Живых изображений сотовый процессе механической Stretch

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rápalo, G., Herwig, J. D., Hewitt, R., Wilhelm, K. R., Waters, C. M., Roan, E. Live Cell Imaging during Mechanical Stretch. J. Vis. Exp. (102), e52737, doi:10.3791/52737 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Клетки подвергают механическим нагрузкам во многих тканях, и это механическое раздражение было показано, способствуют изменения в структуре экспрессии генов, выделению факторов роста, цитокинов, или ремоделирование внеклеточного матрикса и цитоскелетом 1-4. Внутриклеточные сигналы трансдуцированных от таких механических стимулов происходит через процесс механотрансдукции 5-7. В дыхательной системы, одним из результатов механотрансдукции является увеличение активных форм кислорода (АФК) 8,9 и провоспалительных цитокинов 10 в легочных эпителиальных клеток в присутствии циклического напряжения при растяжении. Убедительные доказательства также показывает, что чрезмерное напряжение при растяжении приводит к прямой травмы альвеолярного эпителия, в дополнение к биохимических реакций клеток 11-14. Хотя основное внимание здесь, в первую очередь от реакции легких клеток к механической деформации, пути, вызванные механотрансдукции играть ключевую роль в БАСФункция IC многих тканей в организме человека, в том числе в регуляции сосудистого тонуса 15 и развитие роста пластины 16.

Растущий интерес к механотрансдукции привело к разработке многочисленных устройств для применения физиологически соответствующих механических нагрузок в культивируемых клетках и тканях. В частности, устройства, применяющие деформации растяжения, которая распространенной формой механической нагрузки, испытываемой ткани, популярны 11,17-19. Тем не менее, многие из доступных устройств либо разработан как биореактор для тканевой инженерии или не способствует реального времени визуализации с натяжкой. Таким образом, существует необходимость в разработке инструментов и методов, которые могут визуализировать клеток и тканей в напряженности, чтобы облегчить расследование путей механотрансдукции.

При этом механическое растяжение устройство в плоскости была разработана и протоколы были разработаны для применения мultiple формы деформации тканей и клеток, а позволяет визуализации биохимических и механических реакций в режиме реального времени (1А-D). Устройство использует шесть равномерно расположенных зажимов, расположенных по окружности, чтобы понять гибкую мембрану и применять в плоскости, радиальной живота примерно до 20% (Фиг.1В). Исполнительный механизм может быть размещен в инкубаторе для клеточных культур в течение продолжительного периода времени, в то время как двигатель (рис 1C) расположен вне инкубатора и управляется с помощью патентованного программного обеспечения, предоставленной поставщиком двигателя. Двигатель соединен с линейным драйвером, который вращается внутренний кулачок, вождения шесть носилок зажимы равномерно напряжения и расслабления.

В дополнение к механическим устройством, индивидуальные гибкие мембраны были созданы из коммерчески доступных клеточных культур готовых мембран, которые будут использоваться в механической системе. Затем круговые стенки (диаметром около28 мм) были изготовлены и прикреплены к гибкой мембране таким образом, что клетки могут быть культивированы только в этой области хорошо описанной деформации профиля. Для того чтобы определить, является ли размещение этих мембран в исполнительное устройство обеспечит равномерное и изотропное напряжение в центре гибкой мембраны, анализ методом конечных элементов были проведены с использованием коммерчески доступного программного обеспечения (рис 1E-F). Гибкая мембрана была смоделирована с симметричными граничными условиями и с использованием всех четырехугольных элементов для сетки. Концентрические кольца видели в контурной участке максимальной главной деформации, показанной на рис 1F показывают изотропное распределение напряжения.

Штамм испытали мембраной измерялась записи изображения маркировки через нагрузки (рисунок 2). Рисунок 2D показывает, что средняя деформация мембраны измеряется в радиальных и осевых направлениях было приблизительно линейнымпо отношению к приложенному двигателя рассчитывает до максимальной линейной деформации 20%. Там не было никакого существенного различия между уровнями деформации, измеренных во время растяжения по сравнению с теми, измеряется при отводе назад в положение покоя. Далее, смещение человека бронхиальных эпителиальных клеток (16HBE) и их ядер культивируемых на заказ гибкой мембраны были измерены. Флуоресцентно меченных (DAPI) Ядра клеток 16HBE визуализируют с помощью цели 20X под конфокальной микроскопии, в то время как объем целая клетка была измерена с фазового контраста изображений, записанных с помощью цифрового микроскопа. Как видно на рисунке 3, штамм измеряется смещением ядер был таким же, измеренная по смещению маркировки на мембране, до ~ 20% линейной деформации. Это подтверждает, что применительно к деформации мембран передается на адгезивных клеток. Протоколы, описывающие применение данного пользовательского устройства на традиционном микроскопе и атомно-силовой microscopэлектронной представлены в следующих шагов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Строительство мембраны с хорошо Стены для удерживания культуры клеток (рис 1D для конечного продукта)

  1. Использование полидиметилсилоксановые (PDMS) листы, покрытые коллагеном I, вырезать контур гибкой мембраны с помощью скальпеля или умереть.
  2. Поместите каждую мембрану в 60 мм чашки Петри для хранения.
  3. Создание стен:
    1. Смешайте PDMS в соотношении 10: 1 по массе эластомера А эластомера B (отвердитель).
    2. Налейте 5 мл полностью смешанных PDMS в 50 мл пробирки.
    3. Поместите 50 мл пробирки с неотвержденных PDMS горизонтально в гибридизации духовке.
    4. Используйте функцию ротора, чтобы покрыть внутренние стенки труб на 8 оборотов в минуту в течение времени отверждения. В РТ, PDMS будет полностью вылечить в течение 2 дней.
    5. Снимите PDMS из трубы в стерильной капот культуре клеток.
    6. Используя новый лезвие, разделить цилиндр PDMS в разделах 4 мм в высоту.
    7. Поместите разделы, которые будут служить в качестве мембраны вазаполняет, в посудомоечной контейнера Петри, не позволяя стены, чтобы стать сминаться.
  4. Выбор и центр одной из стен PDMS с одной мембраной, поддерживая два в чашке Петри.
  5. Аккуратно неотвержденных PDMS (10: 1 соотношение) на внешнем периметре стены для использования в качестве клея. Избегать образования зазоров между стенкой и мембраной, так как она есть, чтобы сохранить жидкость.
  6. Поместите каждую чашку Петри, содержащую заполненную оболочку и покрыты в печи при 70 ° С в течение 24 ч, чтобы вылечить.

2. Соотношение оборотов вала двигателя с помощью зажима или перемещении радиального роста для калибровки (рис 2)

  1. Запустите программу управления двигателем.
  2. Свернуть зажимы устройства, используя ручную настройку в программном обеспечении двигателя.
  3. Измерьте расстояние и записать позицию счета двигателя между противоположными зажимы на обоих минимального и максимального смещения зажимов.
  4. Рассчитать процентное изменение в Distance между зажимами в зависимости от кол двигателя (~ 0-75k отсчетов). Это будет означать максимально возможное напряжение, достигнутый на мембране.

3. Применение Stretch на Мышь легких эпителиальных клеток линии (MLE12)

  1. Семенной MLE12 клетки в 2,5 млн клеток на гибкой мембраны (шаг 1) на лунку для сливающийся в течение двух дней. Плотность посева могут отличаться для различных типов клеток.
  2. Убедитесь, что механический привод находится в полностью расслабленном состоянии.
    1. Удалить культуральной среды клеток.
    2. Использование 1,5 мм биопсии удары, удар два отверстия в каждой из шести зажима (рис 1D) выступы мембраны. Радиальное расположение отверстий определяет количество предварительной напряженности мембранные опыты на начальном этапе. Удар отверстия в радиусе 20,5 мм на мембране вкладок, если нет предварительного натяжения не требуется.
    3. Расположите мембрану на носилках с перфорированные отверстия выстраиваются с контактами внутри зажимов.Поместите верхние зажимы на месте. Затянуть винты по одному переменного сторон.
    4. Добавить 1 мл клеточной культуры.
  3. Поместите устройство на столике микроскопа центрирование середину мембраны с пути света.
  4. Используйте ленту или магниты (если это возможно), чтобы зафиксировать устройство на сцену. После фиксированной, контролировать в плоскости (параллельно мембране) и вертикальном (Z-направление) механическое устройство с контроллером стадии микроскопа.
  5. Применить участок с программным обеспечением, предоставленным производителем вручную контролируя положение и скорость вращения двигателя 20.

4. Измерение митохондриальных активных форм кислорода (АФК)

  1. После того, как клетки сливающийся, добавить 1-2 мл DMEM с РТ митохондриальной супероксиддисмутазы индикатора (5 мкМ конечная концентрация) непосредственно на клетки.
  2. Инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С.
  3. Промывают клетки осторожно трижды промывают буфером нагревали на водяной бане до37 ° С.
  4. Сразу же место гибкую мембрану на носилках (этап 2.2) уже в место под вертикальном конфокальной микроскопии.
  5. Добавить 1 мл DMEM с фенол-красный свободной средних и 25 мМ HEPES.
  6. Установите фильтры возбуждения / эмиссии в 510/580 нм.
  7. Image несколько полей каждые 15 мин до достижения желаемого времени курс митохондриальной производства супероксид.
  8. Из захваченных изображений, интенсивность флуоресценции запись гистограмм в каждом интервале времени с помощью программного обеспечения, способного количественной интенсивности флуоресценции.

5. Применение Stretch и атомно-силовой микроскопии (АСМ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги предусмотрены для конкретного АСМ и оптической комбинации микроскопа (рис 4 и список материалов).

  1. Подготовка АСМ для эксперимента.
    1. Увеличение высоты головки AFM, чтобы его максимальное положение в Z-направлении.
    2. Положите удлинители на ногах АСМ вподнять самолет, на котором АСМ консольные контакты образца. Образец и глава АСМ должен быть поднят, чтобы приспособить высоту механического устройства.
  2. Подготовка оптического микроскопа (если имеется).
    1. Снимите АСМ сканера пластину. Удалить желаемой цели.
    2. Добавить прокладку к цели. Высота прокладки будет зависеть от цели и конкретные АСМ настройки, но это необходимо, если визуализация желательно с плоскость наблюдения будет сдвиг в г-направлении на величину, равную высоте носилок и адаптер (рис 5А). Следует отметить, что, как правило, АСМ обеспечивает низкий изображений с увеличением от оптического пути выше устройства.
    3. Установите нужный объективную обратно в его местоположение. Поместите сканер обратно на AFM.
    4. Запустите программное обеспечение АСМ. Начало все необходимые источники света, включая источник света для измерений флуоресценции.
    5. Установите микросхему с консольной балки, чтоподходит для желаемых измерений. 200 PN / нм или менее предпочтительным жесткость при измерении модуля упругости живых клеток.
    6. Совместите лазер и калибровки кантилевера жесткость в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя на покровного стекла, установленного на устройстве.
  3. Подготовка мембраны как на стадии 1, но со следующими модификациями.
    1. Непосредственно перед монтажом мембраны на растяжение в устройстве, сократить стены до примерно 1 мм в высоту. Это предотвращает помехи между испытывали мембранными стенками и тензодатчика.
    2. Установите мембрану от механического устройства, как описано 3.2.1-3.2.3.
    3. Удалить культивирования клеток, чтобы предотвратить повреждение АСМ сканера в случае разлива нефти.
    4. Пара устройство с адаптером (рис 5А). Поместите механическое устройство с адаптером на сканере.
    5. Стретч мембрану до нужного уровня деформации при растяжении.
  4. Добавить Limited (<0,5 мл) объем средств массовой информации на клетки, чтобы избежать АСМ сканера или повреждения микроскопа из-за разлива нефти.
  5. Включите консольной балки с мембраной.
  6. Следуйте протокол конкретной АСМ устройства для сканирования области, представляющие интерес.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Реактивные формы кислорода и деформация

Предыдущие исследования показали, увеличение активных форм кислорода (АФК) в дыхательных путях и альвеолярных эпителиальных клеток в ответ на циклической участке 21. Активные формы кислорода включают молекулы и свободные радикалы, полученные из молекулярного кислорода с высокой реакционной способности липидов, белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот 22-24. АФК служить общей внутриклеточный сигнал для регулирования функции ионного канала, протеинкиназы / активации фосфатазы, и экспрессии генов, но чрезмерное или нерегулируемое производство может способствовать АПОПТОТИЧЕСКУЮ и некротических клеток смерть, нейродегенеративные, атеросклероз, сахарный диабет и рак 24,25. Супероксид, предварительно курсор для других форм АФК, могут быть получены в качестве побочного продукта митохондриального дыхания, когда электроны вытекать из цепи переноса электронов. Предыдущие исследования показали, что циклическая механическая стрейч стимулировало производство супероксида путем сочетания с НАДФН-оксидазы системы (никотинамид-аденин-динуклеотид фосфат-оксидазы) и митохондриальной цепи переноса электронов (комплекс I и III). Было предложено, что это возбуждение было связано с прямым искажением митохондрий 21, возможно из-за связей с клеточной цитоскелета. Для того чтобы проверить эту гипотезу, была разработана клеток устройство растяжения, так что мы могли бы изменения изображения в производстве ROS в живых клетках в ответ на механическое натяжкой. Здесь митохондриальные РОС производимые бронхиальных эпителиальных клеток вследствие растянуть измеряли, используя пользовательский устройства и протокола. При отсутствии механического растяжения, АФК не значительно увеличить более чем на 60 мин (рис 4). Когда один 17% стрейч был применен и поддерживается, было увеличение митохондрий АФК что сохраняется еще 60 мин.

Прямая эпителиальных монослоя повреждения из-за Stretch

2. Некоторые исследования показывают, что чрезмерное механическое протяжение легких эпителиальных клеток может привести к прямой травмы с участием повреждение клеток 11,13,26,27. Этот тип повреждения трудно захватить без визуализации в режиме реального времени во время механической живота. Таким образом, используя пользовательский устройства и фазового контраста микроскопии последовательных изображений клеток, которые механически растянутых были записаны до и после лечения с про-воспалительных цитокинов (50 нг / мл ФНО-α в течение 6 ч) (рисунок 5). Изображения того же поля клеток были захвачены на повышение уровня деформации. Изображения показывают образование зазора, когда клетки, натянутой между 10 и 15% деформации, как указано красными стрелками. Важно отметить, что эти изображения были записаны в режиме реального времени, <10 сек отставания между концом стретч ч и изображений, в то время как клетки растягивается. В предыдущих исследованиях клеточной визуализации вытянутых клеток, изображения были получены до и после растяжения сравнения только изображения клеток не растянутом состоянии 11,13,28.

АСМ Нано-углубление на вытянутых клеток

Механическое устройство было помещено в АСМ с использованием адаптера пластины (рис 6а). Использование ранее опубликованные методы 13, упругие карты модуля упругости (Е-карты) из MLE12 клеток до и после 10% деформации растяжения были получены (рис 6D-E). Хотя фазовый контраст изображения на 10% деформации (рис 6D) была получена в течение 10 секунд в участке, Е-карты, показанные на рис 6D-E потребляется примерно 22 мин с 300 индивидуальных кривых сила-смещение записанных в течение 40 мкм х 40 мкм площадь с / х скорости 2,5 мкм наконечника в г-направлении.ом / файлы / ftp_upload / 52737 / 52737fig1highres.jpg "цель =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Фигура 1
Рисунок 1. специально разработаны устройства для культуры и растяжения клеток. (А) генерируемые компьютером чертеж механической конструкции устройства, (Б) фотография законченного устройства, (C) фотография устройства, подключенного к двигателю и линейного драйвера, который преобразует вращение двигателя в 1-мерного движения, контролирует зажим двухосный участке (D), силиконовой резиновой мембраной. Подложка содержит два отверстия на каждой вкладке зажим, которые будут размещены на столбах на каждом зажиме. (Е) с размерами ВЭД модель гибкой мембраны, которая 1/4 всей конструкции за счет использования симметричных граничных условиях. ( Чонг> F) Максимальная основной деформации показано в полном мембраны, изображающей образование колец индикативных изотропного поля деформаций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. (А) устройства, поддерживающего гибкую мембрану с маркировкой применяемых для измерения приложенного напряжения показана. Крупный план изображения маркировки, до (B) и после (С) стрейч, были помечены стрелкой четко указывают на смещение маркировки на мембране. (D) мембраны штамма в зависимости от двигателя рассчитывает во подводе и отводе. Штамм Мембрана была одинаковой в обеих подвода и отвода с отзывом производить немного выше штаммов. HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52737/52737fig2highres.jpg" цель = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Мембрана передачи штамма к клеткам. (A - B) фазового контраста изображения человека бронхиальных эпителиальных клеток (16HBE) на гибкой мембраны с использованием цели 10X, до (а) и после (б) 20% -ной деформации. (C - D) флуоресцентно меченных (DAPI) Ядра клеток 16HBE визуализируют с помощью цели 20X при конфокальной микроскопии, прежде, чем (С) и после (D) 20% -ной деформации. (Е) штамм мембрана испытывает клеток была линейной и однородной.т = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Влияние одного участка на производстве ROS в 16HBE клеток наблюдалось с помощью кумулятивного датчик митохондриальной супероксид, используя цель 20X под конфокальной микроскопии (- С). Снимки времени курс (0, 60 мин и ~ 65 мин) от супероксида в ходе простиранием в той же области клеток. (D) Относительная интенсивность флуоресценции клеток 16HBE течением времени, указывая на увеличение на 50% интенсивности флуоресценции от базового уровня производства супероксида в течение первого часа (компонент А). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.


Рисунок 5. фазового контраста изображения альвеолярного эпителия (MLE12) монослоя ответ на растущую участке (A - D). Были записаны с помощью цифровой микроскоп с 20-кратным цель. Стрелки указывают места, где происходит разделение клетки к клетке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6. () Механическое устройство показано на AFM для нано-отступа клеток с натяжкой. Сканер должен быть удален для размещения объективной удлинителя. Три удлинители ножек прикреплены к каждой из трех обмоток АФМ голову, чтобы позволить устройствуРазмещение. Переходная плита используется для монтажа носилки на АСМ сканера (черный) пластины. Сканирование консольной балки в направлении стрелки, показанной на растяжение до изображению фазового контраста клеток MLE12 (б). Красные квадраты в перед (B) и после (C) натяжных изображений изобразить область, был захвачен во время нано-углубление (40X объективной). Эластичные карты модулем до (D) и после (Е) стрейч, получены с методами 13 ранее опубликованных анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Был разработан уникальный прибор для живого изображения клеток в процессе механического участка; и это устройство используется в протоколе для изучения mechanobiology эпителиальных клеток легких. В предварительных исследований было установлено, что один проведены растяжения стимулировал продукцию митохондриальной супероксид в бронхиальных эпителиальных клетках. Кроме того, было показано, что повышенные уровни механической деформации вызвано прямой ущерб целостности монослоя эпителиальных клеток альвеол.

Для проведения этих предварительных экспериментов, устройство впервые откалиброван, а затем было показано, что штамм мембрану передается клеток (фиг.2-3). В целом устройство выполнено так, как указано в тесной корреляции между напряжением мембраны (измеряется знаков на мембране) и клеточной линии (измеряется расстояния между ядрами), показанного на фиг 3Е. Тем не менее, есть некоторые незначительные различия, наблюдаемые между СтраВ измеряется на мембранах при подходе и возвращении кривых маркеров, как показано на рисунке 2D. Это было, вероятно, из-за люфта в устройстве и, возможно, связано с сжимая вопросы. Кроме того, универсальное крепление механизм устройства необходим так, что он может быть эффективно использован на микроскопов с различными конфигурациями. Это позволит сократить время, затрачиваемое между позиционированием приобретения устройства и изображения, сохраняя при этом надежную связь с микроскопом. Отверстий, пробитых в мембранах, были использованы для применить незначительную предварительной деформации к мембране, чтобы предотвратить образование начальной сжатие состоянии из-за зажима из эластичного материала. Сжатие состояние также приводит к снижению максимальной применимой деформации.

Пользовательских устройств была разработана, чтобы соответствовать в убежище MFP3D атомно-силовой микроскоп, чтобы нано-отступ живых клеток при механическом участке. Мы не знаем любого другого устройства, которое способно вducing изотропное состояние стресса в плоскости изображения, которые могут функционировать в рамках АСМ. Устройство также предназначено для постоянного использования в культивирования клеток инкубаторе (выдерживали при 37 ° С во влажной стерильной среде с 5% CO 2). Способность функционировать в инкубаторе позволяет изучение клеток, подвергающихся долгосрочные схемы протяжения.

Есть несколько ограничений представленной подхода. Во-первых, так как мембрана участках, поле фокус перемещается из плоскости, хотя минимально (~ 100 мкм). Это становится ограничением при отслеживании поле клеток через схему растяжения, потому что поле зрения изменения в течение мембранного живота. Даже если мембрана в диаметре 22 мм испытывает напряжение 0,23-0,25 регионы за пределами этого опыта внутреннему диаметру поля более переменная деформация. Несмотря на то, рентгеновские снимки, которые легко ограничивается этой центральной области, то возможно, что клетки реагируют на более высокие уровни напряженияна внешних областей может повлиять на реакцию клеток в центральной области. Равномерное распределение деформации по большей площади интереса может быть достигнуто с улучшением конструкции мембраны. PDMS мембраны автоматического флуоресцентного на длинах волн, обычно используемых для люминесцентных индикаторов, а это ограничивает возможность для флуоресценции в клетках из-под оболочки. По этой причине в вертикальном положении микроскопа была использована с погружением в воду задач в наших исследованиях продукции АФК, описанных выше. Это может быть ограничение для исследований, в которых АСМ и флуоресценции объединены.

Наиболее распространенным коммерческим устройство (FlexCell FX 5000 Напряжение системы) для применения механической нагрузки на клетки включает контролируемый вакуумную систему, применяя деформацию растяжения на мембране при движении в и из оптической плоскости. Мембрана и зажим дизайн, представленные здесь, создать би-осевое поле деформаций, где штамм является изотропным и остается в плоскости allowinг в реальном времени изображения. С небольшими изменениями в дизайне мембраны, носилки можно производить одноосные режимы растяжки, а также. Если клетки сначала высевали на раздутым мембраны, в плоскости сжимающих нагрузок может также применяться. Устройство способно достичь обе физиологические и патологические уровни напряжения. Таким образом, новое устройство и протоколы были разработаны, которые могут быть использованы для применения механической нагрузки на живые клетки, которые могут быть отображены с помощью флуоресцентной микроскопии и АСМ нано-отступа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить что Fedex технологический институт в Университете Мемфиса за их поддержку. Авторы хотели бы поблагодарить студентов старшей группы дизайн-проекта в инженерно-механический факультет в университете Мемфиса (David Butler, Джеки Картера, Доминик Кливленде, Иаков Шаффер), Даниэль Кон из отдела Университета Мемфиса инженерных технологий для управления двигателем , и д-р Бен Дэн и г-жа Charlean Luellen за помощь в клеточной культуре. Эта работа была поддержана K01 HL120912 (ER) и R01 (HL123540 CMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SmartMotor NEMA 34: 3400 Series MOOG Animatics SM3416D Integrated motor, controller, amplifier, encoder and communications bus
Flexcell Membrane (Collagen I coated) Flexcell International Corp SM2-1010C 3.5" x 5.25" x 0.020"
Sylgard 184 Dow Corning Corporation 10:1
Hoechst 33342  Sigma-Aldrich H1399 DAPI stain
MitoSOX Sigma-Aldrich M36008
Tiron Sigma-Aldrich D7389  mitochondrial superoxide label
DMEM superoxide inhibitor
FBS
HEPES
50 ml tubes Fisher Scientific 06-443-19 Any centriguge tube can be used to create an area for imaging.
Hybridization oven Bellco Glass
MLE12 Cells ATCC CRL-2110 Mouse Lung Epithelial Cells 
16HBE cells ATCC CRL-2741 Human Bronchial Epithelial Cells
AFM Indentation Experiments
Cantilever Beams for Nano-indentation Budget Sensors Si-Ni30
AFM  Asylum Research MFP3D
Olympus microscope Olympus IX-71 Inverted microscope with 20X and 40X objectives.
AFM Leg Extenders Asylum Research Not available AFM microscope
Finite Element Analyses
ABAQUS Simulia 6.12
Software
ImageJ NIH
Microscopes
Digital microscope Life Technologies EVOS XL Core Initially a self standing company, now owned by Life Technologies.
Confocal microscope Zeiss LSM 710 2-photon upright microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tschumperlin, D. J., Boudreault, F., Liu, F. Recent advances and new opportunities in lung mechanobiology. J Biomech. 43, 99-107 (2010).
  2. Waters, C. M., Roan, E., Navajas, D. Comprehensive Physiology. John Wiley, & Sons, Inc. (2011).
  3. Majkut, S., Dingal, P. C. D. P., Discher, D. E. Stress Sensitivity and Mechanotransduction during Heart Development. Current Biology. 24, R495-R501 (2014).
  4. Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction. Nature. 475, 316-323 (2011).
  5. Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell-surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
  6. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  7. Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli. Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).
  8. Waters, C. M. Reactive oxygen species in mechanotransduction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L484-L485 (2004).
  9. Chapman, K. E., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  10. Chu, E. K., Whitehead, T., Slutsky, A. S. Effects of cyclic opening and closing at low- and high-volume ventilation on bronchoalveolar lavage cytokines. Crit Car Med. 32, 168-174 (2004).
  11. Tschumperlin, D., Margulies, S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  12. Vlahakis, N. E., Hubmayr, R. D. Cellular stress failure in ventilator-injured lungs. Am J Respir Crit Care Med. 171, 1328-1342 (2005).
  13. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L1235-L1241 (2012).
  14. Gamerdinger, K., et al. Mechanical load and mechanical integrity of lung cells - Experimental mechanostimulation of epithelial cell- and fibroblast-monolayers. J Mech Behav Biomed Mater. 4, 201-209 (2014).
  15. Hayashi, K., Naiki, T. Adaptation and remodeling of vascular wall; biomechanical response to hypertension. J Mech Behav Biomed Mater. 2, 3-19 (2009).
  16. Villemure, I., Stokes, I. Growth plate mechanics and mechanobiology. A survey of present understanding. J Biomech. 42, 1793-1803 (2009).
  17. Waters, C. M., et al. A system to impose prescribed homogenous strains on cultured cells. J Appl Physiol (1985). 91, 1600-1610 (2001).
  18. Gerstmair, A., Fois, G., Innerbichler, S., Dietl, P., Felder, E. A device for simultaneous live cell imaging during uni-axial mechanical strain or compression. J Appl Physiol (1985). 107, 613-620 (1985).
  19. Dassow, C., et al. A method to measure mechanical properties of pulmonary epithelial cell layers. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 101, 1164-1171 (2013).
  20. SmartMotor User's Guide v523. Animatics Corporation. Available from: http://www.animatics.com/download/publication/UsersGuide%20v523.pdf (2011).
  21. Chapman, K., et al. Cyclic mechanical strain increases reactive oxygen species production in pulmonary epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 289, L834-L841 (2005).
  22. Birukov, K. G. Cyclic stretch, reactive oxygen species, and vascular remodeling. Antioxid Redox Signal. 11, 1651-1667 (2009).
  23. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, 335-344 (2003).
  24. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134, 279-290 (2008).
  25. Pouvreau, S. Superoxide flashes in mouse skeletal muscle are produced by discrete arrays of active mitochondria operating coherently. PLoS One. 5, (2010).
  26. Yalcin, H. C., et al. Influence of cytoskeletal structure and mechanics on epithelial cell injury during cyclic airway reopening. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297, L881-L891 (2009).
  27. Jacob, A. M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and claudin 4. J Appl Physiol. 113, 1377-1387 (2012).
  28. DiPaolo, B. C., Lenormand, G., Fredberg, J. J., Margulies, S. S. Stretch magnitude and frequency-dependent actin cytoskeleton remodeling in alveolar epithelia. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C345-C353 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics