Verwijdering van Trace Elements van Cupric Oxide Nanodeeltjes van Uranium

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schilz, J. R., Reddy, K. J., Nair, S., Johnson, T. E., Tjalkens, R. B., Krueger, K. P., Clark, S. Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability. J. Vis. Exp. (100), e52715, doi:10.3791/52715 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In situ recovery (ISR) is de meest gangbare uraniumwinning in de Verenigde Staten. Tijdens het ISR, wordt uranium uitgeloogd uit een erts en gewonnen door middel van ionenwisseling. De resulterende productie bleed water (PBW) bevat verontreinigingen, zoals arsenicum en andere zware metalen. Monsters van PBW uit een actieve ISR uranium faciliteit werden behandeld met nanodeeltjes koperoxide (CuO-NP). CuO-NP behandeling van PBW verminderde prioritaire contaminanten, zoals arsenicum, selenium, uranium en vanadium. Onbehandelde en CuO-NP behandelde PBW werd als de vloeistofcomponent van de celgroei medium en veranderingen in de levensvatbaarheid werden bepaald met de MTT (3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) assay in humane embryonale nier (HEK 293) en menselijke hepatocellulaire carcinoom (Hep G2) cellen. CuO-NP behandeling werd geassocieerd met verbeterde HEK en HEP ​​levensvatbaarheid van de cellen. Beperkingen van deze werkwijze omvatten verdunning PBW door kweekmedium componenten en tijdens osmolteit aanpassing alsook de nodige aanpassing van de pH. Deze werkwijze is beperkt in zijn bredere context gevolg van verdunning en wijzigingen in de pH van de PBW die traditioneel echter enigszins zuur; Deze werkwijze kan een ruimer gebruik beoordelen CuO-NP behandeling neutraler wateren.

Introduction

Ongeveer 20% van de Amerikaanse elektrische voeding wordt geleverd door kernenergie en, mede op basis van nationale prikkels om energie-onafhankelijkheid te vergroten, de Amerikaanse nucleaire capaciteit zal naar verwachting toenemen 1. Wereldwijde groei van kernenergie zal naar verwachting ook verder, met veel van de groei die zich buiten de US 2. Met ingang van 2013 werd 83% van de Amerikaanse uranium geïmporteerd, maar 952.544 ton reserves bestaan ​​in de VS 3,4. In 2013 waren er 7 nieuwe faciliteit applicaties en toepassingen 14 herstart / uitzetting tussen Wyoming, New Mexico, en Nebraska 5. In de VS, wordt uranium voornamelijk gehaald door middel van in situ recovery (ISR) processen 6. ISR veroorzaakt minder land verstoring en vermijdt het creëren tailing stapels dat milieuverontreinigende stoffen 7 kan vrijgeven. ISR gebruikt waterbasis oxiderende oplossingen uranium logen uit de ondergrondse erts, waarna het uranium through uit het percolaateen ionenuitwisseling proces 8. Om een ​​negatieve waterbalans in het erts lichaam te handhaven, een deel van het percolaat, genaamd de productie tot aan de randen water (PBW), wordt afgetapt. Een gedeelte van de PBW ontsmet middels omgekeerde osmose (RO) en opnieuw ingebracht in het winningsproces, maar PBW ook gunstige industriële of agrarische doeleinden als toxische contaminanten kunnen worden gereduceerd tot bepaald state regelgevende instanties voor oppervlakte acceptabele niveaus 9 grondwater. Momenteel hebben de meeste ISR uranium faciliteiten RO om verontreinigingen uit PBW te verwijderen. Echter, RO verwerking is energie-intensief en produceert giftige afval pekel, die gereguleerde verwijdering vereist.

Veel water ontsmetting methoden bestaan, met inbegrip van adsorbentia, membranen, en ionenwisseling. Hiervan adsorptie is de meest gebruikte en recente ontwikkelingen in nanodeeltjes synthese de mogelijkheden van adsorbentia watertarifiëringsbeleid ontsmettingsprocédés 10 verbeterd. Cupric oxide nanodeeltjes (CuO-NP) eerder had niet uitgebreid bestudeerd uranium ISR PBW, maar in recente studies van verontreinigende verwijdering uit grondwater, CuO-NP bleken unieke eigenschappen, waaronder niet pre- of post-waterbehandeling stappen vereisen (hebben bv, het aanpassen van de pH of redoxpotentiaal) en goed presteren in verschillende water composities (bijvoorbeeld in verschillende pH, zoutconcentraties, of concurrerende ionen) 11. Daarnaast worden CuO-NPs gemakkelijk geregenereerd door uitlogen met natriumhydroxide (NaOH), waarna de geregenereerde CuO-NP worden hergebruikt. Details van CuO-NP trace metalen filtering mogelijkheden van natuurlijke wateren zijn eerder gepubliceerd 11-14.

Hoewel bruikbaar voor waterbehandeling, kan metaaloxide nanodeeltjes toxisch zijn voor levende organismen, maar de omvang van de toxiciteit hangt gedeeltelijk af van nanodeeltjes eigenschappen en bestanddelen 10,15,16. Daarom is het belangrijk om simult bestuderenaneous verontreiniging verwijdering en nanodeeltjes toxiciteit voor veld applicaties. De huidige studie bepaald het vermogen van CuO-NP naar PBW prioriteit contaminanten (met inbegrip van arseen, seleen, vanadium en uranium) te verwijderen, en beoordeelde het effect van CuO-NP behandeling op PBW cytotoxiciteit.

PBW werd vanuit een actieve ISR uranium faciliteit en gebruikt om de werkzaamheid van CuO-NP behandeling bepalen prioritaire verwijderen van vuil. PBW cytotoxiciteit voor en na CuO-NP behandeling werd beoordeeld. PBW is een complexe geologische (industrieel / milieu) mengsel en zowel de National Institute of Environmental Health and Science (NIEHS) en het Agentschap voor de Toxic Substances en Disease Registry (ASTDR) worden de nadruk te leggen op het bestuderen van de toxiciteit van milieurelevante mengsels, met inbegrip van mengsels zoals zij bestaan ​​in de natuur of industriële omgevingen, alsmede het bevorderen van in vitro testen om chemicaliën voor verdere in vivo tests prioriteit17-19. Studies van chronische, lage dosis mengsel blootstellingen zijn uitdagend vanwege chronische blootstelling aan een lage dosis mengsel niet voor de hand liggende effecten, althans niet in het korte tijdsbestek van de meeste laboratoriumonderzoek. Evenzo meeste in vitro studies van chemische mengsels blootstellen cellen om een vaststaande lab gemaakt mengsel van 2 of meer metalen 20,21. Deze studies geven basisinformatie, maar vereenvoudigde mengsel niet repliceren het complex antagonistische en synergetische interacties die kunnen optreden in een native, milieu-monster, waarbij het volledige gamma van mengsel onderdelen aanwezig zijn.

De doelen van deze studie waren aan alternatieve werkwijzen voor het verwijderen van vuil PBW onderzoeken en het effect van (CuO-NP) behandeling op PBW cytotoxiciteit met gekweekte menselijke cellen te evalueren. De resultaten kunnen de uraniumindustrie baat hebben bij de ontwikkeling van efficiëntere en milieuvriendelijkere werkwijzen voor het verwijderen van vuil. Deze studie geefthet eerste bewijs dat vermindering van prioritaire contaminanten in PBW door CuO-NP verlaagt cytotoxiciteit in zoogdiercellen 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle monsters werden verzameld op het uranium vloeistof verwerken bouw van een uranium ISR faciliteit in Wyoming.

1. Productie Bleed Water (PBW)

  1. Verzamel twee soorten watermonsters uit een ISR uranium faciliteit: PBW en omgekeerde osmose (RO) water. Verzamel PBW uit een controle kraan na de ionenwisseling proces, maar voordat omgekeerde osmose ontsmetting. Verzamel RO monsters na de PBW wordt ontsmet door omgekeerde osmose behandeling.
    OPMERKING: Lixiviant wordt getransporteerd door pijpleidingen van meerdere pompputten om het uranium vloeistofverwerking gebouw, waar het in een kolom wordt opgevangen en voorbereid voor ionenuitwisseling. Ongeveer 1-3% van de lixiviant na ionenuitwisseling wordt verwijderd uit het circuit en genoemd productie bleed water (PBW). PBW wordt hergebruikt in de mijnbouw processen of gedecontamineerd / gedemineraliseerd met RO filtratie.
  2. Verzamel watermonsters in hoge dichtheid polyethyleen (HDPE) flessen met nul hoofd ruimte volgensstandaard operationele procedures voor monstername en analyse van de Wyoming Department of Environmental Quality (WYDEQ) 23.
  3. Meet de temperatuur en de pH op het terrein en het vervoer monsters op ijs om ze koel te houden.
  4. WINKEL PBW bij 4 ° C. Houd de PBW oplossing afkoelen tot na de geconcentreerde Eagle's minimaal essentieel medium (EMEM-10x) wordt toegevoegd tijdens de bereiding media zoals beschreven in het volgende protocol.
    OPMERKING: PBW is een geoxideerde oplossing die neerslaan als daaraan bevriezen of opgewarmd tot kamertemperatuur. Na verdunning PBW oplossing voldoende verdund dat het niet zal neerslaan bij verhitting tot 37 ° C voor de toevoeging aan de cellen en tijdens de incubatie.

2. Voorbereiding van de CuO Nanodeeltjes (CuO-NP)

  1. Combineer een zuivere ethanolische oplossing die 250 ml 0,2 M CuCl 2 • 2H 2 O, 250 ml 0,4 M natriumhydroxide (NaOH) en 5 g polyethyleenglycol (PEG) in een rondbodemkolf met zes mm borosilicaat glazen bollen.
  2. Plaats de oplossing in een gewijzigde magnetron oven blijven onder terugvloeikoeling reageren bij omgevings- luchtdruk gedurende 10 min bij 20% vermogen (intervallen van 6 seconden op, 24 seconden uit).
  3. Koel de oplossing tot kamertemperatuur (20 ° C) en vervolgens gedecanteerd in 50 ml conische buizen, waardoor de glazen bollen.
  4. Centrifugeer de oplossing in de 50 ml conische buizen bij 1000 xg gedurende 30 min, gedecanteerd, en vervolgens was de CuO-NPs met een sequentie van 300 ml warm water (60-65 ° C), 100 ml ethanol en 100 ml aceton.
  5. Droog het CuO-NPs op kamertemperatuur (20 ° C) in 50 ml conische buizen.
  6. Schraap de CuO-NP uit hun buizen in een vijzel. Bedek het CuO-NPs met aluminiumfolie en verwarm het CuO-NPs tot 110 ° C in een oven om de resterende vloeistof te verwijderen. Combineer CuO-NP's in een batch en wegen van de CuO-NP.
    LET OP: De voorbereiding van de CuO-NP en CuO-NP behandeling van PBW werden uitgevoerd in Water Qualteit Laboratorium Ecosystem Science en Management, Universiteit van Wyoming. CuO-NP synthese volgde de procedure van Martinson en Reddy (2009) 11.

3. Behandeling van PBW met CuO-NP

  1. Voeg 50 mg (1 mg / ml) van CuO-NP naar een 50 ml conische buis, gevolgd door 50 ml PBW. Sluit de buis en reageerde gedurende 30 minuten op een bankje top orbitale schudder bij 250 rpm.
  2. Centrifugeer monsterbuizen bij 250 xg gedurende 30 minuten en filtreer de supernatant onder toepassing van een 0,45 urn spuitfilter. Verander de centrifuge snelheid en tijd kan afhangen van de nanodeeltjes te zorgen CuO-NPs worden compact in de centrifugebuis.

4. Elementenanalyse

  1. Bereid Onbehandelde (controle) en CuO-NP behandelde PBW monsters voor elementaire analyse als volgt.
  2. Zuur aliquots (40 ml) CuO-NP-behandelde en onbehandelde PBW met sporenmetalen rang salpeterzuur tot een pH van 2,0. Analyseer aangezuurd PBW porties voor kationen door inductief coupled plasma-massaspectroscopie (ICP-MS) zoals beschreven in Reddy en Roth (2012) 13.
  3. Bereid unacidified aliquots (20 ml) CuO-NP-behandelde en onbehandelde PBW en analyseren unacidified aliquots van anionen door ionenchromatografie (IC) volgens Reddy en Roth (2012) 13.
    OPMERKING: Monsters werden geanalyseerd door de Wyoming Department of Agriculture Analytical Services, Laramie WY 82070. Een beschrijving van de IC en ICPMS procedure kan worden gevonden in Reddy en Roth, (2012) 13.

5. Bereiding van Cell Culture Media gebruiken PBW

  1. Gebruik twee control (EMEM-1x en RO + media) en acht PBW-test media-oplossingen (vier concentraties van elk van onbehandelde PBW en CuO-NP-behandelde media) in de haalbaarheidsstudies. Overzicht van de oplossing zijn als volgt:
    1. Voor EMEM-1x control, kopen Eagle's minimaal essentieel medium (EMEM-1x) met L-glutamine en natriumbicarbonaat al toegevoegd. Voeg foetaal runderserum (FBS) En antibiotica instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: EMEM-1x verdund aangekocht om de juiste concentratie voor celgroei en bevattende L-glutamine en natriumbicarbonaat. EMEM-1x vereist de toevoeging van foetaal runderserum (FBS) en een antibioticum mix van penicilline en streptomycine (50 IU / ml penicilline en 50 gg / ml streptomycine). EMEM-1x wordt gebruikt als controle media, omdat het door de fabrikant aanbevolen groeimedia beide celtypen die in deze studie. Geconcentreerde EMEM-10x wordt met RO water verdund uit de voorziening of onbehandeld of CuO-NP-behandelde PBW aan de testoplossingen te produceren. Geconcentreerde EMEM-10x bij aankoop niet L-glutamine en natriumbicarbonaat dus deze worden toegevoegd in aanvulling op de foetaal runderserum (FBS) en een antibioticum combinatie van penicilline en streptomycine bevat.
    2. Voor de RO controle-oplossing gebruiken RO water verzameld uit de ISR-faciliteit. Gebruik hetzelfde protocol als de PBW-test media slechts vervangen 100% RO water uit de ISR-faciliteit in de plaats van PBW. Om de onbehandelde en CuO-NP-behandelde oplossing gebruiken RO of ultrazuiver water verdund uit het laboratorium.
    3. Verdunnen onbehandeld PBW in vier testconcentraties voor het mengen met de celkweek media componenten. Bereid de vier verschillende concentraties van onbehandelde PBW oplossingen door menging onbehandelde PBW RO (uit het laboratorium) in de volgende combinaties: 100% (zuiver PBW + zonder RO water), 75% (187,5 ml PBW + 62,5 ml RO water), 50% (125 ml PBW + 125 ml RO water) of 25% (62,5 ml van PBW + 187,5 ml RO water).
    4. Verdun CuO-NP-behandelde PBW in vier testconcentraties voor het mengen met de celkweek media componenten. Bereid de vier verschillende concentraties van CuO-NP behandelde PBW oplossingen door mengen PBW (voorbehandeld met 1 mg / ml NP-CuO gedurende 30 min) met RO (uit het laboratorium) in de volgende combinaties: 100% (zuiver CuO- NP-behandelde PBW + geen RO water), 75% (187,5 ml CuO-NP-behandelde PBW + 62,5 ml RO water), 50% (125ml CuO-NP-behandelde PBW + 125 ml RO water) of 25% (62,5 ml CuO-NP-behandelde PBW + 187,5 ml RO water).
  2. Bereid 250 ml RO + media, onbehandelde PBW + media en CuO-NP-behandelde PBW + mediaconcentratie door toevoeging 25 ml geconcentreerd EMEM-10x tot 190 ml van de 100% RO en 100%, 75%, 50% of 25% van de premade onbehandeld of CuO-NP-behandelde PBW concentraties aangemaakt in stap 6.1.3 en 6.1.4.
  3. Stel de pH van elke oplossing op 7,4 met NaOH of HCl.
  4. Supplement elke concentratie van onbehandelde en CuO-NP behandelde PBW en RO + medium met de volgende standaard componenten: 25 ml (10%) foetaal runderserum (FBS), 2,5 ml L-glutamine, 0,55 g NaHCO 3 en 1,25 ml Pen / Strep (50 IU / ml penicilline en 50 gg / ml streptomycine).
  5. Pas de osmolaliteit van elke concentratie van onbehandelde PBW + media, CuO-NP-behandelde PBW + media en RO + media om 290-310 mOsm / kg door het toevoegen van RO water en meten met behulp van een osmometer.
  6. Filter elke oplossing met behulpeen 0,22 urn vacuüm filtereenheid en bewaar bij 4 ° C.
    LET OP: Door de lichte variaties in de hoeveelheid RO water gebruikt om de osmolaliteit aan te passen, verschillen laatste media concentraties binnen een bereik van 5%, met onbehandelde PBW + media concentraties op 56%, 44%, 29% en 16,5% en CuO-NP- behandelde PBW + media concentraties op 53%, 45%, 30% en 17%.

6. Cel levensvatbaarheid

NB: Gezien het feit dat de nieren en de lever zijn doelwit organen van zware metalen toxiciteit, in dienst gekweekte humane embryonale nier (HEK293) cellen (HEK) en menselijke hepatocellulaire carcinoom (HepG2) cellen (HEP) testmethoden 24-26.

  1. Bereid een kweek van HEK en HEP ​​cellen 2-3 dagen voor het uitplaten van de 96-well platen in het experiment gebruikte instructies van de fabrikant.
  2. Meet cellevensvatbaarheid met de 3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] -2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) bepaling.
    OPMERKING: De MTT-test protocol werd gewijzigd van Meerloo et al. (2011) 27.
    1. Verkrijgen van MTT in poedervorm. Voeg fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om een ​​voorraad concentratie van 50 mg / ml. Schud de oplossing voor 2 uur en vervolgens filteren met een 0,45 pm spuitfilter en aliquot in 1,5 ml vriezer veilig buizen. Bescherm buizen van licht en bewaar bij 4 ° C.
  3. Verwijder HEK en HEP ​​cellen uit hun cultuur gerechten met trypsine, centrifuge bij 1000 xg gedurende 5 minuten en giet de trypsine. Voeg 5 ml PBS en meng cellen om een ​​enkele cel oplossing te verkrijgen. Breng daarna 20 ul van de cel oplossing voor een hemocytometer een celgetal per milliliter oplossing te verkrijgen. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 1000 g gedurende 5 minuten en decanteer de PBS wordt gebruikt om de cellen te spoelen. Voeg de juiste hoeveelheid EMEM-1x tot de concentratie van cellen aanpassen aan 500 cellen / 100 ul (100 gl / putje).
  4. Vul de omtrek putjes van de plaat met 200 pl PBS te controleren voor verdamping.
  5. Zaad cels bij een dichtheid van 500 cellen / putje toevoegen van 100 pi aan elk putje, behalve de omtrek wells (die niet zijn bedekt met cellen).
    OPMERKING: Seeding dichtheid voor HEK en HEP ​​cellen is gebaseerd op experimentele groeicurves die het mogelijk maken de piek van de groei voor te komen rond 4-5 dagen. Bereid groeicurven voor alle cellijnen te schatten zaaidichtheid.
  6. Incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C zodat ze (formulier strak verklevingen aan de plaat) herstellen voordat basislijn MTT metingen van celdichtheid.
  7. Voer basislijn MTT metingen van celdichtheid door verwijdering van de uitplaatmedium uit de eerste kolom (exclusief de perimeter) en het toevoegen van 100 pl MTT (5 mg / ml in medium) aan de wells gedurende 1 uur.
  8. Na één uur, verwijder de MTT en voeg 100 pl dimethylsulfoxide (DMSO) aan de MTT-formazan geproduceerd door levende cellen (20 min) los.
  9. Lees de optische dichtheid (OD) van de eerste kolom bij een absorptie- golflengte van 570 nm aan een basis te verkrijgenlijn lezen.
    1. Gebruik basislijn lezingen te zorgen dat alle platen werden juist gezaaid en dat cellen worden constant groeit tussen de platen. Verwijder de DMSO uit de kolom wordt getest voordat incubatie de volgende 24 uur.
      OPMERKING: Indien DMSO achterblijft in de plaat overnacht trekt vocht uit de aangrenzende kolom, waardoor een vermindering van het volume media.
  10. Warm de testoplossingen (dwz de EMEM-1x, RO, onbehandelde PBW en CuO-NP-behandelde PBW media-oplossingen) tot 37 ° C in een waterbad.
  11. Verwijder het uitplaatmedium van de rest van de plaat (exclusief de omtrek of de eerste kolom die werd gebruikt voor de nulmeting) en vervangen door 100 gl EMEM-1x, RO + media, onbehandelde PBW + media concentraties of CuO-NP behandelde PBW + mediaconcentraties (één oplossing per plaat). Incubeer cellen in hun testconcentraties of controleoplossingen in totaal zeven dagen (dagen 2-8).
    OPMERKING: er 10 borden totaal: 1 EMEM-1x, 1 RO + media, 1 van elke onbehandelde PBW + concentratie in de media (56%, 44%, 29% en 16,5%) en een plaat van elke CuO-NP-behandelde PBW + concentratie in de media (53%, 45% , 30% en 17%) per experiment per cellijn.
  12. Elke dag na de baseline MTT lezen, verwijder de controle en testoplossingen (in de nota vermeld onder 6.11) van de volgende kolom van de respectieve plaat (bijvoorbeeld Dag 2-test en controle media worden verwijderd uit rij 3, putten BG; Dag 3: rij 4, putten BG etc.) en herhaal de MTT-protocol, zoals beschreven in de stappen 6,7-6,9 boven.
  13. Herhaal het protocol dagelijks gedurende zeven dagen. Het gemiddelde van de OD resultaten voor elke rij (6 putten) en gerapporteerd tegen de klok om een ​​zevendaagse groeicurve te genereren.
  14. Om het effect van koper chelatie op cellevensvatbaarheid te bepalen CuO-NP-behandelde PBW + media volgens dezelfde procedure als hierboven, behalve voeg 100 pM D-penicillamine controle en testoplossingen vóór toevoegen van de oplossingen voor hun respectieve matrijzen. Voer data analelyse met behulp van wetenschappelijke grafische software.

7. Geochemische Modeling

  1. Download Visual Minteq versie 3.0 / 3.1 een freeware van de volgende website http://www2.lwr.kth.se/English/Oursoftware/vminteq/ .
    OPMERKING: Visual Minteq is een freeware chemisch evenwicht model voor de berekening van de metalen soortvorming, oplosbaarheid evenwichten, adsorptie etc. voor natuurlijke wateren. Bovendien wordt het gebruikt om ion speciatie, ion activiteiten ioncomplexen en verzadiging indexen die wordt vergeleken met de concentratie van de elementen voor en na behandeling (massa spectroscopie) na te gaan welke van element 28 verwijdering onderzoeken voorspellen.
  2. Open het programma en voer het massaspectroscopie gegevens uit stap 4, waaronder pH, alkaliteit en de concentraties van de verschillende elementen, in het programma.
    NB: Gezien het feit dat grondwater wordt geoxideerd tijdens de in situ Uranium extractieproces gebruikt geoxideerde species van arseen, vanadium en uranium voor invoer.

8. remmende concentratie 50 (IC 50)

  1. Bereken de IC 50 voor de onbehandelde en CuO-NP-behandelde PBW + mediaconcentraties door eerst de levensvatbaarheid (gemiddelde OD) op dag 5 van drie afzonderlijke runs gemiddeld.
  2. Aftrekken dag vijf levensvatbaarheid gemiddelden van de onbehandelde en CuO-NP-behandelde PBW + media concentraties van dag vijf levensvatbaarheid gemiddelden van EMEM-1x om de levensvatbaarheid van de verschillen te berekenen. Verdeel dan de levensvatbaarheid verschillen met de gemiddelde levensvatbaarheid op dag 5 in EMEM, en vermenigvuldig met 100 procent remming te krijgen.
  3. Trek de remming procent ten opzichte van 100 (EMEM-1x levensvatbaarheid) om de levensvatbaarheid procent voor elke onbehandelde en CuO-NP-behandelde PBW + mediaconcentratie te krijgen.
  4. Inbreng in wetenschappelijke grafische software door EMEM-1x in een concentratie van een en een levensvatbaarheid van 100 procent; transformeren alle concentraties in logschaal (X = log (x)) en voer lineaire regressie met de minste kwadraten analyse.

9. Data Analyse

  1. Vergelijken concentraties van elementen in onbehandelde en CuO-NP-behandelde PBW met een tweezijdige, gepaarde, Student t-toets.
  2. Bereken de oppervlakken onder de curve (AUC) met de groeicurve data zeven dagen verzameld en de variantie met herhaalde metingen variantieanalyse (ANOVA) analyse, gevolgd door Tukey post hoc vergelijking van alle groepen (n = 3).
  3. Bereken de IC 50 met behulp van gegevens van dag vijf van de groeicurve voor zowel onbehandelde en CuO-NP-behandelde PBW + media oplossingen (hierboven beschreven). P waarden <0,05 worden beschouwd als significant.
    OPMERKING: Ten behoeve van statistische analyse, massaspectroscopie waarden van de halve detectielimiet toegevoegd aan ionen-concentraties beneden die grens 29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PBW concentraties component en pH in onbehandelde en CuO-NP-behandelde PBW zijn weergegeven in tabel 1. Martinson en Reddy (2009) rapporteerde dat de ladingsnulpunt het CuO-NP wordt geschat op 9,4 ± 0,4. Aangezien de pH van PBW was 7,2-7,4, in deze omstandigheden, water schenkt protonen CuO-NPs, waardoor de nanodeeltjes oppervlak positief worden opgeladen waardoor de adsorptie van negatief geladen species. CuO-NP behandeling verwijderd prioriteit verontreinigingen uit PBW, zoals arsenicum, selenium, uranium en vanadium (Tabel 1). De gemiddelde arseen concentratie werd verlaagd met 87% [0,0175-0,002 mg / L (tweezijdige gepaarde t-test, p <0,0001)]. CuO-NP behandeling verminderde eveneens significant selenium (30%), uranium (78%), vanadium (92%) en fosfaat (85%) (p <0,05).

Speciation modelresultaten weergegeven in tabel 2, ondersteunt de analyseresultaten: 99% aan teTal opgelost arseen in PBW is aanwezig als haso 4 2- en H 2 AsO 4 - en 94% van de totale opgeloste selenium in PBW aanwezig als SEO 4 2 is. Deze soorten zijn negatief geladen en dus kunnen adsorberen aan CuO-NPs. Soortvorming modellering voorspelde dat 99% van vanadium soorten in PBW negatief geladen zijn, ook het bevorderen van adsorptie aan CuO-NP. Echter, speciatie modellering voorspelde slechts 35,5% van het uranium soorten negatief geladen, die adsorptie aan CuO-NPs zou beperken. Analyse van verzadiging indices voorspelde dat er geen soort van arseen, seleenhoudende, uranium- of vanadium bevatten mineralen waren in de buurt verzadiging (dwz minerale neerslag) niveaus, het ondersteunen van adsorptie aan CuO-NP, versus neerslag.

Om te beoordelen of verwachte concentraties van prioritaire verontreinigende stoffen in de media gemaakt van onbehandeld en CuO-NP-behandelde PBW, monsters van onverdunde controle media (EMEM-1x), 56%onbehandelde PBW + media en 53% CuO-NP-behandelde PBW + media werden geanalyseerd met ICP-MS. Onverdunde controlemedia (EMEM-1x) is met L-glutamine en natriumbicarbonaat geleverde handelsprodukt (pre-added). Koper en selenium concentraties control EMEM-1x waren enigszins verhoogd zoals verwacht omdat ze essentieel voor celgroei, maar arseen, uranium en vanadium verwaarloosbaar, vermeld in tabel 3. Voorlopige studies toonden aan dat, arsenicum, selenium en vanadium concentraties verlaagd met CuO-NP behandeling en dat de daling is vertegenwoordigd in de concentraties in het CuO-NP-behandelde PBW + media. De gemeten concentratie van uranium in de CuO-NP-behandelde PBW + media was gedaald ten opzichte van onbehandelde PBW, en deze daling was meer uitgesproken dan voorspeld door Visual Mintec v.3 modellering. Koper niveaus steeg in CuO-NP-behandelde media zoals verwacht.

Om het vermogen van CuO-NP behandeling cytotoxiciteit verbeteren van PBW voor zoogdieren bepalencellen, levensvatbaarheid werd in cellen blootgesteld aan oplossingen PBW + media voor en na CuO-NP behandeling. Zowel HEK (figuur 1A) en HEP (Figuur 1B) cellen werden blootgesteld aan verschillende concentraties van onbehandeld of behandeld PBW + media tot zeven dagen. In cellen die in onbehandelde PBW + media, werd de levensvatbaarheid geremd in een concentratie-afhankelijke manier, terwijl CuO-NP behandeling verbeterde cellulaire levensvatbaarheid in beide cellijnen. De geïntegreerde AUC in figuur 1C dat HEK cellen gekweekt in CuO-NP-behandelde PBW + media rendabeler werden vergeleken met onbehandelde PBW + media aan de drie hoogste concentratie (29%, 44% en 56%). HEP cellen toonde iets andere levensvatbaarheid: alleen de twee hoogste concentraties van onbehandelde PBW + media (44% en 56%) vertoonden een verminderde levensvatbaarheid in vergelijking met CuO-NP-behandelde PBW + media (figuur 1D). De meer verdunde concentratie PBW waren minder toxisch voor HEP cellen en levensvatbaarheid van de cellen minder beïnvloed door de behandeling. Delevensvatbaarheid van zowel HEK en HEP cellen gekweekt in 16,5% onbehandelde PBW + media was niet significant verschillend van cellen gekweekt in 53% CuO-NP-behandelde PBW + (p <0,05). Zo CuO-NP behandeling bleek de cytotoxiciteit van PBW te verbeteren, waarbij de levensvatbaarheid in de buurt van controle niveaus. Zoals hierboven besproken, is CuO-NP behandeling van PBW gepaard met een toename koperconcentraties. De groei werd verwacht op basis van eerdere resultaten door Reddy en Roth (2012), waarin ze gebruikt CuO-NPs arseen uit grondwater te verwijderen. De toename koper afhankelijk van de specifieke watersamenstelling PBW, maar bleef onder EPA MCL van 1,3 mg / l. Het was echter belangrijk om uit te sluiten dat de toename koperconcentraties bijgedragen tot verbeterde levensvatbaarheid (bijvoorbeeld, naast of in plaats van, de afname prioriteit verontreinigingen). Daarom werd het koper chelator D-penicillamine toegevoegd aan EMEM-1x control, RO + media controle, onbehandelde en CuO-NP-behandelde PBW + media-oplossingen, en then MTT levensvatbaarheid groeicurve werden gegenereerd zoals hierboven beschreven. Copper chelatie niet significant aantasten levensvatbaarheid van zowel HEK of HEP cellen geïncubeerd in RO + media controle, onbehandelde en CuO-NP-behandelde PBW + media (resultaten niet getoond).

De half-maximale remmende concentratie (IC50) werd berekend vanaf dag vijf groei van HEK en HEP cellen gekweekt in onbehandelde PBW + media (Tabel 4A) en CuO-NP-behandelde PBW + media (tabel 4B). Voor HEK cellen gekweekt in onbehandelde PBW + media, de IC 50 waarde was 1,264 (log% PBW). Zo zou het onbehandelde PBW + media worden verdund tot 18,38% van een 50% afname in levensvatbaarheid te komen. Voor HEK cellen gekweekt in CuO-NP-behandelde PBW + media, de IC 50 waarde was 2,744 (log% PBW). Dit resultaat suggereert dat in theorie de cytotoxiciteit van de oplossing werd verlaagd in zoverre behandelde PBW + media zouden moeten worden geconcentreerd door 500% (log% PBW = 2,744) tot eenzelfde 50% de te producerenvouw in levensvatbaarheid. Voor HEP cellen gekweekt in onbehandelde PBW + media, de IC 50 was 1,243 (log% PBW). Dit zou een verdunning van de PBW + media vereisen 17,5% tot een 50% afname in levensvatbaarheid produceren. In tegenstelling tot HEP cellen gekweekt in CuO-NP-behandelde PBW + media, de IC 50 was 5,327 (log% PBW). Deze waarde waarschijnlijk zo groot, omdat de levensvatbaarheid van de cellen in CuO-NP-behandelde PBW + media was niet significant verschillend van cellen gekweekt in EMEM-1x (control). Helderveld beeldvorming geïllustreerd in figuur 2, zowel HEK en HEP celgroei op dag vijf. Cell nummer en gehechtheid in de CuO-NP-behandelde PBW + media (figuur 2E, F) werden verbeterd in vergelijking met onbehandelde PBW + media (figuur 2C, D).

Figuur 1
Figuur 1: Groei Curves. Groeicurven werden gebruikt om de levensvatbaarheid en G beoordelenGROEI van de culturen gedurende de behandeling. Groeicurven voor HEK (A) en HEP (B) cellen die in vier verdunningen van PBW + media tegenover 53% CuO-NP-behandelde PBW + medium (bovenste panelen). EMEM-1x controle (EMEM) , RO , 53% CuO-NP-behandelde , 16,5% onbehandeld PBW , 29% onbehandelde PBW , 44% onbehandelde PBW , 56% onbehandelde PBW . Oppervlakte onder de curve (AUC) analyse van HEK (C) en HEP ​​(D) 7 dagen groeicurve data (onderste panelen). * P <0,05 vergeleken met controle EMEM, #p <0,05 vergeleken met controle RO, §p <0,05 vergeleken met 53% CuO NP-behandelde PBW-media. (Vergeleken met behulp van een tweezijdige ANOVA metTukey's post hoc analyse, n = 3)

Figuur 2
Figuur 2:. Celmorfologie before and after CuO-NP behandeling helderveld microscopie (20X) van HEK (linker kolom) en HEP (rechterkant) cellen op dag 5, gekweekt: EMEM-1x control (EMEM) (A, B ), 56% onbehandelde PBW + media (C, D) en 53% CuO-NP-behandelde PBW + media (E, F) werd gebruikt om celmorfologie te onderzoeken. HEK en HEP cellen gekweekt in EMEM-1x control (EMEM) (A, B) tonen gezonde, bijna confluente groei. HEK en HEP cellen gekweekt in onbehandelde PBW + media nummers verlaagd verschijnen los (C, D). HEK en HEP cellen gekweekt in CuO-NP-behandelde PBW + media tonen betere hechting en gezond, meer samenvloeiende cellen (E F).

Element (mg / l) Gemiddeld, St. Dev. & Betekenis
Voor de behandeling Na de behandeling
Arsenicum 0.018 ± 0.001 0.002 ± 0.0 ***
Selenium 1,8 ± 0,07 1,3 ± 0,05 **
Koperen 0,0015 ± 0.001 0,93 ± 0,43 *
Calcium 102 ± 82 106 ± 15
Strontium 3.3 ± 1.1 1,5 ± 0,4 *
Magnesium 44 ± 2.1 47 ± 1.7
Natrium 610 ±; 0.0 627 ± 27
Uranium 0.98 ± 0.03 0.21 ± 0.03 ***
Barium 0,037 ± 0.02 0,019 ± 0,01
Kalium 12 ± 0.0 12 ± 0,8
Silicium 12 ± 0,7 12 ± 0,5
Vanadium 1,3 ± 0,07 0,1 ± 0,02 ***
Fosfaat 0,35 ± 0,07 0,05 ± 0.0 ***
Sulfaat 805 ± 21 807 ± 15
Geleidingsvermogen 3125 ± 143 3190 ± 62
pH 7.31 ± 0.09 7.36 ± 0.05

Tabel 1:. Analyse van kationen en anionen voor en na CuO-NP behandeling Gemiddelde elementconcentraties voor en na behandeling met een CuO-NP. Significantie tussen de concentratie van CuO-NP-behandelde en onbehandelde PBW worden aangeduid als * = p <0,05, ** = p <0,01 en *** = p <0,001. Een lege cel geeft geen significant verschil. Chloride concentraties varieerden tussen 46,5 ± 0.707 en 55.25 ± 8.180. Aluminium, borium, en molybdeen concentraties laag waren en toonde geen significante verandering te wijten aan CuO-NP behandeling. Mangaan concentraties waren niet consistent.

Componenten % Van de totale concentratie Species
Arsenicum 58.7 Haso 4 2-
41.2 H 2 AsO 4 -
Uranium 64.1 Ca 2 UO 2 (CO 3) 3 (aq)
32.2 CaUO 2 (CO 3) 3 2-
0.03 UO 2 (CO 3) 2 2-
3,5 UO 2 (CO 3) 3 4
0.09 Ca 2 UO 2 (CO 3) 3 (aq)
0.02 CaUO 2 (CO 3) 3 2-
Selenium 94.3 SeO 4 2-
5.6 Caseo 4 (aq)
Vanadium 2.1 HVO 4 2-
95.7 H 2 VO 4
2.1 H 2 V 2 O 7 2-
0.01 HV 2 O 7 3-
0.01 V 4 O 12 4-

Tabel 2: Soorten modelleren met Visual Minteq ver. 3.0 software. Visual Minteq ver. 3,0 software (KTH Royal Institute of Technology, Valhallavägen, Zweden) werd gebruikt voor metaalspeciatie PBW componenten in Tabel 1 opgesomde berekenen. (Aq) = waterige tegenstelling tot de vaste vorm van die soort.

EMEM Controle Onbehandeld
PBW PBW + media
Arsenicum 0,003 ± 0.0 0.017 ± 0.0 0.010 ± 0.001
Koperen 0.01 ± 0.0 0,0015 ± 0.001 0,018 ± 0.0
Selinium 0,013 ± 0,002 1.75 ± 0.07 1.15 ± 0.06
Uranium 0,00015 ± 0.0 0.975 ± 0.03 0.71 ± 0.01
Vanadium 0,0015 ± 0.0 1.25 ± 0.07 0,785 ± 0,007
CuO NP-behandeld
PBW PBW + media
Arsenicum 0,0022 ± 0.001 0,0015 ± 0.0
Koperen 0.926 ± 0.4 0,81 ± 0.0
Selinium 1.25 ± 0.05 0,855 ± 0.0.02
Uranium 0,208 ± 0,03 0.45 ± 0.01
Vanadium 0,102 ± 0.02 0,0795 ± 0.01

Tabel 3:. Concentraties van contaminanten in media concentraties van prioritaire contaminanten (mg / l) in EMEM-1x control (EMEM), onbehandelde PBW, CuO-NP-behandelde PBW onbehandeld PBW + media en CuO-NP-behandelde PBW + media na toevoeging mediacomponenten (n = 3) werden beoordeeld op veranderingen in contaminant concentratie als gevolg behandeling waarborgen onbehandelde PBW + media en vertegenwoordigd CuO-NP-behandelde PBW + media toegepast CELls.

Een Onbehandelde PBW + Media
Concentraties van Onbehandelde PBW (log X) % Levensvatbaarheid (HEK-cellen) % Levensvatbaarheid (HEP cellen)
EMEM 100 100
16,5% (1,217) 51.4 50.8
29% (1,462) 39 33.3
44% (1.643) 19.3 14.7
56% (1.748) 14.5 9.4
IC 50 Inloggen [PBW] 1.264 1.243
B CuO-NP-behandelde PBW + Media
Concentraties van CuO-NP-behandelde PBW (log X) % Levensvatbaarheid (HEK-cellen) % Levensvatbaarheid (HEP cellen)
EMEM 100 100
17% (1,230) 86,7 119,8
30% (1,477) 75.8 86,7
45% (1.653) 81 92.4
53% (1.724) 70.3 97.5
IC 50 Inloggen [PBW] 2,744 5,327

Tabel 4: Berekening van IC 50. De IC 50 geeft de concentratie van onbehandelde PBW + media of CuO-NP-behandelde PBW + media die nodig is voor een remming van 50% levensvatbaarheid.   De levensvatbaarheid procent op dag 5 van HEK en HEP cellen blootgesteld aan verdunningen van onbehandelde PBW Media + (A) of CuO-NP-behandelde PBW Media + (B) werden gebruikt om de halfmaximale remmende concentratie (IC 50) te berekenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eerdere studies gemeld dat CuO-NP verwijderd arseen uit grondwater 11,13,30,31. Dit onderzoek ondersteunt deze eerdere bevindingen en ook berichten dat CuO-NP verwijderen extra verontreinigingen uit PBW. Deze studie bevestigt ook eerdere rapporten dat CuO-NPs zijn effectief in de verwijdering van arseen, ondanks de aanwezigheid van andere verontreinigingen en mogelijke concurrerende ionen 11. Soortvorming modellering voorspelde dat 97% van vanadium soorten in PBW negatief geladen zijn, waardoor adsorptie aan CuO-NP, en batch behandeling verwijderd 92% van vanadium.

Dit is de eerste studie die het effect van het verwijderen van specifieke verontreinigingen uit PBW gebruik CuO-NP onderzoeken, en de veranderingen in cytotoxiciteit geassocieerd met de verwijdering beoordelen. De resultaten tonen aan dat het onderzoeken van de veranderingen in cytotoxiciteit van complexe mengsels met een in vitro benadering mogelijk is, maar deze werkwijzen zijn niet zonder beperkingen. PBW kon niet worden gebruikt full kracht op de cellen, omdat overleven, gekweekte cellen vereist een gedefinieerd kweekmedium en specifieke osmolaliteit. PBW + media kan ook niet gebruikt worden op de cellen zonder aanpassing van de pH. De pH van de PBW was 7,31 en 7,36 voor na de behandeling nochtans; het toevoegen van groeimedium componenten verlaagd de pH tot ongeveer 6,8, afhankelijk van de verdunning. PH instelling is een normale stap in de bereiding van celkweekmedium nochtans; de pH van de PBW + media kan de moleculaire interacties van het element soorten met mediumbestanddelen veranderd. Onbehandelde en CuO-NP-behandelde PBW werden gecombineerd met geconcentreerd EMEM-10X groeimedia in verschillende verhoudingen aan de testoplossingen (PBW + media) te verkrijgen. ICP-MS analyse werd uitgevoerd op testmedia te controleren of de metaalconcentraties significant beïnvloed door CuO-NP-behandeling (arsenicum, koper, selenium, uranium, vanadium) waren verwachte concentraties na verdunning van media componenten en osmolaliteit instellen. De dalingarseen, seleen, en vanadium na CuO-NP-behandeling wordt op de concentratieverschillen tussen onbehandelde PBW + media en CuO-NP-behandelde PBW + media. Uranium concentraties zijn hoger in de CuO-NP-behandelde PBW + media dan voorspeld. ICP-MS (tabel 1) suggereert dat meer uranium werd verwijderd uit PBW tijdens CuO-NP behandeld dan voorspeld door modellering. Speciatie modellering (Tabel 2) voorspelde dat bij pH 7,3, slechts 35,5% van de soorten uranium zijn negatief geladen. Het model voorspelt dat de belangrijkste soorten uranium, calcium carbonaat uranyl (Ca 2 UO 2 (CO 3) 3), is neutraal.

De waargenomen 78% verwijdering van uranium waarschijnlijk door een combinatie van uranium adsorptie en precipitatie (als calciumcarbonaat uranyl carbonaat mineraal). Op basis van de geochemische modellering, het percentage uranium verwijderd door adsorptie lager dan berekend waardoor een hogere concentratie in het CuO-NPbehandelde PBW + media. Het mechanisme van uranium verwijdering door CuO-NP-behandeling is onduidelijk en vereist nader onderzoek. Een verhoging van de concentratie calcium, kalium en magnesium werd verwacht toen PBW werd toegevoegd aan EMEM-10x echter; CuO-NP-behandeling geen belangrijke verandering in deze cellen niet produceren dus geen verschil waargenomen in onbehandelde vs. CuO-NP-behandelde PBW + media. De techniek van het combineren van de werkelijke milieu met media-onderdelen was succesvol in het vertegenwoordigen van de veranderingen te zien in element concentraties gevolg van de behandeling; maar de geoxideerde aard PBW beperkte wijze PBW + media konden worden. In een poging de maximale concentratie van de elementen in testmedium verhogen, werd gepoederd celkweekmedium aanvankelijk gemengd met onbehandelde en CuO-NP behandelde PBW naar PBW + media. De poedervormige media vaak resulteerde in de neerslag van calcium zouten en het verhoogde de osmolaliteit van de PBW + media die een grotere verdunning met RO water nodig, het produceren van concentraties dicht bij die verkregen met vloeibare 10x media. Deze problemen zijn het meest waarschijnlijk PBW-specifiek vanwege de oxidatieve toestand en kan een probleem met andere, minder gevoelige mengsels niet.

De MTT-assay werd gekozen om de cytotoxiciteit te beoordelen, omdat het een erkende standaard high-throughput assay die de algemene gezondheid van de cellen onderzocht door meten van mitochondriale activiteit. Deze werkwijze heeft voordelen en nadelen. De 96-well formaat geschikt voor het verkrijgen van meerdere gegevenspunten nochtans; de meerderheid van de cellen op dag 5 ongezond kijken, rond en niet meer gekoppeld aan de plaat. De foto in Figuur 2 werden genomen voordat het medium werd verwijderd met een vacuüm; afzuigen van de media, en dan het toevoegen van de MTT-oplossing kan losse cellen hebt verwijderd of losgemaakt slecht hechtende cellen, die bijdragen aan de algehele plateau van de MTT signaal na dag Twee gezien met onbehandelde PBW. De veronderstelling is dat de drijvende cellen zijn dode of stervende en only de aangehechte cellen vastgesteld met deze methode. Het is ook belangrijk om de beperkingen van de MTT assay overweging met betrekking tot studies met nanodeeltjes.

Eerdere studies hebben gemeld dat, wanneer het rechtstreeks op gekweekte cellen kunnen nanodeeltjes inherente toxiciteit hebben dan hun basis chemische eigenschappen, afhankelijk van hun unieke fysische eigenschappen zoals grootte en vorm 32,33. In deze huidige studie, hebben we niet direct op de CuO-NP op de cellen. In plaats daarvan werden de cellen blootgesteld aan PBW die eerder waren behandeld met CuO-NP, gecentrifugeerd om het merendeel van het CuO-NPs te verwijderen en daarna tweemaal gefiltreerd meer CuO-NPs verwijderen voordat PBW gebruikt om PBW + media bereiden. De MS resultaten toonden een toename van koper na behandeling. Dit kan koperionen dat de nanodeeltjes tijdens de bewerking of CuO-NPs die zijn gepasseerd het centrifugeren / filtreren stappen werden in de behandelde PBW U blijvensed op de PBW + media. CuO-NPs in grootte 12-18 nm met BET gemeten specifiek oppervlak van 85 ± 1 m 2 / g 11 maar zijn bekend te aggregeren en gebaseerd op de minimale verhoging van de koperconcentraties in de behandelde PBW meeste koper ongeacht van de bron verwijderd na centrifugeren en filtratie. Visuele bevestiging van een betere gezondheid van de cellen samenvloeiing en ondersteunen de MTT assay resultaten van verbeterde levensvatbaarheid als gevolg van CuO-NP behandeling PBW (figuur 2). Toekomstige studies met andere methoden kunnen evalueren (of karakteriseren) soortgelijke verstorende effecten veroorzaakt door CuO-NP.

Humane embryonale nier (HEK 293) en Human Hepatocellulair carcinoom (HEP G2) cellen werden gekozen voor de toxiciteit. Dit zijn een standaard cellijnen die klinisch relevant heavy metal orgaantoxiciteit 24,25,34-40 zijn. Een lage zaaidichtheid werd gebruikt voor de MTT assays. Cellen werden gezaaid met 500 cellen / putje, men herstellenvoor 24 uur en vervolgens blootgesteld aan de testmedia. De lage zaaidichtheid moest een groeicurve met een log-fase rond dag 5 bereiken, alvorens over-confluent en stationair op dag 6 of 7 Chakraborty et al. (2010) dat in een onderzoek cadmiumtoxiciteit op gekweekte nieren proximale tubuluscellen (PTC), confluentie en status proliferatie (prolifererende versus latente) van invloed op de respons op blootstelling aan cadmium: sub-confluent delende cellen toonde meer cytotoxiciteit dan samenvloeiing (latente) cellen. HEP en HEK cellen blootgesteld aan PBW een hogere concentraties (hoger confluentie) vergelijkbaar met die van andere assay (resultaten niet getoond) heeft geen ingrijpende wijzigingen in de morfologie gezien met de MTT assay tonen. Nader onderzoek naar veranderingen in cytotoxiciteit met behulp van niet-hechtende cellijnen of protocollen die oogsten en verzamel alle cellen (bijvoorbeeld stromingscytometrie) nodig.

Een andere beperking van de MTT werkwijze studies onsing nanodeeltjes is dat sommige soorten nanodeeltjes kunnen interfereren met cellulaire voeding. Celkweek media bevatten gewoonlijk toegevoegd eiwitbronnen, zoals foetaal runderserum (FBS), om celgroei aan te vullen. Studies hebben aangetoond dat metaaloxide nanodeeltjes belangrijke groeicomponenten kan afbreken in FBS, vanwege de grotere absorptiecapaciteit van nanodeeltjes. Metaal oxide nanodeeltjes bleken koppelen aan FBS door een samenspel met calcium 41. Afhankelijk van de pH van de oplossing, kan metaal nanodeeltjes dragen een positieve of negatieve lading. De cytotoxiciteit studies hebben aangetoond dat metaal nanodeeltjes toegevoegd celkweekmedium adsorberen kationen, zoals Ca2 + en verwijder FBS / serumalbumine door binding van het NP-Ca 2+ complex aan de calcium bindingsplaatsen op de eiwitten in FBS. Dit vermindert de concentratie van Ca2 + en FBS uit de media wezen verhongeren de cellen en het verhogen van de cytotoxiciteit toegeschreven aan het nanoparticles 41. Bovendien, pre-exposure van nanodeeltjes te FBS / Ca 2+ gecoat de nanodeeltjes, het verminderen van hun cytotoxische werking. Maar we niet direct de media om CuO-NP bloot. Ook, geen significante afname van Ca2 + concentraties werden waargenomen bij PBW na behandeling met CuO-NP, aangeeft dat er geen significante absorptie van Ca2 + op het CuO-NPs priming ze te binden met FBS. De concentratie van calcium in het PBW hoog genoeg dat nanodeeltjes geïnduceerde daling niet duidelijk zijn geweest. Het blijft onwaarschijnlijk dat het CuO-NPs in dit onderzoek gebruikte absorberen grote hoeveelheden calcium tijdens de verwerking, omdat er geen afname arseen absorptie capaciteiten van CuO-NPs in PBW, die een hoog calciumgehalte in vergelijking met eerdere studies bevat grondwater met een lagere calcium concentraties 13.

De gegevens tonen aan dat CuO-NP verwijderen arseen, selenium vanadium en uranium, en dit wordt geassocieerd met een verbeterde HEK en HEP ​​cellevensvatbaarheid in de MTT assay. Het mechanisme (s) waarmee de levensvatbaarheid wordt verbeterd moet nog worden vastgesteld, maar kan worden veroorzaakt door de verwijdering van verontreinigingen met voorrang CuO-NP, naast andere mechanismen. De huidige studie toont ook aan dat standaard celkweek werkwijzen kunnen worden toegepast om de werkzaamheid van een nanodeeltje ISR waterbehandelingsmethode beoordelen Hierdoor zou een reeks mechanistische studies te vullen, alvorens naar de meer kostbare en tijdrovende in vivo dierstudies . Daarbij mag CuO-NPs blijken veelzijdig voor winningsprocessen en voor de behandeling van metaalmengsels dan gebruikelijke adsorbentia zoals oxiden van aluminium, ijzer, titanium en mangaan, omdat CuO-NPs geen pH-regeling of oxidatie van water vereisen voor arseen verwijdering en CuO-NPs verwijder beide arseniet en arsenaat in aanwezigheid van concurrerende anionen fosfaat, silicaat en sulfaat. Ook kan CuO-NPs worden geregenereerd en opnieuw-used, reducerend reagens kosten en de hoeveelheid van afvalverwerking bijproducten doorgebracht in de behoefte van de verwijdering 12.

Mogelijke beperkingen van de MTT protocollen zijn lage celdichtheid op het moment van blootstelling onthechting van cellen en signaalverlies, mobiele honger en mogelijke directe blootstelling van de cellen aan CuO-NP veranderende MTT reactiviteit. Celdichtheid en onthechting problemen kunnen worden aangepakt met behulp van een alternatieve test zoals flowcytometrie, dat een grotere dichtheid zaaien alsmede het verzamelen van alle cellen (dwz zowel drijvende en bevestigd). Cell honger vragen kunnen worden vastgesteld door het meten groeifactor concentraties in het medium gedurende de behandeling. Toekomstig werk zal zich richten op het toepassen van het huidige protocol om verschillende cytotoxiciteit assays die zal aanpakken indien mogelijk CuO-NP blootstelling veranderde assay activiteit, metingen van de cel honger tijdens de behandeling en ook het testen van het vermogen van CuO-NP om verontreinigingen te verwijderenNTS en de invloed op de cytotoxiciteit van andere vormen van complexe mengsels, zoals afval van Superfund locaties en afvalverwerking vijvers. Dergelijke studies zouden ook pakken of de methodes waren robuuste in verschillende instellingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CuCl2 Sigma 203149
Borosilicate glass balls VWR 26396-639 6 mm
Nitric Acid Fisher A509-P500 Trace metal grade
0.45 μm syringe filter Fisher SLHA 033S S
10x EMEM Fisher BW12-684F
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
L-glutamine Fisher BP379-100
NaHCO3 Sigma S5761
Penicillin/Streptomycin ATCC 30-2300
0.22 μm vacuum filter unit Fisher 09-740-28C
HEK293 ATCC CRL-1573
HEPG2 ATCC HB-8065
Trypsin Sigma SV3003101
MTT Sigma M2128
D-penicillamine Fisher ICN15180680
96-well plates Fisher 07-200-92
DMSO Fisher D12814
Spectra Max 190 Molecular Devices
Visual MINTEQ version 3.0 KTH Royal Institute of Technology
ICP-MS Agilent Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
IC DIONEX DX 500 Dionex Details of instruments, models and detection limits were published in Reddy et al., 2013.
VWR Incubator VWR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. What is the status of the U.S. nuclear industry? Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/energy_in_brief/article/nuclear_industry.cfm (2014).
  2. International Energy Outlook. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/forecasts/archive/ieo11/pdf/0484%282011%29.pdf (2011).
  3. Uranium Marketing Annual Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/uranium/marketing/ (2014).
  4. Domestic Uranium Production Report. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.gov/uranium/production/annual/ (2014).
  5. Uranium Recovery. Washington (DC): U.S. United States Nuclear Regulatory Commission (US). Available from: http://www.nrc.gov/materials/uranium-recovery/license-apps/ur-projects-list-public.pdf (2014).
  6. U.S. Uranium Reserves Estimates. Washington (DC): U.S. Energy Information Administration (US). Available from: http://www.eia.doe.gov/cneaf/nuclear/page/reserves/ures.html (2010).
  7. The Future of Uranium Production in Wyoming: A Public Forum on In-Situ Recovery. Washington (DC): Meridian Institute. Available from: http://www.uwyo.edu/ser/_files/docs/conferences/2010/uraniumforum/ser_uranium_forum_final_report.pdf (2010).
  8. Generic Environmental Impact Statement for In-Situ Leach Uranium Milling Facilities Washington (DC): U.S. Nuclear Regulatory commission (US). Available from: http://www.nrc.gov/reading-rm/doc-collections/nuregs/staff/sr1910/v1/ (2012).
  9. Wyoming surface water quality standards. Cheyenne (WY): State of Wyoming Department of Environmental Quality (US). Available from: http://soswy.state.wy.us/Rules/RULES/6547.pdf (2011).
  10. Qu, X., Alvarez, P., Li, Q. Applications of nanotechnology in water and wastewater treatment. Water Research. 47, (12), 3931-3946 (2013).
  11. Martinson, C., Reddy, K. Adsorption of arsenic(III) and arsenic(V) by cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, (2), 401-411 (2009).
  12. Reddy, K., McDonald, K., King, H. A novel arsenic removal process for water using cupric oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 397, 96-102 (2013).
  13. Reddy, K., Roth, T. Arsenic Removal from Natural Groundwater Using Cupric Oxide. Ground Water. 51, (1), 83-91 (2012).
  14. Zhang, G., Ren, Z., Zhang, X., Chen, J. Nanostructured iron(III)-copper(II) binary oxide: a novel adsorbent for enhanced arsenic removal from aqueous solutions. Water Research. 47, (12), 4022-4031 (2013).
  15. Ali, I. New generation adsorbents for water treatment. Chemical Reviews. 112, (10), 5073-5091 (2012).
  16. Zhang, Q. CuO nanostructures: Synthesis, characterization, growth mechanisms, fundamental properties, and applications. Progress in Materials Science. 60, 208-337 (2014).
  17. Schmidt, C. TOX 21: new dimensions of toxicity testing. Environmental health perspectives. 117, (8), 348-353 (2009).
  18. Firestone, M., Kavlock, R., Zenick, H., Kramer, M. The U.S. Environmental Protection Agency Strategic Plan for Evaluating the Toxicity of Chemicals. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13, (2-4), 139-162 (2010).
  19. Guidance Manual for the Assessment of Joint Toxic Action of Chemical Mixtures [Internet]. Atlanta (GA); Agency for Toxic Substance and Disease Registry (US). Available from: http://www.atsdr.cdc.gov/interactionprofiles/IP-ga/ipga.pdf (2014).
  20. Bae, D., Gennings, C., Carter, W., Yang, R., Campain, J. Toxicological interactions among arsenic, cadmium, chromium, and lead in human keratinocytes. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 63, (1), 132-142 (2001).
  21. Whittaker, M. Exposure to Pb, Cd, and As mixtures potentiates the production of oxidative stress precursors: 30-day, 90-day, and 180-day drinking water studies in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 254, (2), 154-166 (2011).
  22. Schilz, J. Investigating the ability of cupric oxide nanoparticles to adsorb metal contaminants from uranium in-situ recovery (ISR) production bleed water and assessing the associated changes in cytotoxicity. University of Wyoming. Laramie, WY. Available from: ProQuest UMI, Ann Arbor, MI (2014).
  23. Manual of Standard Operating Procedures for Sample Collection and Analysis. Cheyenne (WY): Wyoming Department of Environmental Quality (US). Available from: http://deq.state.wy.us/wqd/watershed/downloads/qa/4-1089.pdf (2011).
  24. Florea, A., Splettstoesser, F., Büsselberg, D. Arsenic trioxide (As2O3) induced calcium signals and cytotoxicity in two human cell lines SY-5Y neuroblastoma and 293 embryonic kidney (HEK). Toxicology and Applied Pharmacology. 220, (3), 292-301 (2007).
  25. Mao, W. Cadmium induces apoptosis in human embryonic kidney (HEK) 293 cells by caspase-dependent and -independent pathways acting on mitochondria. Toxicology in Vitro. 21, (3), 343-354 (2007).
  26. Tchounwou, P., Yedjou, C., Patlolla, A., Sutton, D. Heavy Metal Toxicity and the Environment. Molecular, Clinical and Environmental Toxicology. 101, 133-164 (2012).
  27. Meerloo, J., Kaspers, G., Cloos, J. Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay. Cancer Cell Culture. 731, 237-245 (2011).
  28. Gustafsson, J. Visual MINTEQ. Royal Institute of Technology. Stockholm, Sweden. (2010).
  29. Hallab, N., Caicedo, M., McAllister, K., Skipor, A., Amstutz, H., Jacobs, J. Asymptomatic prospective and retrospective cohorts with metal-on-metal hip arthroplasty indicate acquired lymphocyte reactivity varies with metal ion levels on a group basis. Journal of Orthopaedic Research. 31, (2), 173-182 (2013).
  30. Goswami, A., Raul, P., Purkait, M. Arsenic adsorption using copper (II) oxide nanoparticles. Chemical Engineering Research and Design. 90, (9), 1387-1396 (2011).
  31. Pillewan, P., Mukherjee, S., Roychowdhury, T., Das, S., Bansiwal, A., Rayalu, S. Removal of As(III) and As(V) from water by copper oxide incorporated mesoporous alumina. Journal of Hazardous Materials. 186, (1), 367-375 (2011).
  32. Kroll, A. Cytotoxicity screening of 23 engineered nanomaterials using a test matrix of ten cell lines and three different assays. Particle and fibre toxicology. 8, (9), 1-19 (2011).
  33. Fahmy, B., Cormier, S. Copper oxide nanoparticles induce oxidative stress and cytotoxicity in airway epithelial cells. Toxicology in vitro: an international journal published in association with BIBRA. 23, (7), 1365-1371 (2009).
  34. Radike, M. Distribution and accumulation of a mixture of arsenic, cadmium, chromium, nickel and vanadium in mouse small intestin, kidney, pancreas, and femur following oral administration in water or feed. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 65, (23), 2029-2052 (2002).
  35. Barbier, O., Jacquillet, G., Tauc, M., Cougnon, M., Poujeol, P. Effect of heavy metals on, and handling by, the kidney. Nephron. Physiology. 99, (4), 105-110 (2005).
  36. Zheng, X., Watts, G., Vaught, S., Gandolfi, A. Low-level arsenite induced gene expression in HEK293 cells. Toxicology. 187, (1), 39-48 (2003).
  37. Li, Z., Piao, F., Liu, S., Wang, Y., Qu, S. Subchronic exposure to arsenic trioxide-induced oxidative DNA damage in kidney tissue of mice. Experimental and Toxicologic Pathology. 62, (5), 543-547 (2010).
  38. Farombi, E., Akintunde, J., Nzute, N., Adedara, I., Arojojoye, O. Municipal landfill leachate induces hepatotoxicity and oxidative stress in rats. Toxicology and Industrial Health. 28, (6), 532-541 (2011).
  39. Das, N. Arsenic exposure through drinking water increases the risk of liver and cardiovascular diseases in the population of West Bengal. India. BMC public health. 12, (1), 639-648 (2012).
  40. Valko, M., Morris, H., Cronin, M. Metals, toxicity and oxidative stress. Current Medicinal Chemistry. 12, (10), 1161-1208 (2005).
  41. Horie, M. Protein Adsorption of Ultrafine Metal Oxide and Its Influence on Cytotoxicity toward Cultured Cells. Chemical Research in Toxicology. 22, (3), 543-553 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics