去除微量元素的氧化铜纳米粉体制备铀
1Division of Physical Therapy, Department of Orthopedics & Rehabilitation, University of New Mexico, 2Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 3School of Pharmacy, University of Wyoming, 4Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 5Center for Environmental Medicine, Colorado State University, 6College of Pharmacy, California Northstate University

Published 6/21/2015
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Schilz, J. R., Reddy, K. J., Nair, S., Johnson, T. E., Tjalkens, R. B., Krueger, K. P., et al. Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability. J. Vis. Exp. (100), e52715, doi:10.3791/52715 (2015).

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Abstract

在原位恢复(ISR)是提取铀在美国的主要方法。期间的ISR,铀是从矿体浸出,并通过离子交换萃取。所得的生产泌水(PBW)含有污染物,如砷等重金属。 PBW从激活ISR铀设施处理样品与氧化铜纳米粒子(氧化铜纳米粒)。的CuO-NP处理PBW降低优先污染物,包括砷,硒,铀,和钒。未处理和CuO-NP处理通过MTT(3-(4,5-二甲基吡啶-2-基)-2,5-二苯基溴化)测定PBW用作细胞生长介质和变化生存能力的液体成分分析在人胚肾(HEK 293)和人肝细胞癌(Hep G2细胞)细胞。的CuO-NP处理用改进的HEK和HEP细胞活力有关。这种方法的限制包括稀释PBW由生长培养基成分和渗透压克分子期间先进而精湛调整以及必要pH调节。这种方法是在其更广泛的范围,由于稀释作用以及变化PBW的pH是传统微酸但是限制;这种方法可以有更广泛的用途评估的CuO-NP处理的较为中性的水域。

Introduction

大约是美国电力供应的20%是由核能,部分基于国家鼓励提高能源独立性提供,预计美国的核能力,以增加1。核能的全球增长预计也将继续,与许多美国以外的2出现的增长。截至2013年,美国铀的83%是进口的,但储量952544吨,在美国3,4存在。在2013年有7个新设施的应用和怀俄明州,新墨西哥州,内布拉斯加州和5之间14重启/扩展应用。在美国,铀为主通过原位恢复(ISR)处理6萃取。 ISR导致更少的土地破坏和避免造成尾矿堆,可以释放环境污染物7。 ISR使用水基氧化解决方案,以从​​地下矿石体,在这之后的铀从浸出液通过提取浸出铀离子交换过程8。维持负面水平衡在矿体,浸出液的一部分,被称为生产流血水(PBW)中,放血关闭。所述PBW的一部分被利用反渗透(RO)和净化重新引入开采过程中,但PBW也可以有利于工业或农业用途,如果有毒的污染物可以减少到由状态管理机构对于表面确定的可接受水平和地下水9。目前,大多数ISR铀的设施使用RO从PBW去除污染物。然而,反渗透处理是能源密集型,并产生有毒废物盐水,这需要监管的处置。

许多水净化方法都存在,包括吸附剂,膜和离子交换。在这些中,吸附是最常用的,并且最近的发展纳米颗粒合成具有增强的吸附剂基水净化处理10的功能。铜OXI德纳米颗粒(氧化铜纳米粒)以前没有被广泛研究对铀的ISR PBW,但在最近的污染物去除从地下水的研究,氧化铜纳米粒被发现有独特的性能,包括无需预处理或后处理的水处理工序( 例如 ,调节pH值或氧化还原电位),并在不同的水成分表现良好( 例如 ,在不同的pH值,盐的浓度,或竞争离子)11。另外,氧化铜纳米粒容易通过用氢氧化钠(NaOH),之后,将再生的CuO纳米粒可重复使用浸出再生。从天然水域的CuO-NP微量金属过滤功能细节已先前公布11-14。

虽然对水处理是有用的,金属氧化物纳米颗粒可能是有毒的活生物体,但毒性的程度取决于,部分地基于纳米粒子的特性和成分10,15,16。因此,研究SIMULT是很重要现场应用之前aneous污染物的去除和纳米粒子毒性。目前的研究确定的CuO纳米粒的能力以去除PBW优先污染物(包括砷,硒,钒和铀),和评估的CuO-NP处理对PBW细胞毒性的影响。

PBW从有源ISR铀设施收集并用于确定在优先的污染物去除的CuO-NP处理的功效。之前和之后的CuO-NP处理PBW细胞毒性也进行了评估。 PBW是一个复杂的地质(工业/环境)的混合物和环境都和健康科学(NIEHS)国家研究所和机构的有毒物质及疾病登记(ASTDR)是把重点放在学习环境相关的混合物,包括混合物的毒性因为它们在自然界或工业设置,以及在体外测试促进存在优先的化学品进行进一步的体内测试17-19。是慢性,低剂量暴露的混合物具有挑战性的研究,因为长期接触低剂量的混合物,不会产生明显的影响,至少在大多数实验室研究的很短的时间框架。同样,大多数化学混合物的体外研究细胞暴露于两种或更多种金属20,21限定的实验室制造的混合物。这些研究提供基线信息,但简化的混合物不复制,可能会出现一个天然的,环境样品,其中所述全方位混合物组分都存在于该复合拮抗和协同相互作用。

本研究的目标是检查供PBW备用污染物去除工艺和评估(的CuO-NP)的治疗上PBW细胞毒性使用培养的人类细胞的效果。该结果可能通过更有效的或环保的方法来去除污染物的发展中受益的铀业。这项研究提供第一个证据是PBW减少污染物优先由氧化铜纳米粒在哺乳动物细胞中22毒性降低。

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Protocol

所有样本收集在怀俄明州铀ISR设施铀液体处理建设。

1.生产渗水(PBW)

  1. 收集两种类型的水样从ISR铀设施:PBW和反渗透(RO)水。从离子交换处理后的监测抽头但反渗透净化之前收集PBW。收集的RO样品后PBW通过反渗透处理去污。
    注:浸滤剂输送来自多个井场的铀处理液体的建筑物,在那里被收集在柱和离子交换制得的管道。大约经过离子交换的浸滤剂的1-3%被从电路移除,称为生产排出水(PBW)。 PBW被重新用在挖掘过程或净化/脱钙用RO过滤。
  2. 收集在高密度聚乙烯水样(HDPE)瓶,根据零头部空间为样品采集和环境质量的怀俄明部门(WYDEQ)23分析标准作业程序。
  3. 测量温度和pH现场及运输样品在冰上,让他们冷静。
  4. 商店PBW在4℃。保持PBW液冷却,直至浓缩鹰的最低基本培养基(EMEM-10X),此前有媒体在制备过程中加入的指示在以下协议。
    注:PBW是氧化的溶液,将沉淀如果允许冻结或温热至室温。稀释后的PBW溶液足够稀该应用之前它不会沉淀当加热到37℃至细胞和孵育期间。

2.制备氧化铜纳米粒子(的CuO-NPS)

  1. 结合含有250mM毫升的0.2M的CuCl 2•2H 2 O,加入250毫升的0.4M的氢氧化钠(NaOH),和5克聚乙二醇纯乙醇溶液(PEG)在一个圆底烧瓶中6毫米硼硅酸盐玻璃球。
  2. 放置在修改后的微波炉的溶液,并允许它在20%的功率(的6秒的时间间隔,24秒关)在回流下反应,在环境空气压力10分钟。
  3. 冷却该溶液到室温(20℃),然后倾入50ml锥形管中,留下的玻璃球。
  4. 离心机在1000×g离心30分钟,滗析该溶液在50ml锥形管中,然后洗的CuO纳米粒用300毫升热水(60-65℃),100毫升乙醇中的序列,和100毫升丙酮。
  5. 干燥的CuO纳米粒在50ml锥形管中室温(20℃)。
  6. 刮氧化铜纳米粒他们的管研钵中。覆盖的CuO纳米粒用锡箔和加热的CuO纳米粒至110℃的炉中以除去残留的液体。结合氧化铜纳米粒为一个批次,重量CuO的纳米粒。
    注:氧化铜纳米粒和CuO-NP处理PBW的制备是在水中进行的Qual生态系统科学与管理,怀俄明大学的实验室性。的CuO-NP合成接着马丁森和雷迪(2009)11的方法。

3.治疗PBW与氧化铜纳米粒

  1. 加50毫克的CuO-NP(1毫克/毫升),以50毫升锥形管中随后50毫升PBW的。密封管,并在250转反应30分钟的长凳上顶轨道摇床。
  2. 离心样品管在250×g离心30分钟,然后用0.45微米的注射器过滤器过滤上清液。改变离心机速度和时间可以取决于纳米颗粒,以确保的CuO纳米粒成为紧凑的离心管中。

4.元素分析

  1. 制备未处理(对照)和CuO-NP处理PBW样品进行元素分析如下。
  2. 酸化的CuO-NP-处理和未处理PBW等份(40毫升)与痕量金属级硝酸至pH 2.0。对于阳离子通过感应coupl分析酸化PBW等分编等离子体-质谱(ICP-MS),如雷迪和Roth(2012)13中所述。
  3. 制备的CuO-NP-处理和未处理PBW的未酸化等份(20毫升)并分析未酸化等份阴离子通过如雷迪和Roth(2012)13中所述的离子色谱法(IC)。
    注:等分被农业部分析服务的怀俄明部门,怀俄明州拉勒米的82070. IC和等离子体质谱过程的描述可以在雷迪和罗斯,(2012)13中找到分析。

5.制备细胞培养基使用PBW

  1. 使用两个控制(EMEM-1x和RO +媒体)和八个PBW测试的媒体解决方案(四种浓度每未处理PBW和CuO-NP处理的介质)的可行性研究。是溶液的概述如下:
    1. 对于EMEM-1X控制,购买的Eagle氏最低必需培养基(EMEM-1×)与L-谷氨酰胺和碳酸氢钠已经添加。添加胎牛血清(FBS)并且按照制造商的说明,抗生素。
      注:EMEM-1X被购买稀释到适当的浓度对细胞生长和含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠。 EMEM-1X需要添加胎牛血清(FBS)和青霉素和链霉素(50IU / ml青霉素和50μg/ ml链霉素)的抗生素混合物的。 EMEM-1X被用作对照培养基,因为它是在制造商推荐的生长培养基在该研究中使用两种类型的细胞。浓缩EMEM-10倍,从设施或未经处理或的CuO-NP处理PBW稀释RO水,以产生测试溶液。浓缩EMEM-10倍时购买不包含所以这些被添加除了胎牛血清(FBS)和青霉素和链霉素的抗生素混合物L-谷氨酰胺或碳酸氢钠。
    2. 对于RO控制解决方案中使用RO水从ISR收集设施。使用相同的协议PBW测试仅媒体替代100%RO笏呃从地方PBW的ISR设施。从实验室稀未处理和CuO-NP处理液使用的RO或超纯水。
    3. 稀未处理PBW为四个测试浓度与细胞培养基成分混合之前。通过在下列组合混合未处理PBW用RO(从实验室)制备的4种不同浓度的未处理PBW溶液:100%(纯PBW +无RO水),75%(187.5毫升PBW +62.5毫升RO水的), 50%(125毫升PBW + 125毫升RO水的)或25%(62.5毫升PBW +187.5毫升的RO水)。
    4. 稀的CuO-NP处理PBW为四个测试浓度与细胞培养基成分混合之前。在下列组合通过混合PBW制备的4种不同浓度的的CuO-NP处理PBW溶液(预处理用1毫克/毫升的CuO-NP,30分钟)用RO(从实验室):100%(纯CuO- NP处理PBW +无RO水),75%(187.5毫升的PBW +62.5毫升RO水的CuO-NP处理的),50%(125毫升的CuO-NP处理PBW + 125毫升RO水)或25%(62.5毫升的CuO-NP处理PBW +187.5毫升的RO水)。
  2. 加入25毫升浓EMEM-10倍的190毫升100%的RO及100%,75%,50%或准备250毫升反渗透+媒体,未处理PBW +媒体和CuO-NP处理PBW +媒浓度在步骤6.1.3和6.1.4中创建的预制未处理的或氧化铜-NP处理PBW浓度的25%。
  3. 调节每个溶液至7.4,用NaOH或HCl的pH。
  4. 补充未处理和CuO-NP处理PBW的各个浓度以及反渗透+媒体具有以下标准组件:25毫升(10%)胎牛血清(FBS),2.5毫升L-谷氨酰胺,0.55克碳酸氢钠和1.25ml笔/链霉素(50IU / ml青霉素和50μg/ ml链霉素)。
  5. 调整未处理PBW +介质的每个浓度的渗透压,加入RO水,并用渗透压计测量的CuO-NP处理PBW +媒体以及RO +媒体290-310毫渗透摩尔浓度/千克。
  6. 使用过滤器每个解决方案0.22微米真空过滤器单元,并储存在4℃。
    注意:由于在RO水用于调节渗透压的量的轻微变化,变化在5%范围内的最终介质浓度,与未处理PBW +媒浓度在56%,44%,29%和16.5%,和CuO-NP-处理PBW +媒浓度为53%,45%,30%及17%。

6.细胞活力

注:由于肾脏和肝脏的重金属毒性的靶器官,采用培养的人类胚胎肾(HEK293)细胞(HEK)和人肝癌(肝癌)细胞(HEP)的测试方法24-26。

  1. 电镀在根据制造商的说明,将实验中使用的96孔板前2-3天制备HEK和HEP细胞的培养物。
  2. 使用3- [4,5-二甲基吡啶-2-基] -2,5-二苯基溴化物(MTT)测定法测量细胞活力。
    注:MTT法协议是从眉修改rloo 等人。(2011)27。
    1. 以粉末形式获得MTT。添加磷酸盐缓冲液(PBS),以弥补股票浓度为50毫克/毫升。搅拌该溶液2小时,然后过滤用0.45μm针筒式滤器和分装成1.5毫升冷冻安全管。避光并储存管在4℃下。
  3. 从用胰蛋白酶,离心其培养皿除去HEK和Hep细胞在1000×g离心5分钟,并滗出胰蛋白酶。加入5毫升的PBS和混合细胞以获得单细胞溶液。然后,应用将20μl单细胞溶液到血球以获得每毫升溶液细胞计数。再次离心细胞在1,000×g离心5分钟,倒出PBS用于冲洗细胞。添加EMEM-1倍的适量调节细胞浓度至500个细胞/ 100微升(100μl/孔)。
  4. 填充板的周边的孔用200μlPBS中,以控制蒸发。
  5. 种子细胞s的500个细胞/孔的密度,加入100微升至每个孔,除了外围孔(其不与细胞铺板)。
    注:播种密度和HEK Hep细胞是基于实验的增长曲线,使经济增长的高峰期发生天左右4-5。准备生长曲线对所有细胞系来估计接种密度。
  6. 孵育细胞24小时,在37℃下使它们进行细胞密度的基线MTT读数之前恢复(形式​​紧粘连至板)。
  7. 通过从第一塔提取播种介质(不包括周边)并加入100微升的MTT(5mg / ml的在介质)向孔1小时进行细胞密度的基线MTT读数。
  8. 一小时后,取出MTT法和加入100微升二甲基亚砜(DMSO)的溶解由活细胞(20分钟)产生的MTT-甲。
  9. 读出的第一列的光密度(OD)在570纳米的吸收波长,得到基行读取。
    1. 使用基准读数,以确保所有平板接种正确和细胞板之间持续增长。从塔中取出DMSO培养未来24小时前进行测试。
      注意:如果二甲基亚砜留在板过夜它拉水分从相邻列,导致在介质体积的减少。
  10. 温暖的测试解决方案( EMEM-1X,RO,未经处理的PBW和CuO-NP处理PBW媒体解决方案),以37℃的水浴。
  11. 从板(不包括周边或将其用于基线读数的第一列),并用100微升EMEM-1倍,反渗透+媒体,未处理PBW +媒浓度或的CuO-NP的取代的其余部分移除播种媒体 - 处理PBW +媒体浓度(每盘一个解决方案)。孵育细胞在他们的测试浓度或控制解决方案,共七天(天2-8)。
    注:10共板块:1 EMEM-1X,1 RO +媒体,各1个未处理PBW +媒体浓度(56%,44%,29%和16.5%),每个的CuO-NP处理PBW +媒体集中的一个板块(53%,45% ,每细胞系实验的30%和17%)。
  12. 每天以下基准MTT阅读,从各自板的下一列取下控制和测试解决方案(下6.11的说明中列出)( 第2天测试和控制媒体从第3行中删除,BG井;第3天:行4,井BG ),并重复MTT协议为在上述步骤6.7-6.9所述。
  13. 每天重复协议七天。平均外径结果的每一行(6孔),并报告与时间,以产生一个七天的生长曲线。
  14. 为了评估铜螯合的对细胞活力的影响的CuO-NP处理PBW +媒体按照相同的步骤如上述,除了加入的解决方案,以它们各自的板之前添加的D-青霉胺100μM的控制和测试方案。执行数据肛ysis用科学绘图软件。

7.地球化学模拟

  1. 从以下网站下载的Visual MINTEQ 3.0 / 3.1一个免费http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/
    注:Visual MINTEQ是一个免费的化学平衡模型的金属形态,溶解平衡,吸附天然水域的计算。此外,它是用来预测离子物种,离子活动,离子络合物和饱和指数是相对于元件的前,后处理(质谱结果)的浓度,以检查元件除去28的可能机制。
  2. 打开程序和输入从第4步,包括pH值,碱度和不同的元素的浓度,进入程序的质谱数据。
    注:由于地下水过程中就地 urani氧化嗯提取工艺,用砷,钒和铀的氧化物质为输入。

8.抑制浓度50(IC 50)

  1. 由第一平均上的三个独立的运行5天的存活率(OD平均值)计算的IC 50为未处理和CuO-NP处理PBW +介质的浓度。
  2. 减去第五天从生存能力EMEM-1X的第五天生存能力平均未处理和CuO-NP处理PBW +媒体浓度的平均值来计算可行性的差异。然后除以在EMEM第5天的存活率差异由平均存活率,再乘以100得到的抑制百分比。
  3. 减去100(EMEM-1X生存能力)抑制百分比,以获取每个未处理和CuO-NP处理PBW +媒体集中的百分比生存能力。
  4. 输入到通过设置EMEM-1x在一个的浓度和为100%的存活率科学绘图软件;全部改造成浓度日志规模(X =日志(X)),并进行非线性最小二乘回归拟合分析。

9.数据分析

  1. 在未经处理的和CuO-NP处理PBW元素的浓度与双尾成对,学生T检验进行比较。
  2. 通过使用收集的七天增长曲线的数据计算的曲线(AUC)下面积,并分析与重复测量方差分析(ANOVA)的方差,然后所有组之间Tukey的事后比较(n = 3时)。
  3. 通过使用数据从生长曲线的五天为未处理和CuO-NP处理PBW +媒体溶液(如上所述)计算IC 50值。对<0.05被认为是显著P值。
    注:统计分析的目的,一半的检出限质谱值被分配到离子浓度水平低于该限制29。

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Representative Results

PBW成分浓度和pH值在未处理和CuO-NP处理PBW报道于表1中 。马丁森和雷迪(2009)报告说,估计在9.4±0.4的零电荷的CuO-NP的点。鉴于PBW的pH为7.2-7.4,在这些条件下,水捐赠质子的CuO纳米粒,使纳米颗粒表面带正电荷,允许带负电荷的物质的吸附。从PBW的CuO-NP处理去除优先污染物,包括砷,硒,铀和钒( 表1)。平均砷浓度降低了87%[从0.0175到0.002毫克/升(双尾配对t检验,p <0.0001)。的CuO-NP处理也显著还原的硒(30%),铀(78%),钒(92%)和磷酸(85%)(P <0.05)。

形态的模拟结果,报告在表2中 ,支持分析结果:99%的至在PBW TAL溶解砷是作为HAsO 4 2-和H 2麻生太郎4 -在PBW总溶解硒的94%是目前搜索引擎优化4 2-。这些物种是带负电荷,因此能吸附在CuO纳米粒的。形态建模预测,99%的钒物种PBW的带负电,也促进吸附对于CuO纳米粒。然而,形态建模预测只有35.5%的铀的物种是带负电荷,这将限制吸附在CuO纳米粒的。饱和度指数分析预测,无种属砷,selenium-,铀或含钒矿已接近饱和( 矿物质沉淀)级别,支持吸附氧化铜纳米粒,与沉淀。

为了评估预期的优先污染物浓度在来自未处理和CuO-NP处理PBW,未稀释的对照培养基样品(EMEM-1×),56%制成的媒体未经PBW +媒体和53%的CuO-NP处理PBW +媒体用ICP-MS分析。未稀释的对照培养基(EMEM-1×)是具有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠供给市售品(预添加)。铜和硒浓度控制EMEM-1X被稍微升高的如预期的,因为它们是为细胞生长所必需的,但砷,铀和钒是可以忽略不计,报告在表3中 。初步研究表明,砷,硒和钒的浓度分别降低的CuO-NP处理,而且减少了在的CuO-NP处理PBW +介质的浓度表示。铀中的CuO-NP处理PBW +介质的测量浓度下降相比,未经处理PBW,而这个下降是比预期的Visual MINTEC第3节建模更加明显。铜含量上升的CuO-NP处理媒体如预期。

要确定的CuO-NP治疗,以改善PBW的毒性对哺乳动物的能力细胞活力评估细胞暴露于PBW +媒体解决方案之前和之后的CuO-NP处理。两者的HEK( 图1A)和HEP( 图1B)细胞暴露于不同浓度的未处理或处理的PBW +介质的多达7天。在未处理PBW +培养基中生长的细胞,生存力以浓度依赖性方式受损,而的CuO-NP处理提高细胞生存力在这两个细胞系。集成AUC的图1C显示,在生长的HEK细胞的CuO-NP处理PBW +相比,未经处理PBW +媒体在三个最高浓度(29%,44%和56%)的介质是更可行的。 HEP细胞显示稍微不同的活力:未处理PBW +培养基(44%和56%),只有两个最高浓度表现出受损存活率相比的CuO-NP处理PBW +媒体( 图1D)。越稀浓度PBW的要HEP细胞毒性较低,和细胞活力较少受治疗。该在16.5%未处理PBW +培养基中生长两者的HEK和Hep细胞的存活力没有显著差异在53%的CuO-NP处理PBW +介质(P <0.05)中生长的细胞。因此,氧化铜-NP处理出现改善PBW的细胞毒性,附近控制水平的可行性。如上所述,氧化铜-NP处理PBW是与增加铜的浓度相关联。这一增长预期的基础上,由雷迪和Roth(2012)先前的结果,他们在使用的氧化铜纳米粒从地下水去除砷。在铜的增加是依赖于PBW的具体水化学,但仍保持为1.3毫克/升以下的EPA的MCL。但是,重要的是要排除的增加铜的浓度利于提高存活率( ,除了或代替,在优先的污染物的减少)。因此,铜螯合剂D-青霉胺加入EMEM-1X控制,RO +媒体控制,未经处理和CuO-NP处理PBW +媒体解决方案,与日烯MTT生存力生长曲线生成,如上所述。铜螯合没有显著影响孵育反渗透+媒体控制,未处理和CuO-NP处理PBW +媒要么的HEK或hep细胞的存活力(结果未显示)。

的半数最大抑制浓度(IC 50)是从每天5生长的HEK的和未经处理的PBW +培养基( 表4A)和CuO-NP处理PBW +培养基( 表4B)生长HEP细胞来计算。对于在未处理PBW +培养基中生长的HEK细胞中,IC 50值为1.264(日志%PBW)。因此,未经处理的PBW +媒体将必须稀释到18.38%去的降低存活率50%。对于按CuO-NP处理PBW +培养基中生长的HEK细胞中,IC 50值为2.744(日志%PBW)。这一结果表明,在理论上将溶液的毒性降低到该处理将需要PBW +媒体集中由500%(日志%PBW = 2.744),以产生一个类似的50%去的程度打折生存能力。对于在未处理PBW +培养基中生长HEP细胞中,IC 50为1.243(日志%PBW)。这将需要一个稀释PBW +媒体至17.5%,以产生一个降低活力的50%。相反,对于按CuO-NP处理PBW +培养基中生长HEP细胞中,IC 50为5.327(日志%PBW)。这个值可能是如此之大,因为细胞中的CuO-NP处理PBW +介质的存活率不显著不同于在EMEM-1×(对照)中生长的细胞。亮场成像,在五天在图2中示出两者的HEK和HEP细胞生长的,。在的CuO-NP处理PBW +媒体( 图2E,F)的细胞数和附件进行改进相比,未经处理PBW +媒体( 图2C,D)。

图1
图1:生长曲线。生长曲线被用来评估生存能力和克培养物的处理过程中rowth。生长曲线的HEK(A)和HEP生长在四个稀释PBW +介质相比,53%的CuO-NP处理PBW +媒体(上图)(B)的细胞。 EMEM-1X控制(EMEM) ,RO ,53%的CuO-NP处理 ,16.5%未处理PBW ,29%未经处理的PBW ,44%未经处理的PBW ,56%未经处理的PBW 。曲线下面积(AUC)分析HEK(C)和HEP(D)的7天增长曲线的数据(下图)的区域。 * P <0.05相比EMEM控制,#p中<0.05相比反渗透控制,§p<0.05相比53%的CuO的NP处理PBW-介质。采用双尾ANOVA和(相比杜克的事后分析,N = 3)

图2
图2:前和后的CuO-NP处理细胞形态明场显微术的HEK(左列)和HEP(右列)的细胞在第5天的(20X),生长于:EMEM-1个控制(EMEM)(A,B ),56%未经处理PBW +媒体(C,D)和53%的CuO-NP处理PBW +媒体(E,F)被用来研究细胞的形态。在EMEM-1个控制(EMEM)生长的HEK和HEP细胞(A,B)示出健康的,接近汇合生长。在未处理PBW +培养基中生长的HEK和HEP细胞具有降低的号码和出现脱落(C,D)。按CuO-NP处理PBW +培养基中生长的HEK和HEP细胞表现出更好的附着和健康,更融合细胞(E NG>,F)。

元件(毫克/升) 平均来说,圣开发。和意义
治疗前治疗后
0.018±0.001 0.002±0.0 ***
1.8±0.07 1.3±0.05 **
0.0015±0.001 0.93±0.43 *
102±82 106±15
3.3±1.1 1.5±0.4 *
44±2.1 47±1.7
±610; 0.0 627±27
0.98±0.03 0.21±0.03 ***
0.037±0.02 0.019±0.01
12±0.0 12±0.8
12±0.7 12±0.5
1.3±0.07 0.1±0.02 ***
磷酸盐 0.35±0.07 0.05±0.0 ***
硫酸 805±21 807±15
电导率 3125±143 3190±62
pH值 7.31±0.09 7.36±0.05

表1:前和后的CuO-NP处理的阳离子和阴离子的分析平均元素浓度之前,用的CuO-NP处理后。的CuO-NP-处理和未处理PBW的浓度之间意义被指定为* = P <0.05,** = P <0.01和*** = P <0.001。空白单元格表示没有显著差异。氯离子浓度之间46.5±0.707和55.25±8.180之间。铝,硼和钼的浓度很低,表明由于与CuO-NP处理没有显著变化。锰含量并不一致。

组件 %总浓度的 种类
58.7 HAsO 4 2-
410.2 H 2 ASO 4 -
64.1 的Ca 2 UO 2(CO 3)3(水溶液)
32.2 CaUO 2(CO 3)3 2-
0.03 UO 2(CO 3)2 2-
3.5 UO 2(CO 3)3 4-
0.09 的Ca 2 UO 2(CO 3)3(水溶液)
0.02 CaUO 2(CO 3)3 2-
94.3 4的SeO 2-
5.6 CaSeO 4(水溶液)
2.1 HVO 4 2-
95.7 H 2 VO 4-
2.1 H 2 V 2 O 7 2-
0.01 HV 2 O 7 3-
0.01 V 4 O 12 4-

表2:种造型使用Visual MINTEQ版本。 3.0软件。视觉MINTEQ版本。 3.0软件(技术KTH皇家理工学院,Valhallavägen,瑞典)来计算表1中所列的PBW部件的金属形态。(水溶液)=水,而不是该物质的固体形式。

EMEM控制 未处理
PBW PBW +媒体
0.003±0.0 0.017±0.0 0.010±0.001
0.01±0.0 0.0015±0.001 0.018±0.0
Selinium 0.013±0.002 1.75±0.07 1.15±0.06
0.00015±0.0 0.975±0.03 0.71±0.01
0.0015±0.0 1.25±0.07 0.785±0.007
氧化铜NP处理
PBW PBW +媒体
0.0022±0.001 0.0015±0.0
0.926±0.4 0.81±0.0
Selinium 1.25±0.05 0.855±0.0.02
0.208±0.03 0.45±0.01
0.102±0.02 0.0795±0.01

表3:污染物的介质浓度的优先污染物(毫克/升)在EMEM-1个控制(EMEM),未处理PBW浓度,的CuO-NP处理PBW,未处理PBW +媒体和CuO-NP处理PBW +媒添加媒体组件后(N = 3)进行了评估,以确保对因治疗的变化污染物浓度未处理PBW +媒体和代表出席了会议的CuO-NP处理PBW +媒体应用到CELLS。

未经处理 PBW +媒体
未经处理的PBW浓度(登录X) %生存能力(HEK细胞) %生存能力(Hep细胞)
EMEM 100 100
16.5%(1.217) 51.4 50.8
29%(1.462) 39 33.3
44%(1.643) 19.3 14.7
56%(1.748) 14.5 9.4
IC 50日志[PBW] 1.264 1.243
的CuO-NP处理PBW +媒体
的CuO-NP-处理PBW(日志X)的浓度 %生存能力(HEK细胞) %生存能力(Hep细胞)
EMEM 100 100
17%(1.230) 86.7 119.8
30%(1.477) 75.8 86.7
45%(1.653) 81 92.4
53%(1.724) 70.3 97.5
IC 50日志[PBW] 2.744 5.327

表4:集成电路50所述的IC 50 计算表示所需的50%抑制活力的未处理PBW +媒体或的CuO-NP处理PBW +介质的浓度。   对暴露于未处理PBW +媒体(A)或氧化铜-NP处理PBW +媒体(B)的稀释液的HEK和HEP细胞5天的百分存活率分别用于计算半数最大抑制浓度(IC 50)。

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Discussion

以前的研究报告说,氧化铜,纳米粒子去除砷地下水11,13,30,31。这项研究支持,这些以往的调查结果也报告说,氧化铜纳米粒删除PBW更多的污染物。本研究还证实了以前的报告的CuO纳米粒是在除砷有效,尽管其他污染物和可能的竞争离子11的存在。形态建模预测,钒物种PBW的97%的负电荷,从而允许吸附在CuO纳米粒和批量处理除去钒的92%。

这是第一次研究,调查从PBW去除特定的污染物用的CuO-NP的效果,然后评估与取消相关联的变化的细胞毒性。结果证明调查变化的使用体外方法复杂混合物的细胞毒性是可能的,但这些方法并非没有限制。 PBW不能用于˚F对细胞ULL实力,因为要生存,培养的细胞需要定义生长培养基和具体的渗透压。 PBW +媒体也不能用来对细胞无pH调节。该PBW的pH为7.31前和7.36但是治疗后;加入生长培养基组分的降低pH至约6.8,取决于稀释。 pH值的调整是在不过细胞培养基的制备正常步骤;调整PBW +介质的pH可能已经改变了元件物种与介质组分的分子间的相互作用。未处理和CuO-NP处理PBW合并,用浓EMEM-10X生长培养基以各种比例,得到试验溶液(PBW +媒体)。上检验介质进行ICP-MS分析,以验证显著影响的CuO-NP处理(砷,铜,硒,铀,钒)金属的浓度以预期的浓度稀释由媒体组件和重量克分子渗透压浓度调整后。减少在砷,硒,和CuO-NP-处理后钒反映在未处理PBW +媒体和的CuO-NP处理PBW +媒体之间的浓度差异。铀的浓度都在的CuO-NP处理PBW +传媒高于预测。 ICP-MS数据( 表1)表明,更多的铀从PBW撤除期间的CuO-NP处理比预测建模。形态建模( 表2)预测,在pH 7.3,只有35.5%的铀的物种是带负电荷。该模型预测,主要铀物种,钙铀酰碳酸酯( UO 2(CO 3)3),是中性的。

所观察到的78%除去铀可能是由于铀吸附和沉淀的组合(作为钙铀酰碳酸盐矿物)。基于地球化学建模,铀通过吸附除去百分比小于计算允许在所述的CuO-NP更高浓度- 处理PBW +媒体。铀除去的CuO-NP处理的机制目前尚不清楚,需要进一步调查。在有钙,钾和镁的浓度的增加,预计当PBW加到EMEM-10×然而;的CuO-NP-治疗没有产生在这些元素的显著变化,从而没有差异被认为在未处理对比的CuO-NP处理PBW +媒体。结合实际的环境与媒体组件的技术成功地代表见于元素浓度因治疗的变化;然而PBW的氧化性质的限制如何PBW +媒体可以作出。在试图增加在试验介质中的元素的最大浓度,粉末状细胞培养基最初与未处理和CuO-NP处理PBW混合以使PBW +媒体。粉末状媒体经常导致钙盐的沉淀,且增加了其需要更大的稀释RO水PBW +介质的渗透压,产生concentrations接近那些液体介质的10倍获得的。这些问题是很可能PBW特异性由于其氧化状态,可能不会成为一个问题与其他较不敏感的混合物。

MTT测定法被选择,以评估细胞毒性,因为它是通过测量线粒体活性评估细胞的总体健康一个公认的标准高通量测定法。该方法具有优点和缺点。 96孔格式是用于然而获得多个数据点有用大部分细胞在第5天的分别为不健康看,圆形且不再粘附到板上。 图2中的照片是使用真空除去介质之前;抽吸掉培养基,然后加入MTT溶液可能已除去未附着的细胞或分离的不良粘附细胞,促进了MTT信号的第二天后整体高原看出,与未处理PBW。该假设是浮动细胞死亡或濒临死亡与邻唯一一句附着细胞用此方法评估。同样重要的是要考虑的MTT法的限制相对于使用的纳米颗粒的研究。

以前的研究已经报道,当直接施用于培养的细胞,纳米颗粒可具有固有的毒性,超出其碱的化学性质,这取决于它们的独特的物理特性,例如大小和形状32,33。在此研究中,我们没有直接应用的CuO纳米粒到细胞上。相反,细胞暴露于PBW已被预先用氧化铜纳米粒处理,离心以去除大部分的CuO纳米粒,然后过滤两次以除去更多的CuO纳米粒之前PBW用于制备PBW +媒体。该MS结果显示治疗后增加铜。这可能是来自可以通过离心/过滤步骤已通过治疗或氧化铜纳米粒期间纳米颗粒溶解于保留在处理过的PBW U THAT铜离子sed的使PBW +媒体。的CuO纳米粒的尺寸范围从12-18纳米,具有85±1米2 / 克11的BET测量的表面面积,但是已知聚集并基于在铜浓度在处理过的PBW的增加最少,大多数铜不管源的离心和过滤之后被除去。改进的细胞的健康和合流的可视确认支持改善存活率由于在CuO-NP处理的PBW的MTT分析结果( 图2)。使用其他方法可以评估(或表征)所引起的氧化铜纳米粒类似的混杂影响未来的研究。

被选为人胚肾(HEK 293)和人肝癌(HEP G2)细胞毒性测试。这些都是标准的细胞系,临床相关重金属器官毒性24,25,34-40。低播种密度用于MTT法。细胞以500个细胞/孔,允许恢复24小时,然后再暴露于试验介质。低接种密度是必要的,以实现与约5天数期生长曲线,成为过度汇合和固定在第6天或7 Chakraborty的之前。(2010)报道,在镉的毒性对于培养的肾脏研究近端小管细胞(PTC),汇合和增殖状态(增殖与静态)影响了应对镉接触:亚汇合增殖细胞表现出比汇合(静止)细胞毒性多。暴露于PBW在较高浓度(大于汇合)类似于那些用于其他测定HEP和HEK细胞(结果未显示)没有表现出强劲的变化看出与MTT法的形态。进一步调查的变化使用非粘附细胞系,或收获并收集所有细胞的细胞毒作用的协议( 例如流式细胞术)是必要的。

MTT法在研究美国的另一个限制荷兰国际集团的纳米粒子是,某些类型的纳米颗粒可以与细胞营养干预。细胞培养基典型地含有添加的蛋白质源,如牛胎儿血清(FBS),补充细胞的生长。有研究表明,金属氧化物纳米颗粒可以消耗重要生长成分中的FBS,由于纳米粒子的吸收增加容量。金属氧化物纳米颗粒已显示出通过交互与钙41链接到FBS中。取决于溶液的pH值,金属纳米颗粒可以携带一个正或负电荷。毒性研究表明,金属纳米颗粒添加到细胞培养基吸附阳离子,包括离子,然后通过对NP- 复合物结合到钙结合上在FBS的蛋白位点除去FBS /血清白蛋白。这降低的Ca 2+和FBS的来自介质的浓度,基本上饥饿的细胞,并增加归因于娜的细胞毒性noparticles 41。此外,预曝光纳米颗粒的FBS / 的涂覆的纳米颗粒,降低其细胞毒作用。但是,我们并没有直接公开媒体的CuO-纳米颗粒。此外,没有显著减少离子浓度与氧化铜,纳米粒子治疗后出现在PBW,说明的Ca 2+没有显著吸收到氧化铜纳米粒吸其绑定与FBS。然而,钙在PBW的浓度足够高,纳米颗粒诱导的降低可能不是显而易见的。它仍然是不可能的,在这项研究中所用的氧化铜,纳米颗粒被吸收大量的钙处理期间,因为有在氧化铜纳米粒在PBW,其中含有高浓度的钙相比早期研究用的砷吸收能力没有降低地下水具有较低的钙离子浓度13。

的数据表明,氧化铜纳米粒去除砷,硒钒和乌拉鎓,这是与在MTT法改进的HEK和HEP细胞活力有关。通过该存活率改善机制(S)尚未确定,但可能是由于除去优先污染物的CuO-NP,除其他机制。目前的研究还表明,标准细胞培养方法可用于评估纳米颗粒的ISR水处理方法的功效,可能允许的范围内的机理研究的完成,移动到更昂贵的和费时的体内动物研究前。另外,氧化铜,纳米颗粒可能被证明是更通用采矿过程和比常规吸附剂等的铝,铁,钛和锰的氧化物的金属的混合物的处理中,由于氧化铜纳米粒不需要pH调节或水氧化除砷和CuO纳米粒在竞争阴离子磷酸盐,硅酸盐和硫酸盐的存在既去除砷和砷。另外,氧化铜纳米粒可以再生和再-二手,降低试剂的成本和花费处理废物的副产物在需要处置12的量。

MTT法协议的潜在局限性包括低细胞密度在曝光时间,细胞分离和信号的损失,细胞饥饿并将细胞与CuO-NP改变MTT反应的可能的直接接触。细胞密度和脱离的问题可以通过使用替换测试如流式细胞仪,其允许更高的接种密度以及所有细胞的集合( ,既浮动和附后)加以解决。细胞饥饿问题可以通过测量生长因子的浓度在媒体治疗期间定期进行评估。今后的工作将侧重于应用当前协议不同的细胞毒性试验,这将解决如果可能的CuO-NP暴露改变测定活性,细胞饥饿的测量处理过程中,也测试的CuO-纳米粒子的去除contamina的能力的nts,影响其他类型的复杂混合物,例如从超级基金站点和废物处置池塘废物的细胞毒性。这些研究还将解决方法是否在各种设置强劲。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CuCl2 Sigma 203149
Borosilicate glass balls VWR 26396-639 6 mm
Nitric Acid Fisher A509-P500 Trace metal grade
0.45 μm syringe filter Fisher SLHA 033S S
10x EMEM Fisher BW12-684F
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
L-glutamine Fisher BP379-100
NaHCO3 Sigma S5761
Penicillin/Streptomycin ATCC 30-2300
0.22 μm vacuum filter unit Fisher 09-740-28C
HEK293 ATCC CRL-1573
HEPG2 ATCC HB-8065
Trypsin Sigma SV3003101
MTT Sigma M2128
D-penicillamine Fisher ICN15180680
96-well plates Fisher 07-200-92
DMSO Fisher D12814
Spectra Max 190 Molecular Devices
Visual MINTEQ version 3.0 KTH Royal Institute of Technology
ICP-MS Agilent Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
IC DIONEX DX 500 Dionex Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
VWR Incubator VWR

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