Bir Robotik Sıvı İşleme Sisteminin Kullanılması Ölçeklenebilir 96-iyi iPSC Kültür Bazlı Plaka ve Üretim

Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, E. E., O'Connell, R., Hanson, S., Daily, N. J., Wakatsuki, T. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. J. Vis. Exp. (99), e52755, doi:10.3791/52755 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Pluripotent kök hücre kültüründe Devam ilerleme rejeneratif tıp, ilaç keşfi ve güvenlik testleri, bu hücrelerin kullanımı için tezgah ve Yatağımın arasındaki uçurumu kapatıyor. Doku mühendisliği ve nakli için, hücre kaynaklı Biopharmaceutics ve kök hücreleri üretmek için, uygun maliyetli bir hücre üretim teknolojisi gereklidir. Pluripotensin ve zamanla downstream uygulamalar (örneğin, hücre farklılaşması) hücrelerin istikrarlı performans Bakım büyük ölçekli hücresi üretimi için her şeyden önemlidir. Oysa o operatörün ciddi değişkenlik tanıtmak yanı sıra ölçek-up pahalı olabilir nerede hücrelerin elle kültüre, özellikle elde etmek zor olabilir. Minimal teknisyen katılımını veya deneyim gerektiren sıvı robot taşıma geliştirilen çok kanallı bir tezgah üstü kullanılarak operatör etkisi roman kök hücre kültürü protokolleri yüksek verimlilik, büyük ölçekli kök hücre üretimini etkinleştirmek ve kaldırmak için. IleBu protokoller, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) doğrudan donmuş stoktan besleyici içermeyen koşullar kültürlendi ve 96 oyuklu plakalar içinde muhafaza. Ne zaman geçişine hücre hattı ve istenen ölçek büyütme oranına bağlı olarak, operatörün kolayca bölme için optimal koloni yoğunlukları gösteren görüntülerin bir dizi dayalı belirleyebilirsiniz. Sonra gerekli reaktifler, bir santrifüj aşaması olmadan yeni plakalara bir koloni bölünmüş gerçekleştirmek için hazırız. 20 pasajlar (~ 3 ay) sonra, iki iPSC hatları, kararlı karyotip tutulan kök hücre belirteçleri ifade ve yüksek verimlilik ile kardiyomiyositlere ayrışmıştır. Sistem 96 oyuklu plakalar için tasarlanmış yeni bir farklılaşma protokolleri veya genetik manipülasyon daha sonra, yüksek veri akışı taramasını gerçekleştirmek olabilir. Bu teknoloji uygulamaları sayısız için aynı kök hücrelerin çok sayıda üretmek için emek ve teknik yükünü azaltacaktır.

Introduction

6 - İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) kullanımı bileşiği test rejeneratif tıp ve hastalık modelleme 2 2007 1 kendi türetme beri önemli ölçüde artmıştır. Bu talep, benzersiz bir miktarda somatik hücrelere ayırt edilebilir pluripotent hücreler, çok sayıda elde etmek için IPSC kapasitesi gelir. Yönlendirilmiş farklılaşma teknikleri 7 geliştirmek gibi - çok kaliteli iPSCs kitlesel üretim için gereksinimi yok, 14 - 10 ve insan hücre veya doku modelleme ve hücre tedavisinin geliştirilmesi 11 artar. 18 - Bu yaygın diğer hastalıklarda arasında, miyokard infarktüsü veya b-hücresi işlevsel değiştirme IPSC milyarlarca yüz milyonlarca gerektiren bedensel hücreleri 15 türetilmiş olacağı çağırılır. Ilaç keşfi ve t Dahası, giderek daha karmaşık 3D modelleme dokuherapy hücrelerin 9,13,19 çok sayıda talep edecek. Bu örneklerin tamamında, tanımlanan tek tip ve yeniden üretilebilir iPSCs mevcuttur ve üretilmesi kolay olması gerekir.

Doku mühendisliği ve nakli için, hücre kaynaklı Biopharmaceutics ve kök hücreleri üretmek için, uygun maliyetli bir hücre üretim teknolojisi gereklidir. Bu teknikler, başarılı bir şekilde büyük ölçekli olmayan IPSC ökaryotik göre üretim için dağıtılan kısmen 28 - mikrotaşıyıcı alt tabakalar 26 kullanımı ile 25 veya süspansiyon - iPSCs ölçeklendirilmiş üretimi, süspansiyon kültüründe 20 odaklanmıştır. Çeşitli gruplar, pluripotent kök hücreleri 20,21,23,24,29 verim süspansiyon kültürü sistemleri göstermiştir. Ancak, bu yaklaşım, doku mühendisliği ve sürüş Laborat yapıyor, yeni farklılaşma programlarının geliştirilmesi araştırmacıların hazır değil pahalı ve karmaşık sistemleri kullananORY çaplı araştırma. Ayrıca, süspansiyon ve mikrotaşıyıcı iPSC kültürleri toplanmasını düzenleyen adaptasyon ve teknikleri ya da Rho-kinaz inhibitörü sürekli kullanımı gibi geleneksel yapışık iPSC kültüründe bulunmayan kimyasallar, köpük önleyici maddeler ve filtrasyon gerektirir. Hücrelere fiziksel stres mekanik ajitasyon yanı sıra mikrotaşıyıcı çarpışma sırasında tanıtıldı, süspansiyon kültüründe daha yaygındır. Bu sorunlar, hücre çizgileri süspansiyon içinde kültürlenebilir yeni kök üretilen hangi öngörülebilirlik ve hızını sınırlar. Diğerleri plaka kültürü teknikleri 30,31 taklit robotik plaka taşıma sistemlerini geliştirdik ama bu platformlar ekipman ve kök hücre kültürü ile ilişkili temel zorlukları yanında faaliyet uzmanlık için önemli yatırımlar talep ediyoruz.

Aşağıdaki çalışma kendi kendine yeten, standart 8-kanal robot sıvıyı kullanan geliştirme ve ölçeklenebilir iPSC kültür sisteminin pratiğiişleyici 96 oyuklu plakalar. Bu yöntem laboratuar ölçekli iPSC kültürü ve yüksek hacimli iPSC üretimini köprü için tasarlanmıştır (örneğin, 10 7 - teknisyeni Haftada 1.5 x 10 9 hücre) yeni iPSC teknolojilerin geliştirilmesi olanlar sağlayan kolayca büyük donanım veya işçilik yatırımlar olmadan üretim büyütmek için. Bu yöntem, ayarlamak için nispeten pahalı olmayan bir kök hücre kültürü, bir programlama veya mühendislik deneyimi çok az gerektiren, özel bir hücre kültürü kaputu gerek kalmadan küçük bir ekipman alanına sahiptir, ve otomatik yüksek verimlilik orta sağlamak için standart hücre kültür teçhizatı kullanmaktadır Hücre üretimi. Amaç hücre kültürü kök yeni laboratuvarlar tarafından kullanılabilir ölçeklenebilir kök hücre kültürü yapabilen bir sistem geliştirmekti, manuel ekimi fikirlerini geliştirerek ya da kök hücrelerin çok sayıda üretmek için ekonomik bir vasıta isteyenler için bir engel bulanlar. Burada sunulan platform teknisyen etkisi kaldırırhücre kültürü kök ve tutarlı kök hücre üretimini sağlamak için besleme ve geçiş prosedürlerini normalleştirir.

Protocol

96 gözlü plaka formatında geleneksel yapışkan kültür koşullarını korurken Aşağıdaki protokoller için Gilson en pipetmaX olan robot sıvı taşıma sistemi, ölçeklenebilir kök hücre kültürü ve otomatik kolaylaştırır. Geleneksel 6-çukurlu plaka kültürü gibi, iPSCs ayrı koloniler, bir tek tabaka olarak değil, 96 oyuklu bir plaka biçiminde, bu protokol ile yetiştirilmektedir. Her oyuk izogenik ya da ayrı olabilir ve robot her bir oyuğa ayrılmış devam çünkü yapılandırma da paralel kültürlenebilir. kültürler özelleştirilebilir bir zamanlama ve kullanıcı böylelikle ekim yoğunluğu ve ölçek oranını kontrol ayrışma yöntemi ve bölme oranını seçer bir geçit programı beslenen bir beslenme programı: Tipik robotik iPSC kültür rutin iki aşaması vardır. Aşağıdaki protokoller yeni bir kültür besleme ve geçit gerçekleştirilir nasıl başladı ve iPSC kültürünü kolaylaştıran ek programlar nasıl açıklar.

1. Hazırlama Ekstrasellüler matris jel kaplı 96 oyuklu levhalar

  1. Altı yeni RT 96 oyuklu plakalar ambalajını çıkartın ve pozisyonlar 2, 3, 5, 7, 8, 9 (yatak pozisyonları Şekil 1A bakınız) robot yatak taşıma sıvısı üzerine yerleştirin.
  2. Yatak konum 6'da bir önceden soğutulmuş, 4 ° C 4-çukurlu çukur yerleştirin.
  3. Önceden soğutulmuş, 4 ° C 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12.
  4. Steril tekniği kullanarak bir kısım dökerek 25 ml 4 ° C DMEM / F12 ile yatak pozisyonunda 6 iyi ilk (sol çoğu) çukur doldurun. Alternatif olarak, transferi tamamlamak için pipet kullanın.
  5. (PLHR, Şekil 1A bakınız) 96-plaka kapaklarını çıkarın ve özel olarak tasarlanmış plaka kapağı tutan rafın içine her kaydırın. Temastan kaçınınplaka kapakları iç ile.
    Not: Bir tabak kapağın içini Taşıma veya bir kapağın içinde başka dışında bulaşma için mükemmel bir yoldur dokunan plaka kapakları istifleme.
  6. Robotik kontrolü dokunmatik tabletin kullanılması, iyi ön ıslatma işlemini başlatmak için düğmeler aşağıdaki dizi basın:
    1. "Bir Protokol çalıştır" düğmesine dokunun.
    2. "Hücre dışı matris jel ön ıslatılmış" seçin ve sonraki dokunun.
    3. Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için "deneme" dokunun.
      Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. "Kur atlamak" dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir.
    4. "Run Protokolü" düğmesine dokunun.
  7. Ön ıslatma işlemi (adım 1.6) sırasında 1.8 adıma geçin.
  8. Büyüme faktörü buz bir 4 mg kısım üzerine çözülme 50 ml içinde bulunan hücre dışı matris jel (GFRM) azalırkonik tüp -80 ° C'de saklandı. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde kısım tutun.
    Not: oda sıcaklığına gelmeye bırakılmış ve yararlı olmayacak eğer GFRM katılaşmaktadır.
  9. 25 ml'lik bir cam pipet ile 24 ml 4 ° C DMEM / F12 içinde 4 mg GFRM kısım yeniden süspanse edin. DMEM / F12 aktarırken, pipet GFRM kısım resuspending önce soğuması için 2-3 saniye duraklama.
  10. Ön-ıslatma işlemi (adım 1.6) tamamlandığında, 1.11 adıma devam eder.
  11. Yatakta pozisyonunda 6 çukur dördüncü kuyusuna DMEM / F12 GFRM karışımı 24 ml aktarın.
  12. Robotik kontrol touch pad kullanarak, hücre dışı matris jel kaplama işlemini başlatmak için düğmeler aşağıdaki dizi basın:
    1. "Bir Protokol çalıştır" düğmesine dokunun.
    2. "Hücre dışı matriks jel kısım" seçin ve sonraki dokunun.
    3. Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için "deneme" dokunun.
      Not: robot çalıştırmak ancak rathe değilr yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. "Kur atlamak" dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir.
    4. "Run Protokolü" düğmesine dokunun.
  13. Adım 1.12 tamamlandığında, plaka kapaklarını değiştirin.
  14. 37 ° C,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plakalar transfer ve plakalar kullanmak veya hafızaya hazır olacak bu noktada 24 saat orada tutun.
    Not: hafifletici koşullar altında, yeni kaplanmış hücre dışı matris jel plakaları önerilir inkübasyon, ancak 24 saatlik inkübasyon için O / N, 15-30 dakika sonra kullanılabilir.
  15. Tekrarlama protokol 1.1, 1.3, GFRM ile DMEM / F12 tüm kadar 1,5-1,6, 1.10 ve 1,12-14 kullanılır adımları.

2. Saklama Ekstrasellüler matris jel kaplı 96 oyuklu levhalar

  1. 37 ° C'de,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plakalar.
  2. İsteğe bağlı: Ahücre-dışı matrisin llow jel kaplı 96 oyuklu plakalar 2.3 adımına devam etmeden önce, oda sıcaklığına gelmesi.
    Not: Bu isteğe bağlı bir adımdır plakaları 4 ° C'de konulduğunda yoğunlaşma kurmak azaltacaktır.
  3. Pozisyonlar 2, 3, 5, 7, 8, 9 (yatak pozisyonları Şekil 1A bakınız) sıvı kotarma robotu yatak plakaları yerleştirin.
  4. RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12.
  5. Yatak konum 6'da dört çukur rezervuar yerleştirin.
  6. (En sağdaki) RT DMEM / F12 ile rezervuarın kuyusunu 4 doldurun.
  7. 96-plaka kapaklarını çıkarın ve PLHR içine her kaydırın.
  8. Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın:
    1. "Bir Protokol çalıştır" düğmesine dokunun.
    2. "Hücre dışı matriks jel kısım" seçin ve sonraki dokunun.
    3. Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için "deneme" dokunun.
      Not: Robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. "Kur atlamak" dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir.
    4. "Run Protokolü" düğmesine dokunun.
  9. Tamamlandığında, plaka kapaklarını değiştirmek ve makine yataktan plakaları çıkarın.
  10. 6 inç parafın film şeridi ile bir inç her hücre dışı matris jel (kapak plakası karşılayan) kaplı 96 oyuklu plakanın tüm yan etrafında sarılır. Hava geçirmez bir mühür oluşturmak için parafin filmi germek emin olun.
  11. İsteğe bağlı: tamamlanan hücre dışı matriks jel kaplama tarih plakaları Etiket, hücre dışı matris jel lot numarası, kullanıcı adı ve diğer bilgiler.
  12. Onlar kadar iki hafta boyunca kullanmak için iyi olacaktır 4 ° C'de plakaları saklayın.
    Not: Tabaklar başarıyla ancak bu tavsiye edilmez, iki haftalık sınırın ötesine kullanılmıştır.

3. Kök Hücre Colony Yayımlama Yoğunluk SahneCanlı veya dondurulmuş Kültür 96-kuyu Plate Formatında Gradyan: Nasıl başlatın veya bir Kök Hücre Hattı Normal Passage Aralıkları Geri Yükleme

  1. Donmuş bir kültür ile başlayan varsa, 3.2 adıma geçin. Zaten bir plaka üzerinde canlı kök hücre kültürü ile başlayan, adım 3.5 başlar.
  2. Buz sadece küçük bir yığın kalana kadar 37 ° C su banyosu içinde tüp dönen donmuş kültür çözülme.
  3. İsteğe bağlı: 10 uM Y27632 ihtiva eden taze SCGM süpernatan ortamı aspire ve 7 ml kök hücre pelletini, 300 x g'de 2 dakika süre ile hücre büyüme ortamı (SCGM), santrifüj kök R, 10 ml eritilmiş hücreleri ile seyreltilir.
    Not: Bu adım donma medya taşınmasını ortadan kaldırır.
  4. 3.6 Adım geçin.
  5. Canlı ile başlayan varsa, zaten kök hücreleri kaplama: geçit hücreleri normal olarak enzimatik veya non-enzimatik ayrışma kullanarak. 1,5-3000000 hücrelerinin toplam hasat etmeye çalışın; Genellikle, altı oyuklu plakanın bir de. Hasat hücreler santrifüj2 dk 300 xg'de, süpernatant medya aspire ve 10 mM Y27632 içeren 7 ml taze SCGM kök hücre pelletini. 3.6 Adım geçin.
  6. Hücreler sağlamak ya donmuş bir ya da canlı kültürden, 10 uM Y27632 7 mi RT SCGM içerisinde süspanse edilir.
  7. RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda tek uç rafın yük sütunu 12.
  8. Yatak 2 konumunda bir dört çukur rezervuar yerleştirin.
  9. Yerleştirin yeni bir hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plaka yatağı 5 konumundaki 37 ° C'ye kadar ön-ısıtılır ve PLHR yerleştirerek kapağı çıkarın.
  10. Pipetlemeyin ile rezervuarın kuyuya 3 yeniden süspanse hücrelerin 7 ml aktarın veya steril dökün.
    1. Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın:
    2. "Bir Protokol çalıştır" düğmesine dokunun.
    3. "Tohum Yoğunluk Gradient" i seçin ve yanındaki dokunun.
    4. Kullanıcı kararı: select önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için "deneme" dokununed programı.
      Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. "Kur atlamak" dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir.
  11. "Run Protokolü" düğmesine dokunun.
  12. Seyreltme serisi tamamlandığında, aşağıdaki besleme kadar 37 ° C,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör plaka ve yeri yeniden kapsamaktadır.
  13. İsteğe bağlı: Tarihe, gerilme bilgileri, kullanıcı adı, medya türü ve diğer ilgili bilgileri ile plaka etiketleyin.
  14. Aşağıdaki Protokolü 4 kullanılarak gerektiği gibi önümüzdeki birkaç gün içinde, 96-plaka besleyin.
    Not: Tipik bir kök hücre plakası tam bir medya değiştireceğim kez her 24 saat gerektirir ve SCGM beslenmesi için Y27632 içermez; Sadece geçtikten sonra ilk tohumlama sırasında. Beslenme öncesinde, kirlenme ve koloni yoğunluğu plaka kontrol edin. Koloni yoğunluğu izleme konusunda daha fazla adım için 3.16 bakın.
  15. C yakın Önümüzdeki birkaç gün içinde, çeşitli sütunlarplaka girmek (genellikle sütunlar 5-8) geçiş için ideal bir yoğunluk yaklaşım olacaktır; Bu yoğunluk tanımlamak için, akılda aşağıdaki bilgilerle Şekil 3B'de gösterilen yoğunluk aralığında 96-plaka karşılaştırmak:
    1. Passage kolonilerin çoğunluk arasındaki boşluk bitişik koloni çapı yaklaşık% 25 olduğu zaman.
      Not: mantığı geçiş zamanı tanımlamak için beslenme ve büyüme başka bir döngü kaçınılmalıdır temas, yapım kolonilerde neden olduğunu ifade etti.
  16. Üniform seyreltilmiş plaka başlatmak ve düzenli kültürünü başlamak için ideal bir yoğunluk ve geçit olan bir sütun seçin. Geçişine Protokol 5'e bakınız.

4. Besleme 96 oyuklu plaka Kök Hücre kolonileri

Not: Aşağıdaki protokol, bir 96 oyuklu kök hücre koloni plakanın besleme tarif etmektedir. teknik, paralel toplam 6 plakaları barındıracak kadar ölçeklendirilebilir.

  1. 96-kuyu s kaldır37 ° C ile tem hücre kolonisi levha,% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör.
  2. Kirlenme ve hücre yoğunluğu için plaka kontrol edin. Beslemek için, koloni yoğunluğu ideal bir kanalı yoğunluğunun altında olduğundan emin olun. Yoğunluk hakkında bilgi için Şekil 3B bakın.
    Not: Kirlilik olarak bulanık ortamı sunabilir ve hoş olmayan bir koku eşlik. Küçük, tabii ki sigara iPSC agrega da mikroskobik denetimi altında görülebilir. Hücre yoğunluğu değerlendirmek için yukarıdaki adım 3.16.1 bakın.
  3. Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun.
  4. RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu rafın yük sütunu 12.
  5. Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin.
  6. Steril dökmek veya pipet transferi yoluyla Y27632 olmadan 2 8 ml taze yatak pozisyonu, RT SCGM içinde çukur kuyusunu 3 doldurun.
  7. PLHR yerleştirerek 96-iyi kök hücre koloni plakası kapağını çıkarın.
  8. KullanmaRobotik kontrol touch pad, düğmeler aşağıdaki kombinasyonuna basın:
    1. "Bir Protokol çalıştır" düğmesine dokunun.
    2. "Koloni Bir Plaka Yem" ve yanındaki dokunun seçin.
    3. Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için "deneme" düğmesine dokunun.
      Not robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. "Kur atlamak" dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir.
    4. "Run Protokolü" düğmesine dokunun.
  9. Besleme protokolü tamamlandığında, 96 oyuklu kök hücre koloni plaka yeniden kapak ve 37 ° C'de geri dönmek için,% 5 CO2, aşağıdaki besleme ya da geçiş kadar nemlendirilmiş bir kuluçka cihazı gereklidir. Bu, genellikle, 24 saat sonra, gereklidir.
    Not: Tarih, ortam türü, kullanıcı adı ve diğer ilgili bilgilerle plaka kapağında besleme olayı kaydetmek için tavsiye edilir.

5. Pasajlanması 96 oyuklu PlHücre Koloni Kök yedik

  1. Birkaç beslenme döngüsünden sonra 96 ​​de kök hücre koloni plaka geçişi için hazır olacaktır. Bu protokol, 01:12 bölme oranını temsil eden, tek bir 96 oyuklu plakaya bir sütun geçişini tarif etmektedir. Kullanıcı bölünmüş oranını tanımlar ve komşu olmayabilir kuyuları seçerek dahil, split kuyular veya sütun herhangi bir sayı seçebilirsiniz.
  2. Olup kanalı belirlemek için 3B Şekil 96 oyuklu kök hücre koloni plakası yoğunluğu Karşılaştırması. kolonilerin çoğunda arasındaki boşluk, bitişik koloni çapı yaklaşık olarak% 25 ya da daha sonraki bir besleme birbirlerine büyüyen koloniler ile sonuçlanacaktır idealdir geçit yoğunluğudur.
  3. Hiçbir kirlenme olmadığından emin olmak için mikroskop altında 96-iyi kök hücre koloni plakasını inceleyin.
  4. Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun.
  5. RT 200 ul pipet ile yatak pozisyonunda 1 ucu yükleme rafa Yük kolonlar 8-12ipuçları.
  6. Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin.
  7. Boş çukur kuyu 1 bırakın, kuyunun 2 8.5 ml SCGM + 10 uM Y27632 koymak kuyuya 3 3.5 ml 30% proteolitik ve kolajenolitik ayrışma ayıracı (veya EDTA bazlı ayrılma ayıracı) koymak, kuyunun 4 4.5 ml PBS koydu.
    Not: Bütün reaktifler oda sıcaklığında veya 37 ° C de olabilir. PBS ile seyreltildi% 30 RT proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktifi adipoz kullanıldı ve fibroblast iPSC kültürü burada tarif edilen.
  8. Yatak 5 konumundaki yeni bir önceden ısıtılmış 37 ° C hücre dışı matris jel kaplı 96 oyuklu plaka koyun.
  9. 96 oyuklu kök hücre koloni plakası kapağı, hem de yeni bir 96 oyuklu plaka kapağı çıkarın ve PLHR onları hem yerleştirin.
  10. Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın:
    1. "Bir Protokol çalıştır" düğmesine dokunun.
    2. "Koloni Bölünmüş 01:12 sütun 1" seçin ve sonraki dokunun.
    3. Kullanıcı kararı: dokunun "test sürüşü" kullanmak içinadım-adım sihirbaz seçilen programı önceden test etmek için.
      Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. "Kur atlamak" dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir.
    4. "Run Protokolü" düğmesine dokunun.
  11. Geçit protokolü bittikten sonra, her iki plakaları yeniden kapsamaktadır.
  12. İsteğe bağlı: Gerekli bilgilerle yeni plaka etiketleyin (örneğin, tarih, hücre hattı, geçit sayısı, ortam türü, kullanıcı adı, vb).
  13. 37 ° C, her iki plakaları Dönüş,% 5 CO2, aşağıdaki besleme ya da geçiş kadar nemlendirilmiş bir kuluçka cihazı gereklidir. Not: Bir sonraki beslenme 24 saat sonra tipik olarak.
    Not: Hücreler ve koloniler bölme 2-3 saat içinde plaka takmak ve çok yayılmış bakmak gerekir. Bu, Rho-kinaz inhibitörünün varlığı nedeniyle ve hücreleri (örneğin, parke taşı paketlendi koloniler wi karakteristik kök hücre morfolojisi yoğunlaştırmak ve sergileyecekİlk Rho-kinaz inhibitörü ücretsiz beslenme sonrası büyük çekirdek oranı küçük hücreli hacmi) th.

Üretim 6. Hasat 96 gözlü levhalar Kök Hücreler

Not: Hücre kolonileri kültürü sırasında herhangi bir noktada kullanım için hasat edilebilir Stem. Hücreler geçit hazır olduğunuzda Genellikle bu gerçekleşir (protokolü 5). Bu protokol, 96 oyuklu bir kök hücre koloni plaka on sütun hasat açıklamaktadır.

  1. Hiçbir kirlenme olmadığından emin olmak için mikroskop altında 96-iyi kök hücre koloni plakasını inceleyin.
  2. Bir eğimli, 37 ° C rampa yatakta 3 pozisyonunda 96 oyuklu kök hücre koloni plaka koyun.
  3. Yük sütunlar RT 200 ul pipet uçları ile yatak pozisyonunda 1 ucu yükleme raf 11 ve 12.
  4. Yatakta 2 pozisyonunda 4-iyi bir çukur yerleştirin.
  5. Bırakın yalak kuyu 1 boş, kuyunun 2 8.5 ml SCGM put 3.5 ml% 30 proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktif (veya EDTA bazlı ayrılma reaktif) kuyuda3, kuyunun 4 4.5 ml PBS koydu.
    Not: Bütün reaktifler oda sıcaklığında veya 37 ° C de olabilir.
  6. PLHR 96-de kök hücre koloni plaka kapağı ve yer çıkarın.
  7. Robotik kontrol touch pad kullanarak, düğmelerin aşağıdaki kombinasyonuna basın:
    1. "Bir Protokol çalıştır" düğmesine dokunun.
    2. "Koloni Hasat Sütunları 2-12" seçin ve sonraki dokunun.
    3. Kullanıcı kararı: Seçilen program önceden test etmek için adım-adım sihirbazı kullanmak için "deneme" dokunun.
      Not: robot çalışmaz ziyade yazılım yazılım sorunları için protokol sınar. "Kur atlamak" dokunarak kurulan protokolleri ile kabul edilebilir.
    4. "Run Protokolü" düğmesine dokunun.
      Not: toplama işlemi tamamlandıktan sonra, hücreler yalak kuyuya 2 olması ve toplama için hazır olacaktır.

Representative Results

Bir tabak tabanlı robot kök hücre kültürü platformunun geliştirilmesi.

iPSCs talebi nedeniyle ilaç geliştirme ve rejeneratif tıpta kendi programı büyüyor. Yine ölçeklenebilir üretim birçok araştırmacı dışlar ve kurulan yapışık kültür yöntemleri ayrıldığı nispeten karmaşık ekipman süspansiyon kültürü 32 odaklanmıştır. Aksine büyük ölçüde böyle bir süspansiyon kültürü geçiş veya mikrotaşıyıcı kullanılması gibi kanıtlanmış plaka bazlı kök hücre kültürü yöntemleri, değiştirmek yerine, miniaturizing ve mevcut yapışık iPSC kültürü teknikleri otomasyona üzerinde duruldu. İlk amaç besleyen ve tüm kültür süreci normalleştirmek için Pasajlanması otomatik oldu. Mevcut teknoloji ile hızlı ölçek kadar yetenekli bir platform da gerekli oldu. Otomatik bir sıvı taşıma sistemi (Şekil 1) kullanılarak, bir 96-çukurlu plaka içindeki bir yöntem olup, kültür kök hücreleri geliştirildi, bu amaçlara ulaşmak için. protbeslenme ve geçişi için sıvı taşıma robotu burada geliştirilen ocols bir teknisyen tarafından bir santrifüj adımı veya sürekli izleme gerekmez. Bu protokoller iki besleyici ücretsiz iPSC hatları ile geliştirilmiştir; fibroblastlardan alınan bir ve adipoz hücrelerinin 33 diğer.

Bilgisayar kontrollü bir sıvı taşıma sistemi (Şekil 1A) ön ve arka hareket eden bir düz yatak oluşmaktadır. Yatakta standart hücre kültürü plakaları, sıvı rezervuarları ve diğer özel donanım kabul klipleri istinat basıncı dokuz, yaklaşık 5 x 3.3 inç numaralı girintiler vardır. sağa (yatak hareketine dik) yanı sıra yukarı ve aşağı sol pipet kafa hareket eder. Birlikte yatak, pipet kafası kaldırmak veya doldurulabilir raftan pipet uçları toplayıp sonra herhangi bir yere yatağa medya sunmak için programlanabilir. Gerekirse, 96 oyuktan her biri çapraz kirlenmeyi elimine etmek için, ayrı tutulabilir. Bu konfigürasyonda, 0Ortam 200 ul pipet başın her ucu tarafından hareket ettirilebilir, ancak diğer hacim aralıkları, ucu boyutuna göre mümkündür.

Standart plakalar, enzimatik ya da kimyasal ayrışma kök hücreleri pasaj zaman, tipik olarak 37 ° C 'de inkübasyon gerektirmektedir. Başlangıç ​​testi, bir proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktif ya da iki 96-yuvalı iPSC hatları için üretilen koloni boyutu ayrışması ve homojen olana dek bir süre için, oda sıcaklığında hem de daha 37 ° C de daha iyi bir performans EDTA esaslı bir reaktif ile ayrışma teyit (veriler gösterilmemiştir). Bölünmüş işlemi otomatik ve ve kabul bir inkübatör, eğimli, sıcaklık kontrollü rampaların üzerinden plakaları hareket önlemek ve tekrarlanabilir standart kültür plakaları (Şekil 1A) inşa edildi konumlandırmak için. Rampaları 37 ° C, bir proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktif ya da 96 oyuklu plakalar ile iPSCs EDTA göre ayrışma ısıtıldı zaman 37 ° C inkübatör (veriler n yerleştirilmiş plakalar karşılaştırılabilirot) gösterilen. eğimli rampalar, aynı zamanda elde edilen, yaklaşık 10-15 ul bir artık hacim kalan düz bir plakadan aspirasyon ise oyuk en düşük noktasına ulaşmadan bütün bir kuyunun içeriğini (en az 5 uL artık hacim) toplamak için pipet uçları etkinleştirmek için kullanılmıştır Hücre kaybı. eğimli rampa da kuyular yıkanmış (toz haline getirildi) iyi eğimli üstündeki medya püskürtülmesi yoluyla ve altta toplamak için izin verdi.

96 gözlü plaka formatında kök hücrelerin Robotik kültürü; beslenme ve Pasajlanması.

Robotik sıvı taşıma sistemi kullanılarak iPSCs Kültür iki aşaması vardır; geçit ve beslenme. Bir koloni geçişi için hazır olduğu zaman, tekrar geçit hazır (Şekil 1B) kadar eşit aralıklarla beslenir yeni bir levha tohum için önceden tespit edilmiş bir oranda bölünür. Dondurulmuş ya da olmayan 96 oyuklu kültür 96 oyuklu bir formatta başladı ve hemen geçişi / besleme butonu edilebilirdöngüsü. Bir plaka çoğunluğu koloni korumak için kullanılmayan hücreler, diğer kullanımlar için hasat ve bu sistemin üretim bileşenini temsil eder.

Ortamın bir kısmı ya da her bir kültür süresinden sonra çıkarıldı ve bir atık haznesi yatırılır 96 oyuklu kültür iPSCs Besleme başarılı olduğunu. Sonra taze medya aynı plakaya aliquoted edilir. Robot, yeni medya ile klimalı ortam karıştırma dahil tamamen özelleştirilebilir beslenme için de her ayırmak için yeni ipuçları ve medya olukları kullanabilirsiniz.

Kök hücrelerin tipik geçişi ayrışma ve genellikle bir santrifüjleme adımı için bir yöntem gereklidir. Burada anlatılan protokoller ayrışma normalleştirmek ve santrifüj ortadan kaldırmaya yöneliktir. Robot 37 ° C eğimli rampalar monte 96 oyuklu plakalara ayrılma reaktif veriyorsa kanalı protokolü başlar. Önceden ayarlanmış bir süre sonra, ayrışmış hücreler kullanıcı contro sahip bir yıkama hareketi ile toplanırpozisyon tekrarı, ses ve toz haline getirme oranı üzerinden l. Enzim zaman, öğütme hızı ve öğütme tekrar sayısı ayrışmış koloni boyutu ve homojenlik (Şekil 2) değiştirmek için yeterli, ama her bir parametre, belirli bir hücre hattı gereksinimlerine uyacak şekilde ayarlanabilir. Bu kontrol değişen oranlarda, pozisyonları ve tekrarlı pipetlemeyin teknisyenler tarafından tanıtıldı değişkenliği ortadan kaldırır. Ayrışan hücreler toplanmış ve taze ortam ile bir rezervuarda toplanmış sonra, yeni bir plakaya dağıtılmıştır. Alt-tabaka bozulması veya işlem enzim bağlı hücre ölümünden, santrifüjleme ve tohumlama sorunlarını önlemek için çözülme reaktifi güvenilir bir tohumlama ile sonuçlanmıştır olarak kabul edilebilir bir ayrışma minimum noktasına seyreltildi. Bu teknik, temel-8 35 gibi, aynı zamanda, düşük bir protein ortam içinde etkili olan bir görece protein yüksek içeriğine sahip mTeSR1 ortamı 34 bir proteolitik ve kolajenolitik ayrılma reaktifi, etkili, ancak

Geçtikten sonra kök hücrelerin ekim yoğunluğu kontrol eden rutin ve başarılı kök hücre kültürüne için her şeyden önemlidir. Çok düşük ya da yüksek tohumlama ektopik farklılaşma ve düzensiz geçiş aralıkları neden yanında pluripotensin kaybına neden olabilir. (: 6 parçalı, 1), 6 gözlü bir plakanın bir de tamamen yeni bir 6-yuvalı plaka tohum için kullanıldığında tipik kök hücre kültürü oranı bölme dayanır. Sıvı taşıma robotu ile bu oran kullanıcının ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir (örneğin, 1: 6, 1: 9, 01:12, vs.) ve geçit aralığına en büyük etkiye sahiptir. Robot ampirik olarak tespit edilmelidir kullanıcının ihtiyaçlarına bağlı olarak daha az bir sütun, tek tüm sütunu (8 kuyu), ya da birden fazla sütunu toplayabilir. 01:12 bölmek zaman adipoz ve fibroblast türevli iPSCs dördüncü gününde geçişi ile düzenli üç günlük beslenme programını devam. Bu durumda, bir sütun hasat edildi ve her bir döngü (Şekil 3A) ile 01:12 bölünmüş oluşturma, yeni bir 96 oyuklu plaka tohum kullanıldı. Kalan 11 kuyu downstream uygulamalar için daha sonra kullanılabilir. Bu 11 üretim kuyuları hasat etmek için, geçiş kuralı hücreleri toplanması için bir çukur içine çökelmiş haricinde tekrarlanmıştır. Seçenek olarak ise, hücreler plaka üzerinde bırakılabilir ve direkt olarak kullanıldı.

Rutin bölme takvimi saymadan geçişi tutarlı ekim yoğunluğu geçişini sağlamak ve korumak için, bizim protokoller koloni geçişi için ideal yoğunlukta olduğu sütun aynı önceden belirlenmiş sayıda bölme için arayın. Kullanıcıların geçişi için uygun yoğunluk belirlemenize yardımcı olmak için, görüntüleri bir dizi vurgulanan ideal geçiş yoğunluğu (Şekil 3B) ile yoğunluklarının bir dizi gösteren üretilmiştir. Geçit, bir teknisyen kendi plaka inceler ve yoğunluk görüntü ölçeğine karşılaştırır belirlemek için. Fikirgeçide l yoğunluğu adipoz ve fibroblast türevli iPSCs kültüründen tespit ve en kolonilerin arasındaki alan, bitişik koloni çapı yaklaşık% 25 olduğu zaman olduğu bulunmuştur. Bu koloniler homojen dağıtılmış olması önemlidir. Ilave bir besleme döngüsü ektopik farklılaşması için bir tetikleyici olan temas koloniler neden olur, çünkü, koloni ayırma Bu miktar arzu edilen maksimum yoğunluğu ile bağıntılıdır.

Burada geliştirilen gerekli protokolü, 96 oyuklu bir formatta bir başlangıç ​​kültürü olarak nasıl bir yoğunluğa sorun sonra bir kültür sıfırlamak için nasıl ele almaktadır. Yeni bir kültür başlatıldığında, Pasajlanması önce en iyi ekim yoğunluğu ve besleme döngüsü sayısı bilinmemektedir. Tohumlama sonra kullanılabilir bir yoğunluk sağlamak için, robot, bir seri seyreltme (Şekil 4A), bir 96 oyuklu plaka üzerinde mevcut veya çözülmüş hücreleri dağıtır. Böyle bir gradyan Örnek sonuçlar Şekil 4B-E'de gösterilmiştir. Birkaç beslenme sonrasıdöngüleri, bazı sütunlar bir teknisyen düzenli kültürünü başlatmak için üniform seyreltilmiş plaka tohum robot kullanan hangi noktada bölmek için ideal bir yoğunluk, yaklaşım. Bu yoğunluk gradyan protokolü de düzensiz bir plaka düzenli geçiş aralıkları ve koloni homojenliği geri kullanıldı. Geçit gecikmiş veya cevapsız ise geçit çok erken ise, koloni yoğunluğu çok düşük olduğu ve bireysel koloniler eşit iyi dağılmış olmadan çok büyük hale gelebilir, oysa koloni yoğunluğu ve boyutu çok yüksek olur. yoğunluk gradyan protokolü bu sorunları çözer ve kullanıcı kuyuların bir ideal olarak seribaşı kümesi seçerek yeniden sağlar.

İki iPSC hatları robotik kültürün 3 ay sonra pluripotent kaldı.

Kök hücre pluripotensin Bakım olumsuz kültür koşulları 36,37 etkilenebilir. Adipoz ve fibroblast iPSC hatları (sırasıyla a-iPSC, K-iPSC) plurip muhafaza edilen olmadığını değerlendirmekotency, iki hat 3 ay boyunca, yukarıda tarif edilen ve daha sonra pluripotense belirteçler ele alınan robot taşıma sıvıya kültive edildiğinde, robotik uzun bir süre için 96 oyuklu plakalar içerisinde kültürlendi. Bu dönem için her iki satır santrifüj olmadan bir proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktif ile 20'den fazla kez geçirilmiştir. SSEA-4 hücre yüzey (Şekil 5A-L) üzerine gözlenmediğini Oct4 ve Nanog'un lekeli a-IPSC f-iPSC hatları Sabit 96 oyuklu plakalar bu markerlerin nükleer birikimi görüldü. 41 - Bu pluripotent iPSCs 38 önceki raporlar ile uyumludur. DAPI ile karşıt da üç Pluripotency belirteçlerinin pozitif değildi herhangi bir ek hücreleri ortaya koymamıştır. Kromozom anormallikleri kök hücre kültürü 42,43 gözlenen ancak Şekil 5A-L gösterilenler gibi Pluripotency belirteçlerinin dağılımını etkilemeyebilir. Karyotype analizi hem robot geçişli iPSC hatları robotik kültür yöntemi normalde (Şekil 5M-N) oluşabilir ötesinde kromozomal istikrarsızlık tanıtmak değildi düşündüren, 46 normal kromozomlar vardı gösterdi.

Kurulan kök hücre gen ekspresyonu robotik kültürlenmiş iPSC hatlarında 1,41,44,45 işaretleyicileri prob için, toplam RNA, boyama paralel olan ve karyotipleme toplanmıştır. Her ikisi de 96-plaka iPSC hatları her satırın ayırt kardiyomiyositler vermedi oysa Pluripotency belirteçlerinin Nanog, POU5F1 ve Rex1 benzer bir ifade vardı, ne de (HDF'ler) (Şekil 6) insan dermal fibroblastların ayrı bir hat yaptık. her iki hattan elde edilen kardiyomiyositler MYL7 HDF'ler ise pozitif ve kök hücre MYL7 ifade vermedi. İkisi de iPSC hatları, küçük molekül ile kardiyomiyositlere ayırt edildi, Wnt yolunun manipülasyon tekniği 46 geçenlerde açıklanan (Şekil 7) ile pozitif bulunmuştur. 96 oyuklu bir formatta kardiyomiyositlere farklılaşma kuyu% 80'den fazla başarılı oldu (veriler gösterilmemiştir). Birlikte, bu veriler, 3 ay ve robot kültür 20'den fazla geçit kardiyomiyositlere da farklılaşma yeteneğine sahip olan pluripotensin ile uyumlu bir transkripsiyon programı gösteren kromozomal normal hücreleri ile sonuçlanmıştır göstermektedir.

Şekil 1
Şekil robotik kök hücre kültürü ekipman ve tipik iPSC kültürü rutin 1. Genel Bakış. Için tipik bir yatak düzeni ile gösterilir (A) Robotik sıvı taşıma sistemi 96 oyuklu hücre kültürü kaynaklanıyor. Yeni steril pipet uçları (ipuçları), çıkarılabilir uç çöp konteyneri (Atık), multi-de otoklavlanabilen çukur gerekli tutun sıvı reaktifler (Sıvılar), 96-kuyu plakalar konumlandırılmış bir d kontrollü bir sıcaklığa desteklenen eğimli rampa (96 kuyu plakalar), sağ / sol ve yukarı / aşağı (Pipet kafa) hareket 8 kanallı robot pipet kafası. Plaka kapağı tutan raf (PLHR). Aşağıdaki tabloda gösterilmiştir Yatak pozisyon sayıları. Besleme ve Passage: (B) Robotik iPSC kültürü iki aşaması vardır. Bir koloni plaka geçişine hazır olduğunda hücre üretimi döngüsü başlar. Kullanıcı de geçit istenen oranını seçer ve robot tohumlar 96 oyuklu plakalar, yeni bir grubu daha sonra tekrar geçmesi için hazır olana kadar düzenli aralıklarla beslenir. Plakalar geçişi için hazır olduğu zaman, her bir plakanın en sonraki koloni plakaları tohum için kullanılmaz ve bu nedenle sistem, üretim fazı temsil eden, diğer kullanımlar için kullanılabilir. Dondurulmuş veya mevcut hücre hatları her zaman tanıttı ve yem / geçiş döngüsünde muhafaza edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

hep ">:" keep-together.within-page = fo "e_content Şekil 2,
Şekil 2,. Robotik sıvı kullanım parametreleri iPSC koloni ayrılma özelliklerini kontrol etmek için de kullanılabilir. Her bir Örnek görüntü hala 96-kuyu içinde süspansiyon haline getirilmiş iken, fibroblast türevli iPSCs belirtilen tedaviden sonra ayrışmış gösterir. (Üst Satır, A - C) Enzim Zaman, hiçbir öğütme. 96-çukurlu tablalarda büyütülmüştür Fibroblast kaynaklı iPSCs uygulandı proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktif ayrılma ve bir robot toz haline süreleri artan tabi tutuldu. (Orta Row, D - F) toz haline getirilmesi oranı 3 dakika enzim. Hücreler, proteolitik ve kolajenolitik ayrışma reaktif tedavi üç dakika maruz bırakıldı ve daha sonra 175 ul büyüme ortamı uygulandı ve her bir oyuğa, belirtilen hızda yukarı ve aşağı bir kez pipetle. ul / sn = mikrolitre Per ikinci. (Alt Satır, G - I) toz haline getirilmesi tekrarlar, 3 dakika enzim, 160 ul / sn. Hücreler 3 dakika proteolitik ve kolajenolitik ayrışma ayıracı maruz bırakıldı, 175 ul büyüme ortamı daha sonra 160 ul / tekrarlama belirtilen sayıda sn öğütüldü, uygulanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Geçit düzenli bir beslenme / geçit döngüsünü sürdürmek için zaman Şekil 3. Tipik yağ ve fibroblast iPSC koloni bakımı şeması ve koloni yoğunluğu görüntüleri bir dizi belirlemek için. (A) adipoz veya geçide fibroblast 96-iyi iPSC koloni hazır başlayarak, hücrelerin bir sütun santrifüj lenmeden robot üzerinde geçirildi ve seyreltilmişPlaka tekrar geçit hazır olana kadar bundan sonra belirli aralıklarla beslenen edildi 12 yeni sütunlar. Hücre üretimi için, koloni sağlamak için kullanılmayan sütun geçirilmiş ve daha sonraki kullanım için toplanır. Sütun Herhangi bir sayıda genişleme hızını kontrol etmek geçişli olabilir. Geçit, yoğunluk görüntüleri bir dizi, her 24 saat kullanıcılara sağlanan yakaladığı zaman (B) belirlenmesi. Üst kırmızı kutusunda (ilk tohumlama sonrası 72 saat içinde) koloni geçişi için yeterince yoğun olmadığı ve beslenmelidir. Yoğunluğu (~ 96 saatte) yeşil kutuda gösterilen eşleştiğinde, koloni geçişi için ideal bir yoğunlukta olduğunu. 120 saat ile, koloni geçişi için çok yoğun ve bu senaryo kaçınılmalıdır. İkincisi kesinlikle önerilmez bu yoğunlukta bir ekim yoğunluğu degrade ama rutin kültürü ile çözülebilir. Beyaz çubuk 200 mcM eşittir. Daha büyük bir Versi görmek için buraya tıklayınızbu rakamın üzerinde.

Şekil 4,
Şekil 4. 96-iyi robotik kültür sistemi kullanıcıları donmuş veya aktif hücre hatları kültürleri başlatmak ve tohum degrade gerçekleştirmek için olanak sağlar. (A) hücre çözümü donmuş hücre stoktan veya aktif kültür hasat sonrası kullanıcı tarafından hazırlanan ve yerleştirilir robot. robot sistemi daha sonra bir sütun tarafından dağıtılan yoğunluk gradyanı ile 96 oyuklu plaka boyunca başlangıç ​​hücre çözeltisi dağıtmak için bir seri seyreltme protokolü gerçekleştirir. (B - E) A oniki sütun dört hücre yoğunluğu örnekleri, yoğunluk gradyan tohumlama protokolü sonra 48 saat. Beyaz çizgiler 225 mikron eşit. Bu büyük halini görmek için tıklayınızrakam.

Şekil 5,
. Şekil 5. pluripotensin 22 (yağ) ya da 23 (fibroblast) geçitler (~ 3 ay) boyunca 96 oyuklu robotik kültür sırasında adipoz ve iPSC hatları türetilmiş fibroblast için muhafaza edilmektedir (A - M) Yağ ve fibroblast türevli iPSC hücre çizgileri robotik edildi beslenen ve geçişli daha sonra sabit ve DAPI karşıt olan pluripotense belirteçleri Oct4, Nanog veya Ssea4 lekeli 22 veya 23 geçişleri için 96-yuvalı plakalar içinde santrifüj olmayan metinde anlatıldığı gibi. Beyaz çubuk, 100 mikron eşittir. (M - N). A tarif edilen 46 kromozom normal tamamlayıcı ortaya karyotip analizi için sunuldu paralel kültürleri daha büyük bir versiyonu o görmek için buraya tıklayınızBu rakam f.

Şekil 6,
Şekil 6. Yağ (96-A) ve fibroblast (96-F) elde edilen iPSCs pluripotense gen ekspresyonunu muhafaza 96 oyuklu robotik biçiminde 20 pasajdan fazla kültürlendi ve kardiyomiyositlerde ayrışmıştır. Toplam mRNA, her iki robot tarafından kültürlenmiş iPSC hatlarından özütlendi kardiyomiyositlerde her iki hattan ayırt yanı sıra, (Cm-A = adipoz iPSC türetilmiş kardiyomiyositlerde, CM-F = fibroblast iPSC 14 gün diferansiyasyon indüksiyonuna sonra toplanan, kardiyomiyositlerde türetilmiştir) ve pluripotense belirteçleri Nanog, POU5F1, Rex1 araştırmak için RT-PCR için kullanılan Kardiyomiyosit işaretleyici MYL7 ve yükleme kontrol GAPDH. İnsan dermal fibroblastları (HDF), aynı zamanda toplandı ve olmayan iPSC olmayan kardiyomiyosit kontrol olarak kullanılmıştır. tıklayın Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 7,
. Şekil 7. Fibroblast ve adipoz türetilmiş iPSCs oyuklu 96 uzun vadede robotik kültürü sonra kardiyomiyosit ayırt yeteneğini muhafaza (A - H) Yağ ve fibroblast iPSCs kardiyomiyositlere farklılaştırılmıştır 20 pasajdan fazla 96 oyuklu robotik biçimde kültürlenmiştir . 14 gün farklılaşma indüksiyon sonrası, 96-plaka bağlı kardiyomiyositler ayrışmış ve troponin T (kırmızı), F-aktin (yeşil) ve çekirdekleri (mavi) immün için cam slaytlar üzerine düşük yoğunlukta kaplandı. Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümü.

p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/>
Şekil 8. 96-plaka kök hücre kültürü büyütülmesi. Kök hücre üretimi kadar Ölçek plakaların sonraki grup tohum için kullanılan plakaların sayısına bağlıdır. Kullanıcı ya her bölünmüş fırsatta plakaların aynı sayıda Pasajlanması tek üretim seviyesini korumak veya daha fazla tabak tohumlama yoluyla üretimini genişletebilirsiniz. Örneğin, döngü 0, tek bir 96-deney levhası, bir 12 kat genleşme yaratarak, on iki yeni plakalara (Döngü 1) geçişli edilir. On iki levha bir ilâ on iki levha (2 Döngü 1) 'in bir dizi yeni için geçişli veya daha çok tabakayı (3 Döngü 2) Pasajlanması genleştirilir, bu oran muhafaza edilebilir. Geçiş sırasında, koloni korumak için kullanılan herhangi bir levha downstream uygulamalar için kullanılabilir. Bu nedenle, rutin 12 tabak Pasajlanması iki pasajlar gibi birçok 144 olarak plakaları elde olabilir: koloni bakımı için 12 ve 132 diğer kullanımlar için."> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 9,
Hücre üretimi için 96 oyuklu plaka bazlı kültür Şekil 9. verimliliği büyük ölçüde el ekimi aşmaktadır. Şekil 8'de belirtildiği gibi, tek bir plaka daha sonra 144 plakalara geçişli olabilir on iki tabak, tohum geçişli olabilir. Bu genişleme oranı, iki bölme fırsatların elde edilebilir. Bir teknisyen bunlar mikroskop incelemek ve robot üzerine yerleştirmek için bir 96 oyuklu plaka ile yaklaşık 30 saniye harcama ise, bir 6-yuvalı plaka beslemek için yaklaşık 3.5 dakika sürer. Teknisyen 144 plakaları taşıyan, onlar beslemek için özel 8 saat gerektirir manuel kültürü ise robot ile beslerken. Yaklaşık 1.2 saat işleme plakaları geçirecek v için tıklayınızBu rakamın büyük bir sürümünü iew.

Discussion

Bu çalışmada küçültüyor ve aynı zamanda verimli ölçek yukarı sağlarken bir 96-plaka biçiminde beslenme ve geçit otomatik iPSC üretimi için robotik kültürün bir yöntem geliştirdi. Bir sıvı kotarma robotu rutin enzimatik ayrılma düzenli aralıklarla iPSC koloniler ve geçiş onları beslemek için kullanılmıştır. Robot, aynı zamanda hücre dışı matris jel kaplanmış plakalar üretilmesi ve tohum yoğunluğu gradyanı gerçekleştirmek için programlanmıştır. Fibroblast ve adipoz türetilmiş iPSCs daha büyük 20 pasajlar, yaklaşık 3 ay boyunca bu sistemde kültürlendi zaman stabil karyotipleri gibi, pluripotense, muhafaza edilmiştir. Her iki hücre dizisi kardiyomiyositlerde farklılaşma sahip idi. Birlikte, burada açıklanan protokollerin koleksiyon kültür kök hücrelere çok az kök hücre kültürü deneyimi veya özel kültür ekipmanına sınırlı erişimi olan kullanıcılar sağlar ve yüksek hücre üretimini ya da çok az emek ve maliyetle taşıma çoklu çizgi elde.

44,47 - 49 pluripotensini korumak için. Ölçeklenebilir kök hücre kültürü verimi pluripotent hücrelerin diğer formatlar 20,23,29 bu plaka bazlı yöntem adaptasyonu gibi süspansiyon kültür biçiminde esasen hiçbir değişiklik, kimyasal madde veya Rho-kinaz inhibitörü 20 uzun süreli kullanımı köpük önleyici kullanımını gerektirir iken. Kültür koşulları benzer çünkü bu plaka bazlı yöntem, bu nedenle hızlı bir şekilde ve tahmin edilebileceği gibi, yeni çizgiler ağırlayacak. Hastalık modelleme iPSCs kullanımı 4,6,19,50 arttıkça, yeni iPSC çizgileri sürekli olarak üretilir. biçimine üzerine geçiş bariyer l çünkü burada açıklanan teknikler yüksek hacimli ve verimlilik orta kültür yeni hatlar için en uygunah. Bu aynı zamanda sömürgeleri korumak için gerekli emek ve ekipman için de geçerlidir. Biçimi ve taşıma elde ve yönlendirilmiş farklılaşma iPSC hatları, kültür performansını doğrulamak için kullanılan ortam benzer çünkü Son olarak, tahmin edilebilir olması muhtemeldir.

Şekil 8, 96 oyuklu plakalar içinde kök hücre üretiminin olarak üretim için bir strateji göstermektedir. Bir tabak (Döngü 0) robot 12 yeni tabaklar, 12 kat artış (1 Çevrim 0) tohum kullanılır. Beslenmenin birkaç gün sonra, oniki plakaları on iki tabak (Döngü 2 Döngü 1) başka bir dizi tohum geçişli olduğunu. Geriye kalan on plakalar diğer kullanımlar için şimdi mevcuttur ve sistemin üretim bileşenini temsil etmektedir. Bu gidişle, bir plaka geçişi 11 tabak her döngü veya 3-4 günde sağlayacaktır. Döngü 3'te Döngü 3. Döngü 2 geçişte görüldüğü gibi birden fazla plakalar geçişli Bu yöntem daha ölçeklendirilebilir, iki tabak vardırHer zaman koloniyi korumak ve 24 yeni plakaları tohum kullanılır. Geri kalan 22 plakaları, her geçiş çevriminden sonra kullanım için daha sonra kullanılabilir. Bakım döngüsü içinde herhangi bir noktada kullanıcı üretimini artırmak için daha fazla tabak tohum yapabilirsiniz. Bir örnek geçişine iki büyüme döngüleri için her sütun olacaktır. birinci geçit on iki plakalara bir plaka dönüştürür, ve on iki plakalarının her biri 144 plakaları tohum için kullanılır. Bu durumda, bir kullanıcı, bir plaka ile başlar ve iki geçit veya kültür yaklaşık 1.5-2 hafta sonra, 144 plakaları yer alır. Örneğin, fibroblast ve adipoz iPSC hatları geçide 96 oyuklu plaka başına yaklaşık 25-75.000.000 hücre hazır olduğunda verim. 144 tabak nedenle yaklaşık 4-7 x 10 9 hücre temsil edebilir.

Robotik 144, 96 gözlü levhalar taşıyan iş yükü nedir? Bu iş için amaçlarından biri hücre kültürü kök geleneksel (yani, 6 plaka) ile karşılaştırıldığında emek azaltılmış ölçeklenebilir kök hücre üretimi oldu. Robot accomplishes bu fiziksel beslenme ve Pasajlanması boyunca her plaka ele ihtiyacını azaltarak. Doğrusal bunun gibi 96-plaka üretim ölçekleri, geleneksel 6-kuyucuğu, bir teknisyen plakaları ile çalışan geçirdiği zaman robotik kültürü kullanarak önemli ölçüde daha az olduğu isterken. Robotik kültürünün üretim verimliliği bu fark (Şekil 9) elde edilir. Bu teknisyenler plaka yaklaşık 3.5 dakika, inkübatör 6 plaka çıkarmak mikroskop üzerinde kontrol, daha sonra aspire ve yem olabilir bulundu. Buna karşılık, teknisyenler yaklaşık 30 sn inkübatör 96 çukurlu bir plaka kaldırma ve robot üzerinde yerleştirmeden önce yoğunluğu ve kirlenme mikroskop üzerinde teftiş geçirirler. Yukarıda tarif edilene benzer genişletilmiş bir besleme protokolü ile, altı 96-yuvalı plakalar, yaklaşık 21 dakika ya da plaka başına 3.5 dakika sürer, yüklenip beslenebilir. Bir tabak beslemek için toplam geçen süre robot arasındaki karşılaştırılabilirTeknisyen robot için altı tabak (plaka başına 30 saniye muayene) işleme sadece 3 dakika harcıyor oysa ic ve manuel yöntemler, ancak elle beslemesine 6 tabak, bir teknisyen 21 dakika için gereklidir. Manuel 8 saat karşı ve robot bir hata plakaları kullanırken veya sıvı transferi yapmak asla Şekil 9 görüldüğü gibi, bir teknisyen robot kullanılarak 144 tabak taşıma geçirdiği zamanı yaklaşık 1.2 saattir.

Burada açıklanan 96-kuyu iPSC kültür yöntemleri karmaşık tarama görevleri için uysal bir platform sağlamaktadır. Her bir göze, genetik olarak aynı ve aynı başlangıç ​​havuzu, aynı yoğunlukta ekildi olduğu için, değişken plaka boyunca dağıtılmış ve koşulları ayrılmasına ilişkin ticari olarak temin edilebilen rezervuarlı robot tarafından korunabilir. Bu gibi kök hücre büyüme ortamı gelişim 34,35,47, alt-tabaka ya da kültür durumu test ve kök hücreleri kullanılarak toksisite çalışmaları gibi deneyler için faydalı olacaktırHer kök hücre çizgisi optimum koloni büyüklüğü ve geçiş şartları açısından benzersiz olduğu için 51. Bir hasat sütunlar, geçişi sırasında mekanik ajitasyon ve besleme frekansı manipüle ederek ekim yoğunluğu, beslenme sıklığı ve geçit işleme modüle bu sistemi kullanabilirsiniz. Bu değişkenler yineleme kullanıcı hızlı bir şekilde yeni hat kültürü için uygun koşullar bir dizi bulmak ya da yeni kültür teknikleri geliştirmek için izin verecektir. Robotik sistem ayrıca 96 paralel ancak bağımsız kök hücre kolonileri korumak yeteneğine sahiptir. IPSC somatik hücrelerden köken veya genetik manipülasyon sonrasında klonlanmış zaman, birçok paralel klonlar potansiyel iPSC hatları elde etmek için taranır. Tek hücre 96 oyuklu plakalar içerisine ekilir sonra bu sistem besler ve her bir koloni tutma kanalı 96 oyuklu plakalar ayrılmış. Bu potansiyel klonları seçerken çok yüksek verim sağlayan ve fiziksel olarak 96 paralel çizgiler kültürleme zorluk ortadan kaldırır. Bu yöntem, aynı zamanda, birbu materyal paralel analiz için hazır böylece llows her klon üretimini büyütülüyor. Son olarak, biz ve tam otomatik kültürün sağlayan inkübatör plakaları sunan robotik plaka kaçakçılığı sistemi ile bu kültürü teknikleri entegre öngörülüyor. Bu, burada açıklanan temel protokoller diğer levha tabanlı sistemlere devredilemez beri büyük genişleme için izin daha karmaşık robotik ile gerçekleştirilebilir.

protokollerde ele ilk kritik adımlar önlemek ve 1.5 ve 4.2 adımları gibi kirlenme kontrol olanlardır. Yukarıda ele alındığı gibi iyi steril bir teknik, genel anlamda kullanılmaktadır Eğer kirlilik, başarılı bir şekilde önlenebilir. Bu belirtilen adımlarda kirlenme ve bu protokolde bunu yapmak için operatör kontrol belirgin kirlenme riskini azaltacağını, ne olursa olsun kök hücre kültürü biçimi, zorunludur. Uygun hücre dışı matris jel uygulaması, ikinci bir ess olduğunuBu protokolün genel başarısı için ential adım. Düzgün 96-iyi plakaları kaplanması olmadan, kök hücreler büyüme olmaz. Bir ortak sorunu eksik kuyu kaplamadır. Deneyim hava kabarcıkları, elektrostatik çekim ve kılcal eylem tam kuyu kaplama engel olduğunu göstermiştir. Ön-ıslatma aşama (1.6) önemli ölçüde de alt kaplama arttırmak için geliştirilen ve atlanır olmamalıdır. Hücre dışı matris jel kaplama eşit şekilde iyi bir tabana ve kenarlara dağıtılmıştır uygulandığında bu ön ıslatma aşaması örneğin, plastik, 96 oyuklu plakanın belirgin hidrofobikliğini indirgemektedir. Ayrıca, bir kez yavaşça da hücre dışı matris jel çözeltisi dağılımını sağlamak için kaplanabilir temiz bir yandan karşı, 96 gözlü levhalar dokunun önerilir. ayrışma parametreleri de optimize etmek için önemlidir. Enzim veya EDTA göre ayrıştırma reaktifi ile genişletilmiş inkübasyon veya geçişi esnasında hedef olabilir de olmayabilir de tek hücreler ile sonuçlanacaktır. Bu nedenle operatörayrışma zamanı, öğütme gücü ve yıkama tekrarı koloni morfolojisi ve sağlığını etkileyebilecek ve buna göre ayarlamak nasıl özel dikkat etmelidir.

Burada anlatılan teknikleri sınırlamaları anlamak başarılı çalışması için büyük önem taşımaktadır. Başka bir hücre kültürü ortamında olduğu gibi, 96 oyuklu plakaların kullanımı, nispeten yüksek bir kirlenme riski sunulur. Yukarıda tarif edildiği gibi, bir teknisyenin besleme ve pasajlama boyunca her plaka taşıma olduğu; Örneğin, kapağını açarken robot yatakta plaka koyarak ve mikroskop plaka kontrol ederken. Adım 1.5 sonra belirtildiği gibi, bu nedenle, bu tür yatakta eğimli ısıtma blok veya dikey pimleri gibi herhangi bir plaka kapağın içini dokunmayın veya herhangi bir potansiyel kontamine yüzeye bu bölümü maruz değil zorunludur. Protokol gelişimi sırasında bu sınırlama keşfetti ve sterilite korumak için plaka kapakları tutmak için bir raf geliştirmek için itici güç oldu. Aynı şekilde, oluk rezervuarlar, pipet uçları ve oçevreye açık ve teknisyen tarafından ele çünkü sıvı taşıma robotu yatakta ther malzemeleri kontaminasyon potansiyel kaynaklarıdır. Bu nedenle, iyi steril bir teknik, maruz kalan kültür malzemeler veya açık sıvılar içinde hareketlerini azaltır gibi uygulanmalıdır. Diğer bir kısıtlama protokolü görsel> 100 96-gözlü plakalar, her kuyu kontrol, şekilde ölçeklendirilir hantal olmasıdır. Bu şüpheli kuyu tespit etmek, görsel gibi bulanık medya gibi kontaminasyon belirtileri için bütün plaka incelenerek ele alınabilir. Gelecekteki olarak üretim için, otomatik bir mikroskop ve hücre büyümesi ve potansiyel kirlenme göstergesinin kullanımı dahil edilecektir.

Özetle, burada açıklanan yüksek verimli 96-gözlü tabanlı platform bir tabak biçiminde kök hücre kültürü ve üretimi için tekrarlanabilir, yüksek sadakat yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, hücre kültürü süre kök adanmış gerekli deneyim, ekipman gerekli ve emek süresini azaltırGeleneksel yapışkan kültür avantajlarını muhafaza.

Disclosures

Yazarlar MKC, MJG, EEB, NJD ve RO ya da burada açıklanan robotik protokolleri tasavvur ve gelişmiş InvivoSciences geliştirme çalışanlarının, INC zamanında idi. TW InvivoSciences INC CSO olduğunu. SH Gilson INC bir çalışanıdır.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH hibe, R44 GM087784 ve R01 HL109505 tarafından kısmen desteklenmiştir. Yazarlar genişletilmiş teknik destek için, Gilson de INC teknik ve OEM ekibine teşekkür ediyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning 3596 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough SeahorseBio 201308-100 Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips Gilson F167023 10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12 Life Technologies 12500062 DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel Corning 354230 Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1 StemCell Technologies 5857 mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media StemCell Technologies 5940 TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632 AdooQ BioScience A11001-50 Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase Innovative Cell Technologies ACCUTASE Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS Fisher SH30256FS PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX Gilson PIPETMAX http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2, (12), 3081-3089 (2007).
  2. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
  3. Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
  4. Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34, (6), 755-764 (2013).
  5. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3, (4), 369-381 (2008).
  6. Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60, (4), 408-416 (2012).
  7. Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
  8. Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. 1-17 (2013).
  9. Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
  10. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111, (3), 344-358 (2012).
  11. Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
  12. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
  13. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4, (130), 130ra47 (2012).
  14. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
  15. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
  16. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
  17. Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
  18. Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
  19. Soldner, F., Jaenisch, R. iPSC Disease Modeling. Science. 338, 1155-1156 (2012).
  20. Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5, (1), 51-64 (2010).
  21. Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11, (3), 1103-1116 (2013).
  22. Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8, (3), 388-402 (2012).
  23. Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6, (5), 572-579 (2011).
  24. Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18, (10), (2012).
  25. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16, (2), (2010).
  26. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
  27. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
  28. Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
  29. Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6, (5), (2011).
  30. Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102 (2013).
  31. Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77, (100), 246-257 (2013).
  32. Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
  33. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
  34. Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
  35. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  36. Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
  37. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
  38. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, (7175), 141-146 (2008).
  39. Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113, (5), (2003).
  40. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3, (1), 3-11 (2009).
  41. Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  42. Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7, (4), 521-531 (2010).
  43. Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30, (1), 22-27 (2012).
  44. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, (7151), 313-317 (2007).
  45. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26, (11), 1276-1284 (2008).
  46. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24, (2), 185-187 (2006).
  48. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105, (12), 4598-4603 (2005).
  49. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  50. Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
  51. Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. (2014).

Comments

1 Comment

  1. For setting the protocol how could I download it? Especially I would like to know how the ramp is specified in your protocol? Did you made ramp as a specialized labware or did you do advanced protocols(injections, moves, etc)?
    Sincerely Ji Young Ryu

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 13, 2017 - 3:45 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics