Name: Array sigillabile Femtoliter camera di Biologia gratis-Cell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 44 s
Description: Impara a confinare reazioni di sintesi proteica cell-free in camere di volume femtolitrico usando dispositivi microfabbricati in PDMS. Questo metodo permette di studiare il rumore dell'espressione genica in ambienti confinati con microscopia a fluorescenza.

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Ringraziamo il Dr. Mitch Doktycz, la Dr. Jennifer Morrel-Falvey, la Dr. Amber Bible e il Dr. Brandon Razooky per i consigli e le conversazioni utili, e ringraziamo il Dr. Sukanya Iyer per aver costruito il plasmide Pet3a-EGFP utilizzato nei test di espressione genica. Ringraziamo il supporto del Center for Nanophase Materials Sciences, che è sponsorizzato dalla Scientific User Facilities Division, Office of Science, Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti. SEN e PMC riconoscono il sostegno delle borse di studio del Bredesen Center presso l'Università del Tennessee, Knoxville. Questa ricerca è stata eseguita presso l'Oak Ridge National Laboratory (ORNL). ORNL è gestito da UT-Battelle, LLC, per il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti.

1. litografia ottica Masters dispositivo <ol><li> Disidratare wafer di silicio puliti su un piatto caldo a ~ 250 ° C per almeno 1 ora. NOTA: E &#39;buona norma utilizzare più di un wafer durante la preparazione di un maestro, in caso di errore dell&#39;utente. </li><li> Preparare aliquote photoresist. Preparare aliquote di entrambi SU-8 2015 photoresist e una diluizione di SU-8 2015 photoresist in rapporto 2: 1 usando SU-8 diluente come diluente. NOTA: Circa 1 ml di photoresist è necessaria per-spin rivestimento uno wafer. </li><li> Preparare tre modelli di maschera per la produzione di questi maestri. Per la membrana Maestro, preparare due maschere: una patterning il canale di membrana e l&#39;altra patterning le camere di reazione. Per il maestro valvola di controllo, di preparare un solo modello di maschera. NOTA: Per ulteriori dettagli sulle tecniche litografiche, tra cui maschera patterning, vedi Ito e Okazaki, 2000. 36 Cfr Fowlkes e Collier, 2013 per una descrizione più dettagliata del design del dispositivo 37. </li><li> Preparare la membrana Maestro <ol><li> Spin-coat 2: 1 SU-8 diluizione 2015 photoresist su wafer a 1.000 rpm per 45 sec. </li><li> Wafer cuocere morbide a 95 ° C per 2 min. Utilizzando un assetto contatto, esporre wafer con modello di canale a membrana per 10 secondi, ed eseguire una cottura post-esposizione per 2 minuti a 95 ° C. </li><li> Sviluppare wafer in SU-8 sviluppatore per 1 min, o fino residui photoresist viene rimosso. Risciacquare wafer con isopropanolo, muovendo dall&#39;alto verso il basso. Wafer lavaggio con azoto, ancora muovendo dall&#39;alto verso il basso. Wafer Cuocere in forno a 180 ° C per 4 min. </li><li> Spin-coat modellato wafer di nuovo con 2: 1 SU-8 di diluizione a 2.000 rpm per 45 sec. </li><li> Morbido bake modellato wafer per 2 minuti a 95 ° C. Utilizzando contatto assetto, allineare wafer fantasia con pattern camera di reazione, ed esporre per 10 sec. Eseguire post-esposizione cuocere per 2 minuti a 95 ° C. </li><li> Sviluppare wafer come descritto al punto 1.4.3. Dopo aver sviluppato e asciugatura wafer, wafer infornare a 180 ° C per 4 minuti. NOTA: I wafer possono essere sviluppati nello stesso sviluppatore che è stato utilizzato nel passaggio precedente. </li></ol></li><li> Preparare la valvola di controllo principale <ol><li> Spin-coat non diluito SU-8 photoresist su wafer pulite a 2.000 rpm per 45 sec. </li><li> Morbido bake wafer a 95 ° C per 6 min. Utilizzando un assetto contatto, esporre wafer con pattern valvola di controllo per 10 sec. Eseguire una cottura post-esposizione a 95 ° C per 6 min. </li><li> Sviluppare wafer in SU-8 Sviluppatore per 2 minuti, o fino a residuo viene rimosso. Risciacquare con isopropanolo, muovendo dall&#39;alto verso il basso. Wafer a secco con azoto e infornare a 180 ° C per 4 minuti. </li></ol></li></ol> 2. PDMS di fabbricazione del dispositivo <ol><li> Silanizzare tutti i maestri con ~ 0,2 ml trimetilclorosilano tramite deposizione di vapore. <ol><li> Racchiudere rapidamente il maestro in un contenitore ermetico a temperatura ambiente, con qualche goccia di agente silanizzante. NOTA:. Altri protocolli silanizzanti possono essere accettabili 38 Se properl eseguitay, il PDMS sarà facile da rimuovere. </li></ol></li><li> Mescolare un poli commerciale (dimetilsilossano) (PDMS) base e induritore in diversi rapporti per entrambe le membrane e gli strati di controllo della valvola del dispositivo, come è stato dimostrato in valvola multistrato simili disegni 39. Usa 20: 1 e 5: 1 rapporti di Base: il catalizzatore per gli stampi delle valvole a membrana e di controllo, rispettivamente. <ol><li> Per lo stampo membrana, mescolare 10 g di base con 0,5 g di induritore. NOTA: Questo volume sarà spin-rivestito sul maestro membrana. </li><li> Per lo stampo valvola di controllo, mescolare la base e il catalizzatore in un rapporto di 5: 1. La quantità di PDMS necessarie per modellare la valvola di controllo dipenderà dal contenitore utilizzato per tenere master valvola di controllo; riempire il serbatoio in modo tale che il maestro è rivestita con ~ 1 cm di PDMS. </li></ol></li><li> Miscelare accuratamente sia PDMS preparati, e li de-gas in una camera a vuoto fino a quando non bolle d&#39;aria sono visibili. Posizionare il maestro valvola di controllo in una resistente al calore,contenitore, ad esempio un piatto di vetro. Versare con cautela 5: 1 rapporto di PDMS sul maestro, e de-gas il contenitore una seconda volta. </li><li> Mentre il contenitore di controlli PDMS valvola viene degassati, spin-coat 20: 1 rapporto di PDMS sul master membrana versando accuratamente la miscela PDMS sul maestro membrana per minimizzare la formazione di bolle d&#39;aria, poi spin-coating il maestro a 1.000 rpm per 45 sec. </li><li> Parzialmente curare sia master in un forno a 80 ° C per 6 minuti per il master membrana 15 min per il master valvola di controllo. NOTA: quando parzialmente indurito, il PDMS dovrebbero tenere la sua forma, ma il materiale sarà leggermente appiccicoso. Se PDMS non è ancora guarito, cuocere di nuovo in incrementi di pochi minuti alla volta fino a quando il materiale mantiene la sua forma quando viene premuto. </li><li> Tagliare PDMS rettangolari stampi da padrone valvola di controllo, peeling gli stampi dolcemente. Punch fori di ingresso attraverso il componente stampato utilizzando una foratura 0,75 millimetri. NOTA: Il foro può essere pulito con l&#39;inserimento di un blun 23 gauget punta dell&#39;ago, e l&#39;esterno dello stampo possono essere puliti con nastro adesivo, se necessario. </li><li> Utilizzando un microscopio ottico per individuare le camere di reazione sul master membrana, allineare il componente stampo valvola di controllo con le caratteristiche della membrana camera di reazione e posizionare il componente valvola di controllo direttamente sopra master membrana. Orientare della valvola di controllo verso l&#39;angolo in basso a sinistra del dispositivo, e assicurarsi che le camere di reazione e il canale del maestro membrane sono visibili all&#39;interno della valvola di controllo rettangolare. </li><li> Cuocere i componenti stampo allineati a 80 ° C per 2 ore. NOTA: Le membrane e controllo stampi valvole saranno ora essere sigillati insieme, e manipolati come uno stampo. </li><li> Tagliare il stratificata stampo PDMS dal master membrana, sbucciatura lo stampo dal master molto delicatamente per non perforare la membrana. </li><li> Punch ingresso e di uscita fori per l&#39;ingresso estratto cellulare utilizzando una foratura 0,75 millimetri. Punch buchi attraverso entrambi gli strati,e pulirli nello stesso modo come descritto al punto 2.6. </li><li> Utilizzando un pulitore plasma accoppiato induttivamente, trattare plasma sia lo stampo (lato membrana up) e un bicchiere coprioggetto No. 0 a 10,5 W per 20 sec. Rimuovere immediatamente il coprioggetto e stampo dal pulitore plasma e strato componenti, lato membrana verso il vetro, cercando di minimizzare sacche d&#39;aria tra il vetro e lo stampo. Non premere direttamente sul canale di ingresso di membrana, o la membrana può ricuocere al vetro, rendendo difficile riempire il canale con reagenti. <ol><li> Prestare particolare attenzione quando si maneggiano i dispositivi assemblati per evitare di rompere lo strato di vetro. Utilizzare vetrini sottili come il dispositivo deve essere ripreso con il vetrino di vetro con obiettivi ad immersione in olio ad alto ingrandimento - se il vetro è troppo spesso, le caratteristiche dei dispositivi potrebbero non essere visibili. </li></ol></li><li> Infine, curare i dispositivi completati a 80 ° C per 2 ore. </li></ol> 3. Setup sperimentale foR Protein libera-Cell Synthesis reazione <ol><li> Idrato un dispositivo per ebollizione in acqua deionizzata per 1 ora. NOTA: L&#39;apparecchio deve avere un aspetto torbido quando completamente idratata. Dispositivo può anche essere lasciata O / N in acqua sterile a temperatura ambiente per idratare esso. </li><li> Utilizzando un microscopio invertito con una camera di incubazione, impostare la temperatura ambiente a 30 ° C. NOTA: Questa temperatura è stata scelta per ottimizzare l&#39;espressione di GFP con un promotore T7, quindi le temperature ottimali per altre reazioni possono variare 40. </li><li> Dispositivo Mount per microscopio titolare palco con nastro adesivo e avvolgere bordi dispositivo con la carta velina bagnata per mantenere l&#39;idratazione locale. </li><li> Utilizzare due a circuito chiuso trasduttori di tensione-pressione alta precisione per modulare la pressione del gas di azoto per l&#39;azionamento della valvola di controllo e l&#39;ingresso del reagente. NOTA: Questo protocollo è stato testato solo con azoto a bassa purezza, anche se possono essere utilizzati altri gas inerti. <ol><li> Collegare il primo trasduttore da24-gauge PTFE tubo ad un serbatoio di acqua contenuta in un flacone di vetro 4 ml con un coperchio setto. Collegare il serbatoio a monte della valvola di controllo con un secondo tubo terminato da un 23 gauge punta smussa dell&#39;ago. NOTA: Entrambi i tubi penetrano il setto serbatoio con due taglienti 23 aghi calibro. </li><li> Collegare il secondo trasduttore da tubi in PTFE 24-gauge collegato a un maschio maschio-connettore Luer-lok. Collegare ad un Luer-lok 23 gauge connesso con un tubo con un altro 23 calibro punta smussa dell&#39;ago, che viene assemblata singolarmente per ogni dispositivo. Questo ago collega al canale di reazione della membrana; utilizzarla per irrigare l&#39;acqua dal canale di reazione e reagenti di ingresso. </li></ol></li><li> Utilizzando un sistema di espressione proteica cell-free, assemblare i componenti per la reazione CFPS su ghiaccio, secondo le istruzioni del produttore. Ridurre al minimo il tempo trascorso in possesso di reagenti CFPS su ghiaccio e mettere la reazione nel dispositivo immediatamente dopo il montaggio. NOTA: Questo dispositivo è statoutilizzato con un E. commerciale estrarre coli kit espressione proteica e un plasmide costitutivamente esprime GFP. Il volume totale di reazione è stata scalata a 25 microlitri - può essere possibile utilizzare un volume ancora più basso per reagenti, se desiderato. Come reagenti CFPS tendono ad essere sensibili al gelo-disgelo, può essere utile per rendere aliquote dei reagenti al volume appropriato prima dell&#39;esperimento. Altri reagenti possono essere aggiunti alla miscela di reazione, ma la reazione deve essere completamente assemblato prima di essere applicata al dispositivo. <ol><li> Montare la reazione, aggiungendo l&#39;ingresso DNA ultima. NOTA: Una volta assemblato in un tubo Eppendorf, la reazione CFPS inizierà se non tenuta sul ghiaccio. Dal momento che il tempo necessario per applicare i reagenti al dispositivo e iniziare l&#39;esperimento può variare, è utile avviare un timer, una volta la reazione è assemblato e miscelato - ciò manterrà i tempi tra esperimenti coerenti, e gli aiuti nella risoluzione dei problemi. </li></ol></li><li> Utilizzando iltubi e l&#39;ago del connettore descritto nel punto 3.4.2, ritirare la reazione assemblato nel tubo utilizzando una siringa da 1 ml. Inserire la punta dell&#39;ago smussata nella presa camera di reazione. Staccare il connettore ago dalla siringa e collegarlo al connettore maschio-maschio utilizzata per il trasduttore camera di reazione. </li><li> Applicare pressione (&lt;10 psi) per reagenti CFPS per riempire il canale. Rimuovere l&#39;ago quando la reazione è riempito. </li><li> Inserire il tubo smussato dall&#39;altro trasduttore nella presa valvola di controllo. Non pressurizzare ancora la valvola di controllo. </li><li> Posizionare il dispositivo montato sul palco. Utilizzando immagini chiaro, individuare le camere di reazione con un obiettivo ad immersione in olio 100X. </li><li> Azionare la valvola di controllo pressurizzando trasduttore valvola di controllo a 20 psi; un cambiamento visibile nella membrana sarà evidente quando la valvola di comando viene azionato. Focus sulle fondo delle camere di reazione. </li><li> Iniziare l&#39;acquisizione delle immagini; crescita in fluorescenza will è visibile all&#39;interno ed intorno all&#39;esterno delle camere di reazione, anche se sarà probabilmente non evidente nelle prime fasi della reazione. Cattura immagini ogni 1-3 minuti fino a quando la reazione raggiunge una fluorescenza stato stazionario. Se una fase di messa a fuoco automatica non è disponibile, brevemente riorientare ogni immagine prima di essere adottate le immagini. NOTA: Mentre si verificherà qualche photobleaching, gli effetti sulle relative fluorescenza a causa di photobleaching possono essere contabilizzati fino a quando il tasso di photobleaching è noto. Questo tasso photobleaching può essere stimato esponendo uno standard fluorescente, quale una concentrazione nota di GFP o una miscela fluoroforo, per costante photobleaching per un periodo di tempo. </li><li> Registrare il tempo trascorso dal gruppo reazione alla prima immagine acquisita. NOTA: Questo genere dura 4-5 minuti. </li></ol> 4. Immagine Analisi ed elaborazione dati <ol><li> Usando un&#39;immagine software di analisi come ImageJ, selezionare ilall&#39;interno delle camere di reazione come una ROI. Acquisire il valore di intensità media di fluorescenza del ROI per tutte le immagini. NOTA: Questa è la traccia intensità di fluorescenza raw. <ol><li> Eseguire questa operazione in ImageJ usando i plugin Time Series Analyzer e ROI Manager - Usa Time Series Analyzer per scegliere le regioni di interesse intorno l&#39;interno di ogni camera di reazione. Impostare &quot;AutoROIProperties&quot; per una zona che corrisponde all&#39;interno di ciascuna camera di reazione, selezionare &quot;Add On Click&quot;, e selezionare ciascuna camera. NOTA: Questo passaggio può essere fatto anche con lo strumento Ellisse per disegnare un ROI intorno alla camera fluorescente. Questa dimensione ROI corrisponde solitamente ad un&#39;ellisse 30 x 30 pixel per una camera 10 micron di diametro visualizzazione con un obiettivo 100X. </li><li> Evidenziare tutti ROI nel ROI Manager. Utilizzare la funzione &quot;Multi Measure&quot; per determinare la media intensità di fluorescenza di ogni ROI attraverso l&#39;intera serie di immagini. NOTA: Un plugin di nome StackReg può essere utilizzata per allineare la pila di immagini, se necessario. </li></ol></li><li> Dopo aver acquisito le prime tracce di intensità di fluorescenza per tutte le celle di un esperimento, determinare la componente deterministica della reazione considerando una media inter-sperimentale in tutte le tracce, e sottraendo la media da singole tracce prime. Utilizzare il software di analisi dei dati come Igor o MS Excel per questa analisi. NOTA: Ciò fornisce rumore traccia per ogni camera di reazione. </li><li> Analizzare il rumore di espressione genica di queste camere di reazione utilizzando gli stessi metodi utilizzati per analizzare il rumore espressione genica derivati ​​da cellule 25. </li></ol>

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<li>Retterer, S. T., Siuti, P., Choi, C. -K., Thomas, D. K., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+fabrication+of+nanoporous+silicon-based+bioreactors+within+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Development and fabrication of nanoporous silicon-based bioreactors within a microfluidic chip.</a> Lab on a Chip. 10, 1174-1181 (2010).</li>
<li>Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+protein+production+in+nanoporous%2C+picolitre+volume+containers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers.</a> Lab Chip. 11, 3523-3529 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;espressione genica nelle cellule è intrinsecamente rumorosa a causa di piccoli volumi cellulari e basso numero di copie di reagenti importanti. Biologia rumore spesso si concentra sulle fonti, la lavorazione, e le conseguenze biologiche delle fluttuazioni delle popolazioni, concentrazioni, posizioni, o stati di molecole che controllano i circuiti e le reti di 44 geni. La maggior parte di questo lavoro è stata eseguita in sistemi cellulari, che ha il vantaggio di vedere il rumore di un circuito di gene nel contesto naturale delle reti genetiche all&#39;interno della cellula. Tuttavia, i sistemi acellulari permettono la caratterizzazione delle fluttuazioni intrinseche di un circuito singolo gene senza gli effetti estrinseci confondenti 18 che non possono essere evitati in sistemi cellulari. Analisi del rumore può offrire importanti spunti fisici in modo genetica circuiti sono strutturati e il loro funzionamento, ed è stato utilizzato in sistemi cellulari di caratterizzare negative 25 e positivo <sup&gt; 27 autoregolazione, estrinseci ed intrinseci contributi al rumore espressione 18, e trascrizionale di rottura 45,46. Qui si descrive lo studio di un sistema di espressione di cellule in dispositivi microfluidici che consentono il controllo simultaneo di dimensioni del reattore e la reazione iniziazione volte, al fine di comprendere meglio il ruolo che parto e spiazzamento 47,48 hanno sulla intrinseca rumore espressione della proteina senza complicazioni associate con le cellule viventi. La chiave che permette caratteristica del progetto è l&#39;integrazione di array di femtoliter volume (micron scala) camere di reazione utilizzati per confinare i reagenti di un sistema di espressione proteica cell-free, con una membrana elastomerica &quot;valvola di controllo&quot; in PDMS che intrappola il reagenti in un ben definito, &quot;tempo zero&quot; per reazione apertura (figura 1). Questo controllo permette la cinetica delle reazioni coinvolte nella sintesi proteica da FOLLdovuto in tempo reale ad alta precisione. Come tale, è importante gestire reagenti privi di cellule in modo che la variabilità inter-sperimentale è minimizzato il più possibile. Questo controllo permette di valutare la struttura di rumore dei circuiti genetici privi di cellule in un modo che è analogo a tecniche precedentemente usati per valutare l&#39;espressione genica nelle cellule viventi. Come reagenti usati nei sistemi CFPS possono essere sensibili al gelo-disgelo, è importante mantenere i reagenti freddi e minimizzare il tempo di reagenti trascorrono scongelamento su ghiaccio. È buona norma verificare periodicamente l&#39;espressione del sistema CFPS in massa per identificare cambiamenti nei livelli di espressione nel tempo - ciò può essere fatto in una reazione di 10-15 ml in un tubo Eppendorf, o in un dispositivo come un lettore di micropiastre , che esegue più letture nel tempo per catturare cinetica di reazione. Notando i tempi di età e disgelo dei reagenti per ogni esperimento vi aiuterà durante la risoluzione bassa espressione lEvels. Inoltre, nel montaggio reagenti CFPS, è importante notare che la reazione inizia una volta che è completamente assemblato e rimosso dal ghiaccio. Per mantenere un &quot;tempo zero&quot; coerente, è utile per registrare il tempo dopo l&#39;avvio della reazione CFPS dopo l&#39;aggiunta finale del DNA di ingresso, e di applicare la reazione più rapidamente possibile al dispositivo incubate. Questo processo dovrebbe richiedere circa 4-5 minuti, e la fluorescenza non dovrebbe ancora essere visibile all&#39;interno delle camere di reazione. Questo controllo assicura che il tempo disponibile per visualizzare la porzione di crescita della curva di reazione è massimizzata. Prima di eseguire reazioni CFPS sul dispositivo, si consiglia di eseguire i test di controllo qualità per verificare non vi siano perdite dalle camere. Un test FRAP può essere eseguita (come nella Figura 2D) applicando un fluoroforo al dispositivo ed esponendo un pozzo individuo fino pozzo è completamente sbiancato. Se le camere sonoben sigillata,, nessun recupero dovrebbe essere visibile all&#39;interno del pozzo - ci dovrebbe essere un netto contrasto tra le pareti del vano e gli spazi interni ed esterni. Se il recupero fluorescenza è evidente o le pareti della camera di reazione non sono ben definiti, la pressione sulla valvola di controllo deve essere aumentato o il dispositivo dovrebbe essere controllato per perdite o delaminazione dal vetrino. Questo protocollo è stato testato con reagenti CFPS da E. commerciale Kit coli cell-free espressione della proteina (scala a 25 ml), anche se possono essere utilizzati altri sistemi robusti CFPS. È possibile utilizzare i volumi molto inferiore 25 microlitri nell&#39;applicare reazioni al dispositivo, che può essere utile quando il costo reagente è un fattore limitante in esperimenti. Una volta reagenti vengono aggiunti al dispositivo e le camere di reazione sono sigillate, non è possibile aggiungere reagenti alla soluzione senza la valvola di controllo de-azionamento - quindi questo dispositivo non sia adattoLe reazioni che richiedono l&#39;aggiunta di reagenti durante il corso della reazione. Questo dispositivo non è inoltre ottimizzato per osservare le reazioni CFPS che possono circolare più di 3 ore - gli effetti della disidratazione e l&#39;essiccazione del dispositivo dopo questo periodo di tempo non sono state valutate. Se si desiderano tempi di reazione più lunghi, questi effetti possono essere mitigati sigillando il dispositivo per impedire l&#39;evaporazione, cambiando la temperatura di incubazione, o utilizzando una camera umida. Le modifiche al progetto del dispositivo, come ad esempio le strutture nanoporose nelle pareti della camera di 49,50 o l&#39;inserimento di uno strato di membrana porosa, rappresentano alcuni metodi che potrebbero consentire lo scambio dei reagenti e allungare tempi di reazione così. Compartimenti di reazione microfabbricati volume uniforme sono utili per mantenere le dimensioni coerenti in tutta esperimenti e molto adatto per un&#39;indagine &quot;reazioni collaterali&quot; con le pareti del vano. A differenza dei metodi che utilizzano notecniche di n-microfabbricati, queste reazioni devono essere valutati in piccole quantità, e non forniscono la flessibilità dimensionale durante gli esperimenti. Tuttavia, il disegno controllabile per queste camere di reazione è molto adatto per la microscopia time-lapse, e può essere un complemento illuminante ad un metodo ad alta velocità di confinamento.

Sistemi cell-free offrono una piattaforma semplificata e flessibile per la visualizzazione di reazioni biologiche privo di fattori di complicazione, come il fitness, la divisione, e mutazione che sono inevitabili nello studio delle cellule viventi. Tali approcci sono stati impiegati per studiare sistemi cellulari compresa la caratterizzazione delle proteine ​​di membrana 1, l&#39;ispezione delle interazioni proteina 2, e l&#39;esplorazione degli aspetti fondamentali della traduzione 3-7. Recentemente sistemi cell-free hanno cominciato a prendere piede come piattaforme praticabili per la biologia sintetica 8-10. L&#39;appello di questi approcci è che liberano biologia sintetica dalla condivisione delle risorse e &#39;il rumore estrinseco&#39; che colpisce dinamica di reazione nelle cellule viventi. Tuttavia non è ancora chiaro come l&#39;ambiente fisico in cui le reazioni cell-free sono incorporati influenza la progressione e l&#39;esito della reazione. Ambienti di reazione senza cellulare - biente particolarmente limitatiEnt che si avvicinano volumi cellule rilevanti - rimangono poco caratterizzati. Protein Cell-libero Synthesis (CFPS) è convenzionalmente pensiero di come &#39;gratuito scala,&#39; esibendo cinetica equivalenti in tutta una serie di microlitri per volumi di reazione litro scala 11. Tuttavia, confinanti reazioni a volumi scala cellulare ha dimostrato di influenzare in modo significativo i tassi di espressione proteica 12. La natura stocastica di reazioni cell-free - soprattutto in quanto questi approccio di sistema o anche andare sotto femtoliter volumi - possono essere di particolare importanza. Rumore in espressione genica è una struttura fortemente influenzato dal confinamento come piccoli volumi cellulari e alta densità di componenti forzare molte delle molecole importanti da livelli molto bassi di popolazione - per esempio Escherichia coli confini all&#39;interno di un volume 1 fl ben 4.300 differenti polipeptidi sotto il controllo inducibile di diverse centinaia di diversi promotori 13. Questo rumore intrinseco è stato implicato come una forza trainante centrale in numerosi processi biologici, tra cui chemiotassi 14, la decisione di HIV tra la replicazione attiva e la latenza 15, la decisione di λ fago tra lisi e lisogenia 16,17, e la decisione di Bacillus subtillus tra competenza e sporulazione 17. Senza cellulare biologia sintetica fornisce quindi sia la possibilità di esplorare le proprietà stocastiche dei circuiti genici cellulari e reti, e manipolare questi comportamenti per raggiungere obiettivi tecnologici specifici. Mentre il comportamento di rumore dei sistemi cellulari è stato ben studiato 18-27, c&#39;è stato poco esplorazione del comportamento acustico fondamentale dei sistemi acellulari 8, in particolare a livello cellulare. Qui vi presentiamo una piattaforma per lo studio degli effetti stocastici in cell-free biologia sintetica. Questa piattaforma microfabbricazione contiene femtoliter scala reazione cHambers che possono essere rapidamente la transizione tra aperto (libera diffusione in e fuori dalla camera) e chiusi (reagenti confinati all&#39;interno della camera) stati. Nello stato di chiusura, ci limitiamo cellule-Free sintesi proteica (CFPS) reagenti che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP), e seguiamo espressione genica utilizzando time-lapse microscopia a fluorescenza 28 (Figura 1). Abbiamo caratterizzare questo ambiente privo di cellule misurando la struttura delle fluttuazioni stocastiche nell&#39;espressione genica in modo direttamente analogo a quelli utilizzati per caratterizzare cellule 25. Metodi non microfabbricazione per confinare reazioni cell-free sono vescicole e liposomi 29-32, emulsioni acqua in olio, 12 e 33 mezzi porosi. Tuttavia, mentre questi metodi possono fornire un controllo sulla distribuzione delle dimensioni dei volumi confinati 34, metodi di microfabbricazione creano caratteristiche altamente riproducibili con dimensioni strettamente specificate, anche su scala nanometrica.Inoltre, queste strutture rigide possono essere facilmente monitorati nel tempo senza essere suscettibile di evaporazione o cambiamenti nell&#39;ambiente esterno. Disegni container microfabbricati utilizzati nel precedente 8,35 lavoro non può sigillare rapidamente le camere di reazione seguente reazione iniziazione, complicando la chiara attribuzione del tempo in cui è stata avviata la reazione (tempo zero). Utilizzando il metodo qui presentato, solo 4-5 min sono necessari tra l&#39;inizio e la visualizzazione della reazione sul dispositivo, fornendo così una ben definita &quot;tempo zero&quot;. I seguenti protocolli descrivono i metodi di fabbricazione e collaudo di questo dispositivo, compresa la litografia ottica, il montaggio del dispositivo, il test del dispositivo, e metodi per l&#39;analisi delle immagini.

<table><tbody><tr><td>SU-8 2015</td><td>Microchem</td><td>SU-8 serie 2000</td><td>Tossico. Maneggiare con cura. Indossare occhiali chimici, guanti chimici e indumenti protettivi adeguati quando si maneggia il SU-8 2000 resist. Non entrare negli occhi, sulla pelle o sugli indumenti.</td></tr><tr><td>Diluente SU-8</td><td>Microchem</td><td>SU-8 serie 2000</td><td>Maneggiare con cura. Indossare occhiali chimici, guanti chimici e indumenti protettivi adeguati quando si maneggia il SU-8 2000 resist. Non entrare negli occhi, sulla pelle o sugli indumenti.</td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>Microchem</td><td>SU-8 serie 2000</td><td>Maneggiare con cura. Indossare occhiali chimici, guanti chimici e indumenti protettivi adeguati quando si maneggia il SU-8 2000 resist. Non entrare negli occhi, sulla pelle o sugli indumenti.</td></tr><tr><td>Clorotrimetilsilano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360 FLUKA</td><td>Pericoloso. Corrosivo per le vie respiratorie., Reagisce violentemente con l'acqua.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>Perforatrice da 0,75 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td><td>Harris Uni-Core</td></tr><tr><td>23 gauge aghi punta smussata</td><td>Component Supply Co.</td><td>/NE-231PL-25</td><td></td></tr><tr><td>#0 vetrino coprioggetti</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>260366</td><td>Gold Seal</td></tr><tr><td>Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE 300</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Roper Scientific</td><td>CoolSNAP-HQ</td><td></td></tr><tr><td>Shutter</td><td>Shutter Insturment</td><td>Lambda SC</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>Nikon</td><td>Intensilight C-HGFI</td><td></td></tr><tr><td>Color Filtri</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ZET 532/106 eccitazione, ZT 532rdc dicroico, emissione ET 595/50m</td> 100X obiettivo a immersione in olio Nikon N.A. 1.4 Regolatore di temperatura Oko Lab H201-T Metamorph Universal Imaging Corp.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Versione 7.8.3.0</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttori Marsh Bellofram</td><td>Marsh Bellofram</td><td>T2000</td><td></td></tr><tr><td>24 gauge PTFE tubo</td><td>Component Supply Co.</td><td>/SWTT-24-C</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di setto</td><td>National Scientific</td><td>C4015- Alimentatore da 17 W</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hewlett Packard</td><td>6205B Doppio alimentatore</td><td></td>CC</tr><tr><td>Aghi taglienti da 23 gauge</td><td>305129</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adattatori luer lock da maschio a maschio</td><td>Qosina</td><td>20024</td><td>Ago</td></tr><tr><td>smussato in policarbonato Componente da 23 gauge</td><td> Fornitura Co.</td><td>/NE-232PL-5C</td><td>Polipropilene</td></tr><tr><td>S30 E. coli sistema di espressione proteica</td><td>Promega</td><td>L1110</td><td></td></tr><tr><td>Pet3a-GFP vettore/proteina</td><td>Novagen</td><td>69418-3</td><td>Assemblato internamente. Inserito il gene EGFP in Pet3a.</td></tr><tr><td>Kit Midiprep per plasmidi Quantum Prep</td><td>Biorad</td><td>#732-6120</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Sonde molecolari</td><td>AF555</td><td>http://www.lifetechnologies.com</td></tr><tr><td></td><td>ImageJ National Institutes of Health</td><td>Versione 1.46r</td><td></td></tr><tr><td>Plugin: Analizzatore di serie temporali</td><td>Balaji J Dipartimento di Neurobiologia, UCLA</td><td>versione 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Plugin: StackReg/TurboReg</td><td>Ecole Polytechnique F&eacute; d&eacute; rale de Lausanne Biomedical Imaging Group</td><td>Distribuzione è datato 7 luglio 2011</td><td></td></tr><tr><td>Plugin: ROI Manager Strumenti</td><td>Tiago Ferreira</td><td>12/15/2013 Versione</td><td></td></tr></tbody></table>

array sigillabile femtoliter camera di biologia gratis-cell

Sealable Femtoliter Chamber Arrays for Cell-free Biology

Sistemi cell-free forniscono una piattaforma flessibile per sondare le reti specifiche di reazioni biologiche isolate dalla condivisione delle risorse complesso (ad esempio, l&#39;espressione genica globale, la divisione cellulare) incontra all&#39;interno di cellule viventi. Tuttavia, tali sistemi, utilizzati in macro-scala reattori massa tradizionali, spesso non riescono a mostrare i comportamenti dinamici e le efficienze caratteristici delle loro controparti micro-scala di vita. Capire l&#39;impatto della struttura cellulare interna e la scala sulla dinamica di reazione è cruciale per comprendere reti geniche complesse. Qui riportiamo un dispositivo microfabbricazione che limita le reazioni cell-free dei volumi scala cellulare, consentendo caratterizzazione flessibile del sistema molecolare chiuso. Questo poli multistrato (dimetilsilossano) (PDMS) dispositivo contiene camere di reazione femtoliter dimensioni su una membrana elastomerica azionabile (aperto e chiuso). Quando azionato, le camere di confinare proteine ​​della cellula-Free Sintesi (CFPS) reazioniesprimendo una proteina fluorescente, permettendo la visualizzazione della cinetica di reazione nel tempo utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse. Qui mostriamo come tale dispositivo può essere utilizzato per misurare la struttura di rumore di reazioni CFPS in un modo che è direttamente analogo a quelli utilizzati per caratterizzare sistemi cellulari, consentendo così l&#39;impiego di tecniche di biologia rumore utilizzate in sistemi cellulari di caratterizzare circuiti gene CFPS e loro interazioni con l&#39;ambiente privo di cellule.

Il vantaggio di questa piattaforma microfabbricazione è nell&#39;applicazione della elastomerico &quot;valvola di controllo&quot; controllabile che viene azionato in modo indipendente al fine di limitare le reazioni CFPS (Figura 2A). Quando il dispositivo viene azionato, le camere di membrana vengono premuti contro il vetrino per confinare i reagenti fluorescenti in un array di camere di reazione (Figura 2C). Al fine di verificare che le camere limitano affidabile la reazione attraverso la durata dell&#39;esperimento, una base FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) test è stato condotto 37. Un fluoroforo (AF 555) è stata applicata al dispositivo, e la valvola di controllo è stato azionato; utilizzando l&#39;apertura dell&#39;otturatore del microscopio, un singolo pozzo confinare il fluoroforo è stato isolato e fotodecolorate singolarmente (Figura 2D). La scelto bene è diventato buio e non ha recuperato in luminosità fino a quando la valvola di controllo è stata depressurizzata 20 min60; in seguito, rilasciando la camera dal vetro. Questo test verifica che tali camere di reazione rimangono ben sigillata per tutta la durata dell&#39;esperimento. In condizioni ottimali, una reazione CFPS esprimere una proteina facilmente visualizzate (ad esempio GFP o luciferasi) esprime proteine ​​rilevabile in pochi minuti di essere applicato a questo dispositivo. Durante la durata della reazione, la sintesi proteica in interni ed esterni delle camere di reazione viene esposta e quantificata unità di intensità di fluorescenza di misura all&#39;interno di ciascuna camera (Figura 3A). Intensità di fluorescenza, corrispondente alla concentrazione di proteina, può essere mappato nel tempo per ciascuna camera di reazione (Figura 3D). Espressione genica è un processo intrinsecamente stocastico che introduce le fluttuazioni (rumore) ad ogni passo molecolare (sintesi, la degradazione, legame proteina-DNA, ecc) 20. Un ramo della biologia rumore si concentra suil valore probatorio del gene rumore circuito di 41. Espressione in sistemi acellulari avrà effetti acustici estrinseci derivanti da interazioni tra macchinario molecolare di espressione e le superfici che definiscono i confini dei recipienti di reazione. Questi effetti estrinseci probabilmente diventerà più pronunciato come reazioni cell-free sono confinati in camere di reazione ancora più piccoli. La possibilità di effettuare time-lapse imaging di molteplici reazioni CFPS ristretti quindi permette l&#39;attenta analisi della struttura del rumore (ampiezza e dinamica) in sistemi cell-free confinati in modo direttamente analogo a metodi che sono stati segnalati per sistemi cellulari 25. Figura 3C e 3D mostrano relativi tempi di espressione costitutiva GFP da un promotore T7 in una micropiastra 384 pozzetti standard con un volume di ben 15 microlitri, rispetto al camere di reazione PDMS 10 micron di diametro, corrispondenti a volumi di solo circa 300 fl, su un ordine di settes di grandezza inferiore. La variabilità nel proteina tassi espressione nei 10 micron camere di reazione è molto più elevata che nelle misurazioni ben piastriformi, avvicinandosi quelli osservati nelle cellule. Reazioni Multiplexed eseguite sul dispositivo mostrano cinetiche simili a reazioni CFPS effettuate alla rinfusa su un lettore di micropiastre (Figura 3B), dove c&#39;è un rapido aumento della fluorescenza che plateau, spesso presume essere causata da limitazione di risorse all&#39;interno del volume di reazione 42,43 . Questo comportamento deterministico crescita, anche se altalenante, è in generale coerente in tutti camere di reazione, e tra gli esperimenti - la media tracce tra le camere attraverso esperimenti, il trend deterministico può essere sottratto da valori di traccia, lasciando solo i componenti di rumore della reazione (Figura 4A) . La figura 4B mostra il rumore espressione GFP dopo la rimozione del deterministico, componente transitoria (top), E l&#39;autocorrelazione del rumore (basso), mentre la Figura 4A mostra le corrispondenti tracce nei 10 micron camere di reazione. La distribuzione nei mezze tempi delle tracce autocorrelazione dà la dipendenza dalla frequenza del rumore durante il tempo zero lag delle tracce autocorrelazione dà le grandezze del rumore, la varianza. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig1.jpg" /> Figura 1. Cellulari-Free reagenti sintesi proteica sono confinati in camere di reazione scala femtoliter ai fini della misurazione del rumore genica. Reagenti da un sistema di espressione proteica cell-free commerciali vengono utilizzati per costitutivamente espresso GFP all&#39;interno confinato camere di reazione PDMS. Una serie di queste camere può essere visualizzato con time-lapse microscopia a fluorescenza per caratterizzare l&#39;espressione della proteina e il rumore di espressione genica. L&#39;intensità di fluorescenza of ogni camera di reazione nel corso del tempo può essere tracciata come un individuo traccia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig2.jpg" /> Figura 2. Realizzazione di due strati dispositivo microfluidica con camere sigillabile femtoliter scala. (A) layout e esploso di strati di dispositivi. Il dispositivo è composto da due strati PDMS e un vetrino coprioggetto. La membrana PDMS, sigillata tra gli strati di vetro e di controllo della valvola, mantiene le camere di reazione. (B) Immagine SEM della camera di reazione PDMS. Il diametro interno è di 10 micron. (C) Schema di canali di ingresso nel dispositivo. Proteine ​​delle cellule-Free Synthesis (CFPS) reagenti sono volato attraverso il canale di reazione. L&#39;acqua viene pressurizzata nel controllovalvola per comprimere le camere di reazione contro il vetrino, sigillare le camere di 37. Tratto da Ref. 37 con il permesso di The Royal Society of Chemistry. (D) Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) prova su un singolo pozzo utilizzando FITC indica camera è ben sigillata, contro l&#39;ambiente esterno. Il fluoroforo è stato catturato nelle camere (immagine in alto) e un singolo pozzo è stato fotodecolorate (immagine in basso). Nessun recupero di fluorescenza è stato visto nella camera fotodecolorate fino a quando la valvola di controllo è stato rilasciato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig3.jpg" /> Figura 3. EGFP Expression in Confinati Reaction Cell-libero. (A) le immagini di fluorescenza di sigillato reazione c<html> Hambers in momenti scelti nella reazione. Produzione di proteine ​​può essere visto sia all&#39;interno delle camere di reazione e fuori le camere nel canale principale. (B) EGFP è stato clonato in un vettore Pet3a, fornendo un promotore T7 polimerasi e terminatore e un sito di legame forte ribosoma (RBS). (C) misure di fluorescenza normalizzati di espressione costitutiva di EGFP in una reazione cell-free di massa eseguita in un lettore di micropiastre. Reazioni CFPS solito producono proteine ​​rapidamente prima di rallentare a una fluorescenza &#39;stato stazionario&#39; - questo è associato con limitazione delle risorse 43. Trattini neri indicano la traccia media. (D) di fluorescenza normalizzato di 51 prime tracce di fluorescenza di intensità letti da 51 camere di reazione su diversi esperimenti. Trattini neri indicano la traccia media su diversi esperimenti, che illustrano la componente deterministica dell&#39;espressione proteica./52616/52616fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52616/52616fig4.jpg" /> Figura 4. individuali Tracce rumore e rumore di autocorrelazione di un sistema cellulare e Cell-Free. (A) Da Austin et al., 2006. Rumore di espressione GFP (in alto) e funzioni di autocorrelazione normalizzati (in basso) acquisiti da monitoraggio produzione GFP nei batteri 25 vivente. Ristampato da permesso da Macmillan Publishers Ltd: [Nature] 25 (Vol. 439), diritto d&#39;autore (2006). (B) Noise nell&#39;espressione GFP (in alto) e funzioni di autocorrelazione normalizzati (in basso) acquisite dalla produzione GFP sistema cell-free, rintracciato in camere di reazione del dispositivo di microfluidica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52616/52616fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui</a>per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Viene descritto un dispositivo microfabbricato con camere di reazione sigillabili a volume di femtolitro. Questo rapporto include un protocollo per sigillare i reagenti di sintesi proteica liberi da cellule all'interno di queste camere allo scopo di comprendere il ruolo dell'affollamento e del confinamento nell'espressione genica.

Array sigillabile Femtoliter camera di Biologia gratis-Cell

Cell-free systems provide a flexible platform for probing specific networks of biological reactions isolated from the complex resource sharing (e.g., ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di confinare reazioni di sintesi proteica acellulare in volumi pertinenti alle cellule. Questo risultato si ottiene innanzitutto realizzando un dispositivo A-P-D-M-S mediante tecniche di litografia morbida stratificata. Successivamente, si prepara una reazione di espressione proteica acellulare, la si introduce nel dispositivo e si formano un insieme di reazioni isolate all'interno di un array di camere microfabbricate.Successivamente, il dispositivo viene immaginato mediante microscopia fluorescente a intervalli di tempo. L'ultimo passaggio consiste nella misurazione dell'intensità fluorescente di ogni pozzetto nel tempo. In definitiva, questi andamenti di fluorescenza vengono utilizzati per mostrare il rumore nell'espressione proteica in reazioni acellulari confinate.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come lo studio del rumore in cellule vive, è che i sistemi sintetici possono essere facilmente sottoposti a condizioni come il confinamento, che non possono essere facilmente controllate nei sistemi viventi. Per iniziare il processo di microfabbricazione, preparare innanzitutto una miscela di PDMS in rapporto ponderale di 20 a uno, misurando 10 grammi di base di PDMS e 0,5 grammi di agente indurente in un piccolo contenitore di plastica. In un altro contenitore, pesare una miscela di PDMS in rapporto 5 a 1 in quantità sufficiente a riempire una valvola di controllo.Stampo master fino a un centimetro di spessore. Mescolare uniformemente le due parti con una spatola e inserire le capsule in un vuoto per 20-30 minuti per eliminare tutte le bolle dalla miscela durante la degasazione. Posizionare lo stampo master della valvola di controllo in un contenitore di vetro.Versare la miscela di PDMS in rapporto cinque a uno per la degasificazione sullo stampo della valvola di controllo. Trasferire il contenitore di vetro nel desiccante sotto vuoto e degasare il PDMS per altri 20-30 minuti. Successivamente, posizionare il master della membrana su un spin coater, fissarlo con lo chuck e versare con attenzione un’aliquota del PDMS morbido in rapporto 20 a uno sulla wafer.Fare ruotare la wafer per 45 secondi per formare un sottile strato di PDMS con uno spessore approssimativo compreso tra 30 e 60 micrometri dopo la degasatura. Far polimerizzare parzialmente sia la wafer di PDMS depositata per centrifugazione sia il PDMS della valvola di controllo in un forno a 80 gradi Celsius rispettivamente per sei minuti e 15 minuti. Verificare il grado di polimerizzazione premendo delicatamente il blocco di PDMS con pinzette o una spatola.Se la reticolazione non è completa, estendere il tempo di incubazione di alcuni minuti. A 80 gradi Celsius, un blocco di PDMS parzialmente reticolato dovrebbe mantenere la propria forma. Premendo con una combinazione di bisturi e pinzetta, tagliare con attenzione e separare i blocchi di PDMS dal master della valvola di controllo, quindi praticare i fori di ingresso attraverso i blocchi di PDMS utilizzando una punzonatrice da 0,75 millimetri. Rimuovere tutti i detriti interni ai canali inserendo un ago da 23 gauge a punta smussata all'interno di ciascun foro ed eliminare i detriti esterni sulla superficie del PDMS con del nastro adesivo trasparente.Per preparare le superfici per la legatura PDMS-PDMS, posizionare la wafer di PDMS rivestita per spin coating sulla piastra del microscopio. Spostare la piastra e individuare i segni di allineamento per la legatura PDMS sulla wafer, al fine di semplificare la complessità del successivo processo di allineamento manuale. Queste caratteristiche di ausilio visivo all'allineamento devono essere progettate in precedenza in modo da essere adiacenti alle camere di reazione dei chip.Dopo aver individuato i segni di allineamento sul wafer rivestito con spin coating, utilizzare pinzette incrociate per posizionare con attenzione il blocco in PDMS della valvola di controllo sopra il wafer rivestito mediante spin coating, eseguendo movimenti lenti e costanti. Individuare i segni di allineamento corrispondenti sulla parte superiore del blocco in PDMS della valvola di controllo. Quando il blocco superiore in PDMS è allineato otticamente con le caratteristiche di allineamento corrispondenti sul wafer rivestito, premere delicatamente le due superfici in PDMS in modo che vengano a contatto tra loro.Ispezionare la struttura allineata al microscopio per assicurarsi che sia le camere di reazione che i canali di ingresso siano visibili all'interno della regione rettangolare della valvola di controllo. Ripetere la procedura di allineamento e di contatto interfaciale per gli altri componenti del dispositivo. Dopo aver completato l'allineamento di tutti i componenti e superato l'ispezione visiva, posizionare i componenti in PDMS in un forno e polimerizzarli a 80 gradi Celsius per due ore.Questo passaggio di incubazione formerà successivamente un'interfaccia di legame permanente P-D-M-S-P-D-M-S. Estrarre la struttura in PDMS legata dal forno e raffreddarla a temperatura ambiente sul banco di lavoro. Tagliare la struttura in PDMS ed estrarre il chip in PDMS legato dallo stampo in silicone utilizzando un punzone con anima da 0,75 millimetri.Forare i fori di ingresso e uscita microfluidici. Rimuovere tutti i detriti interni ai porti utilizzando un ago da 23 gauge smussato nelle fasi finali del processo di fabbricazione del chip. Posizionare la struttura in PDMS e un'ampia copertura in vetro numero zero pulita all'interno della camera al plasma, con la membrana in PDMS e le superfici di legame vetro entrambe rivolte verso l'alto nel plasma.Trattare entrambi gli oggetti a 10,5 watt per 20 secondi utilizzando l'aria come sorgente di gas. Rimuovere immediatamente il vetrino di vetro e il blocco in PDMS dal pulitore al plasma. Dopo il trattamento, capovolgere con attenzione il blocco in PDMS e porre la superficie della membrana in PDMS a contatto con il lato del vetrino trattato al plasma.Infine, polimerizzare il dispositivo completato a 80 gradi Celsius per due ore per creare un'interfaccia di legame permanente in vetro PDMS. Prima dell'esperimento, idratare il dispositivo in PDMS facendolo bollire in acqua deionizzata per un'ora oppure immergendolo tutta la notte in acqua sterile a temperatura ambiente. Inoltre, portare la camera ambientale del microscopio invertito alla temperatura di equilibrio di 30 gradi Celsius.Successivamente, montare il chip in PDMS idratato sul supporto del palchetto del microscopio utilizzando nastro adesivo in cellophane per prevenire un'eccessiva disidratazione del chip durante i passaggi di incubazione dell'esperimento. Avvolgere i bordi del dispositivo con carta assorbente bagnata per attivare le valvole di controllo in PDMS e per controllare il processo di caricamento del campione all'interno della reazione principale. Si devono utilizzare due trasduttori di pressione a tensione in loop chiuso per modulare la pressione del gas azoto per ciascun processo.Inoltre, per semplificare le connessioni fluidiche tra i trasduttori e il chip al fine di realizzare le connessioni fluidiche della valvola di controllo, si dovrebbe utilizzare una combinazione di tubi da 24 gauge e adattatori lure lock maschio-maschio. Per prima cosa, dedicando un trasduttore di pressione a questo compito, partendo dall'estremità del trasduttore, la prima sezione del percorso fluidico consiste in un tubo lure asimmetrico da 24 gauge collegato a un adattatore lure maschio-maschio, che a sua volta è collegato a un ago affilato da 23 gauge, inserito in una provetta di vetro da quattro millilitri contenente un serbatoio d'acqua chiuso con tappo settato. Successivamente, la seconda sezione del percorso della valvola di controllo comprende un ago affilato da 23 gauge, seguito da un adattatore lure maschio-maschio, collegato a un tubo simmetrico da 24 gauge, che termina con un insieme di adattatori lure maschio-maschio fissati a un ago da 23 gauge smussato.Per completare il montaggio della valvola di controllo, l'ago affilato da 23 gauge viene inserito nel serbatoio dell'acqua, mentre l'estremità dell'ago smussato verrà inserita nell'ingresso della valvola di controllo del dispositivo in PDMS. Passando alla configurazione dell'ingresso della camera di reazione, il set principale di connettori per il loop del campione è costituito da un tubo nonsimmetrico da 24 gauge collegato a un adattatore maschio-maschio a innesto vite, seguito da un ago da 23 gauge smussato inserito in un tubo da 24 gauge e terminante con un ago smussato da 23 gauge inserito direttamente nel tubo senza bloccaggio a vite; l'estremità femmina prossimale verrà collegata alla siringa o a un secondo trasduttore di pressione durante la fase di caricamento del campione del protocollo. L'estremità distale smussata dell'ago verrà invece collegata all'ingresso della camera di reazione del dispositivo in PDMS utilizzando un sistema di espressione proteica privo di cellule, o CFPS (acronimo di cell-free protein expression system); seguire il protocollo del produttore e preparare tutti i reagenti necessari sul ghiaccio o in un blocco di ghiaccio per questo sistema microfluidico.Un volume tipico di reazione CFPS per l'espressione costitutiva di GFP in estratti cellulari interi di e coli è di circa 25 microlitri per ogni saggio. Il plasmide di DNA deve essere aggiunto per ultimo per prevenire l'espressione prematura delle proteine fluorescenti. Il caricamento del campione sul chip microfluidico comprende cinque passaggi principali.Per iniziare, collegare una siringa da un millilitro all'estremità femmina dell'esca del connettore del loop di campionamento. Successivamente, inserire l'estremità del connettore con ago smussato in un tubo contenente la reazione CFPS ed aspirare la miscela di reazione completamente assemblata nel tubo fino a quando l'intera miscela di reazione non sarà stata caricata nel loop di campionamento. Rimuovere l'estremità con ago smussato dal tubo da microcentrifuga ed inserire l'ago nell'ingresso della camera di reazione del chip al quarto passaggio.Scollegare la siringa dal loop campione e collegare l'estremità libera del lure femmina del loop campione a un adattatore lure maschio collegato a un secondo trasduttore di pressione. Infine, attivare il secondo trasduttore di pressione per avviare il caricamento del campione. Quando il canale microfluidico è stato riempito con i reagenti CFPS, rimuovere l'ago smussato dalla porta di ingresso in PDMS.Inserire ora l'ago ottuso collegato al primo trasduttore di pressione e al serbatoio d'acqua nell'ingresso del canale della valvola di controllo. Dopo il caricamento del campione, aprire la camera ambientale e fissare il dispositivo in PDMS sulla piastra del microscopio. Individuare le camere di reazione utilizzando un obiettivo a immersione in olio da 100x.Sotto illuminazione in campo chiaro, azionare il trasduttore di pressione della valvola di controllo a 20 PSI. L'azionamento della valvola può essere osservato visivamente notando i cambiamenti nel contrasto dello strato di PDMS. Regolare la messa a fuoco in modo che il piano focale corrisponda all'interfaccia inferiore in vetro del dispositivo.Infine, impostare la frequenza di acquisizione dei dati su un'immagine al minuto e iniziare la microscopia a fluorescenza. Continuare a raccogliere dati fino a quando la sintesi proteica in tutti i pozzetti non avrà raggiunto una fluorescenza di stato stazionario. Nel momento della prima acquisizione dell'immagine, verificare il timer del laboratorio e registrare il tempo trascorso dall'introduzione del DNA nella reazione. Dopo aver eseguito la microscopia a fluorescenza, iniziare il processo di analisi dei dati aprendo tutte le immagini con un software di elaborazione delle immagini, come ImageJ. Selezionare l'interno delle camere di reazione come area di interesse o ROI. Per tutte le immagini, la fluorescenza totale della selezione costituirà il tracciato grezzo dell'intensità di fluorescenza.Utilizzando il gestore delle ROI, selezionare le regioni di interesse attorno alla zona interna di ogni camera di reazione nella barra degli strumenti; impostare le proprietà automatiche delle ROI sulle aree corrispondenti all'interno di ciascuna camera di reazione. Quindi verificare, aggiungere, fare clic e selezionare tutte le camere presenti sullo schermo. Infine, evidenziare tutte le ROI.Nel gestore delle ROI, utilizzare la funzione di misurazione multipla per determinare l'intensità fluorescente media di ciascuna ROI in tutta la serie di immagini. Con tecniche standard di fabbricazione del PDMS, la sintesi della GFP all'interno di ciascun pozzetto di dimensioni femtolitro è completamente isolata dal suo ambiente immediato e può essere analizzata singolarmente mediante tecniche di imaging e fotobleaching, tutte attivate mediante valvole di controllo in PDMS definite dall'utente.Con una vasta serie di pozzetti, ognuno dei quali si avvicina al volume intracellulare di un singolo batterio, la natura stocastica dell'espressione genica a livello di singola cellula può essere analizzata mediante la quantificazione della fluorescenza all'interno di ciascun pozzetto in funzione del tempo. Questo risultato può essere confrontato con lo stesso saggio di espressione proteica priva di cellule eseguito in un volume di reazione maggiore, pari a 15 microlitri, in cui la natura stocastica del sistema di espressione risulta mascherata dalla media di insieme di numerosi segnali di fluorescenza, permettendo così un confronto tra il profilo di espressione proteica di un insieme di batteri vivi e quello di reazioni acellulari individuali per pozzetto. Sebbene le ampiezze delle fluttuazioni siano simili, la decadenza dell'autocorrelazione è più rapida nei profili di espressione acellulari.Il tempo di autocorrelazione all'interno delle cellule è controllato dalla crescita e dalla diluizione della GFP, che non avviene nei sistemi acellulari. In alternativa, il tempo di autocorrelazione è controllato dal decadimento del tasso di sintesi proteica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare piattaforme sintetiche microfabbricate come modelli per comprendere meglio in che modo l’affollamento e il confinamento possono influenzare i processi biologici.

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