Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center
Published 6/19/2015
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Immunology and Infection

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Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., et al. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

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Abstract

Os neutrófilos, o mais abundante de todas as células brancas do sangue na circulação humana, desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro contra microorganismos invasores. Além disso, os neutrófilos desempenham um papel central na vigilância imunológica de células de tumor. Eles têm a capacidade de reconhecer as células tumorais e induzir a morte da célula do tumor quer através de um mecanismo dependente do contacto da célula que envolve peróxido de hidrogénio ou através de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Os neutrófilos com actividade anti-tumor pode ser isolado a partir de sangue periférico de doentes de cancro e de ratinhos portadores de tumor. Estes neutrófilos são denominados neutrófilos arrastado-tumorais (RTE) para distingui-los dos neutrófilos de indivíduos saudáveis ​​ou camundongos ingênuos que mostram nenhuma atividade citotóxica significativa tumor. Comparado com outras células brancas do sangue, os neutrófilos mostram flutuabilidade diferente tornando viável para obter a> 98% da população de neutrófilos puro quando submetido a um gradiente de densidade. No entanto, para alémpara a população de neutrófilos de alta densidade normal (HDN), em doentes com cancro, em ratinhos portadores de tumor, bem como em condições inflamatórias crónicas, as populações de neutrófilos baixa densidade distintas (LDN) aparecem na circulação. LDN co-purificar com a fracção de células mononucleares e pode ser separado a partir de células mononucleares usando tanto estratégias de selecção positiva ou negativa. Uma vez que a pureza dos neutrófilos isolados é determinada por citometria de fluxo, que pode ser utilizado in vitro e in vivo em ensaios funcionais. Nós descrevem técnicas para a monitorização da actividade anti-tumoral de neutrófilos, a sua capacidade para migrar e para a produção de espécies reactivas de oxigénio, bem como a monitorização da sua capacidade fagocítica ex vivo. Nós descrevemos mais técnicas para rotular os neutrófilos para rastreamento in vivo, e para determinar a sua capacidade anti-metastático in vivo. Todas estas técnicas são essenciais para a compreensão de como obter e caracterizar os neutrófilos com anti-tumoralfunção.

Introduction

Os neutrófilos foram inicialmente caracterizadas como sendo as células imunes inatos que servem como primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Hoje sabe-se que os neutrófilos funções têm maior alcance, estar envolvido na montagem de resposta imune adaptativa contra antígenos estranhos 1,2, que regula a hematopoiese 3, 4 angiogênese e cicatrização de feridas 5. Além disso, os neutrófilos podem afectar o crescimento do tumor metastático e a progressão em virtude das suas pro- e anti-tumorais actividades 6,7. Os neutrófilos são caracterizados por um núcleo segmentado polimórfica (daqui denominado polimorfonucleares (PMN)) e contêm pelo menos três subclasses distintas de grânulos, bem como vesículas secretoras 8 (Figura 1A-C).

Os neutrófilos possuem elevada capacidade fagocítica e actividade da NADPH-oxidase alta crítica para a eliminação microbiana, e secretam uma vasta gama de quimiocinas importantes para atração de neutrófilos adicionais e outras células do sistema imunológico para o local da inflamação 8,9. Os neutrófilos são caracterizados pela expressão de uma grande quantidade de receptores da superfície, incluindo os receptores semelhantes a Toll (TLRs), lectina do tipo C Receptores (CLRs), complementar do receptor 3 (CD11b / CD18) e outras moléculas de adesão (por exemplo, L-selectina, LFA-1, VLA-4 e carcinoembrionário molécula relacionada com antigénio-adesão celular 3 (CEACAM3 / CD66b)), receptores de quimioquinas (por exemplo, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), quimioatractivas receptores (por exemplo, PAFR, LTB4 R e C5aR) , receptores de citocinas (por exemplo, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-peptídicos dos receptores (por exemplo, FPR1-3), e receptores de Fc (por exemplo, CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII), e CD64 (FcyRI) 10. Em ratinhos, os neutrófilos são geralmente identificados como CD11b + Ly6G +, enquanto que os neutrófilos humanos são identificadas utilizando os marcadores de leucócitos CD11b, CD15, CD16 e CD66b. É também geralmente aceite para corar para a mieloperoxidase proteínas dos grânulos (MPO) e elastase de neutrófilos (NE) para a detecção de neutrófilos em tecidos.

Ainda não é claro se as diversas funções dos neutrófilos são mediadas pela mesma célula ou por sub-populações de células distintas. Acumulando dados sugerem a presença de uma população heterogénea de neutrófilos que exibe um elevado grau de plasticidade afectado por estímulos pró-inflamatórios e o microambiente 11,12. Fridlender et al. 13 ter grosseiramente divididos os neutrófilos no cancro em duas sub-populações principais denominado N1 com propriedades anti-tumorais e N2 com propriedades pró-tumorais. No cancro, bem como na inflamação crónica, há uma sub-população adicional constituído por células granulocíticas derivado supressoras mielóides (L-MDSCs) que suprimem as respostas de células T 14. L-MDSCs são consideradas ser células mielóides imaturas caracterizadas por uma CD11b + Ly6Cbaixo Ly6G fenótipo oi em camundongos 15, ao ter um CD15 + / CD16 baixo fenótipo em humanos 16. L-MDSCs expressar níveis mais elevados de arginase e mieloperoxidase, enquanto os níveis mais baixos de citocinas e quimiocinas que os neutrófilos circulantes normais. Eles são menos fagocíticas e migratório, mas produzem maiores níveis de ROS 15,17,18. No presente artigo vamos descrever algumas metodologias básicas para isolamento e caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais.

Enquanto neutrófilos constituem a maior população de todas as células brancas do sangue na circulação humana (45 - 70%; 1800 - 6000 / mL), em ratos, sob condições normais, que são bastante escassos (10 - 15%; 300-500 / ul ). A contagem de neutrófilos aumenta de forma constante sobre a inflamação e, ocasionalmente, no cancro, o que representa um estado de inflamação crônica 7. Os neutrófilos desenvolver a partir de precursor comum mielóide multipotentes (CMP) cells na medula óssea, por meio de um processo de diferenciação que passam as fases de mieloblastos (MB), promielócitos (PM), (MC) mielócitos, metamielócitos (mm) e as células de banda (BC) 8. Os neutrófilos maduros, pós-mitóticas podem permanecer dentro da medula óssea para 4-7 dias antes de serem liberados para a circulação 8. Volume de neutrófilos no sangue é geralmente rápida, com uma semi-vida média de 6-12 horas, que pode ser prolongado, sob condições inflamatórias. Neutrófilos não estimulados têm limitado actividade anti-tumorigénica, uma característica que pode ser adquirido por exposição dos neutrófilos sem tratamento prévio para as quimiocinas IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 e CXCL5 6,19 ou artificialmente, expondo-as ao forbol de éster de forbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) 6.

A meia-vida curta de neutrófilos do sangue em conjunto com o baixo número de neutrófilos (~ 3-5 x 10 5) obtido a partir de 1 ml de sangue de um naïve 6-8 week rato velho, tornaramdifícil explorar a função de neutrófilos circulantes rato in vitro. Para superar esta dificuldade, outras fontes têm sido usadas. Por exemplo, um grande número de neutrófilos podem ser obtidas da medula óssea ou do peritoneu 20 após a indução da inflamação estéril (por exemplo, após injecção intraperitoneal de tioglicolato ou Zimosan A). Deve notar-se que os neutrófilos obtidos a partir da cavidade peritoneal não exercem qualquer actividade anti-tumorigénico (observação não publicada).

. Granot et al 6 observaram que os ratos BALB / c inoculados ortotopicamente com o rato linha celular de carcinoma da mama 4T1 desenvolver neutrofilia que agrava com a progressão do tumor 6 (Figura 2A), de tal modo que 20-40.000.000 neutrófilos do sangue pode ser facilmente isolado a partir de 1 ml de sangue 3 - 4 semanas pós-inoculação do tumor. Estes neutrófilos ter adquirido as actividades anti-tumorais, e tem sido nesse sentido coineutrófilos NED arrastado-tumorais (RTE), a fim de distingui-los dos neutrófilos ingênuos 6 (Figura 2B). Enquanto os neutrófilos de alta densidade (HDN, Figura 1A) são altamente anti-tumorigénica, neutrófilos baixa densidade (LDN, Figura 1B) geradas no contexto de cancro não são 21. Além disso, os neutrófilos de alta densidade a partir da medula óssea e baço de ratinhos portadores de tumor têm uma actividade anti-tumoral (dados não publicados). Deve notar-se que, com a progressão do tumor torna-se gradualmente alargada baço (esplenomegalia), com quantidades crescentes de neutrófilos.

Deve-se notar que RT também são gerados em outros modelos de cancro, incluindo ambos os tumores mamários (MMTV-PyMT e MMTV-Wnt1 e K-ras tumores pulmonares motrizes) espontâneos e injectado (AT-3 de ratinho (MMTV-PyMT) e carcinoma da mama E0771 células, LLC Lewis células de carcinoma de pulmão e células de melanoma B16-F10). No entanto, a extensão da mobilização de neutrófilos nestes tumou modelos é muito menos do que de ratos 4T1-inoculadas, atingindo 5-10 x 10 6 neutrófilos em 1 ml de sangue após 3 semanas.

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Protocol

Animais: 5-7 semanas de idade BALB / c ratos são comprados na Harlan (Israel). Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Cuidado e Uso de Animais Comitê Institucional da Universidade Hebraica (IACUC). Amostras humanas: Recolha de sangue de pacientes com câncer e voluntários saudáveis ​​foi aprovado pela Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Indução de neutrófilos com propriedades anti-tumorais in vivo utilizando um modelo de cancro da mama do rato.

NOTA: Todas as etapas devem ser realizadas utilizando soluções estéreis em um fluxo de ar laminar gabinete (LAF) Bio-Segurança.

  1. Semente de 5 x 10 5 células 4T1 em 100 milímetros placa de cultura de tecido em 10 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g / L de D-glucose suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), 2 mM de D- glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U / ml de penicilina G e 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina. Incubar the as células a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO2 durante 3 a 4 dias. Assegurar que as pilhas são de 50 - 100% confluente no dia da experiência.
  2. Para retirar as células tumorais a partir da placa de cultura de tecido, aspirar o meio de cultura, lavar as células com 5 ml de PBS, aspiração do PBS e adicionar 3 ml de uma solução de tripsina a 2,5 g / L. Incubar as células a 2-3 minutos com tripsina a 37 ° C.
  3. Adicionar 10 ml de meio contendo soro para neutralizar a tripsina e pipeta cima e para baixo até que todas as células foram removidas. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL cónico.
  4. Centrifugar as células a 200 xg durante 5 min à TA. Aspirar o meio deixando 200 ul de meio acima do sedimento celular. Ressuspender as células no volume residual e adicionar 10 ml de PBS. Inverta o tubo 2-3 vezes para obter uma suspensão celular homogênea e retirar 10 ml para contar as células em um hemocitómetro. Use azul tripano para distinguir entre as células vivas e mortas. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 200 xg à temperatura ambiente. Aspirar o PBS e ressuspender as células em PBS a uma concentração final de 2 x 10 6 células / ml. Assegure-se que a suspensão de célula única não tem qualquer aglomeração.
  5. Injectam-se 1 x 10 6 células 4T1 4T1 ou células em 50 ul de PBS ortotopicamente na almofada de gordura mamaria inguinal esquerda de ratinhos fêmea BALB / c, utilizando uma seringa de 0,3 ml com uma agulha de 30G x 8 milímetros que expressam a luciferase.
    1. Antes da injecção, anestesiar os ratos em uma câmara de indução que recebem um caudal lento de isoflurano (3-5%) em 100% de oxigénio.
    2. Coloque o mouse sobre um bloco cirúrgico estéril e verifique se a cabeça está devidamente colocado no interior do cone do nariz isoflurano. Confirme anestesia adequada por beliscar a pata. Use veterinário pomada nos olhos para evitar a secura sob anestesia. Raspar o cabelo em torno do local da injecção e desinfectar com etanol 70%.
    3. Use um conjunto estéril de instrumentos cirúrgicos para fazer uma pequena incisão horizontal (5 mm) aproxa meio caminho entre o madamente inguinal e os mamilos abdominais, expor a almofada de gordura e injectar 1 x 10 6 células 4T1 em 50 ul. Feche as incisões com clips nove milímetros que devem ser removidos uma semana depois. A injecção de células que expressam luciferase permite a monitorização do tamanho do tumor e metástases por imagem de bioluminescência.
      NOTA: Este procedimento minimamente invasivo não requer nenhum tratamento pós-cirúrgico e os camundongos injetados recuperar dentro de 2-3 min.
    4. Monitorar os ratos até que recupere a consciência, e certifique-se que recupere a consciência plena antes de ingressar na companhia de outros ratos.
  6. Depois de 3 - 4 semanas, quando o tumor primário tenha atingido um volume de 2 cm3, sacrificar os ratinhos por um lento fluxo de CO 2, e imediatamente após o último ar, obter o sangue por punção cardíaca, usando uma 25G x 5/8 "agulha ligada a uma seringa de tuberculina de 1 ml de pré-tratadas com heparina. Mantenha a boca da agulha para cima ao inserir oseringa na posição horizontal através do diafragma para o coração, e lentamente e gradualmente tirar o sangue evitando um excesso de pressão (Figura 3).

2. Neutrophil Isolamento

  1. Isolamento de neutrófilos citotóxicas a partir de sangue de ratinhos portadores de tumor.
    1. Dilui-se 1 ml de sangue retirado de um rato portador de tumor (ver Protocolo 1,11) em PBS contendo 0,5% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) a um volume final de 6 ml.
    2. Fracionamento de sangue diluído em um gradiente de sacarose descontínuo preparada na hora:
      1. Adicionar 3 ml de estéril-filtrada sacarose 1,119 g / ml a parte inferior de uma de 15 ml de polipropileno cónico do tubo de centrifugação.
      2. Devagar e com cuidado, a camada de 3 mL de estéril-filtrada sacarose 1,077 g / ml no topo do g / ml camada de 1.119. Em seguida, adiciona-se lentamente e com cuidado os 6 ml de sangue diluído (protocolo 2.1.1) na parte superior do 1,077 g / ml camada (Figura 4A). Recomenda-se para segurar o tubo inclinado e umdding os diferentes componentes através de um fluxo lento, mas contínuo, mantendo a boca da pipeta na direcção da parede inferior do tubo, de tal modo que não é formada turbulência.
    3. Centrifuga-se o tubo contendo o sangue diluído no gradiente de sacarose a 700 xg durante 30 min à TA sem travão.
    4. Cuidadosamente remover o tubo da centrífuga sem provocar qualquer turbulência. A maioria dos eritrócitos será na parte inferior do tubo. Neutrófilos de alta densidade (HDN) encontram-se como um anel branco-a-vermelho na interface entre a 1,119 g / ml e as camadas de 1,077 g / ml (cerca de 3 ml a marca), enquanto os leucócitos de baixa densidade são encontrados em um anel branco no interface entre a 1.077g / ml e a camada de BSA-PBS contendo (em torno da marca de 6 ml, ver Figura 4B).
    5. Aspirar o PBS + BSA a 0,5%, até atingir 5 mm acima da camada de células de baixa densidade. Pipeta as células de baixa densidade por sucção lenta numa ponta 1 ml através lentamente roda em torno das células.Transferir as células em 30 ml de PBS com 0,5% de BSA.
    6. Aspirar a camada superior do mesmo tubo de gradiente até atingir 5 mm acima da banda de células de alta densidade. Pipetar as células de alta densidade, que são principalmente os neutrófilos de alta densidade, e transferir as células em 30 ml de PBS contendo 0,5% de BSA.
    7. Centrifugar as células a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    8. Aspirar o sobrenadante e lisar eritrócitos por ressuspensão das células em 36 ml de água de qualidade para HPLC estéril durante 30 segundos. A isotonicidade deverá ser restaurada através da adição de 9 ml de um concentrado 5x PBS suplementado com 2,5% (w / v) de BSA.
    9. Centrifugar as células a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    10. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em PBS-BSA. Contar o número de neutrófilos em um hemocitómetro e utilizar azul de tripano para distinguir entre células vivas e mortas.
    11. Centrifugar as células a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente e ressuspender os neutrófilos no meio de incubação desejado para a densidade celular final. Usoos neutrófilos imediatamente.
    12. Então, depois de outra centrifugação, ressuspender as neutrófilos no meio de incubação a densidade celular final. Use os neutrófilos imediatamente.
  2. Isolamento de neutrófilos em circulação de pacientes com cancro.
    1. Misturar 10 ml de heparina (20 U / ml) de sangue humano com um volume igual de Dextrano T500 a 3% em solução salina e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Durante esta incubação, os eritrócitos irá sedimentar.
    2. Preparar um tubo cónico de polipropileno de 50 ml com 10 ml de sacarose 1,077 g / ml e camada lentamente o sobrenadante rico em leucócitos no topo do 1,077 g / ml de camada de sacarose (Figura 4C).
    3. Centrifugar a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente sem travão. Os neutrófilos de alta densidade (HDN) aparece no sedimento. Neutrófilos baixa densidade (LDN) co-purifica com monócitos e linfócitos na interface entre a 1,077 g / ml de camada de sacarose e de plasma (Figura 4D).
    4. Volte a suspender as neutrófilos em 10 ml 0.2% de NaCl durante 30 segundos para lisar os eritrócitos contaminantes, e restaurar a isotonicidade pela adição de 10 ml de 1,6% de NaCl e inverter uma vez.
    5. Centrifugar 5 min a 160 xg à temperatura ambiente, e lava-se três vezes em 20 ml de solução salina equilibrada de Hanks. Centrifugar após cada lavagem e aspirar o sobrenadante.
    6. Contagem de neutrófilos e ressuspender as células em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 2% a 2 x 10 6 / ml neutrófilos ou como desejado.

3. O enriquecimento de sangue neutrófilos utilizando pérolas magnéticas

  1. A selecção positiva
    1. Tomar 1 ml de sangue a partir de um rato conforme descrito no protocolo de 1,8, com uma seringa heparinizada.
    2. Centrifuga-se o sangue num tubo de 15 ml a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    3. Aspirar o sobrenadante ou manter o plasma do sangue para estudos posteriores.
    4. Lisar as eritrócitos por ressuspensão das células em 8 ml de água de grau HPLC. Após 30 seg restaurar isotonicidade, adicionando 2 ml de 5x concentrated PBS contendo 2,5% de BSA. Contar as células.
    5. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    6. Ressuspender o sedimento celular em 200 ul de PBS contendo BSA a 0,5% e 2 mM de EDTA a 10 por 8 células.
    7. Adicionar 50 ul de anticorpo anti-Ly6G biotinilado. Misturar bem e incubar durante 10 min no refrigerador (não em gelo).
    8. Adicionar 150 ul de PBS frio contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
    9. Vortex a solução revestido anti-biotina estoque microbead magnético. Transferir 100 uL de suspensão de células. Misturar bem e incubar durante 15 min no refrigerador (não em gelo).
    10. Lave as células por adição de 10 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, e centrifugar a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
    11. Aspirar o sobrenadante completamente, e ressuspender em 500 ul de PBS frio contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
    12. Inserir uma coluna de separação magnética em um suporte magnético que está ligado a um suporte magnético, e lave-o com 500 mL PBS frio contendo 0.BSA a 5% e 2 mM de EDTA.
    13. Aplicar a suspensão de células na coluna. O flow-through contém células LyG6-negativo não marcados.
    14. Lava-se a coluna com 500 ul de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. As células não marcadas adicionais estarão no fluxo de passagem.
    15. Repetir o passo de lavagem com mais 500 ul de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
    16. Remova a coluna do ímã e coloque-o em um tubo de coleta de 15 ml. Adicionar 1 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, e lavar as células magneticamente marcadas por firmemente empurrando o êmbolo para dentro da coluna. O fluxo através contém neutrófilos Ly6G +.
  2. Selecção negativa
    1. Prepare leucócitos do sangue acordo com os passos 3.1.1 a 3.1.5.
    2. Ressuspender 1 x 10 8 células em 1 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, num tubo de fundo redondo de 5 ml de poliestireno.
    3. Adicionar 50 uL de soro normal de rato.
    4. Adicionar 50 ul de neutrófilos c enriquecimentoocktail (contendo anticorpos biotinilados específicos para as células brancas do sangue não de neutrófilos), misturar bem e incubar durante 15 min no microondas.
    5. Lavam-se as células pela adição de 4 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM, e centrifugar a 400 xg durante 10 min.
    6. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM.
    7. Adicionar 50 ul de complexos de anticorpos tetraméricos dirigidos contra biotina e dextrano. Misturar bem e incubar durante 10 min no microondas.
    8. Vortex bem o tubo contendo as esferas magnéticas revestidas com dextrano antes da adição de 150 ul de suspensão de células. Misturar bem e incubar durante 10 min no microondas.
    9. Trazer a suspensão de células para um volume total de 2,5 ml por adição de PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM. Misture com cuidado para obter uma suspensão de células homogênea.
    10. Insira o tubo (sem a tampa) para dentro do ímã, e deixe repousar por 3 min.
    11. Inverter o ímã com o tubo em um contínuomovimento de tal modo que as células não ligadas no fluido vai ser transferido para um novo tubo. Deixe o ímã e tubo invertido para 2-3 sec, em seguida, retornar à posição vertical. As células indesejadas magneticamente marcadas permanecerá ligada à parede do tubo original, enquanto que os neutrófilos não ligadas será no líquido transferido.

4. citológica Coloração de neutrófilos

  1. Ressuspender 1x10 5 neutrófilos em 50 ul de PBS e transferir a suspensão de células a um adaptador de célula de preparação em camada fina, tal como um Cytospin. Centrifugar a placa a 150 xg durante 5 min. Separa-se a lâmina de vidro pré-marcado a partir do adaptador.
  2. Fix células mediante imersão das lâminas de vidro em etanol a 70% durante 2 minutos. Permitir que os preparativos do adaptador (veja o passo 4.1) para secar à temperatura ambiente antes da coloração. Mergulhar as lâminas 5-6 vezes em água destilada.
  3. Manchar 1-2 min em solução de hematoxilina de Mayer. Enxágüe 1 min em água da torneira. Manchar 10 seg em solução Eosina Y . Lavar em água da torneira. Desidratar por lavagem das lâminas em concentrações crescentes de etanol (70%, 96% e 100%). Deixe a lâminas de vidro ar seco em breve e inspecionar as lâminas com um microscópio de luz.
    NOTA: Hematoxilina tem uma cor e manchas azul-violeta profundo ácidos nucleicos, enquanto eosina é rosa e manchas proteínas não especificamente. Os grânulos citoplasmáticos de neutrófilos permanecem sem mácula por corantes ácidas ou básicas, que é a origem do nome "amar ser neutro '. Considerando basophilic granulócitos mancha azul escuro com hematoxilina e eosina e eosinophilc granulócitos vermelho brilhante, neutrófilos aparecem rosa neutro (ver Figura 1A). Neutrófilos maduros são caracterizados por um núcleo polimorfonucleares, que é, em geral, grandes, com 2-5 lóbulos neutrófilos segmentados '' (Figura 1A e 1C). Neutrófilos imaturos são caracterizados por um núcleo ou curvada em forma de anel uma lóbulos (Figura 1B).
ve_title "> 5. Determinação da pureza dos neutrófilos por citometria de fluxo.

  1. Ressuspender 1x10 6 células em 100 ul de tampão FACS (PBS contendo BSA a 0,5%, EDTA a 2 mM e 0,02% de NaN3). Para amostras de sangue total, a hemólise é necessário antes da coloração (passos 3.1.1 a 3.1.5). Adicionar 10 ul de reagente de bloqueio FcR durante 5 min.
  2. Adicionar 0,5 ug de anticorpo fluorescente marcado com especificidade para Ly-6G para neutrófilos de rato ou de CD11b e CD66b para os neutrófilos humanos, misturar bem e incubar durante 15 min à temperatura ambiente.
  3. Ajustar o volume para 500 mL com PBS contendo 0,5% de BSA e EDTA a 2 mM e analisar a coloração por citometria de fluxo.

6. Siga os neutrófilos Gate in vivo

  1. Na rotulagem BrdU vivo de neutrófilos
    1. Injectar 100 ul de uma solução a 10 mg / ml de bromodesoxiuridina (BrdU) em PBS estéril por via intraperitoneal a ratinhos portadores de tumor.
    2. Isolar neutrófilos no sangue 48 horas após a injecção de umegundo Protocol 2.1. Neutrófilos utilizando um kit de mancha fluxo BrdU marcado com BrdU.
  2. CFSE rotulagem de neutrófilos
    1. Ressuspender 10 7 neutrófilos em 1 mL de PBS pré-aquecido.
    2. Adicionar 2 mL de uma solução estoque 5 mM CFSE para os neutrófilos suspensos a uma concentração final de 10 uM. Misturar bem e incubar durante 15 min a 37 ° C. CFSE 5 mM é preparada por dissolução de 2,8 mg de CFSE (5- (e 6 -) - carboxifluoresceína diacetato, éster de succinimidilo) em 1 ml de DMSO. Divida em 10 mL alíquotas em tubos estéreis e 200 ul loja no escuro a -20 ° C.
    3. Neutralizar o excesso de CFSE por adição de um volume igual de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS. Incubar durante 10 min a 37 ° C. Centrifugar os neutrófilos a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Lavar os neutrófilos duas vezes em 10 ml de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS.
    4. Centrifugar a 400 xg durante 10 min e ressuspender em um volume apropriado de PBS. Os neutrófilos (por exemplo, 1 x 10 7

7. In vitro ensaio de luciferase para monitorar a atividade anti-tumoral de Isolado neutrófilos.

  1. Cultivar as células tumorais marcadas com luciferase como descrito para as células 4T1 em Protocolo 1,1-1,5, mas ressuspender as células dissociadas com tripsina em meio de soro reduzido optimizado suplementado com 2% de FBS. Ajustar a densidade de células de 5 x 10 4 culas por ml.
  2. Semente 5000 células tumorais marcadas com luciferase em 100? L de meio de soro reduzido optimizado contendo FBS a 0,5% em cada cavidade de um branco de fundo plano de 96 de cultura de tecidos bem placa.
  3. 4 horas depois de semear as células tumorais, adicionar 1 x 10 5 neutrófilos em 50 ul de meio de soro reduzido optimizadas contendo 0,5% de FBS, e incubar O / N. Prepara-se uma suspensão de células de neutrófilos, com uma densidade de 2 x 10 6 células / ml. Os poços de controlo deve obter 50 � de meio sem neutrófilos. Fazmúltiplas repetições de cada configuração experimental.
  4. Na manhã seguinte, aspirar cuidadosamente o sobrenadante e lava-se cada poço com 200 ul de PBS. Aspirar o PBS e adicionar 50 ul de tampão de lise passivo. Para as células facilmente destacando (tais como AT-3 células), não lavar em PBS e adicionar o tampão de lise de cultura celular imediatamente após a aspiração do meio de crescimento.
  5. Cobrir a placa com folha de alumínio e incuba-se que num agitador orbital a 150 rpm durante 20 min à temperatura ambiente.
  6. Colocar a placa num leitor de placas de luminescência. Injectar bem-wise 50 ul solução de ensaio de luciferase, e leia a quimiluminescência de 10 segundos por poço.
  7. Calcula-se a lise do tumor% pela seguinte fórmula:% de lise do tumor = (1- [luminescência das amostras com neutrófilos] / [luminescência das amostras em forma]) x 100%.

NOTA: Para avaliar a contribuição de neutrófilos para semeadura metastático, os neutrófilos pode estar esgotada, conforme descrito no protocolo 8.1. Para depl eficazEtion administrar anticorpos que destroem o neutrófilo, começando no dia 7 enxerto pós-tumor.

Atividade 8. Anti-metastático de neutrófilos em um cancro da mama Modelo rato.

  1. A depleção in vivo de neutrófilos.
    1. Recentemente preparar 12,5 ug de anticorpo anti-rato Ly6G (neutrófilos anticorpo esgotar) ou de anticorpo de rato de controlo de isotipo (IgG 2a, Κ) em solução salina a um volume final de 100 ul por rato.
    2. Começando no dia 3 enxerto pós-tumor injetar uma dose diária intraperitoneal de 12,5 mcg rato anticorpo anti-Ly6G (100 mL). Injetar camundongos de controle com ou 12,5 g (100 ul) de anticorpo de controlo de isotipo de rato (2a IgG, Κ).
    3. Começando no dia 14, os anticorpos administrar duas vezes por dia, conforme a taxa de produção de neutrófilos aumenta dramaticamente quando o tumor cresce 4T1.
    4. A cada dois dias, obter uma amostra de sangue (2-3 gotas) por entalhar a cauda-veia lateral. Recolher o sangue em um anti-coagulant contendo tubo (heparina, citrato ou EDTA).
    5. Verifique a depleção de neutrófilos por citometria de fluxo, como descrito no Protocolo nº 5.
  2. Teste de Neutralização do tumor (Ensaio de modificação Winn)
    1. Isolar os neutrófilos a partir de murganhos portadores de tumor. Misturar 1 x 10 6 células tumorais e 3 x 10 6 neutrófilos em 50 ul de soro fisiológico (por ratinho).
    2. Injectar as células subcutaneamente para o flanco de 6 - 8 semanas de idade sem tratamento prévio com ratos BALB / c. Raspar o flanco antes do enxerto tumor para permitir medições precisas do tamanho do tumor. Meça o tamanho do tumor de partida diária no dia 5 pós-enxerto.
  3. Neutrófilos transferência adoptiva
    1. Injectar 2 x 4 10 células de tumor que expressam luciferase em 200 ul de PBS na veia da cauda.
    2. Neutrófilos transferência deve ser feita 4 horas a seguir à injecção de células tumorais. Assim, começam a purificação de HDN de ratinhos portadores de tumor (protocolo 2.1) cerca de 2 horas antes da sua prevista emtransferência vivo. Ressuspender neutrófilos em PBS a uma concentração final de 2,5 x 10 7 células / ml.
    3. 4 horas após a introdução das células de tumor os murganhos colocar sob uma lâmpada de aquecimento durante 5 min. Colocar os ratos num limitador e injectar 5 x 10 6 HDN (200 ul) via veia da cauda. Os ratinhos de controlo são injectados com veículo (PBS).
    4. Monitorar a formação de metástases pulmonares em vários pontos de tempo, utilizando um sistema de imagem em bioluminescência vivo ou por imuno-histoquímica.
  4. Lung ensaio semeadura metastático
    1. Injectar 0,5-1 x 10 6 células 4T1 parentais ortotopicamente na almofada de gordura mamária inguinal esquerda, conforme descrito no Protocolo 1.
    2. No dia 10, ressuspender-4T1 expressando GFP células em PBS a uma concentração final de 5 x 10 5 células / mL. Colocar os ratos sob uma lâmpada de aquecimento durante 5 min.
    3. Colocar os ratos num limitador e injectar 1x10 5-4T1 expressando GFP células (200 ul) por via intravenosa a 4T1 ratinhos portadores de tumor ou ratinhos naive.
    4. No dia seguinte, sacrificar os ratinhos e perfundir os pulmões com 20 ml de PBS para remover os glóbulos vermelhos restantes.
    5. Extirpar os pulmões para análise de células GFP positivas por imuno-histoquímica.
      NOTA: Para avaliar a contribuição de neutrófilos para semeadura metastático, os neutrófilos pode estar esgotada, conforme descrito no protocolo 8.1. Para esgotamento eficaz administrar anticorpos que destroem o neutrófilo, começando no dia 7 enxerto pós-tumor.

9. Supressão da proliferação de células T por Neutrófilos de Ratinhos portadores de tumor.

  1. Remover o baço de um ratinho BALB naïve / c mouse e lugar sacrificados em 10 ml de PBS.
  2. Inserir o baço para um filtro de células de 40 um que é apto numa placa de petri cheia com meio RPMI-1640. Usando a extremidade do êmbolo da seringa, triturar o baço através das células filtro no prato de petri. Lavar o filtro de células com 5 ml RPMI. Descarte o filtro.
  3. Transferir as células ressuspensas para um tubo cónico de 50 ml e centrifugar a 400 xg durante 10 min.
  4. Descartar o sobrenadante, e lisar os eritrócitos por suspensão das células em 36 ml de água pura durante 20 segundos, e se ajustar a isotonicidade pela adição de 4 ml de PBS concentrado x 10. Alternativamente, lisar os eritrócitos por suspensão das células em 5 ml de eritrócitos tampão de lise (ACK), e incuba-se 5 minutos à TA. Neutralizar o ACK através da adição de 10 ml de meio RPMI-1640. Centrifugar a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Volte a suspender as células em 5 ml PBS e contar as células.
  5. Ressuspender as esplenócitos em PBS para uma densidade final de 4 x 10 7 células / ml em 2 15 ml de tubo. Adicionar 2 ml de uma solução CFSE 2,5 uM em PBS. Inverter rapidamente o tubo e incubar durante 10 min a 37 ° C com mistura ocasional (2 min cada), protegida da luz.
  6. Extingue-se o excesso de CFSE por adição de 4 ml de FBS a pré-aquecido (100%) e incubar durante 1 min à temperatura ambiente. Adicionar 3 ml de PBS e centrifugar a 400 xg durante 10min.
  7. Lavam-se as células com 30 ml de PBS, e centrifugar a 400 xg durante 10 min.
  8. Filtrar as células através de um coador de células de 40 ^ m e lavar novamente com PBS.
  9. Ressuspender as células em meio RPMI-1640 suplementado com FBS a 10% para uma densidade final de 2 x 10 7 células / ml.
  10. Semente de 2 x 10 6 / poço (200 ul) numa placa de cultura de tecidos de 24 poços.
  11. Estimular as células por adição de 1 ug de anticorpo purificado de hamster arménio anti-ratinho CD3ε em 500 ul de RPMI-1640 com 10% de FBS.
  12. Adicionar 2 x 10 6 HDN ou LDN em 300 ul de meio RPMI-1640 com FBS a 10% para os esplenócitos CFSE marcados, e incubar durante 3 dias a 37 ° C. Wells sem neutrófilos deve obter 300 � de meio. O volume total em cada poço deverá ser de 1 ml.
  13. Recolher as células e prepará-los para citometria de fluxo. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de FACS (Protocolo 5), e adicionar 10 ul de reagente de bloqueio FcR. Incubar durante 5 min à TA.
  14. Adicionar 1 &# 956; l de anticorpo anti-CD8a de APC-conjugado e incuba-se durante 15 min à TA.
  15. Determinar a intensidade de fluorescência CFSE em células T CD8 + por citometria de fluxo (Figura 5). A intensidade CFSE é reduzido pela metade a cada divisão celular. Assim, o número de divisões de células pode ser determinada pela intensidade de coloração com CFSE.

10. Ensaio de migração de neutrófilos

  1. Semente de 5x10 5 células 4T1 em 7 ml de meio de soro reduzido optimizadas suplementado com 0,5% de FBS num frasco de cultura de tecido 2 25 centímetros e incubar 24 horas a 37 ° C.
  2. Transferir 800 uL do sobrenadante para a câmara de fundo de uma placa de migração com um tamanho de poro de 5 um.
  3. Ressuspender 2 x 10 5 neutrófilos em 400 ul de meio de soro reduzido optimizado, suplementado com 0,5% de FBS. Aplicar a suspensão de células na câmara de topo e incubar durante 2 horas a 37 ° C.
  4. No final da incubação, remover a câmara de topo econtar o número de neutrófilos que migraram para a câmara inferior.

11. Monitoramento de neutrófilos produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS).

  1. Prepare a 1,1 x 10 6 neutrófilos / ml em solução salina equilibrada de Hank sem vermelho de fenol. Placa de 180 ul contendo 2 x 10 5 neutrófilos em cada poço de uma placa branca de fundo liso de 96.
  2. Colocar a placa num leitor de placas de luminescência. Adicionar 20 ul de uma solução 500 uM luminol em PBS a cada poço para se obter uma concentração final de 50 uM. Leia a quimioluminescência basal para 1s em um curso de tempo de 5 minutos com intervalos de 10 segundos.
  3. Adicionar um estimulante (por exemplo, PMA, a uma concentração de 10 nM ou 100 nM ou fMLP a uma concentração de 10 uM). Prepara-se uma solução 10x concentrado de cada agente em solução salina equilibrada de Hank sem vermelho de fenol e adicionar 22 uL aos respectivos poços. Adicionar aos poços de controlo de veículo de 22 ul.
  4. Measure a quimioluminescência no leitor de placas. Fazer ambos a uma curta (a cada 10 segundos durante 5 min) e um longo (a cada minuto durante 1 hr) curso de tempo.

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Representative Results

Em um estudo recente, identificamos uma função anti-metastático para os neutrófilos 6. Os neutrófilos de ratinhos portadores de tumores adquirem um fenótipo citotóxico e têm a capacidade de matar células tumorais 6. Isto está em contraste com os neutrófilos a partir de ratinhos ingénuos que não têm efeito anti-tumoral significativa 6. Várias das técnicas descritas na secção Protocolo têm sido utilizados para estudar a função dos neutrófilos anti-tumoral in vitro e in vivo 6.

Neutrófilos tumor citotóxicos podem ser obtidas a partir de murganhos portadores de tumores 6. Para atingir este objectivo, os ratos foram injectados com ortotopicamente 4T1 células para a almofada de gordura mamária inguinal esquerda (Protocolo 1). Ao dia 21 pós-inoculação do tumor, o tumor primário atingiram um tamanho de 1 - 2 cm 3 (Figura 3 - o tumor é evidente no abdómen inferior esquerdo). Neste momento, os ratos foram sacrificados e 1 ml de sangue foi tirado (por ratinho)por punção cardíaca (Figura 3). Em paralelo, o sangue de um mouse que não tumor-rolamento-naïve, foi elaborado. HDN foram então purificados sobre um gradiente de densidade (Protocolo 2.1 e Figura 4), ​​para se obter um (> 98%) da população de neutrófilos altamente puro. Viabilidade de neutrófilos foi determinada por coloração com azul de tripano (Protocolo 2.1). Os neutrófilos foram então ressuspensas em meio de soro reduzido optimizado contendo 0,5% de FBS a 2 x 10 6 / ml neutrófilos.

Para testar o grau de neutrófilos citotoxicidade, foram adicionados 10 5 ul de neutrófilos (50 x 10 a partir de um 6 neutrófilos / ml de solução-mãe 2) para expressar luciferase 4T1 células alvo (5000 células / alvéolo em 100 ul) em um branco de fundo plano de 96 placa -bem (Protocolo 7). Após uma incubação O / N, as células foram lavadas em PBS e lisadas em tampão de lise celular passiva e a actividade da luciferase em cada amostra foi testado para avaliar o grau de citotoxicidade de neutrófilos ( (Figura 2B, sem tumor), neutrófilos purificados a partir de ratinhos portadores de tumor mostram citotoxicidade significativa (Figura 2B, que possui o tumor).

Para testar as propriedades de supressão do sistema imunológico em LDN e HDN foi utilizado o ensaio de proliferação de células T (Protocolo 9). Nós avaliamos aNúmero de células CD8 + em esplenócitos não tratados e tratados em esplenócitos com um anticorpo oCD3, que foram cultivados sozinhos e células que foram cultivadas na presença de LDN ou na presença de HDN (Figura 5A-D). Notar o aumento dramático nas células T CD8 + CFSE + no seguimento da estimulação de anti-CD3 (comparar painel superior direito em A e B) o dramático efeito inibitório do supressor LDN (comparar painel superior direito em B e C) e a ausência de efeito inibitório de HDN (painel D). Também foram avaliados o grau de retenção CFSE, como uma indicação para a proliferação. Na Figura 5E, a curva de laranja apresenta células CD8 + não tratados, a curva azul células CD8 +, tratados com anticorpos oCD3, a curva de vermelho células CD8 + estimuladas com aCD3 na presença de LDN e a curva verde representa células CD8 + estimuladas com α; CD3 na presença de HDN. Observe o deslocamento para a esquerda nas células tratadas oCD3 (curva azul) eo oCD3 células cultivadas com HDN (curva verde), que indicam a proliferação de células CD8 + tratado.

Figura 1
A microscopia eletrônica de transmissão imagem Figura imagem Luz microscopia de alta densidade (A) e neutrófilos de baixa densidade (B) corados com Hematoxilina e Eosina (H & E) seguinte preparação de células em camada fina 1. Neutrophil morfologia.. (C) (TEM) de um neutrófilo de alta densidade. A barra representa 1.000 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. contagens de neutrófilos no sangue aumentam com o tumor progression neutrófilos e adquirir um fenótipo citotóxico. (A) O número de neutrófilos circulantes por 1 ml foi contado por FACS em vários dias após a inoculação das células de tumor em ratinhos BALB / c. O número de circulantes CD11b + Ly6G + neutrófilos aumenta continuamente com a progressão do tumor 4T1. (B) células de carcinoma da mama 4T1 foram co-cultivadas com neutrófilos de alta densidade ou de ratinhos ingénuos (sem tumor) ou 4T1 ratinhos portadores de tumor (portadores de tumor) ratos, ou incubadas em meio na ausência de neutrófilos (Cont.) a 37 ° C durante 20 horas. Os neutrófilos para ratinhos com tumores, mas não a partir de ratinhos livres de tumor, mostram citotoxicidade significativa no sentido 4T1 células tumorais. As barras de erro representam ± SEM ** p <0,01 pelo teste t de um aluno. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"Figura Figura 3. A coleta de sangue murino através de punção cardíaca. O rato foi sacrificado em uma câmara de indução sob lento fluxo de CO 2. Imediatamente após o rato tenha tomado a sua respiração terminal, que é colocado sobre as suas costas e uma seringa de 1 ml heparinizada é inserido na base do esterno até alcançar o coração. Puxe lentamente o êmbolo para aspirar o sangue. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Neutrófilos purificação a partir de sangue total. (A), 3 ml de 1,077 g / ml de sacarose é cuidadosamente em camadas em cima de 3 mL de 1.119 g / ml de sacarose para formar um gradiente descontínuo. Murino sangue inteiro, diluída em PBS-BSA (0,5%) a um volume final de 6 ml, é então mergulhado no topo da 1,077 g / ml de sacarose (B) Na sequência de um 30 min de centrifugação a 700 xg sem intervalo, três fracções distintas podem ser observadas.; R - células vermelhas do sangue no sedimento, L - a fracção de granulócitos neutrófilos contendo de alta densidade, - M. Fracção mononuclear contendo células mononucleares de neutrófilos e de baixa densidade (C) acabado de colher sangue humano é misturada com um volume igual de Dextrano 500 ( 3%) e incubou-se à TA durante 30 min. A fracção de topo que contém as células brancas do sangue (buffy coat) é, em seguida, em camadas no topo de 10 ml 1,077 g / ml de sacarose (D) Após uma centrifugação de 30 min a 400 xg sem ruptura, duas fracções distintas podem ser observadas.; R + G - pellet contendo células vermelhas do sangue e neutrófilos de alta densidade, M -. Fração mononuclear contendo células mononucleares e neutrófilos baixa densidade Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5
Figura 5. Supressão de proliferação de células T. Análises de citometria de fluxo que mostra o número de células marcadas com CFSE CD8 + cultivadas na ausência de estímulo (A), no seguimento da estimulação com um anticorpo aCD3 na ausência (B) ou na presença de LDN (C) ou HDN (D) (E) apresentação de histograma da intensidade CFSE em células CD8 + a partir de painéis A -.. D Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os neutrófilos são a mais abundante de todas as células brancas do sangue e são os primeiros socorros em casos de infecção e inflamação. Como tal, eles são muito sensíveis a estímulos externos e são facilmente activado. Além disso, os neutrófilos tem uma meia-vida muito curta e um volume de negócios rápida. Juntas, essas características levantam várias dificuldades em trabalhar com neutrófilos, de tal forma que estratégias experimentais originais são necessários. Por exemplo, existem várias estratégias de purificação de neutrófilos, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens.

Um passo essencial no trabalho com neutrófilos é a sua purificação a partir de sangue total. Os neutrófilos podem ser eficientemente purificado utilizando quer gradientes de densidade ou estratégias baseadas em anticorpos positivos (ou de selecção negativa). O nosso método de escolha é a utilização de gradientes de densidade, uma vez que produz um elevado número de neutrófilos altamente purificadas com activação não específica mínima. No entanto, como mostramos em um estudo recente 21, sagacidadeneutrófilos progressão h tumorais acumulam em grande número na fracção de baixa densidade mononuclear. Sob estas condições, a utilização de um gradiente de densidade fornece uma fracção de neutrófilos de alta densidade de elevado grau de pureza, que não representam o repertório inteiro de neutrófilos circulantes, e uma fracção de neutrófilos baixa densidade que está fortemente contaminado com outras células mononucleares (linfócitos e monócitos). Nestas circunstâncias, o método de escolha é uma purificação à base de anticorpo, de um modo preferido de selecção negativa. A utilização de anticorpos para purificar os neutrófilos origina neutrófilos altamente puros e melhor representa o repertório inteiro de neutrófilos circulantes. No entanto, percebemos que quanto mais tempo os neutrófilos são incubadas com os anticorpos, as chances de aumento de ativação não específica. Recomenda-se portanto que, para obter os melhores resultados, com base em anticorpo purificação neutrófilos deve ser realizado tão rapidamente quanto possível. À base de anticorpo de purificação de neutrófilos é também o método de escolha quando purifying neutrófilos a partir de tecidos ou tumores.

Independentemente do processo de purificação escolhidos, a pureza, viabilidade e a integridade funcional deve ser rigorosamente avaliada. A pureza dos neutrófilos pode ser determinada por citometria de fluxo utilizando anticorpos que reagem com os marcadores de superfície dos neutrófilos. No rato, Ly-6G é específico para os neutrófilos, os quais são caracterizados por uma CD11b + Ly-6C baixo Ly-6G + F4 / 80 - fenótipo. Os neutrófilos humanos não expressam um marcador análogo ao Ly-6G e são muitas vezes caracterizados pela expressão de CD11b, CD15, CD16, e CD66b. Desde neutrófilos têm receptores Fc, estes precisam ser bloqueada antes imunocoloração. Os neutrófilos também pode ser distinguida das outras células brancas do sangue por ter um maior SSC. A viabilidade deve ser determinada no final do processo de purificação (azul de tripan, protocolo 2.1) e deve ser consistentemente superior a 98%. Integridade funcional deve ser determinada por purificação de neutrófilos de camundongos ingênuos. Estes neutrófilos não são ativados e fornecer controle não citotóxica para neutrófilos arrastado-tumorais em um ambiente co-cultura com células tumorais (protocolo 7).

A meia-vida curta de neutrófilos no sangue, juntamente com o baixo número de neutrófilos (~ 3-5 x 10 5) alcançado a partir de 1 ml de sangue de uma ingênua 6-8 week rato velho, têm tornado difícil para explorar a função de neutrófilos no sangue do mouse em vitro. Números de neutrófilos aumentar de forma constante em estados de inflamação e, ocasionalmente, no câncer, o que representa um estado de inflamação crônica 7. Alguns pesquisadores têm tentado encontrar fontes alternativas de neutrófilos, como a medula óssea 20. Um elevado número de neutrófilos de rato pode ser obtido dentro de 4-24 horas depois de uma injecção intraperitoneal de 1 ml de uma solução de caldo de tioglicolato a 3% ou 1 ml de uma solução 1 mg / ml Zymosan A solução em soro fisiológico. Mas estes neutrófilos induzidos não exercem umny atividade anti-tumorigenic (observação não publicada).

. Granot et al 6 observaram que os ratos BALB / c inoculados ortotopicamente com o carcinoma da mama do rato 4T1 desenvolver neutrofilia que agrava sobre o tempo (Figura 2A), de tal modo que 20-40.000.000 neutrófilos do sangue pode ser facilmente isolado a partir de 1 ml de sangue 3 - 4 semanas inoculação do tumor. Estes neutrófilos foram adquiridos actividades anti-tumorais, e, consequentemente, têm sido denominados neutrófilos arrastadas pelo tumor (RT), de modo a diferenciá-los dos neutrófilos naive (Figura 2B). Enquanto os neutrófilos de alta densidade (HDN) são altamente anti-tumorigénica, neutrófilos baixa densidade (LDN) geradas no contexto de cancro não são 21. Neutrófilos de alta densidade a partir de medula óssea e baço de ratinhos portadores de tumor têm também actividade anti-tumoral (dados não publicados). Deve notar-se que, com a progressão do tumor torna-se gradualmente alargada baço (esplenomegalia), com avincar quantidades de neutrófilos.

A fim de controlar o destino de neutrófilos após a sua transferência adotiva, estes precisam ser rotulados. Os neutrófilos podem ser rotulados in vivo por injecção de bromodesoxiuridina (BrdU) no tumor-rolamento ou camundongos ingênuos dois dias antes do isolamento. BrdU é um análogo da timidina o precursor do ADN, que é incorporada no ADN sintetizado de novo nas células em proliferação. No caso de neutrófilos, BrdU serão incorporados proliferação de células precursoras que retêm a coloração BrdU quando se diferenciar em neutrófilos pós-mitóticas maduros. O BrdU incorporada pode ser coradas utilizando anticorpos fluorescentes anti-BrdU específicos. As células BrdU + pode então ser analisada por citometria de fluxo. Outra abordagem é para rotular os neutrófilos isolados com um corante rastreador celular, tais como 5-carboxifluoresceína éster de N-succinimidilo (CFSE). CFSE é um composto de éster que pode passar através de membranas de células viáveis. Tem uma succinimid amino-reactivoilo que conduz à ligação de proteínas a fluoresceína e outros grupos amino em a célula e a superfície da célula covalente. As células marcadas com CFSE pode ser analisada por citometria de fluxo utilizando o laser de árgon de 488 nm. As duas técnicas de marcação difere pelo fato de que a rotulagem BrdU depende da proliferação de células precursoras, e não todos os neutrófilos circulantes serão marcados, ao passo que CFSE irá manchar todas neutrófilos. Detecção de CFSE é mais simples do que a coloração BrdU, no entanto rotulagem BrdU é um bom meio para seguir o imaturo para amadurecer a conversão de neutrófilos.

Também descreveram vários métodos para determinar a função de anti-tumoral e anti-metastática de neutrófilos. Estes incluem a depleção de neutrófilos, neutrófilos transferência adotiva, prova de neutralização do tumor ea metástase do pulmão semeadura ensaio. Cada um destes ensaios realiza um aspecto específico de funções de neutrófilos anti-tumorais. Por exemplo, Granot et al. 6 observaram que após a depletion de neutrófilos, o número de metástases pulmonares em 4T1 ratos portadores de tumores é aumentada, sugerindo um papel para o anti-metastático dos neutrófilos. Após a transferência adoptiva de neutrófilos, as células de tumor são injectadas por via intravenosa 4 horas antes da injecção de HDN purificada. A capacidade das células tumorais para formar metástases do pulmão e do fígado são seguidos num estudo de curso de tempo usando um sistema in vivo de imagiologia óptica. Os ratinhos que receberam HDN mostrou menos focos metastáticos do que os ratos de controle 6. No teste de neutralização do tumor, as células de tumor são injectadas por via subcutânea com ou sem HDN, a presença de HDN reduz o crescimento do tumor 21. No ensaio de sementeira metastática, as células tumorais marcadas com GFP são injectados por via intravenosa em de controlo ou pré-metastáticos ratinhos portadores de tumores com depleção de neutrófilos, e a capacidade das células marcadas com GFP para semear nos pulmões é determinado. Os pulmões de ratinhos portadores de tumores pré-metastáticos são caracterizados por alta que impede a infiltração de neutrófilos tumoralsemeadura de células no órgão específico 6. Isto traduz-se mais focos metastáticos nos ratos com depleção de neutrófilos em comparação com ratinhos portadores de tumores de controlo.

Os protocolos descritos foco no estudo da função dos neutrófilos no contexto de cancro e proporcionar estratégias para avaliar as propriedades de neutrófilos relacionadas com o cancro, quer in vitro e in vivo. No entanto, as estratégias de purificação de neutrófilos, bem como alguns dos procedimentos experimentais descritos podem ser utilizados para o estudo da função dos neutrófilos, em uma grande variedade de configurações experimentais onde neutrófilos desempenham um papel crítico (isto é, inflamação e infecção).

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Acknowledgements

ZG é apoiada por doações do Programa I-CORE da Fundação Ciência Israel (Grant No. 41/11), a Fundação Abisch-Frenkel, o Roseiras Trust, do Cancer Research Foundation Israel (ICRF - Investigação Carreira de Desenvolvimento Award) eo PREOCUPAÇÃO fundação. ZGF é apoiada por doações da Fundação Israel Cancer Research (ICRF - Investigação Carreira de Desenvolvimento Award), Cientista Chefe do Ministério da Saúde de Israel e da Associação Lung Israel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

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References

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