e molto adatto per un'indagine "reazioni collaterali" con le pareti del vano. A differenza dei metodi che utilizzano notecniche di n-microfabbricati, queste reazioni devono essere valutati in piccole quantità, e non forniscono la flessibilità dimensionale durante gli esperimenti. Tuttavia, il disegno controllabile per queste camere di reazione è molto adatto per la microscopia time-lapse, e può essere un complemento illuminante ad un metodo ad alta velocità di confinamento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU-8 2015 Microchem SU-8 2000 series Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Thinner Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
SU-8 Developer Microchem SU-8 2000 series Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.
Chlorotrimethylsilane Sigma Aldrich 92360 FLUKA Hazardous. Corrosive to the respiratory tract., Reacts violently with water.
Sylgard 184 PDMS Dow Corning SYLGARD 184
0.75 mm hole-puncher Ted Pella Inc. 15072 Harris Uni-Core
23 gauge needles blunt tip Component Supply Co. /NE-231PL-25
#0 glass coverslip Ted Pella Inc. 260366 Gold Seal
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Microscope Nikon Instruments Eclipse TE 300
CCD camera Roper Scientific CoolSNAP-HQ
Shutter Shutter Insturment Lambda SC
Light Source Nikon Intensilight C-HGFI
Color Filters Chroma Technology Corp. ZET 532/106 excitation, ZT 532rdc dichroic, ET 595/50m emission
100X oil-immersion objective Nikon N.A. 1.4
Temperature Regulator Oko Lab H201-T
Metamorph Universal Imaging Corp. Version 7.8.3.0
Marsh Bellofram transducers Marsh Bellofram T2000
24 gauge PTFE tubing Component Supply Co. /SWTT-24-C
Septum vials National Scientific C4015- 17W
Power Supply Hewlett Packard 6205B Dual DC Power Supply
Sharp 23 gauge needles Precision Glide 305129
Male-to-male luer lock adapters Qosina 20024 Polycarbonate
Stainless Steel Blunt Needle 23 gauge Component Supply Co. /NE-232PL-5C Polypropylene
S30 E. coli protein expression system Promega L1110
Pet3a-GFP vector/protein Novagen 69418-3 Assembled in-house. Inserted EGFP gene in Pet3a.
Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit Biorad #732-6120
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28106
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Alexa Fluor 555 Molecular Probes AF555 http://www.lifetechnologies.com
ImageJ National Institutes of Health Version 1.46r
Plugin: Time Series Analyzer Balaji J Dept. of Neurobiology, UCLA Version 3.0
Plugin: StackReg/TurboReg Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne Biomedical Imaging Group Distribution is dated July 7, 2011
Plugin: ROI Manager Tools Tiago Ferreira 12/15/2013 Version

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