A remoção do Trace Elements por Óxido de Cupric nanopartículas de urânio
1Division of Physical Therapy, Department of Orthopedics & Rehabilitation, University of New Mexico, 2Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 3School of Pharmacy, University of Wyoming, 4Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 5Center for Environmental Medicine, Colorado State University, 6College of Pharmacy, California Northstate University

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Schilz, J. R., Reddy, K. J., Nair, S., Johnson, T. E., Tjalkens, R. B., Krueger, K. P., et al. Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability. J. Vis. Exp. (100), e52715, doi:10.3791/52715 (2015).

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Abstract

Na recuperação in situ (ISR) é o método mais utilizado para a extracção de urânio nos Estados Unidos. Durante ISR, o urânio é lixiviado a partir de um corpo de minério e extraída através de troca iônica. A produção resultante de purga água (PBW) contém contaminantes, tais como arsénio e outros metais pesados. Amostras de PBW de uma instalação de urânio ISR ativo foram tratados com nanopartículas de óxido cúprico (CuO-PN). Tratamento CuO-NP de PBW reduzida contaminantes prioritários, incluindo arsênio, selênio, urânio e vanádio. Ensaio não tratado e CuO-NP PBW tratado foi usado como o componente líquido de os meios de crescimento da célula e alterações na viabilidade foram determinados por o MTT (brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) no rim embrionário humano (HEK 293) e carcinoma hepatocelular humano (Hep G2), células. Tratamento CuO-NP foi associada com melhora HEK e HEP viabilidade celular. As limitações deste método incluem diluição do PBW por componentes do meio de crescimento e durante osmolajuste lidade, bem como o ajuste do pH necessário. Este método é limitado no seu contexto mais amplo devido aos efeitos de diluição e mudanças no pH da PBW que é tradicionalmente acídico no entanto ligeiramente; este método poderia ter um uso mais amplo avaliando tratamento CuO-NP em águas mais neutros.

Introduction

Cerca de 20% da rede elétrica dos EUA é fornecida por energia nuclear e, em parte baseada em incentivos nacionais para aumentar a independência energética, dos EUA deverá capacidade nuclear para aumentar 1. Crescimento mundial da energia nuclear também é esperado que continue, com grande parte do crescimento que ocorre fora os EUA 2. A partir de 2013, 83% do urânio US foi importado, mas 952.544 toneladas métricas de reservas existem em os EUA 3,4. Em 2013 houve 7 novas aplicações de instalações e aplicações de 14 de reiniciar / expansão entre Wyoming, Novo México, e Nebraska 5. Em os EUA, o urânio é extraído através predominantemente na recuperação in situ (ISR) processa 6. ISR provoca menos perturbações terra e evita a criação de decantação pilhas que podem liberar contaminantes ambientais 7. ISR utiliza soluções de oxidantes à base de água para lixiviar de urânio a partir do corpo de minério subterrânea, após o que o urânio é extraído a partir do percolado atravésum processo de permuta de iões 8. Para manter um balanço hídrico negativo no corpo de minério, uma parte do chorume, chamada produção sangrar água (PBW), é sangrado fora. Uma porção do PBW é descontaminada por osmose reversa (RO) e re-introduzido no processo de mineração, mas também poderiam ter PBW usos industriais ou agrícolas benéficas, se os contaminantes tóxicos pode ser reduzida para níveis aceitáveis ​​determinados por agências reguladoras e de estado para a superfície águas subterrâneas 9. Atualmente, a maioria das instalações ISR urânio usar RO para remover contaminantes de PBW. No entanto, o processamento RO consome muita energia e produz salmoura resíduos tóxicos, o que requer disposição regulamentado.

Existem muitos métodos de descontaminação da água, incluindo adsorventes, membranas e troca iônica. Destes, adsorção é a mais utilizada, e os recentes desenvolvimentos na síntese de nanopartículas aprimorou as capacidades de descontaminação da água à base de adsorvente processa 10. Oxi Cupricde nanopartículas (CuO-PN) não haviam sido estudados extensivamente sobre o urânio ISR PBW, mas em estudos recentes de remoção de contaminantes da água subterrânea, CuO-NPs foram encontrados para ter propriedades únicas, incluindo não requerendo etapas de tratamento de água (pré ou pós por exemplo, o ajuste de pH ou potencial redox) e um bom desempenho em diferentes composições de água (por exemplo, em diferentes valores de pH, concentrações de sal, ou iões concorrentes) 11. Além disso, CuO-NPs são facilmente regenerados por lixiviação com hidróxido (NaOH) de sódio, após o que a regenerada CuO-PN pode ser reutilizado. Detalhes de CuO-NP vestígio de metal recursos de filtragem de águas naturais foram previamente publicados 11-14.

Embora útil para o tratamento da água, as nanopartículas de óxido de metal pode ser tóxico para os organismos vivos, mas a extensão da toxicidade depende, em parte, das características e componentes de nanopartículas 10,15,16. Portanto, é importante para estudar simultaneous remoção e nanopartículas toxicidades de contaminantes antes de aplicações de campo. O estudo actual, determinada a capacidade de CuO-NPs para remover contaminantes PBW prioritárias (incluindo arsênio, selênio, vanádio e urânio), e avaliou o efeito do tratamento CuO-NP em PBW citotoxicidade.

PBW foi recolhido a partir de uma instalação de urânio ISR activo e utilizado para determinar a eficácia do tratamento com NP-CuO na remoção de contaminantes de prioridade. PBW citotoxicidade antes e após o tratamento CuO-NP também foi avaliada. PBW é uma geológica complexa mistura (industrial / ambiental) e tanto o Instituto Nacional de Saúde Ambiental e Ciência (NIEHS) e da Agência de Substâncias Tóxicas e Registro de Doenças (ASTDR) estão colocando ênfase no estudo da toxicidade de misturas ambientais relevantes, incluindo as misturas como elas existem na natureza ou industriais configurações, assim como promover a testes in vitro para dar prioridade produtos químicos para mais testes in vivo17-19. Estudos de baixa dosagem, mistura exposições crônicas são um desafio porque a exposição crônica a uma mistura de baixa dose não produzem efeitos óbvios, pelo menos não no curto espaço de tempo da maioria dos estudos de laboratório. Do mesmo modo, a maioria dos estudos in vitro misturas químicas expor as células a uma mistura feita em laboratório definido de duas ou mais metais 20,21. Estes estudos fornecem informações de base, mas misturas simplificados não replicar as interações antagônicas e sinérgicos complexas que podem ocorrer em uma amostra ambiental natal, onde toda a gama de componentes da mistura estão presentes.

Os objetivos deste estudo foram analisar processos de remoção de contaminantes alternativos para PBW e avaliar o efeito de (CuO-NP) tratamento em PBW citotoxicidade utilizando células humanas cultivadas. Os resultados poderiam beneficiar a indústria de urânio através do desenvolvimento de métodos mais eficientes ou ecológicos para a remoção de contaminantes. Este estudo fornecea primeira evidência de que a redução de contaminantes prioritários em PBW por CuO-NPs reduz citotoxicidade em células de mamíferos 22.

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Protocol

Todas as amostras foram coletadas no prédio de processamento de líquido de urânio de uma instalação ISR urânio em Wyoming.

1. Produção sangro Água (PBW)

  1. Recolha dois tipos de amostras de água de uma instalação de urânio ISR: PBW e osmose (RO) água reverter. Recolhe PBW a partir de uma torneira de monitorização, após o processo de permuta iónica mas antes de descontaminação de osmose inversa. Coletar amostras RO após a PBW é descontaminada por meio de tratamento por osmose reversa.
    NOTA: lixiviant é transportado em dutos de vários campos de poços para a construção de processamento de líquido de urânio, onde é coletado em uma coluna e preparados para troca iônica. Aproximadamente 1-3% da lixiviante após a permuta de iões é removida do circuito e denominada água de exsudação de produção (PBW). PBW é reutilizada nos processos de mineração ou descontaminado / desmineralizada com filtração RO.
  2. Coletar amostras de água em polietileno de alta densidade (HDPE) com espaço de cabeça zero, de acordoa procedimentos operacionais padrão para coleta de amostras e análise do Departamento de Qualidade Ambiental Wyoming (WYDEQ) 23.
  3. Medir a temperatura e pH no local e transporte de amostras em gelo para mantê-los frescos.
  4. PBW armazenar a 4 ° C. Manter a solução PBW legal até depois mínimos mídia essencial (EMEM-10x) o concentrado de Eagle é adicionado durante a preparação da mídia conforme as instruções da seguinte protocolo.
    NOTA: PBW é uma solução oxidada que se vai precipitar deixada a congelar ou aquecida até à temperatura ambiente. Após diluição, a solução PBW é suficientemente diluído que não irá precipitar quando aquecido a 37 ° C antes da aplicação às células e durante a incubação.

2. Preparação de CuO Nanopartículas (CuO-PN)

  1. Combinar uma solução etanólica puro contendo 250 ml de 0,2 M de CuCl 2 • 2H 2 O, 250 ml de 0,4 M hidróxido de sódio (NaOH), e 5 g de polietileno glicol (PEG) num balão de fundo redondo com seis milímetros bolas de vidro de borosilicato.
  2. Colocar a solução em um forno de microondas modificado e permitir que ele se reagir sob refluxo à pressão atmosférica durante 10 min a 20% de potência (intervalos de 6 seg de, 24 segundos desligado).
  3. Arrefece-se a solução até à temperatura ambiente (20 ° C), em seguida, decantada para tubos cónicos de 50 mL, deixando as esferas de vidro.
  4. Centrifugar a solução em 50 mL em tubos cónicos de 1000 xg durante 30 min, decantou-se, e, em seguida, lava-se a CuO-PN com uma sequência de 300 ml de água quente (60-65 ° C), 100 ml de etanol, e 100 ml de acetona.
  5. Seca-se a CuO-NPs até à temperatura ambiente (20 ° C) em 50 ml de tubos cónicos.
  6. Raspe a CuO-NPs fora de seus tubos em um almofariz. Cobrir o CuO-NPs com folha de estanho e aquecer o CuO-PN a 110 ° C num forno para retirar o líquido restante. Combinar CuO-NPs em um lote e pesar o CuO-PN.
    NOTA: A preparação de CuO-NPs e tratamento CuO-NP de PBW foram conduzidos de água Qualdade Laboratório de Ecossistema de Ciência e Gestão da Universidade do Wyoming. CuO-NP síntese seguido o procedimento de Martinson e Reddy (2009) 11.

3. Tratamento de PBW com CuO-NPs

  1. Adicionar 50 mg (1 mg / ml) de CuO-NP para um tubo de 50 ml, seguido por 50 ml de PBW. Fecha-se o tubo e feita reagir durante 30 min num agitador orbital de bancada a 250 rpm.
  2. Os tubos de amostra, centrifugar a 250 xg durante 30 min e, em seguida, filtrar o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,45 um. Alterar a velocidade de centrifugação e tempo podem depender da nanopartícula para assegurar o CuO-NPs de se tornar compacta no tubo de centrifugação.

4. Análise Elementar

  1. Prepare não tratada (controle) e amostras tratadas PBW-CuO-NP por análise elementar como se segue.
  2. Acidifica-se alíquotas (40 ml) de CuO-NP-tratados e não tratados com ácido nítrico PBW grau de vestígios metálicos para um pH de 2,0. Analisar alíquotas PBW acidificadas para cátions por coupl indutivamenteed plasma-espectroscopia de massa (ICP-MS), tal como descrito em Roth e Reddy (2012) 13.
  3. Preparar alíquotas unacidified (20 ml) de CuO-NP-tratados e não tratados PBW e analisar as alíquotas unacidified para aniões por cromatografia iónica (IC), como descrito em Roth e Reddy (2012) 13.
    NOTA: As aliquotas foram analisadas pelo Departamento de Agricultura Wyoming Analytical Services, Laramie WY 82070. Uma descrição do procedimento IC ICPMS e pode ser encontrado em Reddy e Roth, (2012) 13.

5. Preparação de Cultura de Células de mídia Usando PBW

  1. Use duas controle (EMEM-1x e RO + mídia) e oito soluções de mídia teste PBW (quatro concentrações de cada PBW não tratada e mídia tratou-CuO-NP) nos estudos de viabilidade. Panorâmica das soluções são as seguintes:
    1. Para o controle de EMEM-1x, compra de mídia essencial mínimo de Eagle (EMEM-1x) com L-glutamina e bicarbonato de sódio já adicionou. Adicionar soro fetal de bovino (FBS) E antibióticos acordo com as instruções do fabricante.
      NOTA: EMEM-1x é comprado diluída para a concentração adequada para o crescimento celular e contendo L-glutamina e bicarbonato de sódio. EMEM-1x requer a adição de soro fetal bovino (FBS) e uma mistura de antibióticos de penicilina e estreptomicina (50 Ul / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina). EMEM-1x é usado como um meio de controlo, porque é o meio de crescimento recomendado do fabricante para ambos os tipos de células utilizadas neste estudo. Concentrado de EMEM-10x é diluída com água a partir da instalação de RO ou não tratado ou tratado com CuO-NP PBW para produzir as soluções de teste. Concentrado de EMEM-10x quando comprado não contém L-glutamina ou de bicarbonato de sódio de forma que estes são adicionados para além do soro fetal bovino (FBS) e uma mistura de antibióticos de penicilina e de estreptomicina.
    2. Para a solução de controle RO usar água RO recolhidos da instalação de ISR. Use o mesmo protocolo que os meios de teste PBW única substituir 100% RO water a partir da instalação de ISR em lugar de PBW. Para diluir a água não tratada e uso solução tratada com CuO-NP RO ou ultrapura do laboratório.
    3. Diluir não tratada PBW em quatro concentrações de ensaio antes de se misturar com os componentes do meio de cultura de células. Prepare os quatro concentrações diferentes de soluções PBW não tratados misturando PBW não tratada com o RO (do laboratório) nas seguintes combinações: 100% (PBW puro sem água RO +), 75% (187,5 ml de PBW + 62,5 ml de água RO), 50% (125 ml de PBW + 125 ml de água RO) ou 25% (62,5 ml de PBW + 187,5 ml de água RO).
    4. Diluir CuO-NP-tratados PBW em quatro concentrações de ensaio antes de se misturar com os componentes do meio de cultura de células. Prepare os quatro concentrações diferentes de soluções PBW tratados com NP-CuO por mistura PBW (pré-tratado com 1 mg / ml de NP-CuO durante 30 min) com o RO (do laboratório) nas seguintes combinações: 100% (CuO- puro PBW tratados com NP + RO sem água), 75% (187,5 ml de PBW + 62,5 ml de água tratada RO-CuO-NP), 50% (125ml de CuO-NP-tratados PBW + 125 ml de água RO) ou 25% (62,5 ml de PBW tratados com CuO-NP + 187,5 ml de água RO).
  2. Prepare 250 ml de RO + media, PBW não tratada + mídia e tratados com CuO-NP PBW + media concentração pela adição de 25 ml de concentrado EMEM-10x para 190 ml de 100% RO e 100%, 75%, 50% ou 25% das concentrações não tratados ou tratados com CuO-NP premade PBW criados no passo 6.1.3 e 6.1.4.
  3. Ajustar o pH de cada solução para 7,4 com NaOH ou HCl.
  4. Suplemento cada concentração de não tratado e tratado com CuO-NP PBW, bem como meios + RO com os seguintes componentes padrão: 25 mL (10%) de soro fetal de bovino (FBS), 2,5 ml de L-glutamina, 0,55 g de NaHCO3 e 1,25 ml Pen / Strep (50 UI / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina).
  5. Ajustar a osmolalidade de cada concentração de PBW não tratada + meios, CuO-NP-tratados PBW + media e + RO meios para 290-310 mOsm / kg por adição de água RO e medida utilizando um osmómetro.
  6. Filtrar cada solução utilizandouma unidade de filtro de vácuo de 0,22 um, e armazenar a 4 ° C.
    NOTA: Devido a pequenas variações na quantidade de água RO usado para ajustar a osmolaridade, variar as concentrações finais de mídia dentro de uma faixa de 5%, com concentrações de mídia em 56%, 44% PBW não tratada +, 29% e 16,5% e CuO-NP- tratada PBW + media concentrações a 53%, 45%, 30% e 17%.

6. Viabilidade celular

NOTA: Dado que nos rins e fígado são os órgãos alvo da toxicidade do metal pesado, empregar rim embrionário humano (HEK293) células cultivadas (HEK) e carcinoma hepatocelular humano (HepG2) células (HEP) métodos de teste 24-26.

  1. Prepara-se uma cultura de células HEK e HEP 2-3 dias antes do plaqueamento das placas de 96 poços utilizados na experiência de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Medir a viabilidade celular utilizando o ácido 3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT).
    NOTA: O protocolo de ensaio MTT foi modificado a partir do Meerloo et al. (2011) 27.
    1. Obter MTT em forma de pó. Adicionar salina tamponada com fosfato (PBS) para perfazer uma concentração de estoque de 50 mg / ml. Agita-se a solução durante 2 horas e depois filtra-se com um filtro de seringa de 0,45 um e alíquota de 1,5 ml em tubos de congelação seguras. Proteja tubos de luz e armazenar a 4 ° C.
  3. Remover as células HEK e HEP das suas placas de cultura utilizando tripsina, centrifugar a 1000 xg durante 5 minutos e decantar a tripsina. Adicionar 5 ml de PBS e as células misturar para se obter uma solução de células única. Em seguida, aplicam-se 20 ul da solução de células única para um hemocitómetro para se obter uma contagem de células por mililitro de solução. Centrifugar as células novamente em 1000 xg durante 5 minutos e decanta-se o PBS usado para lavar as células. Adicionar a quantidade adequada de EMEM-1x a ajustar a concentração de células de 500 células / 100 uL (100 ul / poço).
  4. Encha as cavidades perímetro da placa com 200 ul de PBS para controlar a evaporação.
  5. Semente células a uma densidade de 500 células / poço adição de 100 ul a cada poço, excepto para as cavidades perimetrais (que não são revestidos a células).
    NOTA: densidade de sementeira de células HEK e HEP baseia-se curvas de crescimento experimentais que permitem que o pico de crescimento a ocorrer em torno de 4-5 dias. Preparar as curvas de crescimento de todas as linhas celulares para estimar a densidade de sementeira.
  6. Incubar as células em 24 h a 37 ° C, o que lhes permite recuperar (forma apertados aderências à placa) antes de efectuar leituras da linha de base de MTT densidade celular.
  7. Realizar as leituras da linha de base de MTT densidade celular através da remoção do meio de inoculação a partir da primeira coluna (não incluindo o perímetro) e adição de 100 ul de MTT (5 mg / ml em meio) para os poços, durante 1 h.
  8. Após uma hora, remover o MTT e adicionar 100 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) para dissolver o formazano-MTT produzido pelas células viáveis ​​(20 min).
  9. Leia a densidade óptica (OD) da primeira coluna a um comprimento de onda de absorção de 570 nm, para se obter uma base deleitura linha.
    1. Use leituras de linha de base para assegurar todas as placas foram semeadas corretamente e que as células estão crescendo de forma consistente entre as placas. Remover o DMSO a partir da coluna a ser testado antes de incubação durante 24 horas a próxima.
      NOTA: Se DMSO é deixado na placa durante a noite ele puxa a humidade a partir da coluna adjacente, provocando uma redução no volume do meio.
  10. Aquecer as soluções de ensaio (isto é, o EMEM-1x, RO, PBW não tratada e soluções de mídia PBW tratados com CuO-NP) a 37 ° C num banho de água.
  11. Remover o meio de inoculação a partir do resto da placa (não incluindo o perímetro ou a primeira coluna que foi utilizada para a leitura da linha de base) e substituído por 100 uL de EMEM-1x, RO + media, PBW não tratada + media concentrações ou CuO NP- As concentrações de mídia PBW tenha sido tratada com + (uma solução por placa). Incubar as células em concentrações suas soluções de teste ou de controlo para um total de sete dias (dias 2-8).
    NOTA: Há 10 placas no total: 1 EMEH-1x, 1 RO + meios, um de cada concentração PBW + meios não tratada (56%, 44%, 29% e 16,5%) e uma placa de cada concentração PBW + meios tratados com NP-CuO (53%, 45% , 30% e 17%) por experimento por linha celular.
  12. Cada dia seguinte leitura MTT linha de base, remova as soluções de controle e de teste (listados na nota sob 6.11) a partir da próxima coluna da respectiva placa (por exemplo, Dia 2 media teste e controle são removidos da linha 3, poços BG; Dia 3: linha 4, BG poços, etc.) e repetir o protocolo de MTT, tal como descrito nos passos 6,7-6,9 acima.
  13. Repetir o protocolo todos os dias durante sete dias. Calcular a média dos resultados de DO para cada linha (6 poços) e relatados em função do tempo para gerar uma curva de crescimento de sete dias.
  14. Para avaliar o efeito de quelação de cobre sobre a viabilidade celular em CuO-NP-tratados PBW + meios seguem o mesmo procedimento tal como acima, excepto adicionar 100 | iM de D-penicilamina para controlar e soluções de ensaio antes de se adicionar as soluções para as suas respectivas placas. Execute anal dadosysis usando software de representação gráfica científica.

7. Modelagem geoquímica

  1. Baixe a versão Visual MINTEQ 3.0 / 3.1 um freeware do seguinte site da http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
    NOTA: Visual MINTEQ é um modelo de equilíbrio químico do freeware para o cálculo de especiação do metal, equilíbrios de solubilidade, etc. sorção de águas naturais. Além disso, é usado para prever especiação de iões, as actividades de iões, complexos de iões e índices de saturação, que é comparado com a concentração de elementos antes e após o tratamento (resultados de espectroscopia de massa) para examinar possíveis mecanismos de remoção do elemento 28.
  2. Abra o programa e os dados de entrada de espectroscopia de massa a partir do passo 4, incluindo o pH, alcalinidade e as concentrações dos diferentes elementos, para o programa.
    NOTA: Dado que as águas subterrâneas é oxidado durante a urani situhum processo de extração, uso de espécies oxidadas de arsênico, vanádio e urânio para a entrada.

8. Concentração Inibitória 50 (IC50)

  1. Calcula-se a CI 50 para os meios de comunicação PBW + concentrações não tratados e tratados com CuO-NP em primeiro lugar a viabilidade média (média OD) no dia 5 de três experiências separadas.
  2. Subtrair dia cinco médias de viabilidade das PBW + mídia concentrações não tratados e tratados-CuO-NP do dia cinco médias de viabilidade de EMEM-1x para calcular as diferenças de viabilidade. Em seguida, dividir as diferenças de viabilidade por parte da viabilidade média no dia 5 em EMEM, e multiplique por 100 para obter a percentagem de inibição.
  3. Subtrair a percentagem de inibição de 100 (viabilidade EMEM-1x) para obter a percentagem de viabilidade para cada PBW + media concentração não tratados e tratados com CuO-NP.
  4. Entrada em software gráficos científica, definindo EMEM-1x a uma concentração de um e uma viabilidade por cento dos 100; transformar todas as concentrações no registoescala (X = Log (X)) e realizar análise de regressão não linear com menos apto quadrado.

9. Análise de Dados

  1. Compare as concentrações de elementos não tratados e tratados com NP-CuO PBW com uma de duas caudas, emparelhado, T-Student.
  2. Calcular as áreas sob a curva (AUC), utilizando os dados da curva de crescimento, recolhidas ao longo de sete dias, e analisar a variância com medidas repetidas de análise de variância (ANOVA), seguido por comparação de Tukey post hoc de entre todos os grupos (n = 3).
  3. Calcule o IC 50, usando dados a partir do dia cinco de a curva de crescimento tanto para PBW não tratados e tratados com CuO-NP + soluções de mídia (descritos acima). Os valores de p <0,05 são considerados significativos.
    NOTA: Para efeitos de análise estatística, os valores de espectroscopia de massa de metade do limite de detecção foi atribuída aos iões de níveis de concentrações inferior a esse limite 29.

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Representative Results

As concentrações dos componentes PBW e pH em não tratado e tratado com CuO-NP PBW são apresentados na Tabela 1. Martinson e Reddy (2009), relataram que o ponto de carga zero do CuO-NP é estimado em 9,4 ± 0,4. Dado que o pH era de 7,2-7,4 PBW, nestas condições, água doa protões de CuO em NPS, fazendo com que a superfície da nanopartícula para ser carregado positivamente para permitir a adsorção de espécies carregadas negativamente. Tratamento de NP-CuO removidos contaminantes prioritários de PBW, incluindo o arsénio, o selénio, o urânio e vanádio (Tabela 1). A concentração de arsénio média foi reduzida em 87% [0,0175-0,002 mg / L (bicaudal teste-t emparelhado, p <0,0001)]. CuO NP-tratamento também selénio significativamente reduzido (30%), urânio (78%), vanádio (92%), e fosfato (85%) (p <0,05).

Os resultados da modelização especiação, apresentados na Tabela 2, suporta os resultados analíticos: 99% de atal arsênico dissolvido em PBW está presente como Haso 4 2- e H 2 AsO 4 - e 94% do total de selênio dissolvido em PBW está presente como SeO 4 2-. Estas espécies são carregados negativamente, portanto, capaz de adsorver a CuO-PN. Modelagem especiação previu que 99% das espécies de vanádio em PBW são carregados negativamente, promovendo também a adsorção CuO-PN. No entanto, a modelagem especiação previu apenas 35,5% do urânio espécies são carregados negativamente, o que limitaria a adsorção CuO-PN. Análise de índices de saturação previu que há espécies de arsénio, selenium-, urânio ou de minerais contendo vanádio estavam perto de saturação (ou seja, a precipitação mineral) níveis, apoiando a adsorção CuO-NPs, contra precipitação.

Para avaliar se as concentrações de contaminantes prioritários esperados estão na mídia feita a partir tratadas e não tratadas-CuO-NP PBW, as amostras de controle de mídia não diluído (EMEM-1x), 56%não tratados PBW + mídia ea 53% PBW tratados com CuO-NP + media foram analisadas por ICP-MS. Meios de controlo não diluído (EMEM-1x) é um produto comercial fornecido com L-glutamina e bicarbonato de sódio (pré-adicionado). As concentrações de cobre e selênio no controle EMEM-1x foram ligeiramente elevada como esperado porque eles são essenciais para o crescimento celular, mas o arsénio, o urânio e vanádio foram insignificantes, apresentados na Tabela 3. Estudos preliminares mostraram que, arsênico, as concentrações de selênio e vanádio, foram reduzidas em tratamento CuO-NP e que a diminuição foi representada nas concentrações no PBW tratados com CuO-NP + mídia. A concentração medida do urânio no PBW tratados com CuO-NP + media foi diminuiu em relação ao não tratado PBW, e esta diminuição foi mais acentuada do que o previsto por modelagem Visual MINTEC v.3. Os níveis de cobre aumentou em media tratados com CuO-NP como esperado.

Para determinar a capacidade de tratamento de CuO-NP para melhorar a citotoxicidade de PBW em mamíferoscélulas, viabilidade foi avaliada em células expostas a soluções de meios PBW + antes e depois do tratamento CuO-NP. Ambas as células HEK (Figura 1A) e HEP (Figura 1B) foram expostas a diferentes concentrações de PBW não tratada ou tratada + meios para até sete dias. Em células cultivadas em meios PBW não tratada +, viabilidade foi prejudicada de uma maneira dependente da concentração, enquanto que o tratamento com NP CuO melhorou a viabilidade celular em ambas as linhas celulares. A AUC integrada na Figura 1C mostra que as células HEK-CuO cultivadas em NP-tratados PBW + meios foram mais vantajosos em comparação com PBW não tratada + meios para as três concentrações mais elevadas (29%, 44% e 56%). Células HEP demonstrou um pouco diferente viabilidade: apenas as duas concentrações mais elevadas de PBW não tratada + meios (44% e 56%) mostraram viabilidade diminuída em comparação com PBW tratados com NP-CuO + meios (Figura 1D). As concentrações mais diluídas de PBW foram menos tóxicos para células HEP, e a viabilidade celular afectada menos por tratamento. Oviabilidade de ambas as células HEK e HEP cultivadas em 16,5% PBW não tratada + meios não foi significativamente diferente a partir de células cultivadas em PBW tratados com CuO NP-53% + suporte (p <0,05). Assim, o tratamento com NP CuO apareceu para melhorar a citotoxicidade de PBW, com viabilidade perto dos níveis de controlo. Como discutido acima, o tratamento com NP de CuO PBW está associada com um aumento na concentração de cobre. O aumento era esperado, com base nos resultados anteriores por Reddy e Roth (2012), em que eles usaram CuO-NPs para remover arsênico da água subterrânea. O aumento do cobre é dependente da química da água específico do PBW, mas manteve-se abaixo de EPA MCL de 1,3 mg / L. No entanto, era importante para excluir que o aumento nas concentrações de cobre contribui para a melhoria da viabilidade (isto é, em adição a, ou em vez de, a redução em contaminantes de prioridade). Assim, o quelante de cobre D-penicilamina foi adicionado ao controle EMEM-1x, RO Control + media, soluções PBW + mídia tratados e não tratados-CuO-NP, e then MTT curva de crescimento viabilidade foram gerados, conforme descrito acima. A quelação de cobre não significativa afectar a viabilidade de utilização de células HEK ou HEP incubadas em meios RO Controlo +, PBW não tratado e tratado com NP-CuO + meios (resultados não mostrados).

A metade da concentração máxima inibitória (IC50) foi calculada a partir de cinco dias de crescimento e células HEK HEP PBW cultivadas em meios não tratada + (Tabela 4A) e tratados PBW-CuO-NP + meios (Quadro 4B). Para as células cultivadas em HEK PBW não tratada + media, o valor IC50 foi 1,264 (log% PBW). Assim, os meios + PBW não tratados que têm de ser diluídos a 18,38% para chegar a um decréscimo de 50% na viabilidade. Para as células cultivadas em HEK PBW tratados com CuO-NP + media, o valor IC50 foi 2,744 (log% PBW). Este resultado sugere que, teoricamente, a citotoxicidade da solução foi reduzida na medida em que tratado + meios PBW teria de ser concentrada por 500% (log% PBW = 2,744) para produzir um semelhante de 50%vinco na viabilidade. Para as células cultivadas em HEP PBW não tratada + media, o IC 50 foi 1,243 (log% PBW). Isto exigiria uma diluição do PBW + meios para 17,5% para produzir uma diminuição de 50% na viabilidade. Em contraste, para células crescidas em HEP PBW tratados com NP-CuO + meios de comunicação, o IC50 foi 5,327 (log% PBW). Este valor provável era tão grande, porque a viabilidade das células tratadas em PBW-CuO-NP + meios não foi significativamente diferente a partir de células cultivadas em EMEM-1x (controlo). Imagem de campo claro, ilustrado na Figura 2, de ambos HEK e HEP crescimento celular, no dia cinco. O número de células e apego nos PBW + media tratados com CuO-NP (Figura 2E, F) melhoraram em comparação com PBW não tratada + media (Figura 2C, D).

Figura 1
Figura 1: Crescimento curvas. As curvas de crescimento foram utilizados para avaliar a viabilidade e gCRESCIMENTO das culturas durante o tratamento. As curvas de crescimento para células HEK (A) e HEP (B) células crescidas em quatro diluições de PBW meios + em comparação com 53% PBW tratados com NP-CuO + meios (painéis superiores). Controle EMEM-1x (EMEM) , RO , 53% tratados com CuO-NP , 16,5% não tratada PBW , 29% não tratada PBW , 44% não tratados PBW , 56% não tratados PBW . Área sob a análise de curva (AUC) de HEK (C) e HEP (D) 7 dias dados da curva de crescimento (painéis inferiores). * P <0,05 comparado com o controlo de EMEM, #p <0,05 comparado com o controlo RO, §p <0,05 em comparação com 53% dos tratados com NP CuO PBW-media. (Em comparação utilizando um ANOVA de dois atados comAnálise de Tukey post hoc, n = 3.)

Figura 2
Figura 2:. Morfologia celular, antes e após o tratamento com NP CuO microscopia de campo brilhante (20X) de HEK (coluna da esquerda) e HEP (coluna da direita) as células no dia 5, cultivadas em: controlo de EMEM-1x (EMEM) (A, B ), 56% PBW não tratada + media (C, D) e 53% PBW tratados com NP-CuO + meios (E, F) foi utilizada para examinar a morfologia das células. Células HEK HEP e cultivadas em EMEM-1x controlo (EMEM) (A, B) mostra o crescimento saudável, quase confluentes. HEK e HEP cultivadas em PBW não tratada + media têm reduzido os números e apareça isolada (C, D). Células HEK e HEP cultivadas em PBW tratados com NP-CuO + meios de mostrar melhor fixação e, células confluentes mais saudáveis ​​(E F).

Elemento (mg / L) Média, St. Dev. & Significado
Antes do tratamento Pós Tratamento
Arsênico 0,018 ± 0,001 0,002 ± 0.0 ***
Selênio 1,8 ± 0,07 1,3 ± 0,05 **
Cobre 0,0015 ± 0,001 0,93 ± 0,43 *
Cálcio 102 ± 82 106 ± 15
Estrôncio 3,3 ± 1,1 1,5 ± 0,4 *
Magnésio 44 ± 2,1 47 ± 1,7
Sódio 610 ±; 0.0 627 ± 27
Urânio 0,98 ± 0,03 0,21 ± 0,03 ***
Bário 0,037 ± 0,02 0,019 ± 0,01
Potássio 12 ± 0,0 12 ± 0,8
Silício 12 ± 0,7 12 ± 0,5
Vanádio 1,3 ± 0,07 0,1 ± 0,02 ***
Fosfato 0,35 ± 0,07 0,05 ± 0,0 ***
Sulfato 805 ± 21 807 ± 15
Condutividade 3125 ± 143 3190 ± 62
pH 7,31 ± 0,09 7,36 ± 0,05

Tabela 1:. Análise de cátions e ânions, antes e após o tratamento CuO-NP Média concentrações dos elementos antes e após o tratamento com CuO-NP. Significância entre a concentração de CuO-NP-tratada e não tratada são designados como PBW * = p <0,05, ** = p <0,01 e *** = p <0,001. Uma célula em branco indica que não há diferença significativa. Concentrações de cloreto variou entre 46,5 ± 0,707 e 55,25 ± 8,180. Alumínio, boro, molibdênio e concentrações foram baixas e não mostrou nenhuma mudança significativa devido ao tratamento CuO-NP. Concentrações de manganês não foram consistentes.

Componentes % De concentração total Espécies
Arsênico 58,7 Haso 4 2-
41.2 H 2 AsO 4 -
Urânio 64,1 Ca 2 UO2 (CO3) 3 (aq)
32,2 CaUO 2 (CO 3) 3 2-
0,03 UO2 (CO3) 2 2-
3,5 UO2 (CO3) 3 4-
0.09 Ca 2 UO2 (CO3) 3 (aq)
0,02 CaUO 2 (CO 3) 3 2-
Selênio 94,3 SeO 4 2-
5.6 CaSeO 4 (aq)
Vanádio 2.1 HVO 4 2-
95,7 H 2 VO 4-
2.1 H 2 V 2 O 7 2-
0,01 HV 2 O 7 3-
0,01 V 4 O 12 4-

Tabela 2: Espécies modelagem utilizando Visual MINTEQ ver. Software 3.0. Visual MINTEQ ver. Software 3.0 (KTH Royal Institute of Technology, Valhallavägen, Suécia) foi usada para calcular especiação de metal dos componentes PBW listados na Tabela 1. (Aq) = aquosa, em oposição à forma sólida do que as espécies.

Controle EMEM Não tratada
PBW + Media PBW
Arsênico 0,003 ± 0.0 0,017 ± 0.0 0,010 ± 0,001
Cobre 0,01 ± 0,0 0,0015 ± 0,001 0,018 ± 0.0
Selinium 0,013 ± 0,002 1,75 ± 0,07 1,15 ± 0,06
Urânio 0,00015 ± 0.0 0,975 ± 0,03 0,71 ± 0,01
Vanádio 0,0015 ± 0.0 1,25 ± 0,07 0,785 ± 0,007
Tratou-NP CuO
PBW + Media PBW
Arsênico 0,0022 ± 0,001 0,0015 ± 0.0
Cobre 0,926 ± 0,4 0,81 ± 0,0
Selinium 1,25 ± 0,05 0,855 ± 0.0.02
Urânio 0,208 ± 0,03 0,45 ± 0,01
Vanádio 0,102 ± 0,02 0,0795 ± 0,01

Tabela 3:. As concentrações de contaminantes em meios concentrações de contaminantes prioritários (mg / L) em controlo de EMEM-1x (EMEM), não tratado PBW, tratados com CuO-NP PBW, PBW não tratada + meios PBW e tratados com NP-CuO + meios após a adição de componentes de media (n = 3) foram avaliados para garantir alterações na concentração de contaminante devido ao tratamento foram representados em meios não tratados PBW + e CuO-NP-tratados PBW + meios aplicados para cells.

A não tratada PBW + Mídia
As concentrações de não tratada PBW (log X) % De viabilidade (células HEK) % De viabilidade (células HEP)
EMEM 100 100
16,5% (1.217) 51,4 50,8
29% (1.462) 39 33,3
44% (1.643) 19,3 14,7
56% (1.748) 14,5 9.4
IC 50 Log [PBW] 1.264 1.243
B CuO-NP-tratados PBW + Meios
As concentrações de CuO-NP-Tratada PBW (log X) % De viabilidade (células HEK) % De viabilidade (células HEP)
EMEM 100 100
17% (1.230) 86,7 119,8
30% (1.477) 75,8 86,7
45% (1.653) 81 92,4
53% (1.724) 70,3 97,5
IC 50 Log [PBW] 2.744 5,327

Tabela 4: Cálculo de IC 50. O IC 50 representa a concentração de PBW não tratada + meios PBW ou tratados com NP-CuO + meios de comunicação que é necessária para uma inibição de 50% de viabilidade.   A percentagem de viabilidade no dia 5 para HEK e HEP células expostas às diluições de não tratada PBW + media (A) ou tratadas com NP-CuO PBW + media (B) foram utilizados para calcular a metade da concentração máxima inibitória (IC50).

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Discussion

Estudos anteriores relataram que CuO-NPs removido arsénio das águas subterrâneas 11,13,30,31. Este estudo suporta essas descobertas anteriores e também relata que CuO-NPs remover os contaminantes adicionais de PBW. Este estudo também confirma os relatos anteriores que CuO-NPs são eficazes na remoção de arsénio, apesar da presença de outros contaminantes potenciais e iões concorrentes 11. Modelagem especiação previu que 97% das espécies de vanádio em PBW são carregados negativamente, permitindo a adsorção de CuO-PN, e tratamento de lotes removido 92% de vanádio.

Este é o primeiro estudo a investigar os efeitos de remoção de contaminantes específicos de PBW usando CuO-NP, e, em seguida, avaliar as alterações na citotoxicidade associados com a remoção. Os resultados demonstram que investiga as mudanças na citotoxicidade de misturas complexas, utilizando uma abordagem in vitro pode ser possível, mas estes métodos não são sem limites. PBW não poderia ser utilizado full força sobre as células, porque para sobreviver, as células cultivadas requerem um meio de crescimento definido e osmolalidade específico. Meios PBW + não poderia também ser usado em células sem ajustamento de pH. O pH da PBW foi de 7,31, antes e após o tratamento no entanto 7,36; a adição de componentes do meio de crescimento reduziu o pH para cerca de 6,8, dependendo da diluição. Ajuste do pH é um passo normal na preparação de meios de cultura de células no entanto; ajuste do pH dos meios + PBW pode ter alterado as interacções moleculares das espécies elemento com componentes dos meios. Não tratados e tratados com NP-CuO PBW concentrado foram combinados com meios de crescimento de EMEM-10X em várias proporções para se obter soluções de ensaio (PBW + media). A análise ICP-MS foi realizada em meio de ensaio para verificar que as concentrações de metais significativamente afectadas por CuO-NP-tratamento (arsénio, cobre, selénio, urânio, vanádio) foram a concentrações esperadas após diluição pelos componentes do meio de ajuste da pressão osmótica e. A diminuiçãoem arsênio, selênio e vanádio após CuO-NP-tratamento é refletida nas diferenças de concentração entre PBW não tratada + media eo PBW tratados com CuO-NP + mídia. Concentrações de urânio são mais elevados no PBW tratados com CuO-NP + media do que o previsto. Dados ICP-MS (Tabela 1) sugere que mais urânio foi removido durante o tratamento de PBW CuO-NP do que previsto por modelagem. Modelagem especiação (Tabela 2) previu que a pH 7,3, apenas 35,5% das espécies de urânio são carregadas negativamente. O modelo prediz que as espécies principais de urânio, carbonato de uranilo de cálcio (Ca 2 UO2 (CO3) 3), é neutro.

O observada a remoção de 78% do urânio foi provavelmente devido a uma combinação de adsorção e precipitação de urânio (como um uranilo carbonato de cálcio mineral). Com base na modelagem geoquímico, a percentagem de urânio removido por adsorção é menos do que calculado para permitir uma concentração mais elevada na CuO NP-PBW tenha sido tratada com + mídia. O mecanismo de remoção de urânio pelo CuO-NP-tratamento não é claro e requer uma investigação mais aprofundada. Era esperado quando PBW foi adicionado a EMEM-10x no entanto um aumento da concentração de cálcio, potássio e magnésio; CuO-NP-tratamento não produziu uma mudança significativa nestes elementos para que nenhuma diferença foi observada em não tratado vs. PBW tratados com CuO-NP + mídia. A técnica de combinação do ambiente real com componentes dos meios foi bem sucedido em que representa as mudanças observadas em concentrações de elemento, devido ao tratamento; no entanto, a natureza oxidada do PBW limitada como os meios + PBW pode ser feito. Numa tentativa para aumentar a concentração máxima dos elementos em meios de ensaio, meios de cultura celular em pó foi inicialmente misturado com não tratadas e tratadas com NP-CuO PBW fazer PBW + meios. Os meios de comunicação em pó, muitas vezes resultou em precipitação de sais de cálcio e que aumentou a osmolalidade da PBW + meios que exigia uma maior diluição com água RO, produzindo concentrações próximos aos obtidos com líquidos 10x mídia. Estas questões são mais provável PBW-specific, devido ao seu estado oxidativo e pode não ser um problema com outras misturas menos sensíveis.

O ensaio de MTT foi escolhida para avaliar a citotoxicidade, porque é um ensaio de elevado débito padrão reconhecido que avalia a saúde geral das células medindo a actividade mitocondrial. Este método possui vantagens e desvantagens. O formato de 96 poços é útil para a obtenção de vários pontos de dados no entanto; a maioria das células no dia 5 foram insalubre procurando, arredondadas e não ligado à placa. As fotografias da Figura 2 foram tomados antes que o material foi removido utilizando um vácuo; sucção fora da mídia, e em seguida, adicionando a solução de MTT pode ter removido células não ligadas ou individual células mal aderentes, contribuindo para o planalto global do sinal MTT após Day Two visto com PBW não tratada. A suposição é que as células flutuantes são mortos ou moribundos e oomente as células ligadas são avaliados utilizando este método. Também é importante considerar as limitações do ensaio MTT em relação aos estudos que utilizam nanopartículas.

Estudos anteriores relataram que, quando aplicado diretamente às células cultivadas, as nanopartículas podem ter toxicidade inerente, para além das suas propriedades químicas de base, em função das suas características físicas únicas, tais como a forma e tamanho 32,33. Neste estudo, nós não aplicar o CuO-PN diretamente sobre as células. Em vez disso, as células foram expostas a PBW que tinham sido previamente tratados com CuO-PN, centrifugado para remover a maioria do CuO-PN e depois filtrou-se duas vezes para remover mais CuO-NPs antes da PBW foi utilizado para preparar PBW + meios. Os resultados de MS mostrou um aumento do cobre após o tratamento. Isto poderia ser iões de cobre que foram dissolvidos a partir das nanopartículas durante o tratamento ou CuO-PN que podem ter passado através dos passos de centrifugação / filtração para permanecer no PBW tratada used para fazer a PBW + mídia. CuO-NPs variam em tamanho de 12-18 nm, com uma área de superfície BET medida de 85 ± 1 m2 / g, mas 11 são conhecidos para agregar e com base no aumento mínimo das concentrações de cobre no PBW tratada, a maior parte do cobre independentemente da fonte é removido após a centrifugação e filtração. A confirmação visual da melhoria da saúde das células e confluência suporta os resultados do ensaio MTT de viabilidade melhorada devido ao tratamento com NP de CuO a PBW (Figura 2). Futuros estudos utilizando outros métodos pode avaliar (ou caracterização) efeitos de confusão semelhantes causadas por CuO-NPS.

Células de rim embrionário humano (HEK 293) e de carcinoma hepatocelular humano (Hep G2) foram escolhidos para os ensaios de toxicidade. Estas são as linhas celulares padrão que são clinicamente relevantes para toxicidade nos órgãos de heavy metal 24,25,34-40. Uma baixa densidade sementeira foi usada para os ensaios MTT. As células foram semeadas a 500 células / poço, deixados a recuperardurante 24 h, e, em seguida, exposta ao meio de ensaio. A baixa densidade de sementeira foi necessário para alcançar uma curva de crescimento com uma fase log por volta do dia 5, antes de se tornar sobre-confluente e estacionário no dia 6 ou 7. Chakraborty et al. (2010) relataram que, num estudo de toxicidade de cádmio no rim cultivadas células do túbulo proximal (PTC), de confluência e status proliferação (proliferando vs. repouso) afetou a resposta à exposição ao cádmio: células sub-confluentes proliferando mostrou mais citotoxicidade de células confluentes (quiescentes). HEP e HEK células expostas a PBW a concentrações mais elevadas (superiores confluência) semelhantes aos utilizados para a outra ensaio (resultados não mostrados) não mostraram alterações consistentes na morfologia observada com o ensaio MTT. É necessária uma maior investigação sobre as alterações na citotoxicidade utilizando linhas de células não-aderentes ou protocolos que colhem e recolher todas as células (por exemplo, citometria de fluxo).

Outra limitação do método MTT em estudos realizados nos EUAing nanopartículas é que alguns tipos de nanopartículas podem interferir com a nutrição celular. Meios de cultura celular normalmente contêm fontes de proteína adicionado, tais como soro fetal bovino (FBS), suplemento de crescimento de células. Estudos têm mostrado que nanopartículas de óxido de metal pode esgotar componentes importantes de crescimento em FBS, devido ao aumento da capacidade de absorção de nanopartículas. Nanopartículas de óxido de metal têm sido mostrados para conectar-se a FBS através de uma interacção com cálcio 41. Dependendo do pH da solução, as nanopartículas metálicas pode transportar uma carga positiva ou negativa. Estudos de citotoxicidade revelaram que as nanopartículas de metal adicionado à cultura de células meios adsorver catiões, incluindo Ca2 +, e, em seguida, remover FBS / albumina de soro através da ligação do complexo de NP-Ca 2+ para a locais nas proteínas em FBS a ligação ao cálcio. Isto diminui a concentração de Ca 2+ e FBS a partir do meio, as células essencialmente fome e aumento da citotoxicidade atribuído ao ndnoparticles 41. Além disso, a pré-exposição de nanopartículas para FBS / Ca 2+ as nanopartículas revestidas, diminuindo o seu efeito citotóxico. No entanto, nós não expor diretamente a mídia para CuO-PN. Além disso, não houve diminuição significativa na concentração de Ca 2+ foram vistos em PBW após o tratamento com CuO-PN, indicando que não houve absorção significativa de Ca2 + para o CuO-NPs priming-los para se ligarem com o FBS. No entanto, a concentração de cálcio no PBW é elevada o suficiente para que uma diminuição induzida por nanopartículas podem não ter sido aparentes. Ainda é pouco provável que o CuO-PN usada neste estudo são absorver grandes quantidades de cálcio durante o processamento, porque não houve diminuição da capacidade de absorção de arsénio da CuO-NPs em PBW, que contém níveis elevados de cálcio em comparação com os estudos anteriores com águas subterrâneas com um cálcio menores concentrações 13.

Os dados demonstram que CuO-NPs remover arsênio, selênio vanádio e uranio, e isto está associado com uma melhor viabilidade celular HEK e HEP no ensaio MTT. O mecanismo (s) pelo qual a viabilidade é melhorada ainda não foi determinada, mas poderia ser devido a remoção de contaminantes de prioridade por CuO-NP, entre outros mecanismos. O presente estudo também demonstra que os métodos padrão de cultura de células pode ser utilizado para avaliar a eficácia de um método de tratamento de água de nanopartículas ISR, potencialmente, permitir que uma série de estudos mecanísticos para ser completado, antes de passar para os estudos in vivo em animais mais dispendiosos e demorados . Além disso, CuO-PN pode provar ser mais versátil para os processos de extracção e para o tratamento de misturas de metal do que os adsorventes convencionais como os óxidos de alumínio, ferro, titânio e manganês, desde CuO-NPs de não necessitar de um ajustamento de pH ou a oxidação de água para a remoção do arsénio, e CuO-NPs de remover tanto arsenito e arseniato na presença da aniões fosfato concorrente, silicato e sulfato. Além disso, CuO-PN pode ser regenerado e re-Usado, reduzindo os custos de reagentes e a quantidade de gastos subprodutos dos resíduos de tratamento que necessitam de eliminação 12.

Limitações potenciais do protocolo MTT incluem a baixa densidade celular na altura da exposição, desprendimento de células e perda de sinal, inanição celular e possível exposição directa das células à CuO NP-reactividade alterando MTT. A densidade celular e problemas de descolamento pode ser tratado usando um teste alternativo, tais como citometria de fluxo, o que permite densidades de sementeira mais elevadas, bem como a recolha de todas as células (isto é, ambos flutuantes e em anexo). Questões de fome celular poderia ser avaliada medindo concentrações do fator de crescimento nos meios de comunicação periodicamente durante o tratamento. O trabalho futuro incidirá sobre a aplicação do protocolo atual para diferentes ensaios de citotoxicidade, que irá abordar, se possível exposição alterada atividade ensaio CuO-NP, medições de fome celular durante o tratamento e também testar a capacidade de CuO-NPs para remover contaminaNTS e afetam a citotoxicidade de outros tipos de misturas complexas, tais como resíduos de locais de Superfund e lagoas de eliminação de resíduos. Esses estudos também abordaria se os métodos foram robustos em vários cenários.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CuCl2 Sigma 203149
Borosilicate glass balls VWR 26396-639 6 mm
Nitric Acid Fisher A509-P500 Trace metal grade
0.45 μm syringe filter Fisher SLHA 033S S
10x EMEM Fisher BW12-684F
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
L-glutamine Fisher BP379-100
NaHCO3 Sigma S5761
Penicillin/Streptomycin ATCC 30-2300
0.22 μm vacuum filter unit Fisher 09-740-28C
HEK293 ATCC CRL-1573
HEPG2 ATCC HB-8065
Trypsin Sigma SV3003101
MTT Sigma M2128
D-penicillamine Fisher ICN15180680
96-well plates Fisher 07-200-92
DMSO Fisher D12814
Spectra Max 190 Molecular Devices
Visual MINTEQ version 3.0 KTH Royal Institute of Technology
ICP-MS Agilent Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
IC DIONEX DX 500 Dionex Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
VWR Incubator VWR

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References

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