Fjerning av Trace Elements av Cupric Oxide Nanopartikler fra Uran
1Division of Physical Therapy, Department of Orthopedics & Rehabilitation, University of New Mexico, 2Department of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming, 3School of Pharmacy, University of Wyoming, 4Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 5Center for Environmental Medicine, Colorado State University, 6College of Pharmacy, California Northstate University

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schilz, J. R., Reddy, K. J., Nair, S., Johnson, T. E., Tjalkens, R. B., Krueger, K. P., et al. Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability. J. Vis. Exp. (100), e52715, doi:10.3791/52715 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In situ utvinning (ISR) er den dominerende metoden av uran utvinning i USA. Under ISR, er uran lekket fra en malm kropp og hentet gjennom ionebytte. Den resulterende produksjonsuttaks vann (PBW) inneholder forurensninger som arsen og andre tungmetaller. Prøver av PBW fra en aktiv ISR uran anlegget ble behandlet med kupri oksid nanopartikler (CuO-NPS). CuO-NP behandling av vektdeler redusert satsings forurensninger, blant arsen, selen, uran og vanadium. Ubehandlet og CuO-NP behandlede PBW ble anvendt som den flytende komponent i cellevekstmedier og endringer i levedyktigheten ble bestemt ved MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) assay i human embryonisk nyre (HEK 293) og human leverkreft (Hep G2) celler. CuO-NP behandling var assosiert med forbedret HEK og HEP celle levedyktighet. Begrensninger av denne metoden inkluderer fortynning av PBW av vekstmedier komponenter og under osmolsaklighet justering samt nødvendig å justere pH. Denne metoden er begrenset i sin bredere sammenheng på grunn av utvanningseffekter og endringer i pH i PBW som tradisjonelt er svakt sur imidlertid; denne metoden kan ha en bredere bruk vurdere CuO-NP behandling i mer nøytrale farvann.

Introduction

Omtrent 20% av den amerikanske strømforsyningen er levert av atomenergi og, delvis basert på nasjonale insentiver til å øke energiuavhengighet, amerikanske kjernefysiske kapasitet forventes å øke 1. Verdensomspennende vekst av atomenergi også forventes å fortsette, med mye av veksten inntreffer utenfor USA to. Som i 2013, ble 83% av amerikanske uran importert, men 952 544 tonn reserver finnes i USA 3,4. I 2013 var det 7 nye anlegget programmer og 14 restart / ekspansjonsprogrammer mellom Wyoming, New Mexico, og Nebraska 5. I USA er uran hovedsakelig hentet gjennom in situ utvinning (ISR) behandler seks. ISR fører til mindre land avbrudd og unngår å skape tailing hauger som kan frigjøre miljøgifter 7. ISR anvender vannbaserte oksiderende løsninger til å lekke uran fra den underjordiske malmkroppen, hvoretter uran ekstraheres fra utlutningsvæsken viaen ionebytter-prosess 8. For å opprettholde en negativ vannbalansen i malmkroppen, en del av sigevann, kalt produksjons blø vann (PBW), ventileres ut. En del av PBW dekontamineres ved hjelp av omvendt osmose (RO) og re-innføres i gruvedrift prosessen, men PBW også kunne ha gunstige industri eller jordbruk bruker, hvis toksiske forurensende stoffer reduseres til et akseptabelt nivå bestemt av statlige reguleringsorganer for flate og grunnvann 9. Foreløpig fleste ISR uran lokale bruke RO å fjerne forurensninger fra PBW. Imidlertid er RO behandling energikrevende og gir giftig avfall saltvann, noe som krever regulert disposisjon.

Mange vann dekontaminering metoder finnes, inkludert adsorbenter, membraner, og ionebytting. Av disse er adsorpsjon den mest brukte, og den siste utviklingen i nanopartikkel syntese har forbedret mulighetene til adsorbent baserte vann dekontamineringsprosesser 10. Cupric oxide nanopartikler (CuO-NPS) tidligere ikke hadde blitt grundig studert på uran ISR PBW, men i nyere studier av forurensningsfjerning fra grunnvann, ble CuO-NPs funnet å ha unike egenskaper, inkludert uten egen pre- eller post-vann behandlingstrinn ( f.eks, justere pH eller redokspotensial) og gode resultater i ulike vann komposisjoner (for eksempel i forskjellige pH-verdier, saltkonsentrasjoner, eller konkurrerende ioner) 11. I tillegg er CuO-NPS lett regenereres ved utluting med natriumhydroksyd (NaOH), hvoretter den regenererte CuO-NPS kan gjenbrukes. Detaljer av CuO-NP spormetallfiltreringsmuligheter fra naturlige vannmassene har tidligere blitt publisert 11-14.

Selv om nyttige for vannbehandling, kan metall-oksyd-nanopartikler være toksiske for levende organismer, men omfanget av toksisiteten avhenger delvis av nanopartikkelegenskaper og bestanddeler 10,15,16. Derfor er det viktig å studere simultaneous forurensende fjerning og nanopartikkel toksisitet før feltapplikasjoner. Den aktuelle studien bestemmes evnen til CuO-NPs å fjerne vekt prioriterte miljøgifter (inkludert arsen, selen, vanadium og uran), og vurdert effekten av CuO-NP behandling på PBW cytotoksisitet.

PBW ble oppsamlet fra en aktiv ISR uran anlegget og anvendes for å bestemme effekten av CuO-NP behandling i prioritert forurensningsfjerning. PBW cytotoksisitet før og etter CuO-NP behandling ble også vurdert. PBW er en kompleks geologisk (industri / miljø) blanding og både National Institute of Environmental Health and Science (NIEHS) og Direktoratet for giftige stoffer og Disease Registry (ASTDR) legger vekt på å studere giftigheten av miljørelevante blandinger, herunder blandinger som de finnes i naturen eller industrielle innstillinger, samt fremme in vitro testing for å prioritere kjemikalier for ytterligere in vivo testing17-19. Studier av kroniske, lav dose blanding eksponeringer er utfordrende fordi kronisk eksponering for en lav dose blanding ikke produsere åpenbare effekter, i hvert fall ikke på kort tidsramme for de fleste laboratoriestudier. Tilsvarende har de fleste in vitro-studier av kjemiske blandinger eksponere cellene til en definert lab-laget blanding av to eller flere metaller 20,21. Disse studiene gir grunnlagsinformasjon, men forenklede blandingen ikke replikere komplekse antagonistiske og synergistiske interaksjoner som kan oppstå i en innfødt, miljøprøve, der hele spekteret av blandingskomponenter er til stede.

Målene for denne studien var å undersøke alternative forurensningsfjerningsmekanismer for PBW og for å evaluere effekten av (CuO-NP) behandling på PBW cytotoksisitet hjelp dyrkede humane celler. Resultatene kan være til nytte uran industrien gjennom utvikling av mer effektive eller miljøvennlige metoder for fjerning av forurensninger. Denne studien girdet første beviset på at reduksjon av prioriterte miljøgifter i PBW av CuO-NPs reduserer cytotoksisitet i pattedyrceller 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prøver ble samlet på uran flytende behandlings bygging av en uran ISR anlegg i Wyoming.

1. Produksjon Bleed Vann (PBW)

  1. Samle to typer vannprøver fra en ISR uran anlegget: PBW og omvendt osmose (RO) vann. Samle PBW fra et overvåkings springen etter ionebytting prosessen, men før omvendt osmose dekontaminering. Samle RO prøver etter PBW er dekontamineres ved omvendt osmose behandling.
    MERK: Lixiviant transporteres i rørledninger fra flere brønn felt til uran flytende behandlings bygning, hvor det samles i en kolonne og forberedt for ionebytting. Omtrent 1-3% av lixiviant etter ionebytting er fjernet fra kretsen, og benevnt produksjons bleed vann (PBW). PBW er gjenbrukt i gruve prosesser eller dekontamineres / demineralisert med RO filtrering.
  2. Samle vannprøver i polyetylen med høy tetthet (HDPE) flasker med null hodet plass i henholdtil standard operasjonsprosedyrer for prøvetaking og analyse av Wyoming Department of Environmental Quality (WYDEQ) 23.
  3. Måle temperatur og pH på stedet og transport prøvene på is for å holde dem kjølig.
  4. Oppbevares PBW ved 4 ° C. Hold PBW løsningen kjølig før etter den konsentrerte Eagle minimums viktig media (EMEM-10x) legges under medie forberedelse som beskrevet i følgende protokoll.
    MERK: PBW er en oksydert løsning som vil felle ut dersom det tillates å fryse eller oppvarmet til romtemperatur. Etter fortynning er løsningen PBW er tilstrekkelig fortynnet at den ikke vil utfelles ved oppvarming til 37 ° C før påføring på cellene og i løpet av inkubasjon.

2. Utarbeidelse av CuO Nanopartikler (CuO-NPs)

  1. Kombiner en ren etanolisk oppløsning inneholdende 250 ml 0,2 M CuCl 2 • 2 H 2 O, 250 ml av 0,4 M natriumhydroksid (NaOH), og 5 g polyetylenglykol (PEG) i en rundbunnet kolbe med seks mm borsilikat-glasskuler.
  2. Plasser løsning i en modifisert mikrobølgeovnen og la det reagere under tilbakeløp ved omgivende lufttrykk i 10 min ved 20% effekt (intervaller på 6 sekunder på, 24 sekunder av).
  3. Avkjøl løsningen til romtemperatur (20 ° C), og deretter dekantert inn i 50 ml koniske rør, slik at den glasskuler.
  4. Sentrifuger oppløsningen i 50 ml koniske rør ved 1000 xg i 30 min, dekantert, og deretter vaske CuO-NPS med en sekvens av 300 ml varmt vann (60-65 ° C), 100 ml etanol og 100 ml aceton.
  5. Tørk CuO-NPs til romtemperatur (20 ° C) i 50 ml koniske rør.
  6. Skrape CuO-NPs ut av sine rør inn i en morter. Dekk CuO-NPS med aluminiumsfolie, og oppvarming av CuO-NPs til 110 ° C i en ovn for å fjerne gjenværende væske. Kombiner CuO-NPs inn en batch og veie CuO-NPs.
    MERK: Utarbeidelse av CuO-NPs og CuO-NP behandling av PBW ble gjennomført i Water Qualligheten Laboratory of Ecosystem Science and Management, University of Wyoming. CuO-NP syntese fulgt prosedyren for Martinson og Reddy (2009) 11.

3. Behandling av PBW med CuO-NPs

  1. Tilsett 50 mg (1 mg / ml) av CuO-NP til et 50 ml konisk rør, etterfulgt av 50 ml PBW. Forsegle røret og omsatt for 30 min på en benk topp orbitalrister ved 250 rpm.
  2. Sentrifuger prøverør ved 250 xg i 30 min, og deretter filtrere supernatanten ved bruk av en 0,45 um sprøytefilter. Alter sentrifugehastigheten og tiden kan avhenge av nanopartikler for å sikre at CuO-NPS blir kompakt i sentrifugerøret.

4. Elementæranalyse

  1. Forbered Ubehandlet (kontroll) og CuO-NP-behandlede vektprøver for elementanalyse som følger.
  2. Surgjøre aliquoter (40 ml) av CuO-NP-behandlede og ubehandlede PBW med spormetallkvalitet salpetersyre til en pH-verdi på 2,0. Analyser sure pbw porsjoner for kationer ved induktivt coupled plasma-massespektroskopi (ICP-MS) som beskrevet i Reddy og Roth (2012) 13.
  3. Forbered unacidified aliquoter (20 ml) av CuO-NP-behandlede og ubehandlede PBW og analysere unacidified alikvoter for anioner med ionekromatografi (IC) som beskrevet i Reddy og Roth (2012) 13.
    MERK: Prøver ble analysert av Wyoming Department of Agriculture Analytical Services, Laramie WY 82070. En beskrivelse av IC og ICPMS prosedyren kan bli funnet i Reddy og Roth, (2012) 13.

5. Utarbeidelse av Cell Culture Media Bruke PBW

  1. Bruk to kontroll (EMEM-1x og RO + media) og åtte vekt test medieløsninger (fire konsentrasjoner hver av ubehandlet PBW og CuO-NP-behandlet media) i levedyktighet studiene. Oversikter av løsningene er som følger:
    1. For EMEM-1x kontroll, kjøpe Eagle minimums viktig media (EMEM-1x) med L-glutamin og natriumbikarbonat allerede lagt. Legg føtalt bovint serum (FBS) Og antibiotika per produsentens instruksjoner.
      MERK: EMEM-1x er kjøpt fortynnet til den riktige konsentrasjon for cellevekst og inneholdende L-glutamin og natriumbikarbonat. EMEM-1x krever tilsetning av føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika blanding av penicillin og streptomycin (50 IE / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin). EMEM-1x blir benyttet som en kontroll media, fordi det er produsentens anbefalte vekstmedier for begge celletyper som brukes i denne undersøkelsen. Konsentrert EMEM-10x fortynnes med RO vann fra anlegget eller ubehandlet eller CuO-NP-behandlede PBW å produsere testløsningene. Konsentrert EMEM-10x når den kjøpes ikke inneholder L-glutamin eller natrium-bikarbonat, slik at disse blir tilsatt i tillegg til den føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika blanding av penicillin og streptomycin.
    2. For RO kontrolløsning bruke RO vann hentes fra ISR anlegget. Bruke samme protokoll som vekttest media bare erstatte 100% RO water fra ISR anlegget i stedet for PBW. Å fortynne ubehandlet og CuO-NP-behandlet brukervennlig løsning RO eller ultrarent vann fra laboratoriet.
    3. Fortynne ubehandlet PBW i fire forsøkskonsentrasjoner før blanding med cellekultur mediekomponenter. Forberede de fire ulike konsentrasjoner av ubehandlede pbw løsninger ved å blande ubehandlet PBW med RO (fra laboratoriet) i følgende kombinasjoner: 100% (ren PBW + ingen RO vann), 75% (187,5 ml PBW + 62,5 ml RO vann), 50% (125 ml PBW + 125 ml vann RO) eller 25% (62,5 ml PBW + 187,5 ml RO vann).
    4. Fortynnet CuO-NP-behandlet PBW i fire forsøkskonsentrasjoner før blanding med cellekultur mediekomponenter. Fremstille de fire forskjellige konsentrasjoner av CuO-NP-behandlede vektdeler løsninger ved blanding PBW (forbehandlet med 1 mg / ml CuO-NP i 30 min) med RO (fra laboratoriet) i de følgende kombinasjoner: 100% (ren CuO- NP-behandlet PBW + ingen RO vann), 75% (187,5 ml CuO-NP-behandlet PBW + 62,5 ml RO vann), 50% (125ml av CuO-NP-behandlede PBW + 125 ml vann RO) eller 25% (62,5 ml av CuO-NP-behandlede PBW + 187,5 ml RO vann).
  2. Forbered 250 ml RO + media, ubehandlet PBW + media og CuO-NP-behandlede PBW + mediekonsentrasjon ved å tilsette 25 ml konsentrert EMEM-10x til 190 ml av den 100% RO og 100%, 75%, 50% eller 25% av de forhåndslagde ubehandlede eller CuO-NP-behandlede pbw konsentrasjoner opprettet i trinn 6.1.3 og 6.1.4.
  3. Juster pH i hver løsning til 7,4 med NaOH eller HCl.
  4. Supplement hver konsentrasjon av ubehandlet og CuO-NP-behandlede PBW samt RO + media med følgende standard komponenter: 25 ml (10%) føtalt bovint serum (FBS), 2,5 ml L-glutamin, 0,55 g NaHCO3 og 1,25 ml Pen / Strep (50 IE / ml penicillin og 50 ug / ml streptomycin).
  5. Juster osmolalitet hver konsentrasjon av ubehandlet PBW + media, CuO-NP-behandlet pbw + media og RO + media til 290-310 mOsm / kg ved å legge RO vann og mål ved hjelp av en osmometer.
  6. Filtrere hver løsning ved hjelpen 0,22 mikrometer vakuum filter enhet, og oppbevares ved 4 ° C.
    MERK: På grunn av små variasjoner i mengden av RO vann som brukes til å justere osmolalitet, varierer endelige mediekonsentrasjon innen 5% range, med ubehandlet PBW + mediekonsentrasjon på 56%, 44%, 29% og 16,5% og CuO-NP behandlet vektdeler + media konsentrasjoner på 53%, 45%, 30% og 17%.

6. Cell Livskraftig

MERK: Gitt at nyre og lever er målorganer av heavy metal toksisitet, ansetter dyrkede humane embryonale nyre (HEK293) celler (HEK) og human leverkreft (HepG2) celler (HEP) testmetoder 24-26.

  1. Forbered en kultur av HEK og vannkraft celler 2-3 dager før plating 96-brønners plater som brukes i forsøket henhold til produsentens anvisninger.
  2. Måle cellelevedyktighet ved hjelp av 3- [4, 5-dimetyltiazol-2-yl] -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay.
    MERK: MTT analyseprotokollen ble endret fra Meerloo et al. (2011) 27.
    1. Skaff MTT i pulverform. Legg fosfatbufret saltvann (PBS) for å gjøre opp en lager-konsentrasjon på 50 mg / ml. Agitere løsningen for 2 timer og deretter filtrere med 0,45 mikrometer sprøyte filter og delmengde inn 1,5 ml fryse trygge rør. Beskytt rørene mot lys og oppbevares ved 4 ° C.
  3. Fjern HEK og HEP cellene fra deres kulturskåler ved hjelp av trypsin, sentrifuger ved 1000 xg i 5 min og dekanter trypsin. Tilsett 5 ml PBS, og bland-celler for å oppnå en enkel celleløsning. Deretter gjelder 20 ul av enkeltcelleløsning til et hemocytometer for å oppnå et celletall per milliliter oppløsning. Sentrifuger cellene på nytt ved 1000 xg i 5 min og dekanter PBS som brukes til å skylle cellene. Tilsett passende mengde EMEM-1x å justere konsentrasjonen av celler til 500 celle / 100 ul (100 ul / brønn).
  4. Fyll omkretsen brønnene av platen med 200 ul PBS for å kontrollere for fordampning.
  5. Seed celles ved en tetthet på 500 celler / brønn å tilsette 100 ul til hver brønn, bortsett fra omkretsen brønnene (som ikke er belagt med celler).
    MERK: Seeding tetthet for HEK og vannkraft celler er basert på eksperimentelle vekstkurver som gjør toppen av veksten skal skje rundt dager 4-5. Forbered vekstkurver for alle cellelinjer for å estimere seeding tetthet.
  6. Inkuber cellene i 24-timer ved 37 ° C slik at de kan komme seg (skjema stramme adhesjon til platen) før utføring baseline MTT målinger av celletetthet.
  7. Utfør baseline MTT målinger av celletetthet ved å fjerne seeding medier fra den første kolonnen (ikke inkludert omkretsen) og tilsette 100 ul MTT (5 mg / ml i media) til brønnene i 1 time.
  8. Etter en time, fjern MTT og tilsett 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO) for å oppløse MTT-formazan som frembringes av levedyktige celler (20 min).
  9. Les den optiske tetthet (OD) til den første kolonnen ved en absorpsjonsbølgelengde på 570 nm for å oppnå en baselinje lesing.
    1. Bruk baseline målinger for å sikre alle platene ble sådd riktig, og at cellene vokser jevnt mellom platene. Fjern DMSO fra kolonnen blir testet før inkubering i de neste 24 timer.
      MERK: Hvis DMSO er igjen i platen over natten det trekker fuktighet fra den tilstøtende søyle, forårsaker en reduksjon i medievolumet.
  10. Varm testoppløsningene (dvs. EMEM-1x, RO, ubehandlet PBW og CuO-NP-behandlede PBW Addex) til 37 ° C i et vannbad.
  11. Fjern seeding materialet fra resten av platen (utenom omkretsen eller den første kolonnen som ble anvendt for grunnlinjen lesing) og erstattet med 100 ul av EMEM-1x, RO + media, ubehandlet pbw + mediekonsentrasjonen eller CuO-NP behandlede PBW + mediekonsentrasjon (én løsning per plate). Inkuber celler i deres test konsentrasjoner eller kontrolløsninger for totalt syv dager (Days 2-8).
    MERK: Det 10 plater totalt: 1 EMEM-1x, 1 RO + media, en vektdel av hver ubehandlet + mediekonsentrasjon (56%, 44%, 29% og 16,5%) og en plate av hver CuO-NP-behandlede pbw + mediekonsentrasjon (53%, 45% , 30% og 17%) per eksperiment per cellelinje.
  12. Hver dag etter baseline MTT lesing, fjerne kontroll- og testløsninger (oppført i note under 6.11) fra neste kolonnen deres respektive plate (f.eks Day to test- og kontroll media blir fjernet fra rad 3, brønner BG, Dag 3: p 4, brønner BG etc.) og gjenta MTT-protokollen som beskrevet i trinn 6.7 til 6.9 ovenfor.
  13. Gjenta protokollen hver dag i syv dager. Gjennomsnittlig OD resultatene for hver rad (6 brønner) og rapportert mot tiden for å generere en syv-dagers vekstkurve.
  14. For å vurdere effekten av kobber chelatering på cellelevedyktigheten i CuO-NP-behandlede PBW + media følge den samme fremgangsmåte som ovenfor, bortsett fra tilsettes 100 uM av D-penicillamin å kontrollere og testløsninger før tilsetning løsninger på de respektive plater. Utføre data analysis med vitenskapelig grafer programvare.

7. Geokjemisk modellering

  1. Last ned Visual MINTEQ versjon 3.0 / 3.1 et freeware fra følgende nettside http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
    MERK: Visual MINTEQ er et freeware kjemisk likevektsmodell for beregning av metall arts, løselighet likevekter, sorbsjon etc. for naturlige farvann. I tillegg er det brukt til å forutsi ion arts, ion aktiviteter, ion komplekser og metning indekser som sammenlignes med konsentrasjonen av elementer før og etter behandling (massespektroskopi resultater) for å undersøke mulige mekanismer for element fjerning 28.
  2. Åpne programmet og legge inn massespektroskopi av data fra trinn 4, inkludert pH, alkalitet og konsentrasjonene av forskjellige elementer, inn i programmet.
    MERK: Gitt at grunnvannet er oksidert under in situ uranium utpakkingen, bruke oksidert arter av arsen, vanadium, og uran for innspill.

8. hemmende konsentrasjon 50 (IC 50)

  1. Beregne IC50 for de ubehandlede og CuO-NP-behandlede pbw + mediekonsentrasjonen ved først gjennomsnitt levedyktighet (OD gjennomsnitt) på dag 5 i tre separate kjøringer.
  2. Trekk fra dag fem levedyktighet ende gjennomsnitt av de ubehandlede og CuO-NP-behandlede pbw + mediekonsentrasjon fra dag fem levedyktighet gjennomsnitt av EMEM-1x å beregne levedyktighet forskjeller. Deretter dele levedyktighet forskjellene ved gjennomsnittlig levedyktighet på dag 5 i EMEM, og multipliser med 100 for å få prosent hemming.
  3. Trekk prosent inhibering fra 100 (EMEM-1x levedyktighet) for å få prosent levedyktigheten for hver ubehandlet og CuO-NP-behandlede PBW + mediekonsentrasjon.
  4. Input til vitenskapelig grafer programvare ved å sette EMEM-1x ved en konsentrasjon på en og en prosent levedyktigheten til 100; forvandle alle konsentrasjoner i loggenskala (X = log (X)) og utføre ikke-lineær regresjon med minste kvadraters tilpasningsanalyse.

9. Data Analysis

  1. Sammenligne konsentrasjoner av elementer i ubehandlet og CuO-NP-behandlet PBW med en to-tailed, paret, Student T-test.
  2. Beregn arealene under kurven (AUC) ved hjelp av vekstkurven data som er samlet i løpet av syv dager, og analysere variansen ved gjentatt tiltak for analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av Tukey s post hoc sammenligning mellom alle grupper (n = 3).
  3. Beregn IC 50 ved hjelp av data fra dag fem av vekstkurven for både ubehandlet og CuO-NP-behandlede PBW + Addex (beskrevet ovenfor). P-verdier på <0,05 anses signifikant.
    NB: For formålet med statistisk analyse, massespektroskopi ble verdier av halv påvisningsgrensen som er tilordnet ioner konsentrasjonen nivåer under den grensen 29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vektdeler komponent konsentrasjoner og pH i ubehandlet og CuO-NP-behandlede PBW er rapportert i tabell 1. Martinson og Reddy (2009), rapporterte at et punkt med null ladning av CuO-NP er beregnet til 9,4 ± 0,4. Gitt at pH for PBW var 7,2-7,4, under disse betingelser, donerer vann protoner til CuO-NPS, forårsaker nanopartikkel overflaten som skal positivt ladet slik at for adsorpsjon av negativt ladede arter. CuO-NP behandlings fjernet prioriterte forurensninger fra PBW, blant arsen, selen, uran og vanadium (tabell 1). Den gjennomsnittlige arsen konsentrasjonen ble redusert med 87% [0,0175 til 0,002 mg / L (to-halet paret t-test, p <0,0001)]. CuO-NP behandling også betydelig redusert selen (30%), uran (78%), vanadium (92%) og fosfat (85%) (p <0,05).

Spesiering modelleringsresultater, rapportert i tabell 2, støtter analyseresultatene: 99% av tiltal oppløst arsen i PBW er til stede som HAsO 4 2- og H 2 Aso 4 - og 94% av total oppløst selen i PBW er til stede som SEO 4 2-. Disse artene er negativt ladet, og derfor er i stand til å adsorbere til CuO-NPs. Spesiering modellering anslått at 99% av vanadium arter i PBW er negativt ladet, også fremme adsorpsjon til CuO-NPs. Men spådd arts modellering bare 35,5% av uran artene er negativt ladet, som ville begrense adsorpsjon til CuO-NPs. Analyse av metning indekser spådd at ingen arter av Arsenikk-, selen, uran eller vanadiumholdige mineraler var nær metning (dvs. mineral nedbør) nivåer, støtte adsorpsjon til CuO-NPs, mot nedbør.

Å vurdere om forventede konsentrasjoner av prioriterte miljøgifter er i media laget av ubehandlet og CuO-NP-behandlet PBW, prøver av ufortynnet kontroll media (EMEM-1x), 56%ubehandlede pbw + media og 53% CuO-NP-behandlet PBW + media ble analysert ved ICP-MS. Ufortynnet kontrollmedia (EMEM-1x) er et kommersielt produkt som leveres sammen med L-glutamin og natriumbikarbonat (pre-tilsatt). Kobber- og selenkonsentrasjoner i kontroll EMEM-1x ble svakt forhøyet som forventet fordi de er essensielle for cellevekst, men arsen, uran og vanadium var ubetydelig, er rapportert i tabell 3. Preliminære studier viste at, arsen, selen og vanadium-konsentrasjoner ble redusert med CuO-NP behandling og at nedgangen var representert i de konsentrasjoner i CuO-NP-behandlet PBW + media. Den målte konsentrasjon av uran i CuO-NP-behandlet PBW + media ble redusert sammenlignet med ubehandlet PBW, og denne nedgangen var mer uttalt enn spådd av Visual MINTEC v.3 modellering. Kobber nivåer steg i CuO-NP-behandlet media som forventet.

For å bestemme evnen til CuO-NP behandling for å forbedre cytotoksisitet av PBW på pattedyrsceller, levedyktighet ble vurdert i celler eksponert for løsninger av PBW + media før og etter CuO-NP behandling. Begge HEK (figur 1A) og HEP (figur 1B) celler ble eksponert for ulike konsentrasjoner av ubehandlet eller behandlet PBW + media for opptil sju dager. I celler dyrket i ubehandlet PBW + media, ble levedyktighet svekket på en konsentrasjonsavhengig måte, mens CuO-NP behandling forbedret cellulær levedyktighet i begge cellelinjer. Den integrerte AUC i Figur 1C viser at HEK celler dyrket i CuO-NP-behandlet PBW + media var mer levedyktig i forhold til ubehandlet PBW + media på de tre høyeste konsentrasjonene (29%, 44% og 56%). Vannkraft celler viste litt annen levedyktighet: bare de to høyeste konsentrasjonene av ubehandlet PBW + media (44% og 56%) viste nedsatt levedyktighet i forhold til CuO-NP-behandlet PBW + media (figur 1D). De mer fortynnede konsentrasjoner av PBW var mindre toksisk for HEP-celler, og cellelevedyktigheten mindre påvirket av behandlingen. Denlevedyktigheten både HEK og HEP celler dyrket i 16,5% ubehandlet PBW + media var ikke signifikant forskjellig fra celler dyrket i 53% CuO-NP-behandlede PBW + media (p <0,05). Således CuO-NP behandling viste seg å forbedre den cytotoksisitet av PBW, med levedyktighet nær kontrollnivåer. Som omtalt ovenfor, er CuO-NP behandling av PBW assosiert med en økning i kobberkonsentrasjoner. Økningen var forventet, basert på tidligere resultater etter Reddy og Roth (2012), der brukte de CuO-NPs å fjerne arsen fra grunnvann. Økningen i kobber er avhengig av den spesifikke vannkjemien av PBW, men forble under EPA MCL på 1,3 mg / l. Imidlertid var det viktig å utelukke at økningen i kobberkonsentrasjoner bidratt til økt levedyktighet (dvs. i tillegg til eller i stedet for, nedgangen i prioriterte miljøgifter). Følgelig ble kobberet kelator D-penicillamin lagt til EMEM-1x kontroll, RO + mediekontroll, ubehandlede og CuO-NP-behandlede pbw + medieløsninger, og then MTT levedyktighet vekstkurve ble generert som beskrevet ovenfor. Kobber chelation gjorde ikke signifikant påvirker levedyktigheten til enten HEK eller vannkraft celler inkubert i RO + mediekontroll, ubehandlet og CuO-NP-behandlet PBW + media (resultater ikke vist).

Den halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC 50) ble beregnet fra dag fem vekst av HEK og vannkraft celler dyrket i ubehandlet PBW + media (tabell 4A) og CuO-NP-behandlet PBW + media (tabell 4B). For HEK celler dyrket i ubehandlet PBW + media, IC 50-verdien var 1,264 (log% PBW). Dermed vil de ubehandlede pbw + media må fortynnes til 18,38% for å få til en 50% reduksjon i levedyktighet. For HEK celler dyrket i CuO-NP-behandlet PBW + media, IC 50-verdien var 2,744 (log% PBW). Dette resultatet tyder på at teoretisk cytotoksisiteten av oppløsningen ble redusert i den grad at behandlede pbw + media ville trenge å bli konsentrert ved 500% (log% PBW = 2,744) for å frembringe et tilsvarende 50% dekrøll i levedyktighet. For vannkraft celler dyrket i ubehandlet PBW + media, IC 50 var 1,243 (log% PBW). Dette ville kreve en fortynning av PBW + media til 17,5% for å gi en 50% reduksjon i levedyktighet. I motsetning til dette, for HEP celler dyrket i CuO-NP-behandlede PBW + media, IC50 var 5,327 (log% PBW). Denne verdien sannsynligvis var så stor, fordi levedyktighet av cellene i CuO-NP-behandlede PBW + media var ikke signifikant forskjellig fra celler dyrket i EMEM-1x (kontroll). Lysfelt-avbildning, illustrert i figur 2, av både HEK og HEP cellevekst på dag fem. Celle nummer og vedlegg i CuO-NP-behandlede pbw + media (figur 2E, F) ble forbedret sammenlignet med ubehandlet PBW + media (figur 2C, D).

Figur 1
Figur 1: vekstkurver. Vekstkurver ble brukt for å vurdere levedyktigheten og growth av kulturene under behandlingen. Vekstkurver for HEK (A) og HEP (B) celler dyrket i fire fortynninger av PBW + medier sammenlignet med 53% CuO-NP-behandlede PBW + media (øvre panel). EMEM-1x-kontroll (EMEM) , RO 53% CuO-NP-behandlet 16,5% ubehandlet PBW , 29% ubehandlet PBW 44% ubehandlet PBW , 56% ubehandlet PBW . Arealet under kurven (AUC) analyse av HEK (C) og HEP (D) 7 dagers vekstkurve data (nedre paneler). * P <0,05 sammenlignet med kontroll EMEM, #p <0,05 sammenlignet med kontroll RO, §p <0,05 sammenlignet med 53% CuO NP-behandlede vekt-media. (Sammen bruker en to-tailed ANOVA medTukey sin post hoc-analyse, n = 3.)

Figur 2
Fig. 2: Celle morfologi før og etter CuO-NP behandling lysfelt-mikroskopi (20X) av HEK (venstre kolonne) og HEP (høyre kolonne) celler på dag 5, dyrket i: EMEM-1x kontroll (EMEM) (A, B ), ble 56% ubehandlet PBW + medier (C, D) og 53% CuO-NP-behandlede PBW + media (E, F) som brukes til å undersøke cellemorfologi. HEK og vannkraft celler dyrket i EMEM-1x-kontroll (EMEM) (A, B) viser sunn, nesten sammenflytende vekst. HEK og vannkraft celler dyrket i ubehandlet PBW + media har redusert tallene og vises enebolig (C, D). HEK og vannkraft celler dyrket i CuO-NP-behandlet PBW + media viser bedre feste og sunne, mer sammenflytende celler (E F).

Element (mg / L) Gjennomsnittlig, St. Dev. & Betydning
Før behandling Etter behandling
Arsen 0,018 ± 0,001 0,002 ± 0.0 ***
Selen 1.8 ± 0.07 1.3 ± 0.05 **
Kobber 0,0015 ± 0,001 0,93 ± 0,43 *
Kalsium 102 ± 82 106 ± 15
Strontium 3.3 ± 1.1 1.5 ± 0.4 *
Magnesium 44 ± 2.1 47 ± 1,7
Natrium 610 ±; 0.0 627 ± 27
Uran 0,98 ± 0,03 0,21 ± 0,03 ***
Barium 0,037 ± 0.02 0,019 ± 0.01
Kalium 12 ± 0.0 12 ± 0,8
Silicon 12 ± 0,7 12 ± 0,5
Vanadium 1.3 ± 0.07 0.1 ± 0.02 ***
Fosfat 0,35 ± 0,07 0,05 ± 0,0 ***
Sulfat 805 ± 21 807 ± 15
Ledningsevne 3125 ± 143 3190 ± 62
pH 7.31 ± 0.09 7,36 ± 0,05

Tabell 1:. Analyse av kationer og anioner før og etter CuO-NP behandling Gjennomsnittlig elementkonsentrasjoner før og etter behandling med CuO-NP. Signifikans mellom konsentrasjonen av CuO-NP-behandlede og ubehandlede PBW betegnes som * = p <0,05, ** = p <0,01 og *** = p <0,001. En tom celle indikerer ingen signifikant forskjell. Klorkonsentrasjoner varierte mellom 46,5 ± 0,707 og 55.25 ± 8.180. Aluminium, bor, og molybden konsentrasjonene var lave og viste ingen signifikant endring på grunn av CuO-NP behandling. Mangankonsentrasjonene var ikke konsekvent.

Komponenter % Av total konsentrasjon Arter
Arsen 58.7 HAsO 4 2-
410,2 H 2 Aso 4 -
Uran 64.1 Ca 2 UO 2 (CO 3) 3 (aq)
32.2 CaUO 2 (CO 3) 3 2-
0,03 UO 2 (CO 3) 2 2-
3.5 UO 2 (CO 3) 3 4-
0,09 Ca 2 UO 2 (CO 3) 3 (aq)
0,02 CaUO 2 (CO 3) 3 2-
Selen 94.3 SEO 4 2-
5.6 CaSeO 4 (aq)
Vanadium 2.1 HVO 4 2-
95.7 H 2 VO 4-
2.1 H 2 V 2 O 7 2-
0,01 HV 2 O 7 3-
0,01 V 4 O 12 4-

Tabell 2: Arter modellering ved hjelp av Visual MINTEQ ver. 3.0 software. Visual MINTEQ ver. 3.0-programvare (KTH Royal Institute of Technology, Valhallavägen, Sverige) ble brukt til å beregne metall arts av vekt komponenter er oppført i tabell 1. (Aq) = vandig i motsetning til fast form av at arter.

EMEM kontroll Ubehandlet
PBW Pbw + media
Arsen 0,003 ± 0.0 0,017 ± 0.0 0,010 ± 0,001
Kobber 0,01 ± 0,0 0,0015 ± 0,001 0,018 ± 0.0
Selen 0,013 ± 0,002 1,75 ± 0,07 1,15 ± 0,06
Uran 0,00015 ± 0.0 0,975 ± 0,03 0,71 ± 0,01
Vanadium 0,0015 ± 0.0 1,25 ± 0,07 0,785 ± 0,007
CuO NP-behandlet
PBW Pbw + media
Arsen 0,0022 ± 0,001 0,0015 ± 0.0
Kobber 0,926 ± 0,4 0,81 ± 0,0
Selen 1,25 ± 0,05 0,855 ± 0.0.02
Uran 0,208 ± 0,03 0,45 ± 0,01
Vanadium 0.102 ± 0.02 0,0795 ± 0.01

Tabell 3:. Konsentrasjoner av miljøgifter i media Konsentrasjoner av prioriterte miljøgifter (mg / L) i EMEM-1x-kontroll (EMEM), ubehandlet PBW, CuO-NP-behandlet PBW, ubehandlet PBW + media og CuO-NP-behandlet PBW + media etter tilsetning av mediekomponenter (n = 3) ble undersøkt for å sikre endringer i forurensningskonsentrasjonen som følge av behandling var representert i ubehandlede vektdeler + media og CuO-NP-behandlede PBW + medier brukt til cells.

En Ubehandlet PBW + Media
Konsentrasjoner av Ubehandlet PBW (log X) % Livskraftig (HEK celler) % Livskraftig (vannkraft celler)
EMEM 100 100
16,5% (1,217) 51.4 50.8
29% (1,462) 39 33.3
44% (1,643) 19.3 14.7
56% (1,748) 14.5 9.4
IC 50 Logg [PBW] 1,264 1,243
B CuO-NP-behandlet PBW + Media
Konsentrasjoner av CuO-NP-Behandlet PBW (log X) % Livskraftig (HEK celler) % Livskraftig (vannkraft celler)
EMEM 100 100
17% (1.230) 86.7 119,8
30% (1,477) 75.8 86.7
45% (1,653) 81 92.4
53% (1,724) 70.3 97.5
IC 50 Logg [PBW] 2,744 5,327

Tabell 4: Beregning av IC 50. IC 50 representerer konsentrasjonen av ubehandlet PBW + media eller CuO-NP-behandlede PBW + media som er nødvendig for en 50% hemming av levedyktighet.   Den prosentvise levedyktighet på dag 5 for HEK og HEP-celler utsatt for fortynninger av ubehandlet PBW + Media (A) eller CuO-NP-behandlede PBW + Media (B) ble anvendt for å beregne halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC 50).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidligere studier har rapportert at CuO-NPs fjernet arsen fra grunnvann 11,13,30,31. Denne studien støtter disse tidligere funn og rapporterer at CuO-NPs fjerne flere forurensninger fra PBW også. Denne undersøkelsen bekrefter også tidligere rapporter at CuO-NPS er effektive ved arsen fjerning, til tross for tilstedeværelsen av andre forurensninger og potensielle konkurrerende ioner 11. Spesiering modellering anslått at 97% av vanadium arter i PBW er negativt ladet, slik at for adsorpsjon til CuO-NPS, og satsvis behandling fjernet 92% av vanadium.

Dette er den første studie for å undersøke effekten av fjerning av spesifikke forurensninger fra PBW ved hjelp av CuO-NP, og deretter vurdere forandringene i cytotoksisitet i forbindelse med fjerning. Resultatene viser at undersøke endringene i cytotoksisiteten av komplekse blandinger ved bruk av en in vitro-metode kan være mulig, men disse metodene er ikke uten begrensninger. PBW kunne ikke brukes full styrke på cellene, fordi å overleve, dyrkede celler krever en definert vekstmedier og spesifikk osmolalitet. Vektdeler + media kan heller ikke brukes på cellene uten pH-justering. PH av den PBW var 7,31 før og etter behandling 7,36 imidlertid; tilsetning av vekstmediekomponenter reduserte pH til omtrent 6,8, avhengig av fortynning. PH-justering er et vanlig trinn i fremstillingen av cellekulturmedier imidlertid; justering av pH i de vektdeler + media kan ha endret de molekylære interaksjoner av elementet arter med mediekomponenter. Ubehandlet og CuO-NP-behandlede PBW ble kombinert med konsentrert EMEM-10X vekstmedier i forskjellige proporsjoner for å oppnå testløsningene (pbw + media). ICP-MS analyse ble utført på test medier for å verifisere at konsentrasjonene av metallene betydelig påvirket av CuO-NP-behandling (arsen, kobber, selen, uran, vanadium) var på forventede konsentrasjoner etter fortynning av medie komponenter og osmolalitet justering. Nedgangeni arsen, selen og vanadium etter CuO-NP-behandlingen gjenspeiles i konsentrasjonsforskjeller mellom ubehandlet PBW + media og CuO-NP-behandlet PBW + media. Uran konsentrasjoner er høyere i CuO-NP-behandlet PBW + media enn spådd. ICP-MS-data (tabell 1) viser at mer uran ble fjernet fra PBW under CuO-NP behandling enn forutsagt ved modellering. Spesiering modellering (tabell 2) forutsa at ved pH 7,3, blir bare 35,5% av uran arten negativt ladet. Modellen spår at store uran arter, kalsium uranyl karbonat (Ca 2 UO 2 (CO 3) 3), er nøytral.

Den observerte 78% fjerning av uran var sannsynligvis på grunn av en kombinasjon av adsorpsjon og uran utfelling (som en kalsium-karbonat uranyl mineral). Basert på de geokjemiske modellering, er prosentandelen av uran fjernes ved adsorpsjon mindre enn beregnet som tillater en høyere konsentrasjon i det CuO-NPbehandlede PBW + media. Mekanismen for uran fjerning av CuO-NP-behandling er uklar og krever videre undersøkelser. En økning i konsentrasjonen av kalsium, kalium og magnesium som var forventet da PBW ble lagt til EMEM-10x imidlertid; CuO-NP-behandling ga ikke en vesentlig endring i disse elementene, så ingen forskjell ble sett i ubehandlet vs. CuO-NP-behandlet PBW + media. Teknikken med å kombinere de faktiske miljø med media komponenter lyktes i å representere de endringer sett i elementkonsentrasjoner på grunn av behandlingen; Men det oksyderte arten av PBW begrenset hvordan vektdeler + media kan bli gjort. I et forsøk på å øke den maksimale konsentrasjonen av elementene i testmedium, ble pulverisert cellekulturmedier som opprinnelig blandes med ubehandlet og CuO-NP-behandlede PBW å gjøre PBW + media. Pulverisert media ofte resulterte i utfelling av kalsiumsalter, og det økte osmolaliteten i PBW + Middel som kreves et større fortynning med RO vann, produserer konsensentrasjoner nær de som oppnås med 10x flytende medier. Disse problemene er mest sannsynlig PBW spesifikke grunn av sin oksidativt tilstand og kan ikke være et problem med andre mindre følsomme blandinger.

MTT-assay ble valgt for å evaluere cytotoksisiteten fordi det er en anerkjent standard high-throughput assay som evaluerer den generelle helsen til cellene ved å måle mitokondrie aktivitet. Denne fremgangsmåte har fordeler og ulemper. 96-brønners-formatet er nyttig for oppnåelse av flere datapunkter imidlertid; de fleste av cellene ved dag 5 var usunn ser, avrundet og ikke lenger er festet til platen. Bildene i figur 2 ble tatt før media ble fjernet ved hjelp av et vakuum; suging av media, og deretter legge den MTT løsningen kan ha fjernet ufestede celler eller enebolig dårlig adherente celler, bidrar til den generelle platået av MTT signal etter dag to sett med ubehandlet PBW. Forutsetningen er at flytende cellene er døde eller døende og oare de festede celler blir vurdert ved hjelp av denne metoden. Det er også viktig å ta hensyn til begrensninger av MTT-analysen med hensyn til studier ved hjelp av nanopartikler.

Tidligere studier har rapportert at når direkte brukes til dyrkede celler, kan nanopartikler har iboende giftighet, utover sine basen kjemiske egenskaper, avhengig av deres unike fysiske egenskaper som størrelse og form 32,33. I denne studien, fikk vi ikke bruke CuO-NPs direkte på cellene. I stedet, ble cellene eksponert for PBW som tidligere var blitt behandlet med CuO-NPs, sentrifugert for å fjerne mesteparten av CuO-NPS og deretter filtrert to ganger for å fjerne mer CuO-NPS før PBW ble anvendt for å fremstille PBW + media. MS Resultatene viste en økning i kobber etter behandling. Dette kan være kobber-ioner som ble oppløst av nanopartikler i behandlingsperioden eller CuO-NPS som kan ha passert gjennom sentrifugering / filtreringstrinn for å forbli i den behandlede PBW used å gjøre PBW + media. CuO-NPs varierer i størrelse 12 til 18 nm med en BET målte overflateareal på 85 ± 1 m 2 / g 11, men er kjent for å aggregere og basert på minimal økning i kobberkonsentrasjonen i det behandlede PBW, det meste av kobberet uavhengig av kilden er fjernet etter sentrifugering og filtrering. Visuell bekreftelse av forbedret celle helse og løpet støtter MTT analyseresultatene av forbedret levedyktigheten på grunn av CuO-NP behandling av PBW (figur 2). Fremtidige studier med andre metoder kan vurdere (eller karakter) tilsvar konfunderende effekter forårsaket av CuO-NPs.

Humane embryonale nyre (HEK-293) og human leverkreft (HEP G2) celler ble valgt for toksisitetstesting. Dette er en standard cellelinjer som er klinisk relevant for heavy metal organtoksisitet 24,25,34-40. En lav densitet poding ble brukt til MTT-analyser. Celler ble sådd med 500 celler / brønn, fikk komme segi 24 timer, og deretter eksponert til testmediet. Den lave seeding tetthet var nødvendig for å oppnå en vekstkurve med logfase rundt dag 5, før de blir overflytende og stasjonær på dag 6 eller 7. Chakraborty et al. (2010) rapporterte at i en studie av kadmium giftighet på dyrket nyre proksimale tubulære celler (PTC), confluency og spredning status (proliferende vs. hvilende) påvirket responsen på kadmiumeksponering: sub-konfluent voksende celler viste mer cytotoksisitet enn sammenflytende (hvilende) celler. HEP og HEK-celler utsatt for PBW på et høyere konsentrasjoner (større konfluens) tilsvarende de som benyttes for andre analyse (resultater ikke vist) viste ikke de kraftige endringer i morfologien sett med MTT-analyse. Videre etterforskning i endringene i cytotoksisitet bruk av ikke-adherente cellelinjer eller protokoller som høster og samle alle celler (f.eks flowcytometri) er nødvendig.

En annen begrensning av MTT metoden i studier using nanopartikler er at noen typer av nanopartikler kan påvirke cellulær ernæring. Cellekulturmedier inneholder typisk tilsatte proteinkilder, slik som føtalt bovint serum (FBS), for å supplere cellevekst. Studier har vist at metalloksydet nanopartikler kan tømme viktige vekstkomponenter i FBS, på grunn av økt absorpsjonskapasitet av nanopartikler. Metalloksid nanopartikler har vist seg å linke til FBS gjennom et samspill med kalsium 41. Avhengig av pH i løsningen, kan metallnanopartikler bære en positiv eller negativ ladning. Cytotoksisitetstester studier har vist at metallnanopartikler lagt til cellekultur media adsorbere kationer, inkludert Ca 2+, og deretter fjerne FBS / serum albumin gjennom binding av NP-Ca 2+ komplekset til kalsium bindingsseter på proteiner i FBS. Dette reduserer konsentrasjonen av Ca 2+ og FBS fra mediet, i det vesentlige sulter cellene og øke cytotoksisiteten tilskrives den nanoparticles 41. Videre pre-eksponering av nanopartikler til FBS / Ca 2+ belagt nanopartikler, redusere deres cytotoksiske virkning. Men, vi har ikke direkte utsett media til CuO-NPs. Også, ingen signifikant reduksjon i Ca2 + konsentrasjoner ble sett i PBW etter behandling med CuO-NPS, noe som indikerer ingen signifikant absorpsjon av Ca2 + på CuO-NPS grunning binde dem med FBS. Imidlertid er konsentrasjonen av kalsium i PBW høy nok til at en nanopartikkel-indusert reduksjon ikke kan ha vært åpenbar. Det er likevel sannsynlig at CuO-NPS anvendt i denne studien er å absorbere store mengder kalsium i løpet av behandlingen, fordi det ikke var noen reduksjon i arsen absorpsjons egenskapene til CuO-NPS i PBW, som inneholder høye nivåer av kalsium sammenlignet med tidligere studier med grunnvann med lavere kalsiumkonsentrasjoner 13.

Dataene viser at CuO-NPs fjerne arsen, selen vanadium og uranium, er og dette forbundet med økt HEK og HEP celle levedyktighet i MTT analysen. Mekanismen (e) ved hvilken levedyktighet forbedres ennå ikke er bestemt, men det kan være på grunn av fjernelse av forurensninger ved prioriterte CuO-NP, blant andre mekanismer. Den aktuelle undersøkelse viser også at standard celledyrkningsmetoder kan anvendes for å vurdere effekten av en nanopartikkel ISR vannbehandling metode, noe som muliggjør en rekke mekanistiske undersøkelser å være fullført, før flytter inn i de mer kostbare og tidkrevende in vivo dyrestudier . I tillegg kan CuO-NPs vise seg å være mer allsidig for gruveprosesser og til behandling av metallblandinger enn konvensjonelle adsorbenter som oksider av aluminium, jern, titan og mangan, ettersom CuO-NPS ikke krever pH-justering eller oksydasjon av vann for arsen fjerning, og CuO-NPS fjerne både arsenitt og arsenat i nærvær av konkurrerende anioner fosfat, silikat og sulfat. Dessuten kan CuO-NPs regenereres og re-brukte, reduksjonsmiddel kostnader og hvor mye brukt behandling avfalls biprodukter som trenger disposisjon 12.

Potensielle begrensninger av MTT-protokollen inkluderer lav celletettheten ved tiden for eksponering, løsgjøring av celler og tap av signal, celle sult og mulig direkte eksponering av cellene til CuO-NP rende MTT reaktivitet. Celletetthet og adskillelsesproblemer kan løses ved hjelp av en alternativ test slik som strømningscytometri, som gjør det mulig for høyere pode densiteter samt samling av alle celler (det vil si, både flytende og vedlagt). Cell sult spørsmål kan vurderes ved å måle vekstfaktor konsentrasjoner i media med jevne mellomrom under behandlingen. Fremtidig arbeid vil fokusere på å bruke den aktuelle protokollen til forskjellige cytotoksisitetsanalyser som vil løse hvis mulig CuO-NP eksponering endret analysen aktivitet, målinger av celle sult under behandling og også teste evnen til CuO-NPs å fjerne Contaminants og påvirke cytotoksisitet av andre typer komplekse blandinger, som for eksempel avfall fra Superfund nettsteder og avfallsdammer. Slike studier vil også ta opp hvorvidt metodene var robust i ulike sammenhenger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CuCl2 Sigma 203149
Borosilicate glass balls VWR 26396-639 6 mm
Nitric Acid Fisher A509-P500 Trace metal grade
0.45 μm syringe filter Fisher SLHA 033S S
10x EMEM Fisher BW12-684F
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
L-glutamine Fisher BP379-100
NaHCO3 Sigma S5761
Penicillin/Streptomycin ATCC 30-2300
0.22 μm vacuum filter unit Fisher 09-740-28C
HEK293 ATCC CRL-1573
HEPG2 ATCC HB-8065
Trypsin Sigma SV3003101
MTT Sigma M2128
D-penicillamine Fisher ICN15180680
96-well plates Fisher 07-200-92
DMSO Fisher D12814
Spectra Max 190 Molecular Devices
Visual MINTEQ version 3.0 KTH Royal Institute of Technology
ICP-MS Agilent Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
IC DIONEX DX 500 Dionex Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
VWR Incubator VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. What is the status of the U.S. nuclear industry? Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/energy_in_brief/article/nuclear_industry.cfm (2014).
  2. International Energy Outlook. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/forecasts/archive/ieo11/pdf/0484%282011%29.pdf (2011).
  3. Uranium Marketing Annual Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/uranium/marketing/ (2014).
  4. Domestic Uranium Production Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/uranium/production/annual/ (2014).
  5. Uranium Recovery. Washington (DC): U.S. United States Nuclear Regulatory Commission (US). Available from: http://www.nrc.gov/materials/uranium-recovery/license-apps/ur-projects-list-public.pdf (2014).
  6. U.S. Uranium Reserves Estimates. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.doe.gov/cneaf/nuclear/page/reserves/ures.html (2010).
  7. The Future of Uranium Production in Wyoming: A Public Forum on In-Situ Recovery. Washington (DC): Meridian Institute. Available from: http://www.uwyo.edu/ser/_files/docs/conferences/2010/uraniumforum/ser_uranium_forum_final_report.pdf (2010).
  8. Generic Environmental Impact Statement for In-Situ Leach Uranium Milling Facilities Washington (DC): U.S. Nuclear Regulatory commission (US). Available from: http://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/nuregs/staff/sr1910/v1/ (2012).
  9. Wyoming surface water quality standards. Cheyenne (WY): State of Wyoming Department of Environmental Quality (US). Available from: http://soswy.state.wy.us/Rules/RULES/6547.pdf (2011).
  10. Qu, X., Alvarez, P., Li, Q. Applications of nanotechnology in water and wastewater treatment. Water Research. 47, (12), 3931-3946 (2013).
  11. Martinson, C., Reddy, K. Adsorption of arsenic(III) and arsenic(V) by cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, (2), 401-411 (2009).
  12. Reddy, K., McDonald, K., King, H. A novel arsenic removal process for water using cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 397, 96-102 (2013).
  13. Reddy, K., Roth, T. Arsenic Removal from Natural Groundwater Using Cupric Oxide. Ground Water. 51, (1), 83-91 (2012).
  14. Zhang, G., Ren, Z., Zhang, X., Chen, J. Nanostructured iron(III)-copper(II) binary oxide: a novel adsorbent for enhanced arsenic removal from aqueous solutions. Water Research. 47, (12), 4022-4031 (2013).
  15. Ali, I. New generation adsorbents for water treatment. Chemical Reviews. 112, (10), 5073-5091 (2012).
  16. Zhang, Q. CuO nanostructures: Synthesis, characterization, growth mechanisms, fundamental properties, and applications. Progress in Materials Science. 60, 208-337 (2014).
  17. Schmidt, C. TOX 21: new dimensions of toxicity testing. Environmental health perspectives. 117, (8), 348-353 (2009).
  18. Firestone, M., Kavlock, R., Zenick, H., Kramer, M. The U.S. Environmental Protection Agency Strategic Plan for Evaluating the Toxicity of Chemicals. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13, (2-4), 139-162 (2010).
  19. Guidance Manual for the Assessment of Joint Toxic Action of Chemical Mixtures [Internet]. Atlanta (GA); Agency for Toxic Substance and Disease Registry (US). Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/interactionprofiles/IP-ga/ipga.pdf (2014).
  20. Bae, D., Gennings, C., Carter, W., Yang, R., Campain, J. Toxicological interactions among arsenic, cadmium, chromium, and lead in human keratinocytes. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 63, (1), 132-142 (2001).
  21. Whittaker, M. Exposure to Pb, Cd, and As mixtures potentiates the production of oxidative stress precursors: 30-day, 90-day, and 180-day drinking water studies in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 254, (2), 154-166 (2011).
  22. Schilz, J. Investigating the ability of cupric oxide nanoparticles to adsorb metal contaminants from uranium in-situ recovery (ISR) production bleed water and assessing the associated changes in cytotoxicity. University of Wyoming. Laramie, WY. Available from: ProQuest UMI, Ann Arbor, MI (2014).
  23. Manual of Standard Operating Procedures for Sample Collection and Analysis. Cheyenne (WY): Wyoming Department of Environmental Quality (US). Available from: http://deq.state.wy.us/wqd/watershed/downloads/qa/4-1089.pdf (2011).
  24. Florea, A., Splettstoesser, F., Büsselberg, D. Arsenic trioxide (As2O3) induced calcium signals and cytotoxicity in two human cell lines SY-5Y neuroblastoma and 293 embryonic kidney (HEK). Toxicology and Applied Pharmacology. 220, (3), 292-301 (2007).
  25. Mao, W. Cadmium induces apoptosis in human embryonic kidney (HEK) 293 cells by caspase-dependent and -independent pathways acting on mitochondria. Toxicology in Vitro. 21, (3), 343-354 (2007).
  26. Tchounwou, P., Yedjou, C., Patlolla, A., Sutton, D. Heavy Metal Toxicity and the Environment. Molecular, Clinical and Environmental Toxicology. 101, 133-164 (2012).
  27. Meerloo, J., Kaspers, G., Cloos, J. Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay. Cancer Cell Culture. 731, 237-245 (2011).
  28. Gustafsson, J. Visual MINTEQ. Royal Institute of Technology. Stockholm, Sweden. (2010).
  29. Hallab, N., Caicedo, M., McAllister, K., Skipor, A., Amstutz, H., Jacobs, J. Asymptomatic prospective and retrospective cohorts with metal-on-metal hip arthroplasty indicate acquired lymphocyte reactivity varies with metal ion levels on a group basis. Journal of Orthopaedic Research. 31, (2), 173-182 (2013).
  30. Goswami, A., Raul, P., Purkait, M. Arsenic adsorption using copper (II) oxide nanoparticles. Chemical Engineering Research and Design. 90, (9), 1387-1396 (2011).
  31. Pillewan, P., Mukherjee, S., Roychowdhury, T., Das, S., Bansiwal, A., Rayalu, S. Removal of As(III) and As(V) from water by copper oxide incorporated mesoporous alumina. Journal of Hazardous Materials. 186, (1), 367-375 (2011).
  32. Kroll, A. Cytotoxicity screening of 23 engineered nanomaterials using a test matrix of ten cell lines and three different assays. Particle and fibre toxicology. 8, (9), 1-19 (2011).
  33. Fahmy, B., Cormier, S. Copper oxide nanoparticles induce oxidative stress and cytotoxicity in airway epithelial cells. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 23, (7), 1365-1371 (2009).
  34. Radike, M. Distribution and accumulation of a mixture of arsenic, cadmium, chromium, nickel and vanadium in mouse small intestin, kidney, pancreas, and femur following oral administration in water or feed. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 65, (23), 2029-2052 (2002).
  35. Barbier, O., Jacquillet, G., Tauc, M., Cougnon, M., Poujeol, P. Effect of heavy metals on, and handling by, the kidney. Nephron. Physiology. 99, (4), 105-110 (2005).
  36. Zheng, X., Watts, G., Vaught, S., Gandolfi, A. Low-level arsenite induced gene expression in HEK293 cells. Toxicology. 187, (1), 39-48 (2003).
  37. Li, Z., Piao, F., Liu, S., Wang, Y., Qu, S. Subchronic exposure to arsenic trioxide-induced oxidative DNA damage in kidney tissue of mice. Experimental and Toxicologic Pathology. 62, (5), 543-547 (2010).
  38. Farombi, E., Akintunde, J., Nzute, N., Adedara, I., Arojojoye, O. Municipal landfill leachate induces hepatotoxicity and oxidative stress in rats. Toxicology and Industrial Health. 28, (6), 532-541 (2011).
  39. Das, N. Arsenic exposure through drinking water increases the risk of liver and cardiovascular diseases in the population of West Bengal. India. BMC public health. 12, (1), 639-648 (2012).
  40. Valko, M., Morris, H., Cronin, M. Metals, toxicity and oxidative stress. Current Medicinal Chemistry. 12, (10), 1161-1208 (2005).
  41. Horie, M. Protein Adsorption of Ultrafine Metal Oxide and Its Influence on Cytotoxicity toward Cultured Cells. Chemical Research in Toxicology. 22, (3), 543-553 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics