Instillation et la fixation méthodes utiles en recherche sur le cancer du poumon de souris

Medicine

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Summary

Le but de cet article est de décrire les méthodes simples qui va grandement aider dans la configuration et l'analyse des poumons de souris avec le cancer du poumon ou d'autres pathologies. Nous présentons 3 protocoles d'effectuer simplement et de manière fiable sur instillations pulmonaires, la fixation, et les mesures de volume pulmonaire.

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Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. J. Vis. Exp. (102), e52964, doi:10.3791/52964 (2015).

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Abstract

La capacité d'inculquer agents vivants, cellules ou de produits chimiques directement dans les poumons sans blesser ou de tuer les souris est un outil important dans la recherche sur le cancer du poumon. Bien qu'il existe un certain nombre de méthodes qui ont été publiées montrant comment intuber souris pour les mesures de la fonction pulmonaire, aucun ne sans problèmes potentiels pour l'instillation trachéale rapide dans les grandes cohortes de souris. Dans le présent document, une méthode simple et rapide est décrit qui permet un enquêteur pour mener à bien ces instillations d'une manière efficace. La méthode ne nécessite pas d'outils spéciaux ou de l'éclairage et peut être appris avec très peu de pratique. Elle implique une anesthésie de la souris, une petite incision dans le cou pour visualiser la trachée, puis l'insertion d'un cathéter intraveineux directement. La petite incision est rapidement fermé avec un adhésif tissulaire, et les souris sont autorisés à récupérer. Un étudiant qualifié ou technicien peuvent faire instillations à un taux moyen de 2 min / souris. Une fois que til le cancer est établi, il est souvent une nécessité pour l'analyse quantitative des histologique des poumons. Pathologistes Traditionnellement généralement pas la peine de normaliser l'inflation du poumon lors de la fixation, et les analyses sont souvent basées sur un système de notation qui peut être très subjective. Bien que cela puisse parfois être suffisamment adéquate pour les estimations brutes de la taille d'une tumeur du poumon, tout stéréologique quantification correcte de la structure du poumon ou des cellules nécessite une procédure de fixation reproductible et la mesure du volume pulmonaire ultérieure. Ici, nous décrivons des procédures simples et fiables pour les deux fixant les poumons sous pression, puis en mesurant avec précision le volume du poumon fixe. La seule exigence est une balance de laboratoire qui est précis sur une plage de 1 mg-300 g. Les procédures présentées ici pourraient donc grandement améliorer la capacité de créer, traiter et analyser les cancers du poumon chez les souris.

Introduction

Pour un certain nombre de raisons, le cancer du poumon n'a pas été largement étudiée chez la souris. Une raison à cela est que l'accès au poumon est très difficile in vivo, et l'analyse quantitative des poumons fixes n'a pas fait couramment. Les méthodes décrites dans le présent document sont conçus pour remédier à cette situation. Les buts ici sont à décrire des méthodes simples qui va grandement aider à la mise en place et l'analyse des poumons de souris avec un cancer du poumon ou d'autres pathologies. Bien qu'aucune de ces approches sont entièrement nouvelle, ils ont pas été présentés ainsi que les méthodes autonomes dans la manière simplifiée telle que décrite ici.

Il ya eu un certain nombre de manuscrits qui ont décrit des méthodes pour l'intubation du poumon de la souris principalement dans le but de faire de la fonction pulmonaire répétée ou lavage broncho-alvéolaire chez des souris individuelles dans des études longitudinales. Depuis que le papier d'origine, il ya eu plusieurs autres documents qui ont décrit les différentes approches de protocoles d'ententee intubation 1 -9. Bien que toutes ces méthodes peuvent être utilisées avec succès, ils nécessitent généralement une formation considérable, et ne sont souvent pas sans un taux d'échec non négligeable. En outre, afin d'effectuer des mesures de la fonction pulmonaire, la canule doit adapter la trachée assez serré pour qu'il n'y ait pas de fuites d'air. Cependant, une autre utilisation pratique pour l'intubation est de fournir des agents spécifiques (cellules cancéreuses ou d'autres agressions) ou des médicaments thérapeutiques directement au poumon. Une telle procédure ne nécessite pas une canule hermétique ni aucun équipement de la fonction pulmonaire sophistiqué. La nouvelle caractéristique de cette méthode montré ici implique une procédure chirurgicale mineure qui permet à l'intubation sans aucune possibilité de la canule pénétrer dans l'œsophage. Cette approche simple permet une intubation réussie avec relativement peu de formation ou d'expérience. Autant que 30 souris / h peuvent être traités en utilisant cette approche avec un taux d'échec proche de zéro.

Une fois que tIl souris sont prêts à être sacrifiés, les poumons blessés ou cancéreuses peuvent alors être retirés pour analyse histologique et pathologique. Toutefois, afin de quantifier correctement les variables histologiques pour la comparaison avec d'autres poumons, il est essentiel de normaliser les procédures de fixation et bien quantifier le volume du poumon fixe 10. Ce document décrit en détail les procédures simples qui permettent les procédures de fixation standardisés ainsi comme un moyen de mesurer le volume du poumon fixe. Le volume est un indicateur essentiel de la quantification de l'histologie, car sans une telle détermination du volume, seuls les densités relatives peuvent être mesurés 10. Une fois le volume du poumon est connu, cependant, des mesures absolues de cellules et d'autres mesures structurelles dans les poumons peuvent être quantifiés.

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Protocol

Le protocole suivant décrit un système qui fonctionne bien en 20-35 souris g. Le procédé peut facilement être adapté à des souris plus ou moins simplement en changeant la taille du cathéter. Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation Université Johns Hopkins.

1. Lung instillation

  1. Sélectionnez une longue canule 20 g par voie intraveineuse d'un pouce commerciale à utiliser pour l'intubation.
  2. Modifier la pointe du cathéter flexion manuellement pour générer une légère courbure à l'extrémité comme illustré sur la figure 1.
  3. Anesthésier la souris avec un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (15 mg / kg) injecté IP, et confirmer l'anesthésie par l'absence de mouvement réflexe. Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux immédiatement après l'anesthésie. Immédiatement après l'anesthésie Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux et donnent carprofène (5-10 mg / kg SQ) pour l'analgésie post-opératoire et l'instillation.
  4. Placez le mouSE couchée sur une plate-forme inclinée. Comme le montre la figure 2, un gros classeur de bureau avec des boucles de suture enregistrée sur fonctionne parfaitement bien.
  5. Rasez la partie ventrale du cou et nettoyer et désinfecter la zone du cou avec 70% d'alcool. Avec de nouveaux gants sans latex et de à poudre, utiliser des instruments chirurgicaux désinfectés alcool à 70%.
  6. Utilisation de ciseaux tranchants font une petite incision chirurgicale dans le cou d'environ 12 mm au-dessous de l'incisive inférieure.
  7. Avec une pince tirez doucement la peau dans le cou caudale jusqu'à la paroi ventrale de la trachée peut être vu.
  8. Rétracter doucement la langue et insérer la canule avec le bout courbé incliné vers la surface ventrale de la souris. Comme dans 1.4, tirez doucement sur la peau dans le cou, et insérer la canule dans la trachée.
    NOTE: Avec un peu de pratique, le cathéter sera visible déplacer dans la trachée. Si elle va dans l'œsophage, alors il n'y aura pas observation visuelle du mouvement du cathéter. Aucun incisionssont réalisés dans la trachée.
  9. Une fois que le cathéter est vu dans la trachée dans le cou, l'a avancé d'environ 5 mm pour être fiable passé les cordes vocales, mais toujours bien au-dessus de la carène.
  10. Préparez-vous à inculquer jusqu'à 50 pi de liquide par injection par le cathéter avec une pointe de pipette de chargement de gel. Placez la pointe dans le moyeu luer, mais avant l'injection de regarder attentivement pour observer le mouvement du fluide dans la pointe synchrone avec la respiration de la souris. Puis injecter l'instillation.
  11. Avec une seringue de 1 ml, faire immédiatement une inflation relativement rapide de 0,6 ml d'air dans les poumons à travers le cathéter pour aider à distribuer le liquide profondément dans les poumons. Retirer la canule.
  12. Retirer la canule.
  13. Utilisez une petite quantité de colle cyanoacrylate pour fermer la petite plaie chirurgicale par colis insérer les instructions pour Vetbond. Placez la souris dans des cages individuelles et surveiller visuellement eux jusqu'à ce qu'ils se réveillent et se comporter normalement sans aucune indication de discomfort.

2. Fixation du poumon

Remarque: Une fois que toutes les procédures expérimentales sont réalisées en une souris, les poumons peuvent être préparés pour le traitement histologique par fixation avec du formaldéhyde (ou un autre fixateur désiré).

  1. Sacrifiez la souris avec une procédure acceptable IACUC. Pour la souris représentant le montre la vidéo, la dislocation cervicale d'une souris anesthésiée est utilisé.
  2. Effectuez une trachéotomie (si pas déjà fait) en exposant chirurgicalement la face ventrale de la trachée, faisant une petite coupure, et l'insertion d'un talon pointe de l'aiguille 18 G dans la trachée et l'attachant avec un fil.
  3. Soigneusement ouvrir le thorax avec une incision médiane, couper la membrane, et retirer les parois thoraciques latérales pour exposer les poumons.
  4. Connectez l'extrémité luer de l'aiguille à un réservoir sur un support d'anneau contenant du formaldéhyde. Voir Figure 3.
  5. Réglez la surface supérieure de la formaldéhyde 25 cm au-dessus du niveau de la mouse. Voir Figure 3. Suivant assurez-vous qu'il n'y a pas d'air dans le tube de fixation en exécutant fluide hors la fin d'un robinet. Connectez l'extrémité luer de la canule trachéale à la tubulure de réservoir. Ouvrir le robinet pour gonfler les poumons avec le formaldéhyde. Laissez les poumons sous pression pendant au moins 20 min.
  6. Ouvrir le robinet pour gonfler les poumons avec le formaldéhyde. Laissez les poumons sous pression pendant au moins 20 min.
  7. Ensuite, attacher la trachée au-delà de l'extrémité de l'aiguille de stub. Il peut être utile de se replier lentement sur l'aiguille pour exposer plus de la trachée uncannulated. Lorsque solidement attaché, retirez le robinet.
  8. Disséquer soigneusement les poumons.
  9. Placez les poumons dans la nuit du formaldéhyde. Des durées plus longues sont fines, et quelques taches ou des procédures peuvent spécifier des heures spécifiques. Aussi d'autres fixateurs liquides, telles que z-fix peuvent être utilisées pour l'instillation et l'immersion.
  10. Avant de poursuivre le traitement histologique, mesurerle volume pulmonaire fixe tel que décrit suivant.

3. Mesure du volume pulmonaire fixe

  1. Mesurer le volume du poumon en utilisant le principe d'Archimède, comme illustré sur la figure 4. Retirer le poumon fixe à partir du formaldéhyde et disséquer le cœur et tout autre tissu non-pulmonaire.
  2. Utilisez un dispositif simple maison construite précédemment de support de fil qui est utilisé pour garder les poumons complètement sous l'eau.
    NOTE: Cet appareil doit être rendu compatible avec l'équilibre selon est utilisé. Un dispositif typique de la figure 5 est fabriqué à partir de pipettes en plastique et mince (20 G) fil. Ce système fonctionne bien avec la balance utilisée dans la vidéo, mais peut facilement être adapté à la plupart des balances de laboratoire.
  3. Placez un bécher avec ≈200 ml d'eau sur l'équilibre et la tare de la cage de support en place dans l'eau. Voir la figure 6 Supprimer la cage métallique. placer le poumon sur la surface de l'eau et appuyez sur sous l'eauavec la cage.
  4. Noter le poids sur la balance. Ce chiffre reflète le volume d'eau déplacé et est donc une mesure directe du volume pulmonaire. Soyez prudent pour vous assurer que le poumon ou une suture ou une partie de la cage de fil ne pas toucher les côtés ou le fond du bécher.
  5. Pour plus de précision, répéter cette mesure. Retirer le poumon de l'eau, et sécher sur un tissu. Tarer le bécher avec cage en place et répéter la mesure du volume pulmonaire. Les deux mesures de volume devraient ensuite calculer la moyenne.
    REMARQUE: si les poumons sont laissés dans le formol pendant plus d'une semaine environ, l'air dans les poumons est dissous dans le liquide. Lorsque cela se produit, le poumon coulera, il est donc plus nécessaire d'utiliser un appareil comme dans la Figure 5 pour maintenir le poumon submergée. Dans un tel cas, le volume peut être mesurée par simplement en tenant le poumon par l'une des chaînes de suture jusqu'à ce qu'il soit complètement immergé, comme illustré sur la figure 4.

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Representative Results

La procédure décrire dans le premier protocole n'a pas par lui-même conduire à aucun résultat généralisées. Il décrit seulement un moyen très fiable pour inculquer substances directement dans la trachée. La figure 7 montre un exemple d'un poumon, dans lequel le bleu trypan a été instillé avec le procédé décrit ici. Il ya une large diffusion du colorant, similaire à ce qui a été vu avec d'autres colorants ou traceurs données directement dans la trachée ou les souris 11,12. Nous avons également utilisé cette méthode pour fournir soit la bléomycine ou l'élastase dans le poumon, ce qui conduit à une fibrose généralisée ou l'emphysème, respectivement.

Les procédures décrites pour la quantification des changements structurels dans les poumons post-mortem fournissent des données sur les volumes pulmonaires fixés à une pression de 25 cm H 2 O. De telles mesures de volume sont essentiels pour convertir les mesures histologiques parti pris ultérieures de la densité de cellules ou de tissus dans le nombre total de 10. Ce papier uniquement describes les moyens d'obtenir un volume pulmonaire très précis. Dans neuf vieux de 10 à 12 semaines en bonne santé souris Balb / c, nous avons mesuré une moyenne (± ET) du volume pulmonaire fixe de 0,82 ± 0,09 ml avec le volume pulmonaire gauche étant d'environ 30% du total. Dans des souris Balb / c 3 U donnés de l'élastase pancréatique (avec la méthode décrite dans le présent document) afin de générer emphysème expérimental, le poumon volume fixe augmenté à 1,15 ± 0,13 ml, la fraction restante du poumon gauche à 30%.

Figure 1
Figure 1: cathéter intraveineux avec une pointe légèrement recourbée utilisée pour instillation.

Figure 2
Figure 2: En pente liant 3-anneau utilisé pour soutenir des souris pour la intubation Ce liant mis en place pour contenir 3 souris..


Figure 3:. Réservoir rempli de formol sur l'anneau demeure connecté à la souris, avec le haut de fluide mis 25 cm au-dessus de la souris Cette fixation doit normalement être fait dans une hotte.

Figure 4
Figure 4:. Principe d'Archimède Le poids de l'eau déplacée par un objet immergé est égal au volume de l'objet. Parce que le poumon retient normalement un peu d'air résiduel, un dispositif tel que sur la figure 5 est nécessaire pour maintenir le poumon entièrement immergé.

Figure 5
Figure 5: Lab fait en faveur du maintien poumons complètement sous l'appareil.construit à partir de pipettes en plastique et fil métallique.

Figure 6
Figure 6: Balance de laboratoire avec bécher et dispositif de submersion taré prêt pour la mesure du volume pulmonaire.

Figure 7
Figure 7: Exemple d'un poumon donnée bleu trypan à travers le cathéter d'intubation.

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Discussion

Les procédures décrites ici présentent plusieurs avantages. Première le matériel nécessaire est simple et peu coûteuse. Deuxièmement, l'intubation peut être fait rapidement avec peu d'erreurs. Troisièmement, la capacité de fixer les poumons à une pression constante, puis mesurer le volume du poumon fixe permet une bonne quantification des structures ou des cellules dans le poumon 10.

Un inconvénient possible de l'intubation est la chirurgie mineure. Cela peut limiter la capacité de répéter la procédure si un 2 ème instillation est nécessaire. Cependant, avec la chirurgie et l'application soigneuses de l'adhésif, nous avons été en mesure de faire régulièrement une deuxième instillation d'une semaine ou deux plus tard. Si instillations répétées continus sont nécessaires ou si les tests de la fonction pulmonaire répétées sont nécessaires, une autre approche de l'intubation peut être plus souhaitable 13,14.

En faisant l'instillation, il ya plusieurs questions pratiques qui doivent être mentionnés. Il est important to être aussi doux que possible avec le mouvement de la langue dans l'ouverture initiale de la bouche. Si forceps sont utilisés, les conseils devraient être recouverts d'un tube de caoutchouc, car il est facile de blesser la langue, ce qui peut conduire à la mort de la souris. Bien que les méthodes ici ont été conçues pour l'intubation des souris âgées de 6 semaines, ils pourraient facilement être adaptés aux jeunes souris.

Notre procédé d'instillation a été initialement conçu comme une alternative à la méthode d'aspiration 11 oropharyngée. Bien que cette dernière méthode peut être facilement appris, le volume réel livré au poumon demeure incertain, car une partie de l'instillation reste dans le pharynx et se fait engloutir. Avec une instillation directe dans la trachée et les poumons ultérieure de l'inflation comme nous le démontrons ici, l'instillation est directement livré au poumon. Il est intéressant de noter que, même si il est possible d'utiliser l'intubation à délivrer des substances directement à la trachée 11,12, tels intubation peut damage des voies aériennes supérieures ou cordes vocales, et en général exige un niveau beaucoup plus élevé de la formation pour assurer le taux de réussite de 100% que notre procédure permet.

La procédure de fixation nous décrivons est similaire à ce que de nombreux chercheurs utilisent. Il ya souvent une certaine variabilité de la pression de gonflage utilisée pour le fixateur, mais nous estimons que 25 cm H 2 O est un compromis raisonnable qui maintient le poumon entièrement gonflé sans dommage possible à partir de sur-gonflage. Il convient de noter, cependant, que même si il peut sembler que le poumon gonflé avec un fluide à 25 cm H 2 O doit être à un volume proche de ce que la capacité pulmonaire totale pourrait être de l'inflation de l'air à 35 cm H 2 O, cela est loin de la vérité. En fait, l'inflation avec fixateur se traduit généralement par un volume à 70% de la capacité pulmonaire d'air 15,16. Et avec un traitement ultérieur avec inclusion dans la paraffine, le volume efficace du poumon vues en coupes histologiques est susceptible dessous résiduelle fonctionnelle capacité (FRC). Le fixateur le plus commun est la formaline ou z-fixage, mais pour la coloration immunologique, un mélange de glutaraldéhyde est souvent nécessaire. Les enquêteurs devront choisir un fixateur selon ce qui est besoin d'être teinté, mais un examen plus approfondi du fixateur optimale est au-delà de la portée de ce document sur les méthodes.

Afin de faire une analyse quantitative adéquate des coupes histologiques, il est essentiel d'avoir une mesure de volume pulmonaire 10. Bien qu'il soit possible d'obtenir un volume pulmonaire à partir de la séquence complète de coupes sériées (méthode Cavalieri), dans les poumons de souris, il est souvent plus simple de mesurer simplement le volume du poumon fixe comme on l'a décrit dans ce document et vidéo. La procédure que nous décrivons prend que quelques secondes à faire et doit être fait systématiquement avec toutes les fixations du poumon. Gardez à l'esprit, cependant, que le volume ainsi mesuré ne tient pas compte de tout retrait avec le traitement et l'intégration ultérieure, et si cela est important, la méthode devrait Cavalieriêtre utilisé. Une dernière remarque concernant cette mesure de volume fixe qui est la fraction du volume pulmonaire dans le poumon gauche dans les poumons fixes est nettement inférieure à celle qui a été mesurée in vivo. Tomodensitométrie des poumons in vivo de deux souches de souris à la capacité résiduelle fonctionnelle a montré le poumon gauche à environ 40% du total 17, alors qu'elle est en général seulement 30% dans les mesures ci-dessus à partir de poumons fixés à 25 cm H 2 O . À l'heure actuelle, nous ne comprenons pas pourquoi cela devrait être si différent, mais il faut garder à l'esprit lors de l'analyse des changements dans les analyses histologique quantitative. En ce qui concerne les études sur le cancer du poumon, ayant une mesure de volume pulmonaire permet à un chercheur de normaliser les données correctement sur desnsities chimiques spécifiques ou la densité des différents types cellulaires de nombres absolus dans toute la tumeur pulmonaire ou ensemble.

En résumé, la procédure d'intubation décrire ici est peu coûteux à fabriqueret simple à utiliser, et il devrait permettre à la plupart des chercheurs et des techniciens de laboratoire d'apprendre rapidement à inculquer succès liquides dans les poumons de souris avec relativement peu d'expérience. En outre, le procédé de fixation et le volume pulmonaire mesure pour l'analyse histologique des poumons des moyens pour fournir une analyse quantitative reproductible et correcte des cellules de poumon et de la structure du poumon.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laboratory Balance Ohaus Adventurer Pro Model AV 313  Other balances can be used if they have a range of 1-300 g
20 g Luer intravenous catheter Insylte Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva
500 ml laboratory bottle Various Several other possible vendors

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References

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Comments

1 Comment

  1. First of all great article and it is very informative. I am trying to order supplies to have a setup That is shown approve in Figure 3. I was wondering if you can give a more detailed description of this setup. i.e. the materials and instruments used. I am not sure what the glass reservoir is called and not sure what type of stopcock is being used or the type of tubing. Thanks in advance for your reply.

    Reply
    Posted by: Christina V.
    January 21, 2016 - 3:43 PM

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