Fjernelse af Trace Elements af cuprioxid Nanopartikler fra uran
1Division of Physical Therapy, Department of Orthopedics & Rehabilitation, University of New Mexico, 2Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 3School of Pharmacy, University of Wyoming, 4Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 5Center for Environmental Medicine, Colorado State University, 6College of Pharmacy, California Northstate University

Published 6/21/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Schilz, J. R., Reddy, K. J., Nair, S., Johnson, T. E., Tjalkens, R. B., Krueger, K. P., et al. Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability. J. Vis. Exp. (100), e52715, doi:10.3791/52715 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In situ opsving (ISR) er den fremherskende metode til uranudvinding i USA. Under ISR, er uran udvaskes fra en malm legeme og ekstraheret gennem ionbytning. Det resulterende produktion bleed vand (pbw) indeholder forurenende stoffer som arsen og andre tungmetaller. Prøver af PBW fra en aktiv ISR uran facilitet blev behandlet med cuprioxid nanopartikler (CuO-NPS). CuO-NP behandling af pbw reduceret prioriterede forurenende stoffer, herunder arsen, selen, uran og vanadium. Ubehandlede og CuO-NP behandlede PBW blev anvendt som den flydende bestanddel af medierne og ændringer i levedygtighed cellevæksten blev bestemt ved MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) assay i human embryonisk nyre (HEK 293) og humant hepatocellulært carcinom (Hep G2) celler. CuO-NP behandlingen var forbundet med forbedret HEK og HEP cellelevedygtighed. Begrænsninger ved denne fremgangsmåde indbefatter fortynding af PBW ved vækstmedier komponenter, og under osmolcippet justering samt den nødvendige pH-justering. Denne fremgangsmåde er begrænset i sin bredere sammenhæng grundet fortyndingsvirkninger og ændringer i pH-værdien i PBW som traditionelt svagt sur dog; denne metode kunne have en bredere anvendelse vurdere CuO-NP behandling i mere neutrale farvande.

Introduction

Ca. 20% af den elektriske forsyning amerikanske leveres af atomenergi, og delvist baseret på de nationale incitamenter til at øge energi uafhængighed, amerikanske nukleare kapacitet forventes at stige 1. Verdensomspændende vækst af kernekraft også forventes at fortsætte, med meget af væksten sker uden for USA 2. Fra 2013 blev 83% af amerikanske uran importeret, men 952.544 tons reserver findes i USA 3,4. I 2013 var der 7 nye facilitet applikationer og 14 genstart / ekspansion ansøgninger mellem Wyoming, New Mexico, og Nebraska 5. I USA er uran overvejende udvindes gennem in situ inddrivelse (ISR) processer 6. ISR forårsager mindre jord forstyrrelser og undgår at skabe affaldsgruber bunker, der kan frigive miljøbelastende stoffer 7. ISR anvender vandbaserede oxiderende løsninger udvaskes uran fra undergrunden malm organ, hvorefter uran ekstraheres fra perkolatet gennemen ionbytningsproces 8. At opretholde en negativ vandbalance i malmen organ, en del af perkolat, kaldet produktion bløder vand (pbw), afledes. En del af PBW dekontamineres anvendelse af omvendt osmose (RO) og re-introduceret i minedrift proces, men PBW også kunne have gavnlige industrielle eller landbrugsmæssige formål, hvis toksiske forurenende stoffer kan reduceres til et acceptabelt niveau bestemt af statslige reguleringsorganer for overfladevand og grundvand 9. I øjeblikket er de fleste ISR uran faciliteter bruger RO til at fjerne forurenende stoffer fra PBW. Men RO behandlingen er energikrævende og producerer giftigt affald saltlage, som kræver reguleret bortskaffelse.

Der eksisterer mange vand dekontamineringsmetoder, herunder adsorbenter, membraner, og ionbytning. Af disse adsorption er den mest anvendte, og den seneste udvikling i nanopartikel syntese har forbedret mulighederne i adsorbent-baserede vand rensningsprocesser 10. Cupri oxide nanopartikler (CuO-NPS) tidligere havde ikke blevet grundigt undersøgt på uran ISR PBW, men i de seneste undersøgelser af forurenende fjernelse fra grundvand blev CuO-NP'er sig at have unikke egenskaber, herunder ikke kræver før eller efter vand behandlingstrin ( fx justering pH eller redoxpotentiale) og klarer sig godt i forskellige vand kompositioner (fx i forskellige pH-værdier, saltkoncentrationer eller konkurrerende ioner) 11. Desuden er CuO-NP'er let regenereres ved udludning med natriumhydroxid (NaOH), hvorefter den regenererede CuO-NP'er kan genanvendes. Nærmere oplysninger om CuO-NP trace metal filtrering kapaciteter fra naturlige vandområder er tidligere blevet udgivet 11-14.

Selvom nyttigt for vandbehandling, kan metal oxide nanopartikler være giftige for levende organismer, men omfanget af toksicitet afhænger til dels på nanopartikler egenskaber og bestanddele 10,15,16. Derfor er det vigtigt at studere simultaneous forurenende fjernelse og nanopartikler toksiciteter før marken applikationer. Den aktuelle undersøgelse bestemt evne CuO-NP'er at fjerne pbw prioriterede forurenende stoffer (herunder arsen, selen, vanadium og uran), og vurderet effekten af ​​CuO-NP behandling på PBW cytotoksicitet.

PBW blev opsamlet fra en aktiv ISR uran facilitet og anvendes til at fastlægge effekten af ​​CuO-NP behandling i prioriteret kontaminantfjernelse. PBW cytotoksicitet før og efter CuO-NP behandling også blev vurderet. PBW er en kompleks geologisk (industriel / miljø) blandingen og både National Institute of Environmental Health and Science (NIEHS) og agenturet for giftige stoffer og sygdom Registry (ASTDR) lægger vægt på at studere toksiciteten af ​​miljømæssigt relevante blandinger, herunder blandinger som de findes i naturen eller industrielle indstillinger, samt fremme in vitro test for at prioritere kemikalier til yderligere in vivo-test17-19. Undersøgelser af kronisk, lavdosis blanding engagementer udfordrende fordi kronisk eksponering til en blanding lav dosis ikke producere tydelige virkninger, i hvert fald ikke på kort tidsramme fleste laboratorieundersøgelser. Tilsvarende fleste in vitro studier af kemiske blandinger udsætte celler for et defineret lab-made blanding af 2 eller flere metaller 20,21. Disse undersøgelser giver baseline oplysninger, men forenklede blandingen ikke gentage de komplekse antagonistiske og synergistiske interaktioner, der kan opstå i en indfødt, miljømæssig prøve, hvor hele spektret af blandingen komponenter er til stede.

Målene for denne undersøgelse var at undersøge alternative forurenende fjernelse processer for PBW og vurdere effekten af ​​(CuO-NP) behandling på PBW cytotoksicitet ved hjælp dyrkede humane celler. Resultaterne kunne gavne uran industrien gennem udvikling af mere effektive eller miljøvenlige metoder til forurenende fjernelse. Denne undersøgelse giverdet første tegn på, at reduktionen af prioriterede forurenende stoffer i PBW af CuO-NP'er reducerer cytotoksicitet i pattedyrceller 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prøver blev indsamlet på den flydende uran forarbejdning bygning af et uran ISR facilitet i Wyoming.

1. Produktion Bleed Vand (PBW)

  1. Saml to typer vandprøver fra en ISR uran facilitet: PBW og osmose (RO) vand omvendt. Indsamle PBW fra et overvågningssystem vandhanen efter ionbytning, men før omvendt osmose dekontaminering. Saml RO prøver efter PBW dekontamineres ved osmose behandling omvendt.
    BEMÆRK: Lixiviant transporteres i rørledninger fra flere kildepladser til flydende uran forarbejdning bygning, hvor det opsamles i en kolonne og forberedt til ionbytning. Ca. 1-3% af lixiviant efter ionbytning er fjernet fra kredsløbet, og betegnes produktion bleed vand (pbw). PBW genbruges i minedrift processer eller dekontamineres / demineraliseret med RO filtrering.
  2. Saml vandprøver i HD-polyethylen (HDPE) flasker med nul head plads eftertil standardprocedurer for prøvetagning og analyse af Wyoming Department of Environmental Quality (WYDEQ) 23.
  3. Mål temperatur og pH på stedet og transport prøver på is for at holde dem kolde.
  4. Store PBW ved 4 ° C. Hold PBW opløsningen afkøles før efter den koncentrerede Eagles minimale væsentlige medier (EMEM-10x) tilsættes under forberedelse medier som anvist i følgende protokol.
    BEMÆRK: PBW er et oxideret løsning, der vil udfælde hvis de får lov til at fryse eller opvarmet til stuetemperatur. Efter fortynding er PBW opløsningen er tilstrækkeligt fortyndet, at den ikke vil udfælde ved opvarmning til 37 ° C før anvendelse til celler og under inkubation.

2. Fremstilling af CuO Nanopartikler (CuO-NP'er)

  1. Kombiner en ren ethanolisk opløsning indeholdende 250 ml 0,2 M CuCl2 • 2H 2 O, 250 ml 0,4 M natriumhydroxid (NaOH) og 5 g polyethylenglycol (PEG) i en rundbundet kolbe med seks mm borsilikat glaskugler.
  2. Placer opløsning i en modificeret mikrobølgeovn og lad det reagere under tilbagesvaling ved omgivelsernes lufttryk i 10 minutter ved 20% effekt (intervaller på 6 sek på 24 sek slukket).
  3. Opløsningen afkøles til stuetemperatur (20 ° C), derefter dekanteret over i 50 ml koniske rør, forlader glaskugler.
  4. Centrifuger opløsningen i 50 ml koniske rør ved 1000 xg i 30 min, dekanteret, og vask derefter CuO-NP'er med en sekvens af 300 ml varmt vand (60-65 ° C), 100 ml ethanol og 100 ml acetone.
  5. Tør CuO-nationale parlamenters til stuetemperatur (20 ° C) i 50 ml koniske rør.
  6. Skrabe CuO-NPs ud af deres rør i en morter. Dække CuO-NP'er med tin folie og opvarm CuO-NPs til 110 ° C i en ovn for at fjerne den resterende væske. Kombiner CuO-NP'er i én batch og vejer den CuO-NP'er.
    BEMÆRK: Udarbejdelsen af ​​CuO-NP'er og CuO-NP behandling af PBW blev gennemført i vand Quality Laboratoriet for Ecosystem Science and Management, University of Wyoming. CuO-NP-syntese fulgt proceduren i Martinson og Reddy (2009) 11.

3. Behandling af PBW med CuO-NP'er

  1. Tilsættes 50 mg (1 mg / ml) af CuO-NP til en 50 ml konisk rør efterfulgt af 50 ml PBW. Forsegle røret og omsat i 30 minutter på en bænk top orbitalryster ved 250 rpm.
  2. Centrifugér prøverør ved 250 x g i 30 minutter og derefter filtrere supernatanten under anvendelse af en 0,45 um sprøjtefilter. Alter centrifugen hastighed og tid kan afhænge af nanopartikel at sikre CuO-NP'er bliver kompakt i centrifugeglasset.

4. Grundstofanalyse

  1. Forbered Ubehandlet (kontrol) og CuO-NP-behandlede vægtdele prøver til elementæranalyse som følger.
  2. Forsure alikvoter (40 ml) af CuO-NP-behandlet og ubehandlet PBW med spormetalkvalitet salpetersyre til en pH på 2,0. Analyser syrnede pbw portioner for kationer ved induktivt par rined plasma-massespektroskopi (ICP-MS) som beskrevet i Reddy og Roth (2012) 13.
  3. Forbered unacidified alikvoter (20 ml) af CuO-NP-behandlet og ubehandlet PBW og analysere unacidified alikvoter for anioner ved ionkromatografi (IC) som beskrevet i Reddy og Roth (2012) 13.
    BEMÆRK: Prøver blev analyseret af Wyoming Institut for Landbrug Analytical Services, Laramie WY 82070. En beskrivelse af IC og ICPMS proceduren kan findes i Reddy og Roth, (2012) 13.

5. Udarbejdelse af Cell Culture Media Brug PBW

  1. Brug to kontrol (EMEM-1x og RO + medier) og otte pbw test medieløsninger (fire koncentrationer hver af ubehandlet PBW og CuO-NP-behandlede medier) i de levedygtighed studier. Oversigter over de løsninger er som følger:
    1. For EMEM-1x kontrol, købe Eagles minimale essentielle medier (EMEM-1x) med L-glutamin og natriumbicarbonat allerede tilføjet. Tilføj føtalt bovint serum (FBS) Og antibiotika pr producentens anvisninger.
      BEMÆRK: EMEM-1x købes fortyndet til den korrekte koncentration for cellevækst og indeholdende L-glutamin og natriumbicarbonat. EMEM-1x kræver tilsætning af føtalt bovint serum (FBS) og et antibiotisk blanding af penicillin og streptomycin (50 IU / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin). EMEM-1x anvendes som en kontrol medie, fordi det er producentens anbefalede vækstmedier for begge celletyper anvendt i denne undersøgelse. Koncentreret EMEM-10x fortyndes med RO vand fra anlægget eller ubehandlet eller CuO-NP-behandlede PBW at producere testopløsningerne. Koncentreret EMEM-10x, når de købes ikke indeholder L-glutamin eller natriumbicarbonat så disse tilsættes i tillæg til den føtalt bovint serum (FBS) og et antibiotisk blanding af penicillin og streptomycin.
    2. For RO kontrolopløsning bruger RO vand indsamlet fra ISR facilitet. Brug den samme protokol som pbw test medier kun erstatte 100% RO watis fra ISR anlæg i stedet for PBW. At fortynde ubehandlede og CuO-NP-behandlede opløsning brug RO eller ultrarent vand fra laboratoriet.
    3. Fortynd ubehandlet PBW i fire testkoncentrationer før blanding med cellekultur mediekomponenter de. Forberede de fire forskellige koncentrationer af ubehandlede vægtdele løsninger ved at blande ubehandlet PBW med RO (fra laboratoriet) i følgende kombinationer: 100% (rent PBW + ingen RO vand), 75% (187,5 ml PBW + 62,5 ml RO vand), 50% (125 ml PBW + 125 ml RO vand) eller 25% (62,5 ml PBW + 187,5 ml RO vand).
    4. Fortynd CuO-NP-behandlede PBW i fire testkoncentrationer før blanding med cellekultur mediekomponenter de. Forberede de fire forskellige koncentrationer af CuO-NP-behandlede vægtdele opløsninger ved blanding PBW (forbehandlet med 1 mg / ml CuO-NP i 30 minutter) med RO (fra laboratoriet) i følgende kombinationer: 100% (rent CuO- NP-behandlede PBW + ingen RO vand), 75% (187,5 ml CuO-NP-behandlede PBW + 62,5 ml RO vand), 50% (125ml CuO-NP-behandlede PBW + 125 ml RO vand) eller 25% (62,5 ml CuO-NP-behandlede PBW + 187,5 ml RO vand).
  2. Forbered 250 ml RO + medier, ubehandlet PBW + medier og CuO-NP-behandlede PBW + mediekoncentration ved at tilsætte 25 ml koncentreret EMEM-10x til 190 ml af 100% RO og 100%, 75%, 50% eller 25% af de premade ubehandlede eller CuO-NP-behandlede pbw koncentrationer oprettet i trin 6.1.3 og 6.1.4.
  3. Justere pH af hver opløsning til 7,4 med NaOH eller HCI.
  4. Supplement hver koncentration af ubehandlet og CuO-NP-behandlede PBW samt RO + medier med følgende standardkomponenter: 25ml (10%) føtalt bovint serum (FBS), 2,5 ml L-glutamin, 0,55 g NaHCO3 og 1,25 ml Pen / Strep (50 IU / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin).
  5. Juster osmolalitet hver koncentration af ubehandlet PBW + medier, CuO-NP-behandlede pbw + medier og RO + medier til 290-310 mOsm / kg ved at tilføje RO vand og måle ved hjælp af en osmometer.
  6. Filter hver løsning meden 0,22 um vakuum filterenhed og opbevar ved 4 ° C.
    BEMÆRK: På grund af små variationer i mængden af ​​RO vand, der bruges til at justere osmolalitet, varierer endelige medier koncentrationer inden for en 5% interval, med ubehandlet PBW + medier koncentrationer ved 56%, 44%, 29% og 16,5%, og CuO-NP- behandlet vægtdele + mediekoncentrationer ved 53%, 45%, 30% og 17%.

6. cellelevedygtighed

BEMÆRK: Da nyre og lever er målorganer af heavy metal toksicitet, beskæftiger dyrkede humane embryonale nyre (HEK293) celler (HEK) og den menneskelige hepatocellulært carcinom (HepG2) celler (HEP) test metoder 24-26.

  1. Forberede en kultur af HEK og HEP-celler 2-3 dage før udpladning af 96-brønds plader, der anvendes i forsøget henhold til producentens instruktioner.
  2. Måle cellelevedygtighed under anvendelse af 3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay.
    BEMÆRK: MTT assayprotokollen blev modificeret fra Meerloo et al. (2011) 27.
    1. Opnå MTT i pulverform. Tilføj phosphatbufret saltvand (PBS) for at gøre et lager koncentration på 50 mg / ml. Agitere opløsningen i 2 timer og filtreres med et 0,45 um sprøjtefilter og alikvot i 1,5 ml frys rør. Beskyt rør fra lys og opbevares ved 4 ° C.
  3. Fjern HEK og HEP-celler fra deres dyrkningsskåle ved anvendelse af trypsin, centrifugeres ved 1.000 xg i 5 minutter og dekanteres trypsin Der tilsættes 5 ml PBS og blandes celler til opnåelse af en enkelt celle løsning. Anvend derefter 20 pi af enkelt celle løsning på et hæmocytometer til opnåelse af en celletælling pr milliliter opløsning. Centrifuger cellerne igen ved 1000 xg i 5 minutter og dekanteres PBS bruges til skylning af cellerne. Tilsæt passende mængde EMEM-1x at justere koncentrationen af ​​celler til 500 celler / 100 pi (100 pl / brønd).
  4. Fyld perimeter brønde på pladen med 200 pi PBS for at kontrollere for fordampning.
  5. Kernehusets ved en densitet på 500 celler / brønd at tilsætte 100 pi til hver brønd med undtagelse af omkredsen brønde (som ikke er belagt med celler).
    BEMÆRK: podningsdensitet for HEK og HEP-celler er baseret på eksperimentelle vækstkurver, der tillader toppen af ​​vækst sker omkring dage 4-5. Forberede vækstkurver for alle cellelinier til at estimere podningstæthed.
  6. Cellerne inkuberes i 24-time ved 37 ° C mulighed for at restituere (skema stramme adhæsioner til pladen) før udførelse baseline MTT aflæsninger af celledensitet.
  7. Udføre baseline MTT aflæsninger af celledensitet ved at fjerne podning medier fra den første søjle (ikke inklusive omkredsen) og tilsætte 100 pi MTT (5 mg / ml i medier) til brøndene i 1 time.
  8. Efter en time fjernes MTT, og 100 pi dimethylsulfoxid (DMSO) for at opløse MTT-formazan produceret af levedygtige celler (20 min).
  9. Læse den optiske densitet (OD) af den første søjle ved en absorptionsbølgelængde på 570 nm til opnåelse af en baseline læsning.
    1. Brug baseline aflæsninger for at sikre alle plader blev podet korrekt, og at celler vokser konsekvent mellem pladerne. Fjern DMSO fra kolonnen, der testes, før inkubering i de næste 24 timer.
      BEMÆRK: Hvis DMSO efterlades i pladen natten over det trækker fugt fra den tilstødende kolonne, hvilket medfører en reduktion i mængden medier.
  10. Varm testopløsningerne (dvs. EMEM-1x, RO, ubehandlet PBW og CuO-NP-behandlede PBW medieløsninger) til 37 ° C i et vandbad.
  11. Fjern seeding medier fra resten af ​​pladen (ikke inklusive omkredsen eller den første søjle, som blev anvendt til baseline behandling) og erstattet med 100 pi EMEM-1x, RO + medier, ubehandlet vægtdele + mediekoncentrationer eller CuO-NP -behandlet PBW + medier koncentrationer (én løsning per plade). Inkuberes celler i deres testkoncentrationer eller styringsløsninger til i alt syv dage (dage 2-8).
    BEMÆRK: Der 10 plader alt: 1 EMEM-1x, 1 RO + medier, 1 af hver ubehandlet pbw + media koncentration (56%, 44%, 29% og 16,5%) og en plade af hver CuO-NP-behandlede koncentration vægtdele + media (53%, 45% , 30% og 17%) pr eksperiment per cellelinje.
  12. Hver dag efter baseline MTT læsning, fjerne kontrol- og test løsninger (anført i note under 6.11) fra den næste kolonne i deres respektive plade (f.eks Dag 2 test og kontrol medier fjernes fra række 3, brønde BG, Dag 3: rækken 4, brønde BG etc.) og gentag MTT protokol som beskrevet i trin 6,7-6,9 ovenfor.
  13. Gentag protokollen hver dag i syv dage. Gennemsnittet af OD resultater for hver række (6 brønde) og indberettet mod tiden for at generere en syv-dages vækstkurve.
  14. For at vurdere effekten af ​​kobber kelation på cellernes levedygtighed i CuO-NP-behandlede PBW + medier følger samme procedure som ovenfor, bortset tilføje 100 uM D-penicillamin at kontrollere og afprøve løsninger, før du tilføjer de løsninger til deres respektive plader. Udfør data analysis bruge videnskabelige graftegning software.

7. Geokemisk Modeling

  1. Hent Visual MINTEQ version 3.0 / 3.1 et freeware fra følgende websted http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
    BEMÆRK: Visuel MINTEQ er et freeware kemisk ligevægt model for beregning af metal artsdannelse, opløselighed ligevægte, sorption etc. til naturlige vande. Derudover er det bruges til at forudsige ion artsdannelse, ion aktiviteter, ion-komplekser og mætning indekser, der er i forhold til koncentrationen af elementer før og efter behandling (massespektroskopi resultater) for at undersøge mulige mekanismer element fjernelse 28.
  2. Åbne programmet og indtaste de massespektroskopi data fra trin 4, herunder pH, alkalinitet og koncentrationerne af forskellige elementer, i programmet.
    BEMÆRK: Da grundvandet oxideres under in situ uranium udvinding proces, brug oxiderede arter af arsen, vanadium, og uran til input.

8. inhiberende koncentration 50 (IC50)

  1. Beregn IC 50 for de ubehandlede og CuO-NP-behandlede pbw + medier koncentrationer ved først gennemsnit levedygtighed (OD gennemsnit) på dag 5 i tre separate kørsler.
  2. Trække dag fem rentabilitet gennemsnit af de ubehandlede og CuO-NP-behandlede pbw + medier koncentrationer fra dag fem levedygtighed gennemsnit af EMEM-1x til at beregne levedygtighed forskelle. Derefter opdele rentabilitet forskelle ved den gennemsnitlige levedygtighed på dag 5 i EMEM, og gange med 100 for at få procent hæmning.
  3. Fratræk den procentvise inhibering fra 100 (EMEM-1x levedygtighed) at få procent levedygtighed for hver ubehandlede og CuO-NP-behandlede PBW + medier koncentration.
  4. Input til den videnskabelige graftegning software ved at indstille EMEM-1x ved en koncentration på en og en procent levedygtighed 100; omdanne alle koncentrationer i logskala (X = Log (X)), og udføre ikke-lineær regression med mindste kvadraters fit-analyse.

9. Data Analysis

  1. Sammenlign koncentrationer af elementer i ubehandlede og CuO-NP-behandlede PBW med en to-halet, parret, Student t-test.
  2. Arealerne under kurven (AUC) ved anvendelse vækstkurven data indsamlet over syv dage, og analysere variansen med variansanalyse gentagne målinger (ANOVA) efterfulgt af Tukey post hoc sammenligning mellem alle grupper (n = 3).
  3. Beregne IC50 ved hjælp af data fra dag fem af vækstkurven for både ubehandlede og CuO-NP-behandlede PBW + medieløsninger (beskrevet ovenfor). P-værdier på <0,05 anses signifikant.
    BEMÆRK: I forbindelse med statistisk analyse blev massespektroskopi værdier af den halve detektionsgrænse tildelt ioner koncentrationer niveauer under denne grænse 29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vægtdele koncentrationer komponent og pH i ubehandlede og CuO-NP-behandlede PBW er rapporteret i tabel 1. Martinson og Reddy (2009), rapporterede, at punktet for nul ladning af CuO-NP, anslås til 9,4 ± 0,4. Eftersom pH af PBW var 7,2-7,4 under disse betingelser, vand donerer protoner til CuO-NP, forårsager nanopartikel overflade, der skal positivt ladet muliggør adsorption af negativt ladede arter. CuO-NP behandling fjernede prioriterede kontaminanter fra PBW, herunder arsen, selen, uran og vanadium (tabel 1). Den gennemsnitlige arsen koncentrationen blev reduceret med 87% [0,0175-0,002 mg / l (to-halet parret t-test, p <0,0001)]. CuO-NP behandling reducerede også signifikant selen (30%), uran (78%), vanadium (92%), og phosphat (85%) (p <0,05).

Artsdannelse modelresultater, rapporteret i tabel 2, støtter analyseresultaterne: 99% af tiltal opløst arsen i PBW er til stede som HAsO 4 2- og H2 Aso 4 - og 94% af den samlede opløst selen i PBW er til stede som SEO 4 2-. Disse arter er negativt ladede, dermed stand til at adsorbere til CuO-NP'er. Artsdannelse modellering forudsagde, at 99% af vanadium arter i PBW er negativt ladede, også fremmer adsorption til CuO-NP'er. Men artsdannelse modellering forudsagde kun 35,5% af uran arter negativt ladet, hvilket ville begrænse adsorption til CuO-NP'er. Analyse af mætning indeks forudsagde, at der ikke arter af arsen, selenium-, uran- eller vanadium-holdige mineraler var nær mætning (dvs. mineralsk nedbør) niveauer, støtte adsorption til CuO-NP'er, versus nedbør.

At vurdere, om de forventede koncentrationer af prioriterede forurenende stoffer er i medierne lavet af ubehandlet og CuO-NP-behandlede PBW, prøver af ufortyndet kontrol medier (EMEM-1x), 56%ubehandlede vægtdele + medier og 53% CuO-NP-behandlede PBW + medier blev analyseret ved ICP-MS. Ufortyndet kontrol medier (EMEM-1x) er et kommercielt produkt leveres med L-glutamin og natriumhydrogencarbonat (pre-added). Kobber og selen koncentrationer i kontrol EMEM-1x blev lidt forhøjet som forventet, fordi de er afgørende for cellevækst, men arsen, uran og vanadium var ubetydelig, rapporteret i tabel 3. Foreløbige undersøgelser viste, at arsen, selen og vanadium koncentrationer blev reduceret med CuO-NP behandling og at faldet var repræsenteret i koncentrationer i CuO-NP-behandlede PBW + medier. Den målte koncentration af uran i CuO-NP-behandlede PBW + medier blev faldt i forhold til ubehandlet PBW, og dette fald var mere udtalt end forudsagt af Visual MINTEC v.3 modellering. Kobber niveauer steg i CuO-NP-behandlede medier som forventet.

At bestemme evnen af ​​CuO-NP behandling til bedring cytotoksicitet PBW på pattedyrceller, blev levedygtigheden vurderet i celler udsat for opløsninger af PBW + medier før og efter CuO-NP behandling. Begge HEK (figur 1A) og HEP (figur 1B) celler blev udsat for forskellige koncentrationer af ubehandlet eller behandlet PBW + medier i op til syv dage. I celler dyrket i ubehandlet PBW + medier, blev levedygtigheden forringet i en koncentrationsafhængig måde, hvorimod CuO-NP behandling forbedret cellulære levedygtighed i begge cellelinier. Den integrerede AUC i figur 1C viser, at HEK-celler dyrket i CuO-NP-behandlede PBW + medier var mere levedygtige sammenlignet med ubehandlet PBW + medier ved de tre højeste koncentrationer (29%, 44% og 56%). HEP celler viste lidt anderledes levedygtighed: kun de to højeste koncentrationer af ubehandlet PBW + medier (44% og 56%) viste nedsat levedygtighed sammenlignet med CuO-NP-behandlede PBW + medier (figur 1D). De mere fortyndede koncentrationer af PBW var mindre toksisk for HEP-celler, og cellelevedygtighed mindre påvirket af behandlingen. Denlevedygtighed både HEK og HEP-celler dyrket i 16,5% ubehandlet PBW + medier var ikke signifikant forskellig fra celler dyrket i 53% CuO-NP-behandlede PBW + medier (p <0,05). Således CuO-NP behandling syntes at lindre cytotoksiciteten af ​​PBW, med levedygtighed nær kontrolniveauer. Som diskuteret ovenfor er CuO-NP behandling af PBW forbundet med en stigning i kobber koncentrationer. Stigningen var forventet, baseret på tidligere resultater efter Reddy og Roth (2012), hvor de brugte CuO-NP'er at fjerne arsen fra grundvandet. Stigningen i kobber er afhængig af det specifikke vand kemien i PBW, men forblev under EPA MCL på 1,3 mg / l. Men det var vigtigt at udelukke, at stigningen i kobber koncentrationer bidraget til forbedret levedygtighed (dvs. ud over eller i stedet for, faldet i prioriterede forureninger). Derfor kobber chelator D-penicillamin blev tilføjet til EMEM-1x-kontrol, RO + medier kontrol, ubehandlede og CuO-NP-behandlede pbw + medieløsninger, og thOr MTT levedygtighed vækstkurve blev dannet, som beskrevet ovenfor. Kobber chelatering ikke signifikant påvirker levedygtigheden af ​​enten HEK eller HEP-celler inkuberet i RO + medier kontrol, ubehandlede og CuO-NP-behandlede PBW + medier (resultater ikke vist).

Den halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50) blev beregnet ud fra dag fem væksten af HEK og HEP celler dyrket i ubehandlet PBW + medier (tabel 4A) og CuO-NP-behandlede PBW + medier (tabel 4B). For HEK-celler dyrket i ubehandlet PBW + medier, IC50-værdien var 1,264 (log% PBW). Således ville de ubehandlede vægtdele + medier skal fortyndes til 18,38% for at komme til et fald i levedygtighed 50%. For HEK-celler dyrket i CuO-NP-behandlede PBW + medier, IC50-værdien var 2,744 (log% PBW). Dette resultat antyder, at teoretisk cytotoksiciteten af ​​opløsningen blev reduceret i det omfang, behandlede vægtdele + medier vil skulle koncentreres ved 500% (log% PBW = 2,744) for at fremstille en tilsvarende 50% destigning i levedygtighed. For HEP-celler dyrket i ubehandlet PBW + medier, IC50 var 1.243 (log% PBW). Dette ville kræve en fortynding af PBW + medier til 17,5% for at frembringe et fald i levedygtighed 50%. I modsætning til HEP-celler dyrket i CuO-NP-behandlede PBW + medier, IC50 var 5,327 (log% PBW). Denne værdi sandsynligvis var så stort, fordi levedygtigheden af ​​cellerne i CuO-NP-behandlede PBW + medier var ikke signifikant forskellig fra celler dyrket i EMEM-1x (kontrol). Lysfelt billeddannelse, illustreret i figur 2, af både HEK og HEP cellulær vækst på dag fem. Celleantal og fastgørelse i CuO-NP-behandlede vægtdele + medier (figur 2E, F), blev forbedret i forhold til ubehandlet PBW + medier (figur 2C, D).

Figur 1
Figur 1: vækstkurver. Vækstkurver blev anvendt til at vurdere levedygtigheden og gVÆKST af kulturerne under behandlingen. vækstkurver for HEK (A) og HEP (B) celler dyrket i fire fortyndinger af PBW + medier sammenlignet med 53% CuO-NP-behandlede PBW + medier (øvre paneler). EMEM-1x kontrol (EMEM) , RO , 53% CuO-NP-behandlede , 16,5% ubehandlet PBW , 29% ubehandlet PBW , 44% ubehandlet PBW , 56% ubehandlet PBW . Areal under kurven (AUC) analyse af HEK (C) og HEP (D) 7 dage vækst curve data (lavere paneler). * P <0,05 sammenlignet med EMEM kontrol, #p <0,05 sammenlignet med RO kontrol, §p <0,05 sammenlignet med 53% CuO NP-behandlede vægtdele-medier. (Sammenlignet anvendelse af en to-halet ANOVA medTukeys post hoc-analyse, n = 3)

Figur 2
Figur 2:. Cell morfologi før og efter CuO-NP behandling lysfeltmikroskopi (20X), i HEK (venstre kolonne) og HEP (højre kolonne) celler på dag 5, dyrket i: EMEM-1x kontrol (EMEM) (A, B ), blev 56% ubehandlet PBW + medier (C, D) og 53% CuO-NP-behandlede PBW + medier (E, F), der anvendes til at undersøge cellemorfologi. HEK og HEP celler dyrket i EMEM-1x kontrol (EMEM) (A, B) viser sunde, nær-sammenflydende vækst. HEK og HEP celler dyrket i ubehandlet PBW + medier har reduceret numre og fremtræder fritliggende (C, D). HEK og HEP celler dyrket i CuO-NP-behandlede PBW + medier viser bedre vedhæftning og sunde, mere sammenflydende celler (E F).

Elementet (mg / l) Gennemsnit, St. Dev. & Betydning
Før behandling Efter Behandling
Arsen 0,018 ± 0,001 0,002 ± 0,0 ***
Selen 1,8 ± 0,07 1,3 ± 0,05 **
Kobber 0,0015 ± 0,001 0,93 ± 0,43 *
Calcium 102 ± 82 106 ± 15
Strontium 3,3 ± 1,1 1,5 ± 0,4 *
Magnesium 44 ± 2,1 47 ± 1,7
Natrium 610 ±; 0,0 627 ± 27
Uran 0,98 ± 0,03 0.21 ± 0.03 ***
Barium 0,037 ± 0,02 0,019 ± 0,01
Kalium 12 ± 0,0 12 ± 0,8
Silicon 12 ± 0,7 12 ± 0,5
Vanadium 1,3 ± 0,07 0,1 ± 0,02 ***
Fosfat 0,35 ± 0,07 0,05 ± 0,0 ***
Sulfat 805 ± 21 807 ± 15
Ledningsevne 3125 ± 143 3190 ± 62
pH 7,31 ± 0,09 7,36 ± 0,05

Tabel 1:. Analyse af kationer og anioner før og efter CuO-NP behandling Gennemsnitlig element koncentrationer før og efter behandling med CuO-NP. Signifikans mellem koncentrationen af ​​CuO-NP-behandlet og ubehandlet PBW betegnes som * = p <0,05, ** = p <0,01 og *** = p <0,001. En tom celle angiver ingen signifikant forskel. Chloridkoncentrationer varierede mellem 46,5 ± 0,707 og 55,25 ± 8.180. Aluminium, bor og molybdæn koncentrationerne var lave og viste ingen signifikant ændring som følge af CuO-NP behandling. Mangan koncentrationer ikke var konsekvent.

Komponenter % Af den samlede koncentration Arter
Arsen 58.7 HAsO 4 2-
41.2 H2 Aso 4 -
Uran 64.1 Ca 2 UO 2 (CO 3) 3 (aq)
32.2 CaUO 2 (CO 3) 3 2-
0.03 UO 2 (CO 3) 2 2-
3.5 UO 2 (CO 3) 3 4
0,09 Ca 2 UO 2 (CO 3) 3 (aq)
0.02 CaUO 2 (CO 3) 3 2-
Selen 94,3 SEO 4 2-
5.6 CaSeO 4 (aq)
Vanadium 2.1 HVO 4 2-
95,7 H 2 VO 4-
2.1 H 2 V 2 O 7 2-
0.01 HV 2 O 7 3-
0.01 V 4 O 12 4-

Tabel 2: Arter modellering ved hjælp af Visual MINTEQ ver. 3.0-software. Visual MINTEQ ver. 3.0 software (KTH Royal Institute of Technology, Valhallavägen, Sverige) blev anvendt til at beregne metal artsdannelse af pbw komponenter anført i tabel 1. (Aq) = vandig i modsætning til den faste form af den pågældende art.

EMEM Kontrol Ubehandlet
PBW Pbw + medier
Arsen 0,003 ± 0,0 0,017 ± 0,0 0,010 ± 0,001
Kobber 0.01 ± 0,0 0,0015 ± 0,001 0,018 ± 0,0
Selinium 0,013 ± 0,002 1,75 ± 0,07 1.15 ± 0,06
Uran 0,00015 ± 0,0 0,975 ± 0,03 0,71 ± 0,01
Vanadium 0,0015 ± 0,0 1,25 ± 0,07 0,785 ± 0,007
CuO NP-behandlede
PBW Pbw + medier
Arsen 0,0022 ± 0,001 0,0015 ± 0,0
Kobber 0,926 ± 0,4 0,81 ± 0,0
Selinium 1,25 ± 0,05 0,855 ± 0.0.02
Uran 0,208 ± 0,03 0,45 ± 0,01
Vanadium 0,102 ± 0,02 0,0795 ± 0,01

Tabel 3:. Koncentrationer af forurenende stoffer i medier Koncentrationer af prioriterede forurenende stoffer (mg / L) i EMEM-1x-kontrol (EMEM), ubehandlet PBW, CuO-NP-behandlede PBW, ubehandlet PBW + medier og CuO-NP-behandlede PBW + medier efter tilsætning mediekomponenter (n = 3) blev vurderet til at sikre ændringer i forureningskoncentration grund af behandling var repræsenteret i ubehandlede pbw + medier og CuO-NP-behandlede PBW + medier påføres cells.

En Ubehandlet PBW + Media
Koncentrationer af Ubehandlet PBW (log X) % Levedygtighed (HEK-celler) % Levedygtighed (HEP celler)
EMEM 100 100
16,5% (1,217) 51.4 50,8
29% (1.462) 39 33.3
44% (1,643) 19.3 14.7
56% (1,748) 14.5 9.4
IC50 Log [PBW] 1,264 1.243
B CuO-NP-behandlede PBW + Media
Koncentrationer af CuO-NP-behandlet PBW (log X) % Levedygtighed (HEK-celler) % Levedygtighed (HEP celler)
EMEM 100 100
17% (1.230) 86.7 119,8
30% (1,477) 75.8 86.7
45% (1,653) 81 92,4
53% (1,724) 70,3 97,5
IC50 Log [PBW] 2,744 5,327

Tabel 4: Beregning af IC 50. IC50 repræsenterer koncentrationen af ubehandlet PBW + medier eller CuO-NP-behandlede PBW + medier, der er nødvendig for en 50% inhibering af levedygtighed.   Den procentvise levedygtighed på dag 5 for HEK og HEP celler udsat for fortyndinger af ubehandlet PBW + Media (A) eller CuO-NP-behandlede PBW + Media (B) blev anvendt til at beregne halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere undersøgelser rapporteret, at CuO-NP'er fjernet arsen fra grundvand 11,13,30,31. Denne undersøgelse understøtter disse tidligere resultater, og også rapporterer, at CuO-NP'er fjerne yderligere forureninger fra PBW. Denne undersøgelse bekræfter også tidligere rapporter, at CuO-NP'er er effektive på arsen fjernelse, på trods af tilstedeværelsen af andre forurenende stoffer og potentielle konkurrerende ioner 11. Artsdannelse modellering forudsagde, at 97% af vanadium arter i PBW er negativt ladede, hvilket tillader adsorption til CuO-NP, og batch behandling fjernede 92% af vanadium.

Dette er den første undersøgelse for at undersøge virkningerne af at fjerne bestemte forurenende stoffer fra PBW hjælp CuO-NP, og derefter vurdere de ændringer i cytotoksicitet forbundet med fjernelsen. Resultaterne viser, at undersøge ændringerne i cytotoksicitet af komplekse blandinger ved hjælp af en in vitro fremgangsmåde kan være muligt, men disse metoder er ikke uden grænser. PBW ikke kunne anvendes full styrke på cellerne, fordi at overleve, dyrkede celler kræver et defineret vækstmedium og specifik osmolalitet. Pbw + medier kunne heller ikke anvendes på cellerne uden pH-justering. PH af PBW var 7,31 før og 7,36 efter behandling dog; tilsætningen af ​​vækstmedier komponenter reduceret pH-værdien til ca. 6,8, afhængigt af fortynding. PH-justering er en normal skridt i forberedelsen af ​​celledyrkningsmedier dog; indstilling af pH af pbw + medier kan have ændret de molekylære vekselvirkninger af elementet arter med mediekomponenter. Ubehandlet og CuO-NP-behandlede PBW blev kombineret med koncentreret EMEM-10X vækstmedier i forskellige forhold for at opnå testopløsningerne (pbw + medier). ICP-MS-analyse blev udført på test medier for at kontrollere, at koncentrationerne af metaller betydeligt berørt af CuO-NP-behandling (arsen, kobber, selen, uran, vanadium) var på forventede koncentrationer efter fortynding af medier komponenter og osmolalitet justering. Faldeti arsen, selen og vanadium efter CuO-NP-behandling afspejles i koncentrationsforskelle mellem ubehandlet PBW + medier og CuO-NP-behandlede PBW + medier. Uran koncentrationer højere i CuO-NP-behandlede PBW + medier end forudset. ICP-MS-data (tabel 1) tyder på, at mere uran blev fjernet fra PBW under CuO-NP behandling end forudsagt ved modellering. Artsdannelse modellering (tabel 2) forudsagde, at ved pH 7,3 er kun 35,5% af uran arter negativt ladet. Modellen forudsiger, at den store uran arter, calcium uranyl carbonat (Ca 2 UO 2 (CO 3) 3), er neutral.

Den observerede 78% fjernelse af uran var sandsynligvis på grund af en kombination af uran adsorption og udfældning (som et calcium- uranyl carbonat mineral). Baseret på det geokemiske modellering, procentdelen af ​​uran fjernes ved adsorption er mindre end beregnet giver mulighed for en højere koncentration i CuO-NP-behandlet PBW + medier. Mekanismen for fjernelse uran ved CuO-NP-behandling er uklar og kræver yderligere undersøgelser. Var forventet en stigning i koncentrationen af ​​calcium, kalium og magnesium, når PBW sattes til EMEM-10x dog; CuO-NP-behandlingen ikke producere en betydelig ændring i disse elementer, så ingen forskel blev set i ubehandlet vs. CuO-NP-behandlede PBW + medier. Teknikken med at kombinere den faktiske miljømæssige med mediekomponenter var en succes i at repræsentere de ændringer, der ses i element koncentrationer på grund af behandling; men det oxiderede karakter af PBW begrænset hvordan vægtdele + medier kunne foretages. I et forsøg på at øge den maksimale koncentration af elementerne i testmedier blev pulveriseret celledyrkningsmedier oprindeligt blandet med ubehandlede og CuO-NP-behandlede PBW at gøre PBW + medier. De pulveriserede medier ofte resulterede i udfældning af calciumsalte, og det forøgede osmolalitet PBW + medier, som krævede en større fortynding med RO vand til koncentioner tæt på dem, der opnås med flydende 10x medier. Disse spørgsmål er mest sandsynligt PBW-specifik grund af sin oxidative tilstand, og kan ikke være et problem med andre mindre følsomme blandinger.

MTT-assayet blev valgt for at vurdere cytotoksicitet fordi det er en anerkendt standard high-throughput assay, som evaluerer den generelle sundhed i celler ved at måle mitokondrie-aktivitet. Denne metode har fordele og ulemper. Den 96-brønds format er nyttig til at opnå flere datapunkter dog; størstedelen af ​​celler på dag 5 var usund leder, afrundet og ikke længere bundet til pladen. Billederne i figur 2 blev taget før mediet blev fjernet ved hjælp af et vakuum; sugning fra medierne, og derefter tilsætte MTT opløsning kan have fjernet separate celler eller fritliggende dårligt vedhæftende celler, der bidrager til den samlede plateau af MTT signal efter dag to set med ubehandlet PBW. Antagelsen er, at flydende celler er døde eller døende og oun de vedhæftede celler vurderes ved hjælp af denne metode. Det er også vigtigt at overveje de begrænsninger af MTT-assayet med hensyn til undersøgelser under anvendelse nanopartikler.

Tidligere undersøgelser har rapporteret, at, når den anvendes direkte på dyrkede celler, kan nanopartikler har iboende toksicitet, ud over deres basis kemiske egenskaber, afhængigt af deres unikke fysiske egenskaber, såsom størrelse og form 32,33. I denne aktuelle undersøgelse, vi ikke anvende CuO-NP'er direkte på cellerne. I stedet blev celler eksponeret for PBW som tidligere var blevet behandlet med CuO-NP, centrifugeres for at fjerne størstedelen af ​​CuO-NPs og derefter filtreret to gange for at fjerne mere CuO-NPs før PBW blev anvendt til fremstilling PBW + medier. De MS Resultaterne viste en stigning i kobber efter behandling. Dette kunne være kobberioner, der blev opløst fra nanopartiklerne under behandlingen eller CuO-NP'er, som kan have passeret gennem centrifugering / filtreringstrin til at forblive i den behandlede PBW used at gøre PBW + medier. CuO-NP'er varierer i størrelse 12-18 nm med et BET målt overfladeareal på 85 ± 1 m2 / g 11, men er kendt for at aggregere og baseret på minimal stigning i kobber koncentrationer i det behandlede PBW, det meste af kobber uanset af kilden fjernes efter centrifugering og filtrering. Visuel bekræftelse af forbedret celle sundhed og sammenløbet støtter MTT analyseresultaterne af forbedret levedygtighed på grund af CuO-NP behandling af PBW (figur 2). Fremtidige undersøgelser anvender andre metoder kan vurdere (eller karakterisere) tilsvarende forstyrrende virkninger forårsaget af CuO-NP'er.

Humane embryoniske nyre (HEK 293) og humant hepatocellulært carcinom (HEP G2) celler blev valgt til toksicitetstestning. Disse er et standard celle linjer, der er klinisk relevant for heavy metal organtoksicitet 24,25,34-40. En lav udsåningstæthed blev anvendt til MTT-assays. Celler blev podet ved 500 celler / brønd, lov til at kommei 24 timer, og derefter udsat for testen medier. Den lave seeding tæthed var nødvendig for at opnå en vækstkurve med en log fase omkring dag 5, før han bliver over-sammenflydende og stationært på dag 6 eller 7. Chakraborty et al. (2010) rapporterede, at i en undersøgelse af cadmium toksicitet på dyrkede nyre proksimale tubuliceller (PTC), sammenflydning og spredning status (prolifererende vs. hvilende) påvirkede respons på cadmium eksponering: sub-sammenflydende prolifererende celler viste mere cytotoksicitet end sammenflydende (hvilende) celler. HEP og HEK-celler eksponeret for PBW på et højere koncentrationer (større konfluens) i lighed med dem, der anvendes til andet assay (resultater ikke vist) viste ikke de robuste ændringer i morfologien set med MTT-assayet. Yderligere undersøgelser af ændringer i cytotoksicitet ved hjælp af ikke-klæbende cellelinjer eller protokoller, der høster og indsamle alle celler (f.eks flowcytometri) er nødvendig.

En anden begrænsning ved MTT metoden i amerikanske undersøgelsering nanopartikler er, at nogle typer af nanopartikler kan interferere med cellulær ernæring. Celledyrkningsmedier indeholder typisk tilsatte proteinkilder, såsom føtalt bovint serum (FBS), at supplere cellevækst. Undersøgelser har vist, at metaloxid nanopartikel kan nedbryder vigtige vækstkomponenter i FBS, på grund af den forbedrede absorptionsevne af nanopartikler. Metaloxid nanopartikler er blevet vist at linke til FBS gennem en interaktion med calcium 41. Afhængig af pH af opløsningen, kan metalnanopartikler bære en positiv eller negativ ladning. Cytotoksicitetsstudier har vist, at metalnanopartikler tilføjet til celledyrkningsmedier adsorberer kationer, herunder Ca2 +, og derefter fjerne FBS / serumalbumin ved binding af NP-Ca 2+ komplekset til calcium bindingssteder på proteiner i FBS. Dette reducerer koncentrationen af Ca2 + og FBS fra medierne, i det væsentlige sultende cellerne og kan øge cytotoksiciteten tilskrives den nanoparticles 41. Endvidere præ-eksponering af nanopartikler til FBS / Ca2 + overtrukket nanopartiklerne, faldende deres cytotoksiske virkning. Men har vi ikke direkte udsættes medierne til CuO-NP'er. Også, ingen signifikant fald i Ca2 + koncentrationer blev set i PBW efter behandling med CuO-NP, hvilket indikerer ingen signifikant absorption af Ca2 + på CuO-NP'er priming dem binde med FBS. Koncentrationen af ​​calcium i PBW er høj nok til, at en nanopartikel-induceret fald ikke kan have været indlysende. Det er stadig usandsynligt, at CuO-NP'er anvendt i denne undersøgelse er at absorbere store mængder af calcium under bearbejdning, fordi der ikke var noget fald i arsen absorption kapaciteter af CuO-NP'er i PBW, som indeholder høje niveauer af calcium sammenlignet med tidligere undersøgelser med grundvand med en lavere calciumkoncentrationer 13.

Dataene viser, at CuO-NP fjerne arsen, selen vanadium og uranium, er og dette er forbundet med forbedret HEK og HEP celle levedygtighed i MTT-analysen. Mekanismen (er), hvorved rentabiliteten forbedres er endnu ikke fastlagt, men kunne skyldes fjernelse af prioriterede forurenende stoffer ved CuO-NP, blandt andre mekanismer. Den aktuelle undersøgelse viser også, at der kan bruges standard cellekultur metoder til at vurdere effekten af en nanopartikel ISR vand behandlingsmetode, potentielt tillade en række mekanistiske undersøgelser skal være afsluttet, før man går ind i de mere dyre og tidskrævende in vivo dyreforsøg . Derudover kan CuO-NPs vise sig at være mere alsidig til minedrift processer og til behandling af metal blandinger end konventionelle adsorbenter såsom oxider af aluminium, jern, titan og mangan, idet CuO-NP'er ikke kræver pH-indstilling eller oxidation af vand til fjernelse arsen, og CuO-NPs fjerne både arsenit og arsenat i nærvær af det konkurrerende anioner phosphat, silicat og sulfat. Desuden kan CuO-NP'er regenereres og re-brugte, reducerer reagensomkostninger og mængden af brugte behandling affald biprodukter med behov for bortskaffelse 12.

Potentielle begrænsninger af MTT-protokollen omfatter lav celletæthed på tidspunktet for eksponering, frigørelse af celler og tab af signal, celle sult og mulig direkte eksponering af cellerne til CuO-NP ændre MTT reaktivitet. Celletæthed og udstationeringsprocedurer spørgsmål kunne løses ved hjælp af en alternativ test, såsom flowcytometri, som giver mulighed for højere såning tætheder samt indsamling af alle celler (dvs. både flydende og vedlagt). Celle sult spørgsmål kunne vurderes ved at måle vækstfaktor koncentrationer i medierne jævnligt under behandlingen. Det fremtidige arbejde vil fokusere på at anvende den nuværende protokol til forskellige cytotoksicitetsassays som vil tage fat om muligt CuO-NP eksponering ændret assay aktivitet, målinger af celle sult under behandlingen, og også at afprøve, om CuO-NP'er at fjerne kontaminants og påvirker cytotoksicitet af andre typer komplekse blandinger, såsom affald fra Superfund sites og bortskaffelse af affald damme. Sådanne undersøgelser vil også tage fat om de metoder, var robust i forskellige indstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CuCl2 Sigma 203149
Borosilicate glass balls VWR 26396-639 6 mm
Nitric Acid Fisher A509-P500 Trace metal grade
0.45 μm syringe filter Fisher SLHA 033S S
10x EMEM Fisher BW12-684F
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
L-glutamine Fisher BP379-100
NaHCO3 Sigma S5761
Penicillin/Streptomycin ATCC 30-2300
0.22 μm vacuum filter unit Fisher 09-740-28C
HEK293 ATCC CRL-1573
HEPG2 ATCC HB-8065
Trypsin Sigma SV3003101
MTT Sigma M2128
D-penicillamine Fisher ICN15180680
96-well plates Fisher 07-200-92
DMSO Fisher D12814
Spectra Max 190 Molecular Devices
Visual MINTEQ version 3.0 KTH Royal Institute of Technology
ICP-MS Agilent Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
IC DIONEX DX 500 Dionex Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
VWR Incubator VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. What is the status of the U.S. nuclear industry? Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/energy_in_brief/article/nuclear_industry.cfm (2014).
  2. International Energy Outlook. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/forecasts/archive/ieo11/pdf/0484%282011%29.pdf (2011).
  3. Uranium Marketing Annual Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/uranium/marketing/ (2014).
  4. Domestic Uranium Production Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/uranium/production/annual/ (2014).
  5. Uranium Recovery. Washington (DC): U.S. United States Nuclear Regulatory Commission (US). Available from: http://www.nrc.gov/materials/uranium-recovery/license-apps/ur-projects-list-public.pdf (2014).
  6. U.S. Uranium Reserves Estimates. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.doe.gov/cneaf/nuclear/page/reserves/ures.html (2010).
  7. The Future of Uranium Production in Wyoming: A Public Forum on In-Situ Recovery. Washington (DC): Meridian Institute. Available from: http://www.uwyo.edu/ser/_files/docs/conferences/2010/uraniumforum/ser_uranium_forum_final_report.pdf (2010).
  8. Generic Environmental Impact Statement for In-Situ Leach Uranium Milling Facilities Washington (DC): U.S. Nuclear Regulatory commission (US). Available from: http://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/nuregs/staff/sr1910/v1/ (2012).
  9. Wyoming surface water quality standards. Cheyenne (WY): State of Wyoming Department of Environmental Quality (US). Available from: http://soswy.state.wy.us/Rules/RULES/6547.pdf (2011).
  10. Qu, X., Alvarez, P., Li, Q. Applications of nanotechnology in water and wastewater treatment. Water Research. 47, (12), 3931-3946 (2013).
  11. Martinson, C., Reddy, K. Adsorption of arsenic(III) and arsenic(V) by cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, (2), 401-411 (2009).
  12. Reddy, K., McDonald, K., King, H. A novel arsenic removal process for water using cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 397, 96-102 (2013).
  13. Reddy, K., Roth, T. Arsenic Removal from Natural Groundwater Using Cupric Oxide. Ground Water. 51, (1), 83-91 (2012).
  14. Zhang, G., Ren, Z., Zhang, X., Chen, J. Nanostructured iron(III)-copper(II) binary oxide: a novel adsorbent for enhanced arsenic removal from aqueous solutions. Water Research. 47, (12), 4022-4031 (2013).
  15. Ali, I. New generation adsorbents for water treatment. Chemical Reviews. 112, (10), 5073-5091 (2012).
  16. Zhang, Q. CuO nanostructures: Synthesis, characterization, growth mechanisms, fundamental properties, and applications. Progress in Materials Science. 60, 208-337 (2014).
  17. Schmidt, C. TOX 21: new dimensions of toxicity testing. Environmental health perspectives. 117, (8), 348-353 (2009).
  18. Firestone, M., Kavlock, R., Zenick, H., Kramer, M. The U.S. Environmental Protection Agency Strategic Plan for Evaluating the Toxicity of Chemicals. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13, (2-4), 139-162 (2010).
  19. Guidance Manual for the Assessment of Joint Toxic Action of Chemical Mixtures [Internet]. Atlanta (GA); Agency for Toxic Substance and Disease Registry (US). Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/interactionprofiles/IP-ga/ipga.pdf (2014).
  20. Bae, D., Gennings, C., Carter, W., Yang, R., Campain, J. Toxicological interactions among arsenic, cadmium, chromium, and lead in human keratinocytes. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 63, (1), 132-142 (2001).
  21. Whittaker, M. Exposure to Pb, Cd, and As mixtures potentiates the production of oxidative stress precursors: 30-day, 90-day, and 180-day drinking water studies in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 254, (2), 154-166 (2011).
  22. Schilz, J. Investigating the ability of cupric oxide nanoparticles to adsorb metal contaminants from uranium in-situ recovery (ISR) production bleed water and assessing the associated changes in cytotoxicity. University of Wyoming. Laramie, WY. Available from: ProQuest UMI, Ann Arbor, MI (2014).
  23. Manual of Standard Operating Procedures for Sample Collection and Analysis. Cheyenne (WY): Wyoming Department of Environmental Quality (US). Available from: http://deq.state.wy.us/wqd/watershed/downloads/qa/4-1089.pdf (2011).
  24. Florea, A., Splettstoesser, F., Büsselberg, D. Arsenic trioxide (As2O3) induced calcium signals and cytotoxicity in two human cell lines SY-5Y neuroblastoma and 293 embryonic kidney (HEK). Toxicology and Applied Pharmacology. 220, (3), 292-301 (2007).
  25. Mao, W. Cadmium induces apoptosis in human embryonic kidney (HEK) 293 cells by caspase-dependent and -independent pathways acting on mitochondria. Toxicology in Vitro. 21, (3), 343-354 (2007).
  26. Tchounwou, P., Yedjou, C., Patlolla, A., Sutton, D. Heavy Metal Toxicity and the Environment. Molecular, Clinical and Environmental Toxicology. 101, 133-164 (2012).
  27. Meerloo, J., Kaspers, G., Cloos, J. Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay. Cancer Cell Culture. 731, 237-245 (2011).
  28. Gustafsson, J. Visual MINTEQ. Royal Institute of Technology. Stockholm, Sweden. (2010).
  29. Hallab, N., Caicedo, M., McAllister, K., Skipor, A., Amstutz, H., Jacobs, J. Asymptomatic prospective and retrospective cohorts with metal-on-metal hip arthroplasty indicate acquired lymphocyte reactivity varies with metal ion levels on a group basis. Journal of Orthopaedic Research. 31, (2), 173-182 (2013).
  30. Goswami, A., Raul, P., Purkait, M. Arsenic adsorption using copper (II) oxide nanoparticles. Chemical Engineering Research and Design. 90, (9), 1387-1396 (2011).
  31. Pillewan, P., Mukherjee, S., Roychowdhury, T., Das, S., Bansiwal, A., Rayalu, S. Removal of As(III) and As(V) from water by copper oxide incorporated mesoporous alumina. Journal of Hazardous Materials. 186, (1), 367-375 (2011).
  32. Kroll, A. Cytotoxicity screening of 23 engineered nanomaterials using a test matrix of ten cell lines and three different assays. Particle and fibre toxicology. 8, (9), 1-19 (2011).
  33. Fahmy, B., Cormier, S. Copper oxide nanoparticles induce oxidative stress and cytotoxicity in airway epithelial cells. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 23, (7), 1365-1371 (2009).
  34. Radike, M. Distribution and accumulation of a mixture of arsenic, cadmium, chromium, nickel and vanadium in mouse small intestin, kidney, pancreas, and femur following oral administration in water or feed. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 65, (23), 2029-2052 (2002).
  35. Barbier, O., Jacquillet, G., Tauc, M., Cougnon, M., Poujeol, P. Effect of heavy metals on, and handling by, the kidney. Nephron. Physiology. 99, (4), 105-110 (2005).
  36. Zheng, X., Watts, G., Vaught, S., Gandolfi, A. Low-level arsenite induced gene expression in HEK293 cells. Toxicology. 187, (1), 39-48 (2003).
  37. Li, Z., Piao, F., Liu, S., Wang, Y., Qu, S. Subchronic exposure to arsenic trioxide-induced oxidative DNA damage in kidney tissue of mice. Experimental and Toxicologic Pathology. 62, (5), 543-547 (2010).
  38. Farombi, E., Akintunde, J., Nzute, N., Adedara, I., Arojojoye, O. Municipal landfill leachate induces hepatotoxicity and oxidative stress in rats. Toxicology and Industrial Health. 28, (6), 532-541 (2011).
  39. Das, N. Arsenic exposure through drinking water increases the risk of liver and cardiovascular diseases in the population of West Bengal. India. BMC public health. 12, (1), 639-648 (2012).
  40. Valko, M., Morris, H., Cronin, M. Metals, toxicity and oxidative stress. Current Medicinal Chemistry. 12, (10), 1161-1208 (2005).
  41. Horie, M. Protein Adsorption of Ultrafine Metal Oxide and Its Influence on Cytotoxicity toward Cultured Cells. Chemical Research in Toxicology. 22, (3), 543-553 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats