Мышь Модель аллоиммунная-индуцированной сосудистой неприятие и трансплантации атеросклероз

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enns, W., von Rossum, A., Choy, J. Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis. J. Vis. Exp. (99), e52800, doi:10.3791/52800 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

За последние 30 с лишним лет, прогресс в иммуносупрессивных препаратов уменьшились отторжения трансплантата вследствие острого отторжения, но хроническое отторжение остается главной задачей. Основным проявлением хронического отторжения трансплантата сердце пересадки атеросклероз (ТА) 1,2. Это условие характеризуется гиперплазией интимы и вазомоторного дисфункции аллотрансплантата артерий и развивается в результате иммунологической нацеливания эндотелиальных и гладкомышечных клетках получателем иммунной системы. Таргетинга привитого сосудистой связи с признанием иностранных пептидов главного комплекса гистосовместимости (МНС) подсвечивается развития ТА исключительно в привитых артерий, щадя хозяев сосуды 3. В соответствии с этим является наблюдение, что ТА не происходит экспериментально, когда получатель является генетически идентичны донору или когда получатель не имеет Т- и В-клетки 4. Иммунная опосредованной сосудистой травмы и dysfunctioп приводит к развитию утолщением интимы и фиброза, а также аномальным накоплением липидов и белков ЕСМ в TA 5. Утолщение интимы, как правило, быть концентрическими по всей артериального дерева 4-6. Потери трансплантата и смерть обычно происходит в результате прогрессирующей ишемии вследствие окклюзии просвета артерии аллотрансплантата 4.

В 1991 году Mennander др. 7 впервые аорты модель вмешательство на крысах модели TA. Несколько групп впоследствии адаптированы эту процедуру для использования в мышах. В этой модели, аллотрансплантатов аортального сегменты развиваются повреждения, которые имеют особенности, сопоставимые с ТА наблюдается в клинических трансплантаций. Это включает в себя утолщение интимы, характеризующийся накоплением гладких мышечных клеток, как и лейкоцитов получателей 7. За последние 2 десятилетия эта модель была использована для создания важное понимание механизмов повреждения сосудов, неприятия и ТП. Это может быть намиред изучить вопросы, связанные с иммунной и сосудистых реакций в ходе артериальной патологии. Выбор антигена несоответствия воздействий способность должным образом решать эти вопросы.

Трансплантация по полной МНС барьеров позволяет комплексную оценку иммунного ответа, что, как известно, участвует в отторжение трансплантата. Это включает в себя прямое признание клеток CD4 и CD8 T и адресности иностранных пептид-MHC, представленный привитых клеток, полученных, косвенные CD4 (и, возможно, CD8) Т признание клеток и адресности привитых полученных аллоантигенам представленных получателя антиген-представляющих клеток, и антитело опосредованной признание аллоантигенам на поверхности клеток сосудистых 8. Тем не менее, сосудистый ответ на повреждение в полных МНС-несогласованных экспериментов может быть различным, чем это наблюдалось клинически. Джонсон и др. 9, показал, что в аорты разъединению трансплантатов, пересаженных через полное несоответствие МНС барьер, большинство изв неоинтимальная клетки реципиента происхождения, а не донорской происхождения. Это отличается от, что наблюдается в человеческих трансплантатов, где большинство внутреннюю оболочку клетки гладких мышц, донорской происхождения 9,10. Для учета этого ограничения, альтернативные экспериментальные модели, которые включают прививки по незначительных несоответствий антиген гистосовместимости были разработаны, которые вызывают сосудистые реакции, которые больше напоминают те, наблюдается в клинической трансплантации 11. В то время как эти альтернативные модели позволяют важных выводов, который можно сделать о сосудистых реакций, которые приводят в развитие ТА, иммунологических процессов, которые вызывают сосудистый отказ в Малой антиген гистосовместимости несогласованных трансплантатов не полностью заново капитулировать тех, которые происходят в клинических условиях. Например, незначительные антигены гистосовместимости признаются плохо от привитых реактивных антител 12. Учитывая вышеизложенные соображения, важно рассмотреть патологический questiна изучаются при выборе типа антигена несоответствия, используемого в модели аорты разъединения. Здесь мы опишем подробный протокол для мыши аорты разъединительных прививки. Мы описываем вмешательство прививки между полными MHC-несогласованных мышей, но тот же протокол используется для прививки через другие антиген несогласованных линиях мышей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все протоколы в данном исследовании были рассмотрены и одобрены этическим комитетом по уходу за животными Университета Саймона Фрейзера. Использование Balb / cYJ (Н2 г) мышей-доноров и мышей C57BL / 6 (Н2 б) получателей изучить аллогенных реакций. Мыши используются для экспериментов в возрасте от 8 до 12 недель. Используйте либо женщина или мужчина мышей. Сингенные управления состоят из аорты сегментов из C57BL / 6 доноров в C57Bl / 6 получателям.

1. Донор и реципиент Подготовка

Примечание: Оба донора и реципиента наркозом и подготовлены до операции, чтобы свести к минимуму ишемии трансплантата. Инъекционные анестетики используются в протоколе, чтобы предотвратить закупорку животного оборудования, необходимого для доставки ингаляционных анестетиков. Тем не менее, при желании, вдыхаемый анестетик приемлемой альтернативой. Из первой инъекции анестетиков, вся процедура занимает приблизительно 90 мин, чтобы завершить. Ишемическая время трансплантата менее тхаN 30 мин.

  1. Обезболить мышь с внутрибрюшинных инъекций кетамина (100 мг / кг; 10 мг / мл) и ксилазина (10 мг / кг; 1 мг / мл). Мышь будет в отключке от 10 до 15 мин. Оценить глубину анестезии, зажимая жировую часть животных подушечку лапы. Администрирование 1/3 от первоначальной дозы анестетика коктейль, в случае необходимости, до тех пор, пока животное не проявляет вывода рефлекс. Монитор дыхания тесно после каждого коктейль вводят. Во время операции, оценить уровень анестезии каждые 15 мин, зажимая переднюю брюшную стенку с парой щипцов. Мышей должны оставаться глубоко под наркозом 60 до 90 мин.
  2. Смажьте глаза мыши с глазной мази, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  3. Бритье волос как можно ближе к коже, как это возможно на брюшной брюшной области с середины грудной клетки к лобку. Будьте особенно осторожны, чтобы не ник любой кожи. Не используйте для удаления волос крем, потому что это может быть поглощен IНТО кожу и может быть воспалительные.
  4. Поместите животное в положении лежа на спине на полотенце над столом отопления или колодки.
  5. Очистите место операции с предварительного скраб с 2% хлоргексидина. Подготовьте большую рабочую зону, чтобы максимизировать операционного поля. Начало очистки в центре места операции и перейти к внешней стороне в линейной или круговой образом. Утилизировать марлю. Повторите эту процедуру по крайней мере еще 5 раз. Нанесите спирт подготовительную площадку к той же области. После того, как алкоголь сухой, подготовить чистую зону раствором Бетадин и драпировка стерильной марлей.

2. Конец-в-конец анастомоза Порядок

  1. Операция доноров
    1. Поддерживать асептики всей операции. Очистите все столешницы и хирургическое столешницы с 0,5% раствором перекиси водорода ускоряется до использования. Оберните и автоклав все хирургические инструменты, сеток, шторы и халаты перед использованием. Убедитесь, стерильность инструментов с паромстерилизатор полоска индикатора размещены в каждом пакете. Стерильные хирургические перчатки используются и утилизировать между операций. Для нескольких операций, стерилизации хирургических инструментов между использования с горячей бисер стерилизатор.
    2. Поместите курсор доноров в положении лежа на спине на чистом, тонком оргстекла борту завернутый в стерильной салфетке под операционным микроскопом на 8-30X увеличения.
    3. После обеспечения адекватных хирургических анестезии, как описано в разделе 1.1, выполните операции.
    4. Использование стерильных ножниц, сделать один средней линии нижнего продольного разреза брюшной полости, от лобка к xyphoid процесса.
    5. С помощью небольшой ретрактор, откройте брюшной стенки, чтобы разоблачить полость.
    6. Использование стерильной ватной палочки аппликаторы, мягко убрать кишечник сверху, чтобы животное слева и накрыть марлей, смоченной физиологическим раствором. Перемещение репродуктивные органы книзу и найдите ИНФРАРЕНАЛЬНОГО аорты и нижней полой вены (НПВ). Moisдесять открытые ткани периодически с физиологическим раствором.
    7. Использование медицинской № 5 щипцы, отделить аорты от НПВ, от уровня левой почечной артерии в области бифуркации. Используйте 10-0 полиамидные мононити швов для лигирования мелких ветвей вблизи аорты.
    8. После аорты донора была отделена от нижней полой вены, насытить сосуд с физиологическим раствором, покрыть открытую полость с увлажненной марли и установить донора сторону на стерильной зоне. Проверка состояния донора (дыхательной и сердечно-сосудистой системы, и глубины анестезии) каждые 15 мин. Начать работу на реципиента, изолируя аорты, как описано ниже (этапы 2.2.1 2.2.7).
    9. После того, как аорта получатель был отделен от НПВ и отложить, возвращают донору под микроскопом. Кросс зажим (проксимальных и дистальных к сегменту интерес) донор аорты, приблизительно 5 мм друг от друга, с двумя 4 мм микрососудистых зажимов.
    10. Использование microscissors Vannas-Тюбинген,секут небольшой сегмент трансплантата (от 3 до 4 мм в длину) брюшной аорты.
    11. Использование 25 г 5/8 иглу, присоединенную к шприцу, промыть вырезали аорты с гепаринизированной (100 ед / мл солевого раствора). Убедитесь, что кончик иглы не вступают в контакт с судном.
    12. Место аорты в гепаринизированные (100 ед / мл) физиологического раствора на льду и отложите в сторону. Хотя до сих пор под глубоким наркозом, отпустите микрососудистых зажимы. Эвтаназии донора обескровливания.
    13. Имплантат доноров судно в течение 30 мин удаления. Несмотря на то, что можно использовать один донор сосуд для нескольких получателей путем вырезания большую длину аорты, сохранить ишемии до менее чем 30 мин.
  2. Получатель Эксплуатация
    1. Поддерживать асептики всей операции, как в работе доноров.
    2. Наведите получатель в положении лежа на спине на тонкой оргстекла борту завернутый в стерильной салфетке под операционным микроскопом на 8-30X увеличения.
    3. Мтер обеспечения адекватной анестезии, заполните операции, когда животное не проявляет снятие рефлекс.
    4. Использование стерильных ножниц, сделать один средней линии нижнего продольного разреза брюшной полости, от лобка к xyphoid процесса.
    5. С помощью небольшой ретрактор, откройте брюшной стенки, чтобы разоблачить полость.
    6. Использование стерильной ватной палочки аппликаторы, мягко убрать кишечник сверху, чтобы животное слева и накрыть марлей, смоченной физиологическим раствором. Перемещение репродуктивные органы книзу и найдите ИНФРАРЕНАЛЬНОГО аорты и нижней полой вены. Смочите периодически открытые тканей с физиологическим раствором.
    7. Отдельные аорту от НПВ, от уровня левой почечной артерии в области бифуркации. Если необходимо, используйте 10-0 полиамид мононити швов для лигирования мелких ветвей вблизи аорты.
    8. Кросс зажим (проксимальных и дистальных к сегменту интерес) аорта, примерно 5 мм друг от друга, с двумя 4 мм микрососудистых зажимов.
    9. Использование microscissors Vannas-Тюбинген, сделать одну горизонтальную aortotomy и резекцию небольшой сегмент (не более 0,5 мм) брюшной аорты, чтобы приспособить доноров аортального трансплантата.
    10. Промыть вырезали аорты с гепаринизированной (100 ед / мл солевого раствора). Донор трансплантата аорты должны быть соответствующей длины для подключения перерезают аорты концы получателя.
    11. Поместите доноров аортального трансплантата в ортотопической позиции и анастомозируют конец трансплантата донора до конца получателя, соответствие соответствующего трансплантата анатомическую ориентацию, что получателя.
    12. Аккуратно возьмитесь Туника наружный судна и выворачивания его немного с помощью медицинских No.5 щипцы. Используя пинцет, приводной иглу, присоединенную к 10-0 полиамида мононити шов через всю толщину стенки сосуда для того, чтобы обеспечить донора аорты трансплантата для удаленной судна получателя. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что открытие судно не закрыты из-за тO случайного сшивание задней стенке сосуда.
    13. Для непрерывных швов, место пребывания швов на 9:00 в обоих верхних и нижних концах трансплантата. Начиная с верхнего конца трансплантата от 3:00, анастомозировать резецированную концы с 2 ходовых швов и закрепить шовный материал с пребыванием шва.
      1. Переверните трансплантат снова и продолжить бега шов на спинной части судна, встречая происхождения пребывания шов. Безопасный без применения большого давления на судно. Повторите наложение швов на нижней анастомоза.
        Примечание: швами начать так же, как в непрерывным швом с тем исключением, что судно анастомозировали с тремя разделенными между стежками швов проживания. Время анастомоза, как правило, 20 мин.
    14. После завершения анастомоза, отпустите дистального капилляров зажим, позволяющий ретроградная крови течь и проверить на утечку из анастомозировали сайтов. Если есть утечка, immediatelу разместить стежок, чтобы закрыть дефектный участок. Если нет кровотечения в местах, затем отпустить проксимальный зажим.
    15. Осмотрите пересадку и убедитесь, что нет никаких препятствий в крови трансплантата, и проксимальных и дистальных часть судна получателя. Энергичный рисунок импульсов в сосуде как донора и реципиента является основной признак того, что кровь течет свободно. Использование пара щипцов, мягко понять один конец пребывания швов и слегка выворачивания судно, чтобы осмотреть заднюю стенку сосуда.
      Примечание: Там не должно быть сморщивание стенки сосуда на обоих концах анастомозировали сайтов. Плохо кровотока после удаления зажимов является признаком тромбоза.
    16. Использование хлопка наконечником аппликаторы, вернуть кишечник в брюшной полости.
    17. С держателем иглы Castroviejo и Грефе пинцет, закрыть брюшной стенки с 5-0 полипропиленовых швов с использованием непрерывного сшивания. Закройте слой кожи с той жеШвы, использующие субкутикулярных закрытие.
    18. Администрирование сразу Torbugesic (1 мг / кг) внутримышечно по завершении пересадки.
    19. Дайте немедленно, в порядке, Атипамезол (1 мг / кг), кетопрофен (5 мг / кг) и нагревают раствор подкожно раствор Рингера с лактатом.
    20. Сразу после операции мышей разместить в отапливаемом клетку под водой одеяло в течение ночи (12 ч). В период анестетик-восстановления, поместить животных в покое в чистом, сухом открытом пространстве. Линия клетку (автоклавного) с чистыми бумажными полотенцами и регулировать температуру воды одеяло примерно от 20 до 22 ° С. Обеспечить сухие и влажные крупные куски вволю на полу клетки.
      Примечание: важным компонентом послеоперационного ухода является наблюдение животного и соответствующего вмешательства, в случае необходимости, во время выхода из наркоза и хирургического вмешательства. Необходимо интенсивность мониторинга будет варьироваться в зависимости от животного и может быть выше при непосредственной анестезии восстановительного периода в качестве соmpared позже в послеоперационном восстановлении.
    21. Постоянно следить животных, подвергшихся анестезии мониторинг, пока они не восстановятся полностью. Животное должно быть в состоянии поддерживать грудины лежачее положение без посторонней помощи, и она должна казаться спокойной и свободной от боли, прежде чем он может быть оставлен без присмотра.
    22. Дайте бупренорфин (0,1 мг / кг BID) и кетопрофен (5 мг / кг SID) в течение трех дней, и подкожно.
    23. Монитор сердечно-сосудистую и дыхательную функцию, температуру тела, и послеоперационной боли или дискомфорт во время выхода из наркоза в течение минимум трех дней. Дополнительный уход может потребоваться, например, администрации анальгетиков и других препаратов, и парентеральных жидкостей, чтобы минимизировать обезвоживание и электролитный потери.
    24. Оценить успех пересадки, наблюдая моторную функцию задних конечностей. Полный успех трансплантации включает в себя беспрепятственный приток крови к задней конечности и хвост, который должен быть немедленным на восстановление Анималь, и полное восстановление, не паралич задних конечностей на второй день

3. Ткань Коллекция

Примечание: Предварительно определенные конечные точки в диапазоне от 3-60 дней, в зависимости от типа анализа и желаемой природы антигена рассогласования. Вообще, утолщение интимы является надежной на 30 день после трансплантации через полных МНС штаммов несоответствие мыши.

  1. Обезболить мышь с внутрибрюшинных инъекций кетамина (100 мг / кг; 10 мг / мл) и ксилазина (10 мг / кг; 1 мг / мл). Оценить глубину анестезии, зажимая жировую часть животных подушечку лапы. Продолжить операции, когда животное не проявляет вывода рефлекс.
  2. Очистите место операции с водой и заканчивая 70% алкоголя.
  3. Поместите животное в положении лежа на спине на подносе выложены впитывающей прокладки.
  4. Откройте брюшной полости с большой средней линии продольного разреза. Поставьте самоудерживающийся втягивающего подвергайте полость, IVCD брюшной аорты.
  5. Аккуратно отделить пересаженных сегмент аорты донора из соседнего IVC, используя пару медицинской № 5 щипцами. Будьте особенно осторожны, чтобы не лишить адвентиции пересаженных судна.
  6. Защиту грудной полости путем разреза по ребрам вдоль обеих сторон грудного отдела позвоночника на всем пути к грудной входе. Отражение передней грудной стенки сверху, чтобы разоблачить перикарда и закрепите грудную клетку с парой кровоостанавливающего.
  7. После того, как сердце подвергается вставьте 25 G иглу (5/8, прикрепленный к шприцу) в левый желудочек и на одном уровне с 0,1 мл гепаринизированной (100 Ед / мл) физиологическим раствором.
  8. Использование ножницы, удалить правое предсердие, чтобы кровь, гепарином солевой раствор, и фиксатор, чтобы оставить тело во время перфузии. Заливать животное с 5 мл 4% параформальдегида или пока жидкость не станет чистой. Удалить сердце, чтобы эвтаназии.
  9. Акцизный пересадили сегмент сосуда и погрузите в 4% пформальдегида не более чем за один час. Установите пересаженных судно в октябре (оптимальная температура резки) матрицы и флэш замораживание. Раздел судно под криостата установленного в 8 толщиной мкм. Пятно разделы гематоксилином и эозином и / или Verhoeff-ван Гизону (ван Гизону) упругой пятно.

4. морфологический анализ трансплантатов

Примечание: Т. характеризуется утолщением интимы 13. В этой модели, утолщение интимы и полученную уменьшение размера просвета отражают тяжести иммуно-опосредованной сосудистой травмы. Syngraft управления используются для определения базовых характеристик сосудов при отсутствии аллогенных иммунных ответов. Эти элементы также позволяют оценить артериальной ущерб, возникший в результате хирургического вмешательства. Там не должно быть утолщение интимы в syngrafts.

  1. Чтобы изучить утолщение интимы и просвета окклюзии, измерить площадь в эндотелиальных клетокслой, внутренняя эластическая пластинка (ИЭЛ) и внешних упругой пластинки (угорь) на упругих ван Гизону сегментов окрашенных артерии с программным обеспечением для анализа изображений. Приведенные ниже параметры могут быть использованы для определения изменения артериальных отражающие ТА.
    1. Измерьте абсолютную область интимы: площадь в пределах внутренней упругой пластинки - площадь в эндотелиальных слоя клеток. Это обеспечивает абсолютное измерение расширения интимы, который является отличительной чертой ТА.
    2. Измерьте абсолютное медиальной площадь: площадь в пределах внешнего упругой пластинки - область в внутренней эластичной оболочкой. Это обеспечивает абсолютное измерение деградации медиальной или роста, который иногда может произойти в результате иммунных-опосредованных изменений в этой области стенки сосуда.
    3. Измерить общую площадь сосудов как в области внешней эластичной оболочкой. Это обеспечивает измерение ремоделирования сосудов, который включает расширение или сужение артерии в результате иммунологической повреждений.
    4. Мераинтимы / медиа: (площадь в пределах внутренней эластичной оболочкой - область в эндотелиальных клеток слоя) / (площадь в пределах внешнего упругой пластинки - область в пределах внутренней упругой пластинки). Это обеспечивает относительную меру расширения интимы и нормализует различий в размере сосуда.
    5. Измерьте% сужения просвета: [(площадь в пределах внутренней упругой пластинки - область в эндотелиальных слоя клеток) / площадь с внутренней упругой пластинки)] * 100. Это обеспечивает меру степени окклюзии просвета, что является результатом сочетания расширения интимы и ремоделирование (внутрь или наружу) стенки сосуда.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этой модели, брюшной аорты у мыши Balb / cYJ вставлен в инфраренального аорты в / 6 получателя C57Bl. Это позволяет всесторонне оценить аллоиммунная ответов, которые направлены аллотрансплантатов артерии. Иммунная опосредованной травмы сосудов в этой модели инициирует сосудистых репаративные реакции, которые достигают высшей точки в утолщением интимы, сужения просвета и набор иммунных клеток (рис 1 и 2). Эти критерии служить в качестве считывания для тяжести аллоиммунная ответов, сосудистой отказа, и ТП. Успех процедуры может быть оценена путем разработки надежной утолщением интимы сегментов аллотрансплантата сердца и отсутствие утолщением интимы в контрольной syngraft. Клинически значимые иммуносупрессии могут быть использованы с этой моделью, чтобы больше напоминают клиническую трансплантацию. Эта модель также может быть использован с трансгенных животных для изучения влияния специфических белков / в путей аллоиммунная ответовс мы сделали 14.

Аллотрансплантата аорты сегменты развиваются утолщение интимы

Количество трансплантата повреждения сосудов иммуноопосредованного был осмотрен количественного утолщение интимы и сужение просвета аорты в привитых сегментов в день 30 после трансплантации. Сегменты аллотрансплантата артерии развивать значительные утолщение интимы и просвета окклюзии и никаких изменений не наблюдается в сегментах управления syngraft артерии (рисунок 1).

Накопление лейкоцитов в аллотрансплантата аорты сегментов.

Накопление лейкоцитов в Аллотрансплантация артерий исследовали количественным количество CD4 Т-клеток, CD8 Т-клеток и макрофагов (Mac-3) 15 по иммуногистохимии. Мак-3 был использован для окрашивания для макрофагов в данном исследовании, хотя другие маркеры, такие как F4 / 80, также может быть использован 16. CD4 T-клетки, CD8 Т-клеток и макрофагов были обнаружены в интиме артерий аллотрансплантата (рисунок 2)

Фигура 1
Рисунок 1: Гистологический анализ привитых артерий (А) брюшной аорты сегменты из сингенных и аллогенных мышей были вставлены в резекции брюшной аорты мышей C57BL / 6.. Привитые артерии собирают в день 30 после трансплантации. Представительства микрофотографии упругой ван Гизен окрашенных артерий показано. Масштаб бар = 0,1 мм = 100 мкм (б) Схема, изображающая, как различные слои судна измеряется, л:. Просвет, E: эндотелия слой, я: интимы, M: СМИ,:. Адвентиции (С) Количественная интима / медиа отношение и% сужения просвета от 30 дней сингенной (п = 3) и аллогенных (п = 6) Трансплантация * Р <0,05.= "_ Пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2: Иммунная накопление клеток в Аллотрансплантация артерий. Типичные микрофотографии аллотрансплантата аорты сегментов иммуногистохимическое окрашивали на (A) CD4, (б) CD8, и (C) MAC-3 и гематоксилином показаны. Масштаб бар = 0,1 мм = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы описали протокол для аорты промежуточным прививки у мышей, что является полезным для изучения иммунной опосредованного сосудистой неприятие и TA. Эта модель может быть использована для расследования причин ТА, а также развитие новых терапевтических стратегий. Он был использован в прошлом, чтобы создать существенную роль адаптивного иммунитета, цитотоксических Т-клеточных ответов, опосредованных цитокинами ответов Т-клеток CD4 эффекторных и опосредованного антителами повреждения трансплантата в ТА 14,17-21. Трансплантации сердца у мышей трудно из-за очевидной небольшого размера животного; Однако, с практикой и должной осмотрительности, успешные операции могут быть выполнены. Успех зависит от проходимости сосуда. Это включает в себя обеспечение, что трансплантат не повреждены неправильно обработки судна с пинцетом, сужение просвета сосудов, ушивание задней стенки сосуда, и повторяющиеся пришиванию же месте. Утечка судна также проблематично и требует ухода в еNsure, что количество и положение швов делятся равномерно вокруг стенки сосуда. Важно также, что трансплантат ишемии минимизируется до менее чем 30 минут. При этом, вероятность успеха больше, чем 95% может быть достигнута.

Аорта большая артерия в мышь, так эта процедура простой микрохирургическая подход для исследования сосудов отказ в этой модели животного. Кроме того, аорты сегмент прививают в физиологически подходящем месте, испытывает нормальный кровоток, и утолщение интимы быстро развивается. Другой основной модели, используемой для оценки сосудистого отторжения и ТА гетеротопическая трансплантации сердца, которое имеет то преимущество, рассматривая развитие ТА в коронарных артериях и в контексте трансплантации сердца, что является наиболее значимым клиническим сценарием для ТА. Тем не менее, гетеротопические пересадка сердца помещают в нефизиологичного месте внутри тела (обычно anastamosed к полой вены иаорты в брюшной полости) и сердце не насос крови через желудочков из-за ретроградного характера кровоснабжения в пересаженного сердца. Таким образом, характер кровотока через коронарную дерева может отличаться от того, что, как правило, испытывают коронарных сосудов 22,23. Кроме того, стратегии, направленные на преодоление острого отторжения сердца должны быть включены, чтобы оценить артериальные изменения. В обеих моделях, важно тщательно выбирать тип антигена рассогласования, используемой для того, чтобы иметь возможность должным образом решать определенные вопросы, связанные с сосудистой отторжения и TA.

В целом, аортальный вмешательство прививка является мощная техника для исследования иммунной опосредованного повреждения артериальной и TA. Это может регулярно освоил с практикой и трудолюбие на стороны исследователя. После освоено, эта процедура может быть модифицирована для разъединения прививки других артериальных сегментов, таких как сонная артерия, гона может позволить изучение дополнительных научных вопросов. Кроме того, использование этой модели может быть расширен за пределы изучения трансплантации. Взаиморасположение прививка артерий может быть использована для введения артериальные сегменты из модифицированного (например, трансгенной или липид-кормили) мышей в немодифицированных аналогов, или наоборот, чтобы изолировать биологические эффекты молекул в клетках стенки артерии по сравнению с не-артериальной стенки клеток 24 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами от Канадского института исследований в области здравоохранения и сердца и инсульта Фонда до н.э. и Юкон (СКК).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 000664
Balb/cBYJ Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml Ketalean DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/ml Rompum DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/ml Anafen DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml Torbugesic DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml Reckitt Benckiser B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution Antisedan DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml McKesson Distribution DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment Alcon DIN 02082519
Stereomicroscope Leica M80
0.9% Sodium Chloride, sterile Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads Loris
Povidone Iodine Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament AROSurgical Instruments T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle Ethicon 8698G
1 ml Syringe BD REF 309659
10 ml Syringe BD REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 BD REF 309309
25 G 7/8, hypodermic needle BD REF 305124
27 G 1/2, hypodermic needle BD REF 305109
Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm Fine Science Tools 17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock Fine Science Tools 00072-14
Supergrip forceps, S&T Fine Science Tools 00632-11
Medical No.5 forceps Fine Science Tools 11253-20
Lexer Baby Scissors Fine Science Tools 14078-10
Micro Adson forceps serrated Fine Science Tools 11018-12
Vannas-Tubingen microscissors Fine Science Tools 15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length Fine Science Tools 00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth Fine Science Tools 11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws Fine Science Tools 12565-14
Hot glass bead sterilizer Inotech 250 IS-250 - Steri-250
Non-woven gauzes Progene
Cotton Tipped Applicators Puritan
Beard Trimmer Wahl
Heating pad Sunbeam

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
  2. Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
  3. Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
  4. Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
  5. Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
  6. Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
  7. Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
  8. Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
  9. Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
  10. Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
  11. Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
  12. Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
  13. Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
  14. Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
  15. Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
  16. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
  17. Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
  18. Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
  19. Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
  20. Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
  21. Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
  22. Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
  23. Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
  24. Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
  25. Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics