마우스 폐 암 연구에 유용한 점안 및 고정 방법

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Summary

이 논문의 목적은 크게 폐암 또는 다른 병리와 설정 및 마우스 폐의 분석에 도움이 될 간단한 방법을 설명하는 것입니다. 우리는 간단하고 확실하게 폐 instillations, 정착, 폐 용적 측정을 수행하는데 3 프로토콜을 제시한다.

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Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. J. Vis. Exp. (102), e52964, doi:10.3791/52964 (2015).

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Abstract

부상 또는 쥐를 죽이지 않고 직접 폐로 라이브 제제, 세포, 또는 화학 물질을 주입하는 능력은 폐암 연구에서 중요한 도구이다. 폐 기능 측정을 위해 마우스를 삽관하는 방법을 보여주는 게시 된 많은 방법이 있지만, 아무도는 마우스의 큰 동료의 급격한 기관 점안에 대한 잠재적 인 문제없이 없습니다. 본 논문에서는 간단하고 빠른 방법은 효율적인 방식으로 이러한 instillations을 수행하는 연구자있게 것이 기재되어있다. 이 방법은 특별한 도구 나 조명을 필요로하지 않고 약간의 연습을 배울 수 있습니다. 또한, 마우스를 마취 기관을 시각화 목에 작은 절개를 제작 한 후 직접 정맥 카테터를 삽입하는 것을 포함한다. 작은 절개 빠르게 조직 접착제로 폐쇄하고, 마우스를 복구 할 수있다. 숙련 된 학생 또는 기술자는 2 분 / 마우스의 평균 속도로 instillations을 수행 할 수 있습니다. T 일단암이 확립 그는, 폐의 조직 학적 정량 분석​​에 대한 요구가 빈번하다. 전통적으로 고정하는 동안 폐 인플레이션을 표준화 귀찮게하지 않습니다 일반적으로 병리학 및 분석은 종종 매우 주관적 일 수있는 평가 시스템을 기반으로합니다. 이 언젠가 폐 종양의 크기의 추정을위한 총 충분히 적합 할 수 있지만, 폐 세포 구조 또는 임의의 적절한 stereological 정량화 재현성 정착 과정 및 후속 폐 량 측정을 필요로한다. 여기에서 우리는 모두 압력 폐를 고정하고 정확하게 고정 폐 용적을 측정하는 간단한 신뢰할 수있는 절차에 대해 설명합니다. 유일한 요구 사항은 MG-1 300 g의 범위에 걸쳐 정확한 실험 실용 저울이다. 그러므로 여기에 제시된 절차는 크게 마우스에서 폐암을 생성 처리, 및 분석 할 수있는 능력을 향상시킬 수있다.

Introduction

여러 가지 이유로, 폐암 널리 마우스에서 연구되지 ​​않았다. 그 이유 중 하나는 폐에 대한 액세스가 생체 내에서 매우 곤란하며, 고정 된 폐의 정량 분석은 일반적으로 수행되지 않는다는 것이다. 이 문서에서 설명하는 방법은이 상황을 해결하기 위해 설계되었습니다. 목표는 여기에 크게 폐암 또는 다른 병리와 설정 및 마우스 폐의 분석에 도움이 될 간단한 방법을 설명한다. 이러한 방법 중 어느 것도 완전히 새로운 없지만, 그들은 여기에 설명 된대로 단순화 된 방식으로 독립 실행 형 방법으로 함께 제시되지 않았다.

주로 길이 연구에서 개별 마우스에서 반복 폐 기능 또는 기관지 세척을하는 목적 마우스 폐 삽관 용 방법을 설명 하였다 원고있어왔다. 그 원래의 종이 때문에, MOUS에 다른 접근 방식을 설명했다 몇 가지 다른 논문이 있었다전자 삽관 1 -9. 이들 방법 모두가 성공적으로 사용될 수 있지만, 그들은 일반적으로 상당한 훈련이 필요하며, 사소 실패율없이 종종있다. 또한, 폐 기능의 측정을 수행하기 위해, 캐 뉼러는 공기 누설이 없도록 충분히 밀접 기관 적합해야한다. 그러나, 삽관 용 다른 실용적인 사용은 폐에 직접 특정 에이전트 (암세포 또는 기타 욕설) 또는 치료제를 제공하는 것이다. 이러한 절차는 꽉 피팅 정맥이나 정교한 폐 기능의 장비를 필요로하지 않습니다. 여기에 도시 된 본 방법의 특징은 신규 한 식도를 입력 뉼러의 가능성없이 삽관을 허용 작은 외과 수술을 포함한다. 이 간단한 방법은 비교적 적은 훈련이나 경험이 성공적인 삽관을 할 수 있습니다. 30 개의 마우스 / 시간은 제로에 접근 실패율이 방법을 사용하여 처리 될 수있다.

T 일단그는 마우스는 부상 또는 암의 폐 후 조직 학적 및 병리학 적 분석을 위해 제거 할 수 있습니다, 희생 할 준비가되어 있습니다. 그러나, 적절하게 다른 폐과의 비교를 위해 모든 조직 학적 변수를 정량화하기 위해서, 정착 과정을 표준화하고 적절히 고정 폐 용적 (10)을 정량화하는 것이 필수적이다. 이 논문은 상세히 표준화 정착 절차뿐만 아니라 고정 폐 용적을 측정 할 수있는 방법을 허용 간단한 절차를 설명한다. 이러한 체적 측정없이, 단지 상대 밀도가 10을 측정 할 수 있기 때문에, 부피가 조직학의 정량화에 필수적인 메트릭이다. 폐 용적이 알려지면, 그러나, 세포 및 폐의 다른 구조적 측정의 절대 측정은 다음 정량화 할 수있다.

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Protocol

다음 프로토콜은 20-35g 마우스에서 잘 작동하는 시스템을 설명합니다. 방법은 쉽게 간단히 카테터의 크기를 변경하여 더 크거나 작은 마우스에 적응 될 수있다. 모든 동물 프로토콜은 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 폐 떨어 뜨림

  1. 삽관에 사용하는 상용 1 인치 긴 20g 정맥 캐뉼라를 선택합니다.
  2. 수동으로도 1에 도시 된 바와 같이 그 선단부에 약간의 곡률을 생성하도록 절곡 카테터 팁을 수정한다.
  3. IP는 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (15 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 마취 주사 마우스, 반사 및 움직임의 부재를 확인하여 마취. 즉시 마취 후 눈에 수의학 연고를 적용합니다. 마취는 눈에 수의학 연고를 적용하고 이후 수술 및 점안 마취에 대한 카프로 펜 (5 ~ 10 ㎎ / ㎏ SQ)을 얻었다 직후.
  4. 양해 각서 (MOU)를 배치경 사진 플랫폼에 자체 부정사. 도 2에 도시 된 바와 같이, 봉합 루프와 함께 큰 사무실 바인더 완벽 잘 작동에 녹화.
  5. 목 청소의 복부 부분을 면도하고 70 % 알코올로 목 영역을 소독. 새로운 라텍스 -와 powder- 무료 장갑, 70 % 알코올로 소독 된 수술 도구를 사용합니다.
  6. 사용 날카로운 가위는 약 12​​mm 아래 앞니 아래의 목에 작은 수술 절개를합니다.
  7. 집게 부드럽게 목 피부를 당겨와 기관의 복부 벽을 알 수 미부까지.
  8. 부드럽게 혀를 철회하고 마우스의 복부 표면을 향해 기울어 구부러진 끝 캐 뉼러를 삽입합니다. 1.4에서와 같이, 목의 피부에 부드럽게 당기와 기관에 캐 뉼러를 삽입합니다.
    참고 : 약간의 연습으로, 카테터는 기관을 아래로 이동 볼 수 있습니다. 이 식도로가는 경우, 카테터의 움직임의 시각적 관찰은 없을 것이다. 어떤 절개하지기관에서 만들어진다.
  9. 카테터는 목의 기관에서 볼되면, 안정적으로 그것을 약 5mm 고급 성대를 통과하지만 여전히 잘 카리나 위.
  10. 겔로드 피펫 팁 카테터를 통해 주입 액의 50 μL까지 심어 준비합니다. 루어 허브에서 팁을 배치,하지만 마우스의 호흡과 팁 동기에 유체의 움직임을 관찰하기 위해주의 깊게 살펴 주입하기 전에. 그런 다음 instillate를 주입.
  11. 1 mL의 시린지로 즉시 폐 액체 깊이를 분배하기 위해 카테터를 통해 폐에 공기 0.6 ㎖가 비교적 급속 팽창을한다. 정맥을 제거합니다.
  12. 정맥을 제거합니다.
  13. VetBond에 대한 패키지 삽입 지시에 따라 작은 수술 상처를 닫 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 작은 금액을 사용합니다. 개별 케이지에 마우스를 놓고 그들이 일어나까지 시각적으로 모니터링하고 discomf의 표시없이 정상적으로 작동오트.

2. 폐 고정

참고 : 모든 실험 절차는 마우스에서 수행되면, 폐는 포름 알데히드 (또는 기타 원하는 정착액)와 고정에 의해 조직 학적 처리를 위해 준비 할 수 있습니다.

  1. IACUC 수용 절차에 마우스를 희생. 비디오에 도시 대표 마우스를 들어, 마취 된 쥐의 경추 탈구가 사용된다.
  2. 수술, 기관의 복부 측면을 노출 작은 컷을하고, 기관에 18 G 스텁 바늘 끝을 삽입하고, 스레드와 함께 매서 (아직 수행하지 않은 경우) 기관 절개술을 수행합니다.
  3. 조심스럽게, 중간 선 절개로 가슴을 열고 다이어프램을 절단하고, 폐를 노출하는 측면 가슴 벽을 제거합니다.
  4. 포름 알데히드를 포함하는 링 스탠드에 저수지에 바늘의 루어 끝을 연결합니다. 그림 3을 참조하십시오.
  5. 25cm 각서의 레벨보다 포름 알데히드의 상면을 설정할그 자체. 그림 3을 참조하십시오. 다음 꼭지의 끝에서 유체를 실행하여 고정 튜브에 공기가없는 있는지 확인하십시오. 저수지 튜브로 기관 캐뉼라의 루어 끝을 연결합니다. 포름 알데히드와 폐를 팽창 할 수있는 꼭지를 엽니 다. 적어도 20 분 동안 압력으로 폐를 남겨주세요.
  6. 포름 알데히드와 폐를 팽창 할 수있는 꼭지를 엽니 다. 적어도 20 분 동안 압력으로 폐를 남겨주세요.
  7. 다음으로, 스텁 바늘의 끝을지나 기관을 묶어. 그것은 uncannulated 기관의 더 많은 노출 바늘에 다시 천천히 당겨하는 데 도움이 될 수 있습니다. 안전하게 연결하면, 꼭지를 제거합니다.
  8. 조심스럽게 폐를 해부하다.
  9. 하룻밤 포름 알데히드의 폐를 놓습니다. 긴 시간은 괜찮, 일부 얼룩이나 절차는 특정 시간을 지정할 수 있습니다. 또한 Z-수정 같은 다른 액체 고정 제는, 점적 및 침지에 사용될 수있다.
  10. 또한 조직 학적 처리하기 전에 측정다음에 기술 된 바와 같이 고정 된 폐 용적.

고정 폐 볼륨 3. 측정

  1. .도 4에 도시 된 바와 같이 아르키메데스 원리를 이용한 폐의 부피를 측정 포름 알데히드에서 고정 폐를 제거하고 심장 및 다른 비 - 폐 조직 해부.
  2. 완전히 수몰 폐를 유지하는 데 사용되는 이전에 구성된 간단한 만든 와이어지지 장치를 사용한다.
    참고 :이 장치가 사용되는 중 균형과 호환 할 필요가있다. 도 5에 도시 된 전형적인 플라스틱 피펫 장치는 얇은 (20 G) 와이어로 제조된다. 이 시스템은 비디오에 사용 된 균형이 잘 작동하지만, 가장 쉽게 실험실 저울에 적용 할 수있다.
  3. 물에 장소에 지원 케이지 균형과 용기에 물 ≈200 ml의 비커를 놓습니다. . 그림 6 참조 금속 케이지를 제거; 물 표면에 폐를두고 물에서 눌러케이지.
  4. 균형에 무게를 기록한다. 이 수는 물 변위의 양을 반영하고, 따라서 폐 용적의 직접적인 척도이다. 확인 폐 또는 봉합 또는 측면이나 비커의 바닥에 닿지 않도록 와이어 케이지의 어떤 부분을주의하십시오.
  5. 정확도,이 측​​정을 반복한다. 조직에있는 물에서 폐, 건조를 제거합니다. 다시 자리에 케이지와 비커를 용기와 폐 용적 측정을 반복한다. 두 부피 측정은 다음 평균화한다.
    주 : 폐보다 약 일주일 포르말린에 남아있는 경우, 폐에 공기를 액체에 용해 될 것이다. 이 경우, 폐 싱크 것, 그래서 침수 폐 유지도 5에서와 같이 임의의 장치를 사용하는 것이 더 이상 필요하지 않다. 이러한 경우 볼륨은도 4에 도시 된 것처럼 완전히 잠길 때까지 봉합 문자열 중 하나에 의해 폐 유지시킴으로써 간단하게 측정 할 수있다.

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Representative Results

절차는 그 자체로 어떤 일반화 된 결과로 연결되지 않는 첫 번째 프로토콜에 대해 설명합니다. 단지 직접 기관지 내로 물질을 주입하기위한 수단을 더 믿을만한 설명한다.도 7은 트립 판 블루가 여기에 기재된 방법에 주입시킨 폐의 일례를 도시한다. 기관 또는 마우스 (11, 12)에 주어진 다른 염료 또는 추적자로 볼 된 것과 유사한 염료의 광범위한 분포는있다. 우리는 또한 각각 널리 섬유증이나 폐기종, 결과 폐에 블레오 마이신 또는 엘라 스타 제를 제공하기 위해이 방법을 사용했다.

사후 폐에서 구조적 변화를 정량화 기재된 절차는 25cm의 H 2 O의 압력으로 고정 폐 볼륨에 데이터를 제공 할 이러한 볼륨 측정은 총 수 (10)에 세포 또는 조직 밀도의 후속 편견 조직 학적 측정을 변환하는 것이 필수적이다. 본 논문 만 드매우 정확한 폐 용적을 구하는 수단을 스크라이브한다. 아홉 10-12주 오래 건강을 Balb / c 마우스에서 우리는 (± SD) 평균 좌측 폐의 총 부피의 약 30 % 인과 0.82 ± 0.09 ml로 고정 폐 용적을 측정 하였다. 을 BALB / c 마우스 췌장 엘라 스타 제의 3 U 주어 실험 폐기종을 발생시키기 (이 문서에 기재된 방법), 폐 정량은 30 %로, 나머지 좌측 폐 분율로, 1.15 ± 0.13 ml의 증가.

그림 1
그림 1 : 점안 사용 약간 곡선 팁과 정맥 카테터.

그림 2
그림 2 :. 삽관을 위해 마우스를 지원하는 데 사용 3 링 바인더 3 마우스를 개최하도록 설정이 바인더를 경 사진.


그림 3 :. 유체 위에 마우스 위 25cm를 설정으로 링에 포르말린 작성 저수지가, 마우스에 연결 스탠드이 고정은 보통 흄 후드에서 수행되어야한다.

그림 4
도 4 :. 아르키메데스 원리에 의해 잠긴 물체 변위 물의 중량을 객체의 볼륨 같다. 폐 정상적으로 일부 잔여 공기를 유지하기 때문에,도 5에서와 같이 장치가 완전히 잠긴 폐를 유지하는데 필요하다.

그림 5
그림 5 : 랩은 폐를 완전히 수중 유지에 대한 지원을 만든 장치.플라스틱 피펫 및 금속 와이어로 구성.

그림 6
그림 6 : 비커와 폐 용적 측정을위한 준비 칭량 침수 장치 실험 실용 저울.

그림 7
그림 7 : 삽관 카테터를 통해 트리 판 블루 주어 폐의 예.

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Discussion

여기에 설명 된 절차는 여러 가지 장점이있다. 먼저 필요한 장비는 간단하고 저렴하다. 둘째, 삽관 빠르게 거의 오류없이 수행 할 수있다. 셋째로, 고정 폐 용적을 일정한 압력으로 폐를 고정하고 측정하는 능력은 폐 (10)의 구조 또는 셀의 적절한 정량을 허용한다.

삽관에 한 가지 단점은 작은 수술이다. 이것은 2 차 점적 주입이 필요한 경우의 절차를 반복 할 수있는 능력을 제한 할 수있다. 그러나, 접착제의주의 수술과 응용 프로그램과 함께 우리는 정기적으로 또는 두 개의 나중에 제 점안 일주일을 할 수 있었다. 연속 반복 instillations가 필요 또는 반복적으로 폐 기능 검사가 필요한 경우, 다른 삽관 방식은 13,14 더 바람직 할 수있다합니다.

점안을함으로써, 언급해야 몇 가지 실제적인 문제가 있습니다. 그것은 중요 T입니다오 입의 초기 개방의 혀의 움직임에 가능한 한 부드럽게. 집게를 사용하는 경우, 팁이 혀에 상처가 용이하기 때문에, 고무 튜브로 피복되어야하고, 이것은 마우스의 사망으로 이어질 수있다. 여기에 방법이 육주보다 나이가 생쥐의 삽관을 위해 설계되었지만, 그들은 쉽게 젊은 쥐에 적용 할 수있다.

우리 점안 절차는 초기 구인두 포부 (11)의 방법에 대한 대안으로 설계되었다. 이 후자의 방법을 쉽게 배울 수 있지만 instillate 일부 인두에 남아 삼킬 도착하기 때문에, 폐에 전달되는 실제 체적은 불확실하다. 기관과 우리가 여기에서 보여 후속 폐 인플레이션에 직접 점적으로 instillate 직접 폐에 전달된다. 이 같은 삽관 할 수있는 기관 (11, 12)에 직접 물질을 제공하기 위해 삽관을 사용하는 것이 다 가능하지만 그것은 그 주목할 가치가있다상기도 또는 성대를 MAGE, 그리고 일반적으로 우리가 허용하는 절차 100 % 성공률을 보장하기 위해 훈련 훨씬 더 높은 수준을 요구한다.

우리가 설명하는 고정 절차는 많은 연구자가 사용하는 것과 유사하다. 이 정착액에 사용되는 인플레이션 압력에 약간의 변화는 종종 있지만, 우리는 25cm의 H 2 O를 통해 인플레이션에서 손상없이 완벽하게 팽창 된 폐를 유지하는 것이 적당하다고 생각합니다. 그것은이 25cm의 H에 유체가 팽창 폐는 2 O는 총 폐 용량은 35cm의 H 2 O에서 공기 인플레가 무엇인지에 가까운 볼륨에 있어야합니다 보일 수 있지만, 그러나, 주목해야한다,이다 지금까지 진실. 사실, 정착액과 팽창은 일반적으로 공기 폐활량 15, 16의 70 %의 체적을 초래한다. 파라핀 매립와 후속 처리와, 조직 학적 단면에서 볼 때 효율적인 폐 용적 기능성 잔류 CA 아래와 같다pacity (FRC). 가장 일반적인 정착은 포르말린 또는 Z-수정이지만, 면역 염색을 위해, glutaraldehye 혼합물은 종종 필요합니다. 수사관들은 염색 할 필요가 있는지에 따라 정착액을 선택해야하지만, 최적의 정착에 대한 자세한 설명은이 방법 용지의 범위를 벗어납니다.

조직 학적 단면의 적절한 정량 분석을하기 위해 그것은 폐 용적 (10)의 측정을하는 것이 필수적이다. 이 직렬 섹션 (카발리 법)의 완전한 서열로부터 폐 용적을 얻을 수 있지만, 마우스 폐에서 우리가이 문서 영상에 기술 한 바와 같이 단순히 고정 폐의 부피를 측정하는 것이 더 간단하다. 우리가 설명하는 절차는 어떻게 단 몇 초를 소요하고 정기적으로 모든 폐 고착으로 수행해야합니다. 이렇게 측정 된 볼륨 후속 처리 및 매립에 어떤 수축을 고려하지 않습니다, 그러나, 명심하십시오, 이것은 중요한 경우, 카발리 에리 방법은해야사용. 이 정량 측정에 관한 한, 최종 주 고정 폐 왼쪽 폐에서의 폐의 부피 분율은 생체 내에서 측정 된 것보다 훨씬 더 작다는 것이다. 그것은 일반적으로 25cm의 H에 고정 폐로부터 상기 측정에서 30 % 인 반면, 기능성 잔류 용량으로 마우스의 두 균주의 생체 내에서 폐의 CT 영상은 전체 (17)의 약 40 %로 왼쪽 폐를 보였다 2 O . 이 때문에 다른되어야하는 이유 현재, 우리는 이해하지 않지만, 양적 조직 학적 분석의 변화를 분석 할 때 염두에 보관해야합니다. 폐 용적의 측정을 갖는 폐암의 연구에 대해서는 적절하게 특정 화학 desnsities 또는 전체 종양 또는 전체 폐의 절대 번호로 여러 종류의 세포 밀도에 데이터를 정규화하는 조사원을 가능하게한다.

요약하면, 삽관 절차는 여기에서 설명하는 제조가 저렴간단한 사용하고, 신속하게 성공적으로 상대적으로 약간의 경험과 마우스 폐에 액체를 주입하는 법을 배워야 대부분의 연구자 및 실험실 기술자를 사용하도록 설정해야합니다. 또한, 폐의 조직 학적 분석을 위해 고정 절차 및 폐 용적 측정은 폐암 세포 및 폐 구조의 적절한 반복 및 정량 분석​​을위한 수단을 제공한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laboratory Balance Ohaus Adventurer Pro Model AV 313  Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter Insylte Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle Various Several other possible vendors

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References

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Comments

1 Comment

  1. First of all great article and it is very informative. I am trying to order supplies to have a setup That is shown approve in Figure 3. I was wondering if you can give a more detailed description of this setup. i.e. the materials and instruments used. I am not sure what the glass reservoir is called and not sure what type of stopcock is being used or the type of tubing. Thanks in advance for your reply.

    Reply
    Posted by: Christina V.
    January 21, 2016 - 3:43 PM

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