Aloimmün kaynaklı Vasküler Reddi ve Nakli arterioskleroz Fare Modeli

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enns, W., von Rossum, A., Choy, J. Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis. J. Vis. Exp. (99), e52800, doi:10.3791/52800 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Geçtiğimiz 30 + yıl içinde, immunsupresif ilaçların gelişmeler nedeniyle akut ret greft reddi azalmış fakat kronik ret ana sorun olmaya devam etmektedir. Kronik kalp transplant reddi ana tezahürü nakli damar sertliği (TA) 1,2 olduğunu. Bu durum, intimal hiperplazi ve allogreft arterlerin vazomotor disfonksiyon ile karakterizedir ve alıcı bağışıklık sisteminin endotel ve düz kas hücrelerinin imünolojik hedefleme bir sonucu olarak gelişir. konak gemiler 3 tutumlu iken sebebiyle yabancı peptit-majör histokompatibilite kompleksi (MHC) tanınması greft damar spesifik hedefleme sadece greft arterlerde ta gelişmesi ile vurgulanır. Buna uygun olarak, alıcı verici veya alıcı T ve B hücreleri 4 yoksun için genetik olarak özdeş olduğu zaman ta deneysel oluşmaz gözlemdir. İmmün aracılı vasküler yaralanma ve disfonksiyonunn, TA 5 intimal kalınlaşma ve fibroz gelişimi, hem de lipid ve ECM proteinleri olarak anormal birikimi neden olur. Iç tabakasındaki kalınlaşma belirgin tüm arteryel ağaç 4-6 boyunca eş olma eğilimindedir. Greft kaybı ve ölüm genellikle allogreft arterlerin 4 lümen tıkanıklığı sonucu ilerleyici iskemi sonucu meydana gelir.

1991 yılında, Mennander ve ark., 7 TA model sıçanlarda aort interpozisyon modeli öncülük etmiştir. Çeşitli gruplar, daha sonra farelerde kullanım için bu prosedürü adapte edilmiştir. Bu modelde, allogreft aort segmentleri TA karşılaştırılabilir özellikler, klinik nakli gözlenen olan lezyonlar gelişir. Bu düz kas-benzeri hücreler ve alıcı lökositlerin 7 birikimi ile karakterize edilen, intimal kalınlaşma içerir. Son 2 yılda bu model, vasküler yaralanma, reddedilme ve TA mekanizmalarına önemli fikir üretmek için kullanılır olmuştur. Bizi olabilired arteriyel patoloji sırasında bağışıklık ve vasküler yanıtlarına ilişkin soruları incelemek. antijen uyumsuzluğu etkileri seçimi uygun bu sorulara cevap yeteneği.

Tam MHC bariyerleri boyunca nakli, organ transplant reddi dahil olmak üzere bilinen immün cevapların kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar. Bu greft türetilmiş hücreler tarafından sunulan doğrudan CD4 ve CD8 T hücresi tanıma ve yabancı peptit-MHC hedef içerir, dolaylı CD4 (ve muhtemelen CD8), T hücresi tanınması ve sunucu hücreler alıcının antijen tarafından sunulan greft türetilen alloantijenlere hedeflenmesi ve antikor vasküler hücre yüzeylerinde 8 alloantijenlere aracılı tanınması. Bununla birlikte, tam bir MHC-uyumsuz deneylerde yaralanması vasküler müdahale, klinik olarak gözlenenden daha farklı olabilir. Johnson ve ark. 9 gösterdi, bu en iyi şekilde tam bir MHC uyumsuzluğu bariyer boyunca nakledilen aort interpozisyon greft bölgesineointimal Hücreler, alıcı kökenli olup donör kökenlidir. Bu en intimal düz kas hücreleri, donor kaynaklı 9,10 insan nakli gözlenenden farklıdır. Bu sınırlama için hesap için, küçük doku uygunluk antijeni uyumsuzlukları genelinde aşılama barındırır alternatif deneysel modeller daha yakından klinik transplantasyon 11 gözlenen benzeyen vasküler yanıtları tetikleyen geliştirilmiştir. Bu alternatif modeller önemli sonuçlar için izin yaparken TA, tamamen klinik ortamda meydana olanlar yeniden teslim olmayan küçük histokompatabilite antijen uyumsuz greft vasküler ret neden immünolojik süreçlerin gelişimini sürücü damar yanıtları ile ilgili yapılacak. Örneğin, küçük doku uygunluk antijenleri aşı reaktif antikorlar 12 ile kötü tanınır. Yukarıdaki hususlar göz önüne alındığında, patolojik sorunlarınızda dikkate almak önemlidiraort interpozisyonu modelinde kullanılan antijen uyumsuzluğu türünü seçerken üzerinde incelenen. Burada fare aort interpozisyon aşılama için ayrıntılı bir protokol açıklar. Biz tam MHC-uyumsuz farelerde aynı protokolü diğer antijen uyumsuz fare suşları arasında aşılama için kullanılan arasındaki interpozisyonu aşılama açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada tüm protokoller gözden ve Simon Fraser Üniversitesi hayvan bakım etik kurul tarafından onaylandı. Kullanım Balb / cYJ (H2 d) donör fare ve C57BL / 6 (H2 b) alıcı fareler allojenik tepkilerini incelemek. Fareler 8-12 haftalık yaş arası deneyler için kullanılır. Kadın ya da erkek ya fareler kullanın. Singenik kontroller C57Bl / 6 alıcıya içine C57Bl / 6 donörden aort kesimleri oluşmaktadır.

1. Donör ve Alıcı Hazırlık

Not: donör ve alıcı Hem anestezi ve greft iskemi en aza indirmek için ameliyattan önce hazırlanır. Enjekte anestezikler inhale anestezik teslimat için gerekli ekipman ile hayvanın tıkanıklığı önlemek için protokolde kullanılır. Bununla birlikte, eğer arzu edilirse, inhalasyon anestezi uygun bir alternatiftir. Anestezik ilk enjeksiyon, tüm prosedür tamamlamak için yaklaşık 90 dakika sürer. Greft İskemik zaman daha az than 30 dakika.

  1. Ketamin intraperitonal enjeksiyonu ile fare anestezisi (100 mg / kg; 10 mg / ml) ve ksilazin (10 mg / kg; 1 mg / ml). Fare 10 ila 15 dakika içinde sedasyon edilecektir. Hayvan ayak pedi yağlı kısmını sıkıştırarak anestezi derinliğini değerlendirin. Gerektiği gibi hayvan çekme refleksi sergilemek değil dek, anestezik kokteyl orijinal dozunun 1/3 yönetme. Her kokteyl uygulanır yakından sonra solunum hızını izleyin. Ameliyat sırasında, forseps bir çift ile karın ön duvarı sıkıştırarak anestezi seviye her 15 dakika değerlendirmek. fareler derinden 60 ila 90 dakika süreyle anestezi kalmalıdır.
  2. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için bir göz merhemi ile farenin gözleri yağlayın.
  3. Pubis ortalarından toraks karın ventral bölgeye mümkün olduğunca cilde yakın saçları tıraş. Herhangi bir cilt nick özellikle dikkatli olun. Bu i absorbe edilebilir çünkü tüy dökücü krem ​​kullanmayınCildi nto ve inflamatuar olabilir.
  4. Isıtma tablo veya ped üzerinde bir havlu üzerine yatar pozisyonda hayvan yerleştirin.
  5. % 2 kloroheksidinler ile bir ön fırçalama ile cerrahi siteyi temizleyin. Cerrahi alan en üst düzeye çıkarmak için geniş bir çalışma alanı hazırlayın. Cerrahi bölge merkezinde ovma başlatın ve bir doğrusal ya da dairesel bir şekilde dışarıya hareket eder. Gazlı atınız. Bu işlemi en az 5 kez daha tekrarlayın. Aynı bölgede bir alkol hazırlık pad uygulayın. Alkol kuruduktan sonra, steril gazlı bez ile Betadinede çözüm ve örtü ile temiz alanı hazırlamak.

2. Uçtan uca anastomoz Prosedürü

  1. Donör Operasyonu
    1. Işlem boyunca aseptik teknik koruyun. Kullanmadan önce% 0.5 hızlandırılmış hidrojen peroksit solüsyonu ile tüm tezgah ve cerrahi masa yüzeylerini temizleyin. Sarın ve kullanmak için önce tüm cerrahi aletler, Gauzes, perdeler ve önlük otoklav. Bir buhar ile araçların sterilite doğrulamaHer pakette yer sterilizatör gösterge şeridi. Steril cerrahi eldiven kullanılır ve ameliyatlar arasında atılmaktadır. Birden ameliyatlar için sıcak cam boncuk sterilizatör ile kullanımlar arasındaki cerrahi aletler sterilize edin.
    2. 8-30X büyütme ameliyat mikroskop altında steril örtü ile sarılmış temiz, ince pleksiglas gemide yatar pozisyonda donör fare yerleştirin.
    3. Bölüm 1.1 belirtildiği gibi yeterli cerrahi anestezi olduktan sonra, cerrahi ile devam edin.
    4. Steril makas kullanarak, xiphoid sürecine pubis, tek bir orta hat alt boyuna karın kesi yapmak.
    5. Karın duvarları küçük retraktör açık kullanma boşluğu ortaya çıkarmak.
    6. Aplikatörler steril pamuk uçlu kullanarak, yavaşça superior hayvan sol için bağırsakları geri çekin ve tuzlu su çözeltisi ile nemlendirilmiş gazlı bez ile örtün. Altta üreme organları hareket ettirin ve infrarenal aorta ve inferior vena kava (IVC) bulun. Moisperiyodik tuzlu su çözeltisi ile on maruz dokular.
    7. Tıbbi No. 5 forseps kullanarak, çatallanma sol renal arter düzeyinden, IVC dan aorta ayırın. Aorta yakın küçük dalları Arter 10-0 polyamid monofilament sütür kullanın.
    8. Donörün aort IVC ayrılır sonra, nemli bir gazlı bez ile maruz kalan boşluğu kapsamaktadır, tuzlu su ile kap doyurulması ve steril bir alanı üzerine bir kenara donör ayarlayın. Donör (solunum ve kardiyovasküler fonksiyon ve anestezi derinliği) her 15 dakikada durumunu kontrol edin. (Adımlar 2.2.7 2.2.1) aşağıda tarif edildiği gibi aort izole, alıcı işletim başlayın.
    9. Alıcı aort IVC ayrılmış ve bir kenara edildikten sonra, mikroskop altında donör dönün. Çapraz kelepçe (proksimal ve ilgi segmente uzak) donör aort, iki adet 4 mm mikrovasküler kelepçeler ile ayrı yaklaşık 5 mm.
    10. Vannas-Tübingen Microscissors kullanılarak,abdominal aorta küçük bir greft parçası (uzunluk olarak 3-4 mm) transeksiyonu.
    11. Bir şırıngaya bağlanmış bir 25 G 5/8 iğne kullanarak, Heparinli (100 U / ml), tuzlu su çözeltisi ile eksize aort yıkayın. Kap ile temas etmez iğne ucu sağlanması.
    12. Heparinli yerleştirin aort (100 U / ml) tuz buz üzerinde çözüm ve bir kenara koyun. Hala derin anestezi altında, mikrovasküler kelepçeler serbest iken. Kansız bırakılarak donör Euthanize.
    13. Eksizyonun 30 dakika içinde donör gemi implante. Bu aort daha büyük bir uzunluğa kesilmesiyle birden çok alıcı için bir donör kap kullanmak mümkün olsa da, en az 30 dakika iskemi zaman tutun.
  2. Alıcı Operasyonu
    1. Donör operasyonda olduğu gibi, operasyon boyunca aseptik teknik koruyun.
    2. 8-30X büyütme ameliyat mikroskop altında steril örtü ile sarılmış ince bir pleksiglas gemide yatar pozisyonda alıcı fare yerleştirin.
    3. AfHayvan çekilme refleksi sergilemek olmadığında yeterli anestezi sağlanması ter, cerrahi ile devam edin.
    4. Steril makas kullanarak, xiphoid sürecine pubis, tek bir orta hat alt boyuna karın kesi yapmak.
    5. Karın duvarları küçük retraktör açık kullanma boşluğu ortaya çıkarmak.
    6. Aplikatörler steril pamuk uçlu kullanarak, yavaşça superior hayvan sol için bağırsakları geri çekin ve tuzlu su çözeltisi ile nemlendirilmiş gazlı bez ile örtün. Altta üreme organları hareket ettirin ve infrarenal aorta ve IVC bulun. Tuzlu su çözeltisi ile periyodik maruz kalan dokuların nemlendirin.
    7. Çatallanma sol renal arter düzeyinden, IVC dan aorta ayırın. Gerekirse, aort yakın küçük dalları Arter 10-0 poliamid monofilament sütür kullanın.
    8. Çapraz kelepçe (proksimal ve ilgi segmente uzak) aort, iki adet 4 mm mikrovasküler kelepçeler ile ayrı yaklaşık 5 mm.
    9. Vannas-Tübingen microscissors kullanarak, tek bir yatay aortatomi yapmak ve donör aort greft karşılamak için abdominal aorta küçük bir kesimini (en fazla 0,5 mm) rezeke.
    10. Heparinli (100 U / ml), tuzlu su çözeltisi ile eksize aort yıkayın. Donör aort greft alıcının transeksiyon aort uçları bağlamak için uygun uzunlukta olmalıdır.
    11. Ortotopik pozisyonda donör aort greft yerleştirin ve alıcının bununla ilgili greft anatomik oryantasyon uyan, alıcının sonuna kadar vericinin greft ucunu anastomoz.
    12. Yavaşça kabın tunika eksterna kavramak ve hafif tıbbi No.5 forseps kullanılarak da tersine çevrilmesi. Forseps kullanarak, alıcının rezeke gemiye donör aort greft güvence altına almak için damar duvarının tam kalınlığı boyunca 10-0 poliamid monofilament sütür bağlı iğne sürücü. Damar açma kapama nedeniyle t kapalı olmadığından emin olmak için özenGeminin arka duvarının o yanlışlıkla dikiş.
    13. Sürekli dikişler için, greft, üst ve alt uçları, hem de 9:00 kalmak sütür koyun. 03:00 den greft üst ucunda başlayarak, 2 koşu dikişlerle rezeke uçları anastomoz ve fiyatının dikişine dikiş sabitleyin.
      1. Üzerinde greft çevirin ve menşe fiyatının dikiş toplantı geminin parçası dorsal çalışan dikiş devam ediyor. Gemide fazla baskı uygulamadan sabitleyin. Alt anastomoz için dikilmesi tekrarlayın.
        Not: kesintiye dikişler damar kalmak ameliyat dikiş iplikleri arasında üç ayrı dikişlerle anastomoz olduğu dışında sürekli bir dikiş ile aynı şekilde başlar. Anastomoz süresi genellikle 20 dakikadır.
    14. Anastomoz tamamlandıktan sonra, retrograd kan akış ve anastomoz sitelerin sızıntı kontrol etmek için izin uzak mikrovasküler kelepçe bırakın. Bir kaçak, immediatel varsay kusurlu siteyi kapatmak için bir dikiş yerleştirin. Sitelerde hiçbir kanama yoksa, o zaman yakın kelepçe bırakın.
    15. Nakli inceleyin ve greft kan tıkanıklığı ve proksimal ve alıcının geminin distal kısmı olup olmadığını kontrol edin. Vericinin ve alıcının hem kap içinde Dinç darbe desen kan serbestçe akan olduğunu birincil göstergesidir. Forseps çifti kullanarak, yavaşça kalmak sütür bir ucunu kavramak ve biraz geminin arka duvarını incelemek için gemi ters çevrilecek.
      Not: anastomoz sitelerinin her iki ucunda damar duvarının bir kırışma olmalıdır. Kelepçeler çıkarıldıktan sonra fakir kan akımı tromboz bir işaretidir.
    16. Pamuk uçlu aplikatörler kullanarak, karın boşluğuna bağırsakları dönün.
    17. Castroviejo iğne tutucu ve Graefe forseps ile sürekli dikiş kullanarak 5-0 polipropilen sütür ile karın duvarı kapatın. Aynı cilt katmanı kapatınsubkütiküler kapatma kullanarak dikişler.
    18. Transplant tamamlanmasından hemen Torbugesic (1 mg / kg) im uygulayın.
    19. Amacıyla, hemen, atipamezol (1 mg / kg), ketoprofen (5 mg / kg) vermek ve Laktatlı Ringer çözeltisi deri altına ısıtılmıştır.
    20. Ameliyattan hemen sonra, bir su battaniye gecede (12 saat) altında ısıtılmış bir kafes fareler yerleştirin. Anestetik-iyileşme döneminde, temiz ve kuru bir engelsiz alanda yalnız hayvanları yerleştirin. Çizgi temiz bir kağıt havlu ile (otoklav) kafes ve yaklaşık 20 ° C ile 22 su battaniye sıcaklığını ayarlamak. Kafes katta kuru ve ıslak tanecikleri ad libitum sağlayın.
      Not: Ameliyat sonrası bakımın önemli bir bileşeni anestezi ve cerrahi kurtarma sırasında, gerektiği gibi, hayvan ve uygun müdahale gözlemdir. izlenmesi gerekli yoğunluğu hayvanla değişecektir ve eş olarak derhal anestezik iyileşme döneminde daha olabilirDaha sonra ameliyat sonrası iyileşme için mpared.
    21. Sürekli tamamen kurtarmak kadar izlenen geçirmiş anestezi sahip hayvanların izlemek. Hayvan yardımsız sternal yatma korumak gerekir ve gözetimsiz bırakılmamalıdır önce bu sakin ve ağrı serbest görünmesi gerekir.
    22. Her iki deri altından, üç günlük bir süre için buprenorfın (0.1 mg / kg BID) ve ketoprofen (5 mg / kg SID) verin.
    23. Üç gün en az anestezi kurtarma sırasında kardiyovasküler ve solunum fonksiyon, vücut ısısı ve postoperatif ağrı veya rahatsızlık izleyin. Ek bakımı gibi dehidrasyon ve elektrolit kaybı en aza indirmek için analjezikler ve diğer ilaçlarla ve parenteral sıvı idaresi olarak, gerekli olabilir.
    24. Arka bacaklarda motor fonksiyonunu gözlemleyerek nakli ameliyatı başarı değerlendirin. Nakli tam bir başarı hayvanlardaki kurtarma üzerine derhal olmalı arka bacak ve kuyruk, engelsiz kan akışını içerirEl ve ikinci gününde arka bacaklarda hiçbir felç ile tam iyileşme

3. Doku Toplama

Not: Önceden belirlenmiş bitiş noktaları istenen analizin tipi ve antijen uyumsuzluğu doğasına bağlı olarak 3-60 gün arasında değişir. Genellikle, intimal kalınlaşma tam MHC uyumsuz fare suşları arasında naklinden sonra günde 30 sağlamdır.

  1. Ketamin intraperitonal enjeksiyonu ile fare anestezisi (100 mg / kg; 10 mg / ml) ve ksilazin (10 mg / kg; 1 mg / ml). Hayvan ayak pedi yağlı kısmını sıkıştırarak anestezi derinliğini değerlendirin. Hayvan çekilme refleksi sergilemek vermediğinde cerrahi ile devam edin.
  2. Su ve% 70 alkol ile biten cerrahi siteyi temizleyin.
  3. Emici ped ile kaplı bir tepsi üzerinde yatar pozisyonda hayvan yerleştirin.
  4. Büyük bir orta hat boyuna kesi ile karın boşluğuna açın. Boşluğu ortaya çıkarmak için bir öz-istinat retraktör yerleştirin, IVC birabdominal aorta d.
  5. Yavaşça tıbbi No. 5 forseps bir çift kullanarak komşu IVC nakledilen donör aort segmenti ayırın. Nakledilen geminin adventisya şerit değil, özellikle dikkatli olun.
  6. Tüm yol torakal girişine torakal her iki yanında kaburga ile keserek göğüs boşluğu Açığa. Perikard ortaya çıkarmak ve hemostat bir çift göğüs kafesi sabitlemek için superiorda göğüs ön duvarı Reflect.
  7. Kalp ortaya çıktığında, 25 G 5/8 sol ventrikül içine (bir şınngaya bağlanmış) iğne ve heparinize 0.1 ml (100 U / ml), tuzlu su çözeltisi ile aynı hizada yerleştirin.
  8. Makas kullanarak, kan, heparinize tuzlu ve fiksatif perfüzyon sırasında vücudu terk etmesi için sağ atrium kaldırın. % 4 paraformaldehid 5 ml veya sıvı çalışır berrak kadar hayvan serpmek. Ötenazi sağlamak için kalbin çıkarın.
  9. Vergi damar segmentini nakledilen ve% 4 para sokmakBir saat daha fazlası için formaldehid. Nakledilen Ekim gemiyi (optimum kesim sıcaklık) matrisi ve flaş dondurma ayarlayın. Bölüm 8 um kalınlığında ayarlanmış bir kriyostat altında gemi. Hematoksilen Eozin ve ve / veya Verhoeff-van Gieson (van Gieson) elastik boyası ile Leke bölümleri.

Greft 4. Morfolojik Analizi

Not: TA intimal kalınlaşma 13 ile karakterizedir. Bu modelde, intimal kalınlaşma ve lümen boyutunda bir azalma elde edilen bağışıklık aracılı vasküler yaralanma şiddetine yansıtıcıdır. Syngraft kontrol allojenik bağışıklık tepkilerinin yokluğunda damarların temel özelliklerini belirlemek için kullanılır. Bu kontroller, aynı zamanda, cerrahi prosedürün bir sonucu olarak ortaya çıkar arteriyal hasar değerlendirme izin verir. Syngrafts hiçbir intimal kalınlaşma olmalıdır.

  1. Endotel hücre içinde alanı ölçmek, intimal kalınlaşma ve lümen tıkanıklığı incelemek içintabaka, internal elastik lamina (IEL) ve bir görüntü analiz yazılımı ile elastik van Gieson lekeli arter segmentlerinde harici elastik lamina (EEL). Aşağıdaki parametreler TA yansıtıcı arter değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir.
    1. Mutlak intimal alanını ölçün: internal elastik lamina içinde bölgeyi - endotel hücre tabakasının içinde bölgede. Bu ta işaretidir intimal genişleme, mutlak bir ölçüm sağlar.
    2. Internal elastik lamina içinde alan - alan dış elastik lamina içinde: Mutlak medial alan ölçün. Bu arada bir damar duvarının bu bölgeye immün aracılı değişikliklerin bir sonucu olarak ortaya çıkabilir, medial veya bozunma büyüme mutlak ölçüm sağlar.
    3. Dış elastik lamina içinde alan olarak toplam damar alanını ölçün. Bu immünolojik hasar sonucunda genişleme veya daralma arter içeren damar yeniden bir ölçüm sağlar.
    4. Tedbir(internal elastik lamina içinde alan - endotel hücre tabakası içinde bölge) / (dış elastik lamina içinde alan - internal elastik lamina içinde bölge): intima / Medya. Bu intimal genleşme göreceli bir ölçümünü sunar ve damar boyutunda farklılıklar için normalleştirir.
    5. % Luminal daralması ölçün: [(internal elastik lamina içinde bölgeyi - endotel hücre tabakası içinde alan) internal elastik lamina ile / alan)] * 100. Bu intimal genişlemesi ve damar duvarının yeniden (içe veya dışa doğru) bir kombinasyonu kaynaklanan lümen oklüzyon ölçüde, bir ölçü sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu modelde, bir Balb / cYJ fare abdominal aort, bir C57BL / 6 alıcı infrarenal aort içine yerleştirilir. Bu allogreft arterler hedef Alloimmün tepkilerin kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar. Bu modelde immün aracılı vasküler yaralanma intimal kalınlaşma, luminal daralmasının ve immün hücre toplanmasından sonuçlanan vasküler onarım yanıtları başlatır (Şekil 1 ve 2). Bu kriterler daha sonra Alloimmün tepkilerin şiddeti, vasküler ret, ve TA için bir okuma olarak hizmet vermektedir. Prosedürün başarısı allogreft arter parçalarının sağlam bir intimal kalınlaşma geliştirilmesi ve syngraft kontrolleri intimal kalınlaşma yokluğu ile değerlendirilebilir. Klinik olarak ilgili immünosupresyon daha yakından klinik nakli benzemeye bu model ile kullanılabilmektedir. Bu model aynı zamanda Alloimmün yanıtlarında spesifik proteinlerin / yolların etkisini araştırmak için transgenik hayvanlar ile kullanılabilen birs biz 14 yaptık.

Allogreft aort segmentleri intimal kalınlaşma geliştirmek

immün aracılı allogreft vasküler hasar miktarı gün 30 post-transplantasyon de aşılı aort segmentlerinde intimal kalınlaşma ve lümen daralması miktarının incelenmiştir. Allogreft arter segmentleri önemli intimal kalınlaşma ve lümen tıkanıklığı geliştirmek ve hiçbir değişiklik syngraft kontrol arter segmentlerinin (Şekil 1) görülmektedir.

Allogreft aort segmentlerinde lökositlerin birikimi.

allogreft arterlerde lökositlerin toplanması CD4 T hücreleri, CD8 + T hücreleri ve makrofajlar (Mac-3) immünohistokimya ile 15 sayısını nicelleştirilmesiyle incelenmiştir. Mac-3 gibi F4 / 80, gibi diğer belirteçler de 16 kullanılabilir, ancak bu çalışmada makrofajlar için leke için kullanılmıştır. CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri ve makrofajlar saptandı allogreft arterlerin intima (Şekil 2)

Şekil 1
Şekil 1: aşılanmış arterlerin Histolojik analiz (A), sinjeneik farelerden alınan ve allojenik abdominal aorta segmentleri C57BL / 6 farelerinin rezeke karın aorta içine yerleştirilmiş edilmiştir.. aşılı arterler gün 30 post-transplant hasat edildi. Elastik van Giesen lekeli arterlerin Temsilcisi fotomikrografı gösterilir. Ölçek çubuğu = 0.1 mm = 100 geminin farklı katmanları, L nasıl ölçüldüğünü anlatan um (B) Diyagram: lümen, E: endotel tabakası, ben: intima, M: medya, A.:. Adventitia (C) Kantitasyonu İntima / medya oranı ve 30 günlük singeneik daralan% lümen (n = 3) ve allojenik (n = 6) nakli, * p <0.05.= "_ Blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2: allogreft arterlerde Bağışıklık hücre birikimi. Allogreft aort bölümlerinin Temsil edici fotomikrografikler immünohistokimyasal (A) CD4, (B) CD8, ve (C) Mac-3 boyanmış ve gösterilmiştir hematoksilin ile karşı. Ölçek çubuğu = 0.1 mm = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immün aracılı vasküler reddi ve TA araştırılması için de faydalıdıdr farelerde aşılama aort araya yerleştirilmesi için bir protokol tanımlamışlardır. Bu model TA nedenleri olarak, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini araştırmak için kullanılabilir. Bu TA 14,17-21 adaptif bağışıklık, sitotoksik T hücre yanıtları, sitokinin aracılık ettiği bir CD4 T hücre yanıtlarının efektör ve antikor-aracılı greft hasarının önemli bir rol oluşturulması için geçmişte kullanılmıştır. Farelerde Arter nakli nedeniyle hayvanın bariz küçük boyutu zordur; Ancak, uygulama ve durum tespiti ile, başarılı ameliyatlar yapılabilir. Başarı damarın açıklığı bağlıdır. Bu greft yanlış, damar lümeninin forseps ile gemi, daralma taşıma kabının arka duvarını ve aynı sitede tekrarlayan dikilmesi dikilerek hasarlı olup olmadığını sağlamayı içerir. Geminin Kaçak de sorunludur ve e bakım gerektiririlmek sayısı ve pozisyon damar duvarı etrafında eşit bölünmüş şekilde almalarının sağlanması. Bu greft iskemi az 30 dakika en aza indirecek de esastır. Bu sayede,% 95'ten daha fazla bir başarı oranı elde edilebilir.

aort fare büyük arter yüzden bu prosedür bu model hayvan vasküler ret araştırmak için en basit mikrocerrahi yaklaşım olmasıdır. Ayrıca, aort kademeli fizyolojik ilgili bir konumda aşılanır, normal kan akışını karşılaşır ve intimal kalınlaşma hızla gelişir. vasküler ret ve TA değerlendirilmesinde kullanılan diğer ana model, koroner arterlerde ve TA için en uygun klinik senaryo kalp nakli bağlamında TA gelişimini inceleyerek avantajı vardır heterotopik kalp nakli olduğunu. Bununla birlikte, heterotopik kalp nakilleri vücut içindeki fizyolojik olmayan bir konumda yerleştirilir (genellikle vena kava anastamosed vekarın aort) ve kalp nedeniyle nakledilen kalbin içine kan akımı retrograd doğasına ventriküller aracılığıyla kan pompalamak değildir. Bu nedenle, koroner ağacın içinden kan akışının doğası normalde koroner damar sistemine 22,23 yaşadığı ne farklı olabilir. Ayrıca, stratejiler kalbin akut rejeksiyon arter değişiklikleri değerlendirmek amacıyla dahil edilmelidir üstesinden gelmek için. Her iki modelde de, dikkatli uygun damar reddi ve TA ile ilgili özel soruları edebilmek amacıyla kullanılan antijen uyumsuzluğu türünü seçmek önemlidir.

Özetle, aort interpozisyon grefti immün aracılı arteriyel hasar ve TA araştırmak için güçlü bir tekniktir. Bu rutin araştırmacı adına uygulama ve titizlikle hakim olabilir. Bir kez hakim, bu prosedür böyle karotid arter, inci gibi diğer arter segmentlerinin, interpozisyonu aşılaması için modifiye edilebilirek bilimsel soruların incelenmesini sağlayabilir. Ayrıca, bu modelin kullanımı naklinin çalışma ötesine genişletilebilir. Tadil edilmiş arterlerin interpozisyonu aşılama arter parçalarının tanıtmak için kullanılabilir (örneğin, transjenik veya lipit beslenmiş) modifiye edilmemiş karşılıklarına fareler, ya da tam tersi olmayan damar duvarı hücreleri 24 karşı arter duvarı hücrelerinde moleküllerin biyolojik etkilerini izole etmek için , 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Bu çalışma Sağlık Araştırma ve Kalp ve M.Ö. & Yukon İnme Vakfı (KİK) Kanada Enstitüleri hibe ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 000664
Balb/cBYJ Jackson Laboratories, Bar Harbour ME Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml Ketalean DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/ml Rompum DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/ml Anafen DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/ml Torbugesic DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml Reckitt Benckiser B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution Antisedan DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml McKesson Distribution DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment Alcon DIN 02082519
Stereomicroscope Leica M80
0.9% Sodium Chloride, sterile Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads Loris
Povidone Iodine Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament AROSurgical Instruments T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle Ethicon 8698G
1 ml Syringe BD REF 309659
10 ml Syringe BD REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2 BD REF 309309
25 G 7/8, hypodermic needle BD REF 305124
27 G 1/2, hypodermic needle BD REF 305109
Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm Fine Science Tools 17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock Fine Science Tools 00072-14
Supergrip forceps, S&T Fine Science Tools 00632-11
Medical No.5 forceps Fine Science Tools 11253-20
Lexer Baby Scissors Fine Science Tools 14078-10
Micro Adson forceps serrated Fine Science Tools 11018-12
Vannas-Tubingen microscissors Fine Science Tools 15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length Fine Science Tools 00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth Fine Science Tools 11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws Fine Science Tools 12565-14
Hot glass bead sterilizer Inotech 250 IS-250 - Steri-250
Non-woven gauzes Progene
Cotton Tipped Applicators Puritan
Beard Trimmer Wahl
Heating pad Sunbeam

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
  2. Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
  3. Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
  4. Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
  5. Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
  6. Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
  7. Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
  8. Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
  9. Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
  10. Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
  11. Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
  12. Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
  13. Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
  14. Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
  15. Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
  16. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
  17. Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
  18. Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
  19. Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
  20. Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
  21. Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
  22. Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
  23. Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
  24. Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
  25. Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics