Un trombotica Stroke modello basato sulla transitoria cerebrale ipossia-ischemia

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Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia. J. Vis. Exp. (102), e52978, doi:10.3791/52978 (2015).

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Abstract

Ricerca Stroke ha sopportato molte battute d'arresto nel tradurre terapie neuroprotettive nella pratica clinica. Al contrario, la terapia del mondo reale (tPA trombolisi) raramente produce benefici in modelli sperimentali meccanici basati occlusione-, che dominano la ricerca preclinica ictus. Questa scissione tra la panchina e comodini suggerisce la necessità di impiegare modelli tPA-reattiva nella ricerca preclinica ictus. A tal fine, un modello semplice e tPA-reattiva ictus trombotico è inventato e descritto qui. Questo modello si compone di occlusione transitoria dell'arteria carotide comune unilaterale e consegna del 7,5% di ossigeno attraverso una maschera in topi adulti per 30 minuti, mantenendo la temperatura rettale animale a 37,5 ± 0,5 ° C. Sebbene legatura reversibile della carotide unilaterale o ipossia ciascun soppressa flusso sanguigno cerebrale solo transitoriamente, la combinazione di entrambi insulti causato durata deficit riperfusione, fibrina e piastrine deposizione e grande Infarct nel territorio cerebrale mezzo dell'arteria fornito. Importante, coda vena iniezione di tPA ricombinante a 0,5, 1, o 4 ore post-THI (10 mg / kg) disponibile riduzione tempo-dipendente delle dimensioni mortalità e infarto. Questo nuovo modello di ictus è semplice e può essere standardizzata attraverso laboratori per confrontare i risultati sperimentali. Inoltre, induce trombosi senza craniectomy o introdurre emboli preformati. Alla luce di questi meriti unici, il modello THI è un'utile aggiunta al repertorio della ricerca preclinica ictus.

Introduction

La trombolisi e ricanalizzazione è la più efficace terapia dell'ictus ischemico acuto nella pratica clinica 1. Tuttavia, la maggior parte delle ricerche neuroprotezione preclinica è stata eseguita in un modello transitorio meccanico ostruzione (endoluminale sutura occlusione dell'arteria cerebrale media) che produce un rapido recupero del flusso sanguigno cerebrale dopo la rimozione della occlusione vascolare e mostra poco o nessun benefici di tPA trombolisi. È stato suggerito che la scelta dubbia di modelli ictus contribuito, almeno in parte, alla difficoltà nel tradurre terapia neuroprotettiva ai pazienti 2,3. Quindi, vi è una crescente richiesta per l'impiego di modelli di ictus tromboembolico tPA-reattiva nella ricerca preclinica, ma tali modelli hanno anche problemi tecnici (vedi Discussione) 4-7. Qui si descrive un nuovo modello di ictus trombotico in base transitorio ipossico-ischemica (THI) insulto unilaterale e le sue risposte alla terapia endovenosa tPA 8.

Il modello di ictus THI è stato sviluppato sulla base della procedura di Levine (legatura permanente della carotide comune unilaterale seguita da esposizione ad ipossia transitoria in una camera), che è stato inventato per esperimenti con ratti adulti nel 1960 9. La procedura originale Levine caduta nell'oscurità perché ha prodotto solo danni al cervello variabile, ma lo stesso insulto causato neuropatologia coerente in cuccioli di roditori quando fu reintrodotta da Robert Vannucci e dai suoi colleghi come un modello di neonatale ipossico-ischemica encefalopatia (HIE) nel 1981 10. Negli ultimi anni, un po ' investigatori ri-adattato il modello Levine-Vannucci di topi adulti regolando la temperatura della camera ipossica 11. E 'plausibile che le lesioni cerebrali incoerenti nella procedura originale Levine possono derivare da sbalzi di temperatura del corpo dei roditori adulti nella camera ipossica. Per verificare questa ipotesi, abbiamo modificato la procedura di Levine con la somministrazione di gas ipossicoattraverso una maschera, mantenendo la temperatura al cuore roditore a 37 ° C sul tavolo operatorio 12. Come previsto, il controllo della temperatura corporea severi notevolmente aumentato la riproducibilità della patologia cerebrale HI-indotta. L'insulto HI innesca anche la coagulazione, l'autofagia, e grigi e lesioni 13 bianco-materia. Altri ricercatori hanno usato anche il modello HI a indagare post-ictus risposte infiammatorie 14.

Una caratteristica unica del modello ictus HI è che ricalca triade di Virchow di formazione di trombi, compresa la stasi del flusso di sangue, danno endoteliale (ad esempio a causa di stress ossidativo HI-indotta), e ipercoagulabilità (attivazione piastrinica HI-indotta) ( Figura 1A) 15. In quanto tale, il modello HI può catturare alcuni meccanismi fisiopatologici rilevanti per ictus ischemico del mondo reale. Con questa idea in mente, abbiamo perfezionato ulteriormente il modello HI con legatura reversibile delle Nazioni Uniteilateral carotide comune (quindi per creare un transitorio HI insulto), e testato le sue risposte a tPA trombolisi con o senza edaravone. Edaravone è un scavenger di radicali liberi già approvato in Giappone per il trattamento di ictus ischemico entro 24 ore di insorgenza 9. I nostri esperimenti hanno dimostrato che il più breve 30 minuti transitorio HI innesca infarto trombotico, e che il trattamento combinato tPA-edaravone conferisce benefici sinergici 8. Qui si descrivono le procedure chirurgiche dettagliate e considerazioni metodologiche del modello THI, che possono essere utilizzati per ottimizzare i trattamenti riperfusione di ictus ischemico acuto.

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Protocol

Questo protocollo è approvato dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) della Emory University e segue il National Institutes of Health Linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Setup

  1. Preparare il letto chirurgico su pad riscaldamento collegata con pompa di calore a 37 ° C per almeno 15 minuti prima della chirurgia. Posizionare un paranuca con il barile di 3 ml della siringa sul letto chirurgico. Preparare il gas anestesia con 2% isoflurano in aria medicale.
  2. Preparare pinze autoclavato, forbici, porta micro aghi, emostatico, tamponi di cotone e suture. Preparare colla tissutale e unguento oculare.
  3. Impostare il sistema ipossia e termoregolatori con lampada di riscaldamento e sonda rettale. Preparare gas ipossia con 2% isoflurano nel 7,5% O 2 equilibrato per il 92,5% di N 2.
  4. Un'ora prima dell'intervento chirurgico, i topi sono analgesized mediante iniezione sottocutanea di un lento rilascio Meloxicam (4.0 mg / kg).
<p class = "jove_title"> 2. Transient cerebrale ipossia-ischemia (Figura 1B)

  1. Anestetizzare 10-13 settimane di età C57BL maschio / 6 topi di peso 22-30 g nella camera di induzione dell'anestesia con il 3% isoflurano finché l'animale non risponde ai piedi stretta, e quindi rimuovere i peli sul collo a destra con un rasoio elettronico.
  2. Posizionare i mouse sul letto chirurgico legato 2% isoflurano in aria medicale a portata di 2 l / min. Arti anteriori Sicuro stese lungo paranuca ai lati con del nastro medico.
  3. Pulire il sito chirurgico per incisione con betadine seguito da alcol e poi tamponi di cotone.
  4. Sotto il microscopio dissezione, fare un'incisione a 0,5 centimetri destro del collo dell'utero con una pinza rette e un micro forbici circa 0,2 cm lateralmente dalla pelle linea mediana.
  5. Utilizzare un paio di belle pinze dentellate per separare la fascia e il tessuto per esporre la destra carotide comune (RCCA). Separare con cura il RCCA dal nervo vagale usando un paio di pinza sottile liscia.
  6. Live nodo due pretagliati 5-0 sutura di seta (rilasciabile) sul RCCA, e poi cucire la pelle utilizzando 4-0 Nylon monofilamento di sutura (Figura 1C).
  7. Applicare una pomata occhio su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
  8. Trasferire rapidamente i topi al sistema ipossia e mettere il naso e la bocca in maschera facciale con 2% isoflurano in 7,5% O 2 a portata di 0.5-1 L / min per 30 min.
    1. Durante ipossia, utilizzare termoregolatori con lampade riscaldanti per controllare la temperatura rettale a 37,5 ± 0,5 ° C. Monitorare la frequenza respiratoria a 80-120 respiri / min. Il mantenimento della temperatura corporea superiore a 37 ° C durante l'ipossia è importante creare infarto cerebrale coerente. Bassa frequenza respiratoria di solito accade dopo 20 min ipossia. Rimuovere la maschera facciale e consentire il normale alimentazione di aria se la frequenza respiratoria scende al di sotto di 40. Questo richiede 1-2 minuti e non conta nella durata ipossia 30 min.
  9. Dopo ipossia, trasferiretopi per un letto chirurgica e rilasciare i due punti di sutura da RCCA. Chiudere la ferita utilizzando colla tissutale e quindi tornare topi per gabbia. Escludere gli animali se entrambi due nodi vivi sono inaspettatamente rilasciati dopo ipossia.
  10. Monitorare i topi per 5-10 minuti per recuperare da ipossia e anestesia. Posizionare il cibo bagnata nella gabbia e restituirlo alla struttura di cura degli animali.
    Nota: Gli animali che presentano lievi a comportamenti circuitazione grave a 24 ore dopo Thi sono correlati con infrazione del cervello. La maggior parte degli animali con sintomi di sequestro muoiono prima della timepoint 24 ore dopo Thị.

3. Laser Speckle Contrast Imaging

Nota: Anche se questa non è una procedura essenziale del modello THI, un sistema di imaging contrasto bidimensionale speckle laser 16 può essere utilizzato per caratterizzare i cambiamenti del flusso sanguigno cerebrale (CBF) durante o dopo ipossia-ischemia transitoria. Per documentare le alterazioni del CBF sotto THI, registrare subito dopo la step 2.6. In alternativa, per confrontare recupero CBF dopo THI insulto, queste procedure possono essere eseguite dopo la fase 2.10.

  1. Inserire un topo anestetizzato in posizione prona ed eseguire da 1 cm a lunga incisione mediana sul cuoio capelluto con il cranio esposto, ma non aperto.
  2. Monitorare CBF in entrambi gli emisferi cerebrali sotto un imager flusso di sangue, secondo il protocollo del produttore e avviare la registrazione del flusso ematico cerebrale subito dopo l'intervento chirurgico CCAO (passo 2,6). Proseguire per 50 min.
  3. Mostra immagine CBF con unità arbitrarie in una tavolozza di 16 colori e analizzare in tempo reale le regioni selezionate utilizzando il software MoorFLPI seguendo le istruzioni del produttore (Figura 2).
  4. Dopo aver registrato l'immagine CBF, chiudere il cuoio capelluto con colla tissutale e rispedire l'animale verso la gabbia.

Amministrazione 4. tPA

  1. Iniettare animali durante la vena della coda con il solvente o 10 mg / kg ricombinante tPA (220-300 &# 956; l di 1 mg / m tPA) a 0.5, 1 o 4 ore dopo tCCAo più ipossia (Figura 4).

5. Cervello rilevamento dei danni con diverse opzioni

Nota: Per raccogliere i campioni di cervello, eutanasia i topi a 1, 4 o 24 ore dopo Thị.

  1. Metodo Eseguire quantificazione del volume di infarto in vivo cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) a 24 ore dopo THI insulto come descritto precedente. 17
    1. Intraperitoneale iniettare animali con 1,4 M soluzione di mannitolo (~ 0,1 ml / g di peso corporeo) 30 minuti prima di perfusione transcardial. Topi profumato transcardial con PBS seguita da 10 ml di 2% TTC.
    2. Rimuovere il cervello degli animali con strumenti chirurgici dopo 10 min e riporre in paraformaldeide 4% per la fissazione durante la notte e la sezione in spessore di 1 mm con un vibratome.
    3. Scatta una serie di quattro diapositive cervello sezionati al microscopio digitale e quantficare il volume dell'infarto come il rapporto tra l'area infartuata (area bianca sul lato destro) alla zona della integro, nell'emisfero controlaterale utilizzando il software ImageJ.
  2. In alternativa, effettuare la formazione di trombosi mediante immunofluorescenza a 1 ora dopo Thi insulto.
    1. Congelare il cervello fisso in OCT e la sezione del cervello a 12 micron di spessore con un criostato.
    2. Incubare il vetrino di cervello di coniglio con anticorpo anti-fibrinogeno (1: 100) in seguito da capra anti-coniglio Alexa fluo 488 dye (1: 200) per osservare la fluorescenza su un microscopio a fluorescenza.
  3. In alternativa, eseguire nave ostruzione da iniezione vena della coda di 100 ml 2% Evans colorante blu a 4 ore dopo Thị insulto.
    1. Euthanize i topi e rapidamente tagliare la testa per rimuovere cervelli in paraformaldeide al 4% dopo l'iniezione blu Evans. Nota: Ci vogliono 5-10 min per Evans blu circolazione con il colore blu sia anteriori e hind arti.
    2. Seziosu cervelli fissi a 100 micron di spessore con un microtomo scorrimento e osservare la fluorescenza usando un filtro di emissione 680 nm su un microscopio a fluorescenza.

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Representative Results

Bidimensionale imaging a contrasto di speckle laser (LSCI) 16 è stato utilizzato per confrontare le alterazioni del flusso ematico cerebrale (CBF) per 30 min transitoria occlusione carotidea unilaterale (tCCAO), 30 minuti di esposizione ad ipossia (7,5% di ossigeno), e 30 min unilaterale carotidea legatura sotto ipossia (THI). Questo esperimento ha rivelato che tCCAO sotto normossia soppressa la CBF sulla carotide legatura emisfero ~ 50% del valore basale, che recuperato rapidamente al di sopra dell'85% dopo il rilascio dell'occlusione carotidea (R nella Figura 2A). L'esposizione a ipossia sistemica monoterapia ha ridotto il CBF a circa il 75% del valore basale, che transitoriamente rimbalzo a ~ 130% dopo il ritorno all'atmosfera normossia (Figura 2B). In contrasto carotide legatura sotto ipossia (THI) rapidamente ridotto CBF nell'emisfero ipsilaterale a meno del 20% del valore basale circa 10 min, che raramente recuperato sopra 30% a 20 min dopo il rilascio del ligatio carotiden e tornando a normossia. CBF sull'emisfero controlaterale (L), tuttavia, oscilla tra il 20 e il 50% durante l'ipossia, e rapidamente restituito superiore all'80% dopo l'insulto THI (Figura 2C).

A 24 ore dopo tCCAo (30 min) o tCCAO più 30 min ipossia (THI), in vivo macchia TTC è stato utilizzato per rilevare infarto 17. Questa analisi ha mostrato alcun pregiudizio evidente dal insulto tCCAO, ma infarto considerevole nel territorio cerebrale mezzo dell'arteria forniti seguente THI insulto (figura 3A). Anti-fibrina (ogen) immunocolorazione è stato utilizzato per confrontare il cervello tCCAO- e Thi-feriti in 1 ora di recupero e ha mostrato diffusa la deposizione di fibrina (ogen), un indicatore di trombosi, nel Thi-feriti, ma non il mouse tCCAO-sfidato cervello (Figura 3B, C). Iniezione Coda-vena di Evans colorante blu è stato utilizzato anche per confrontare la perfusione vascolare del cervello tCCAO- e Thi-feriti a 4 ore di recupero. Questa analisi ha mostrato diminuirecato perfusione cerebrale e intenso stravaso del colorante blu Evans in Thi-feriti, ma non il cervello di topo tCCAO-sfidati (Figura 3D, E).

Infine, i risultati di Thi insulto nei topi trattati con iniezione coda vena del veicolo (a 0,5 ore di recupero) o ricombinante umano tPA (Activase, 10 mg / kg, a 0,5, 1, o 4 ore post-THI) sono stati confrontati con in Vivo macchia TTC a 24 ore di recupero (Figura 4A). Nei topi trattati con veicolo, il tasso di mortalità a 24 ore post-Thi era 23,8% e solo uno su 21 topi Thi-feriti era oltre la media e 2 SD (il outlier). Il tasso di mortalità con 24 ore di topi che ricevono un trattamento tPA al recupero 0,5 ore è sceso al 8,3%, ma questo effetto è stato perso quando tPA è stato somministrato a 1 o 4 ore dopo l'insulto THI (Figura 4B). La figura 4C tracciata la dimensione infartuale di tutto sopravvissuto topi nei quattro gruppi di trattamento. Da segnalare, sia 0,5 e 1 ora tPA somministrazione significantly ridotta dimensione dell'infarto, rispetto al trattamento dei veicoli. Il gruppo tPA trattamento 0,5 ore ha anche mostrato una estensione dell'infarto significativamente ridotta rispetto al gruppo tPA-trattamento di 4 ore. Figura 4D ha mostrato risultati rappresentativi TTC-macchia dopo ogni trattamento.

Figura 1
Figura 1:. Procedura di transitorio cerebrale ipossia-ischemia (THI) insulto a topi adulti (A) triade del Virchow che spinge la trombosi comprende la stasi del flusso di sangue, danno endoteliale, e ipercoagulabilità del sangue. (B) Un diagramma schematico del procedimento ictus Thi. Due nodi rilasciabili erano legati sulla destra carotide comune (CCA), seguito da erogazione di 7,5% di ossigeno con un cono per 30 minuti, mentre la temperatura rettale topo è stata mantenuta a 37-38 ° C. Dopo il transipossia sistemica ient, la legatura CCA stato rilasciato tirando una estremità dei nodi di sutura rilasciabile. MCA, dell'arteria cerebrale media; ICA, carotide interna; ECA, carotide esterna; CCA, comune carotide. (C) Le procedure chirurgiche per il diritto transitorio CCA occlusione. 1. Due pretagliati sutura (# 1 e # 2) sono stati sottoposti a una isolata CAA destra. Sono state fatte 2. Due nodi rilasciabili. 3. La linea di incisione è stata chiusa da sutura # 3. Assicurarsi che le estremità della sutura # 1 e # 2 sono stati accessibile al di fuori della linea di incisione. 4. Estrarre delicatamente sutura # 1 e # 2 dall'esterno per rilasciare il CCA. Quando eseguito delicatamente, questa procedura non provoca lacerazione del CCA.

Figura 2
Figura 2:. Analisi del flusso ematico cerebrale alterazioni durante e dopo Thi insulto A bidimensionale laser imaging a contrasto di speckle (LSSistema CI) è stato utilizzato per valutare il flusso ematico cerebrale (CBF). R (a destra) indica l'emisfero carotide-legatura; L (a sinistra) è l'emisfero controlaterale. (A) tCCAO sotto normossia soppressa CBF a ~ 50% del valore basale sull'emisfero carotide-legatura (R) per almeno 30 minuti, che recuperato sopra 85% entro 3 min al rilascio del legatura carotidea. (B) In ipossia (7,5% di ossigeno, 30 min) senza carotide legatura, CBF è sceso al 76% del valore di base e transitoriamente rimbalzato a circa il 130% dopo il ritorno alla normossia. (C) In transitoria carotide legatura sotto ipossia (THI, 30 min), CBF sul (R) emisfero carotide-legatura rapidamente sceso a meno del 20% del valore basale, e raramente recuperato sopra 30% al rilascio del carotidea legatura e tornando alla normossia. Al contrario, CBF sul controlaterale (L) emisfero oscillato tra 20-50% durante l'ipossia, e rapidamente restituito al> 80% della linea di basevalore dopo il rilascio di carotide legatura e il ritorno alla normossia. Vengono mostrati rappresentativi tracciati CBF per n> 4 in ogni gruppo. I punti temporali per rappresentativi fotografie LSCI sono stati caratterizzati da linee grigie nel tracciato rappresentante.

Figura 3
Figura 3: infarto cerebrale, trombosi spontanea e vaso ostruzione dopo l'insulto THI (A) in vivo TTC-macchia non ha mostrato miocardico visibile a 24 ore dopo 30 min legatura transitoria del diritto carotide comune (tCCAO), ma l'aggiunta di. 30 min ipossia (7,5% di ossigeno) per tCCAO prodotta infarto consistente nell'emisfero ipsilaterale (asterisco), per lo più nella zona di arterie fornitura cerebrale media. (B, C) ​​Anti-fibrina (ogen) immunocolorazione a 1 ora dopo l'insulto THI ha mostrato depositi diffusi nelemisfero ipsilaterale. Al contrario, non vi era alcuna fibrina (ogen) depositi a 1 ora dopo la tCCAo (30 min) insulto (n> 4 per ciascuno). (D, E) perfusione cerebrale è stata valutata mediante iniezione coda vena di Evans blu colorante in 4 ore dopo tCCAO (30 min) o THI (30 min) insulto. In post-tCCAO cervello, Blu di Evans colorante riempito la maggior parte dei vasi sanguigni nell'emisfero ipsilaterale. Al contrario, nella fase di post-THI cervello, Evan blu colorante compilato un minor numero di vasi sanguigni e è trapelata nel parenchima (n> 3). Scala bar: 250 micron.

Figura 4
Figura 4: Effetti della tPA trombolisi nel modello tratto THI (A) Schema di esperimenti per confrontare gli effetti della somministrazione endovenosa di tPA (10 mg / kg) a 0.5, 1 o 4 ore dopo l'insulto THI.. (B) Sintesi del numero di animali operati, mortality in 24 ore dopo insulti, valori anomali (la dimensione dell'infarto esterna media +/- 2 SD), e il numero di animali incluso per il confronto delle dimensioni dell'infarto. (C) Quantificazione mostrato una media del 32% del volume dell'infarto nel gruppo veicolo e significativa riduzione del miocardio in 0,5 ore (al 16%) e 1 ora (al 20%) (gruppi presenti sono la media e la SEM per ciascun gruppo). I valori p sono determinati dalla t-test. Cervello (D) Rappresentante TTC-macchiato da animali che sono stati contestati dal insulto THI e ricevuto un trattamento tPA al time-point dopo l'infortunio indicato. In colorazione TTC, tessuto vivo ha dimostrato di colore rosso; tessuto infarto era pallido.

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Discussion

L'ictus è un problema di salute importante di crescente importanza per ogni società con un invecchiamento della popolazione. A livello globale, l'ictus è la seconda causa di morte, con una stima di 5,9 milioni di eventi fatali nel 2010, pari al 11,1% di tutti i decessi 18. L'ictus è anche la terza principale causa di anni di vita disability-adjusted (DALY) hanno perso a livello mondiale nel 2010, passando dalla quinta posizione nel 1990 19. Questi dati epidemiologici evidenziano la necessità di terapie più efficaci di acute stroke (ischemico). Tuttavia, nonostante intense ricerche in trattamento neuroprotettivo preclinica, tPA-trombolisi rimane l'unica terapia specifica dell'ictus ischemico acuto che è approvato dalla Food and Drug Administration negli Stati Uniti, mentre numerosi agenti neuroprotettivi volta promettenti in studi sugli animali non sono riusciti negli studi clinici. La difficoltà nel tradurre terapie neuroprotettive in pazienti ha molti fattori, e l'attuale enfasi è sulla buona pra di laboratorioce, meta-analisi di più set di dati, e la cooperazione internazionale per migliorare la ricerca preclinica ictus 20,21. Tuttavia, vi è un parere di minoranza suggerendo che la difficoltà traslazionale è dovuta ad una scarsa scelta di modelli di occlusione vascolare meccanici (es endoluminale sutura MCA occlusione) nella maggior parte delle ricerche ictus preclinica finora 2,3. Perché i modelli di occlusione vascolare meccanica raramente inducono trombosi e riperfusione cerebrale avviene troppo velocemente sul rilascio di ostruzione meccanica, questi modelli non rispondono alla terapia real-word (tPA fibrinolisi), né forniscono una stretta finestra terapeutica di quelli nei pazienti con ictus. Di conseguenza, il rimedio suggerito è quello di sottolineare, almeno includono, modelli ictus tromboembolico in preclinica ricerca ictus 3.

Questa raccomandazione, però, ha i suoi vincoli, perché gli attuali modelli di ictus tromboembolici (consegna emboli esogeno, MCA-iniezione di thrombin e photothrombosis) tutti hanno alcuni inconvenienti tecnici 4. Per il modello emboli esogeno, l'infusione intravascolare di risultati emboli nelle significativa variabilità nella dimensione dell'infarto e la posizione, così come risposte imprevedibili al tPA trombolisi causa di differenze nella preparazione coagulo 4,5. Iniezione diretta della trombina nel ramo MCA richiede craniectomy, e la sua utilità per ottimizzare la terapia trombolitica è ancora da dimostrare 4,6. Chimicamente avviato tromboembolismo basato su iniezione sistemica di un colorante fotosensibile (es Rosa Bengala o eritrosina B) e l'irradiazione attraverso il cranio esposto produce spesso aggregati solo piastrine che non rispondono a trombolisi 4,7. Nel loro insieme, vi è la necessità di modelli tromboembolici semplici e tPA-reattivi per la ricerca preclinica ictus.

Il paradigma THI ha quattro vantaggi unici come modello ictus tromboembolico. In primo luogo, l'insulto THI branditacomponenti endogene per formare in situ trombi senza l'aiuto di sostanze chimiche esogene o emboli preformate. Così, la formazione di trombi nel modello thi è più rilevante per condizioni fisiologiche. In secondo luogo, il modello THI risponde favorevole alla rapida tPA-trattamento (a 0,5 e 1 ora post-infortunio), ma non a trattamento ritardato (a 4 ore). Questa finestra terapeutica è simile a quella osservata nei pazienti con ictus. Quindi, il modello THI può essere utilizzato per la ricerca volta a migliorare la terapia di riperfusione nell'ictus ischemico acuto. In terzo luogo, le procedure chirurgiche nel modello THI sono semplici e diretti, rispetto al modello di occlusione di sutura MCA endoluminale. La durata di ipossia nel modello thi è anche controllabile. Queste caratteristiche rendono il modello THI meno suscettibile a variazioni procedurali tra i diversi laboratori. Infine, il modello THI può capannone informazioni sui meccanismi di riperfusione incompleta nonostante ricanalizzazione delle grandi arterie dopo la trombolisi, che èuna sfida unica nella terapia ictus se confrontato con ischemia cardiaca 1,22. Quindi, il modello di Thi fornisce un sistema unico per studiare i meccanismi della vascolare cerebrale specifica letto disregolazione dell'emostasi 23.

Tutti i modelli lesioni cerebrali sperimentali hanno dei limiti, e il modello Thi non fa eccezione. Tre grandi vincoli tecnici del modello di ictus THI sono state identificate nell'esperimento. In primo luogo, a differenza di altri modelli corsa dove l'insulto è limitata al cervello, la combinazione di ipossia e occlusione carotidea induce la vasodilatazione periferica e una maggiore richiesta di gittata cardiaca 12. Così, quando si confrontano gli effetti delle mutazioni del mouse o agenti neuroprotettivi contro l'insulto THI, il loro impatto sulle funzioni cardiovascolari devono anche essere attentamente confrontati. In secondo luogo, abbiamo scoperto che i diversi ceppi di topi inbred hanno risposte variabili al modello THI, che può essere dovuto a pervietà irregolare del commun posterioriicating arteria 24, funzioni cardiache dissimili, o una combinazione di entrambi. Pertanto, si raccomanda che i sesso, età, peso corporeo, e mouse tensioni tra due gruppi sperimentali siano confrontabili negli studi neuroprotezione. Infine, la corsa THI si basa su animali per respirare il gas ipossico sotto una condizione leggermente anestetizzato. Gli effetti dell'anestesia sui risultati corsa devono essere ridotti al minimo, mantenendo la coerenza tra gli animali. Tuttavia, fintanto che i ricercatori sono vigili di questi dettagli tecnici e riducono le variabili da animali agli animali, il modello di ictus THI possibile stabilire rapidamente per produrre alta consistenza di infarto cerebrale.

In sintesi, THI è un modello tratto semplice e standardizzato che risponde positivamente alla terapia del mondo reale (tPA trombolisi) in una finestra temporale clinicamente rilevante. Questo nuovo modello è una preziosa aggiunta alla ricerca preclinica ictus, e può contribuire a migliorare la terapia trombolitica in ischemico acutoictus.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
adult male mice Charles River C57BL/6  10-13 weeks old (22-30 g)
Mobile Laboratory Animal Anesthesia System VetEquip 901807 anesthesia
Medical air (Compressed) air tank Airgas UN1002 anesthesia
Isoflurane Piramal Healthcare NDC 66794-013-25 anesthesia
Multi-Station Lab Animal AnesthesiaSystem Surgivet V703501 hypoxia system
7.5% O2 balanced by 92.5% N2 tank Airgas UN1956 hypoxia system
Temperature Controller with heating lamp  Cole Parmer  EW-89000-10 temperature controllers
Rectal probe Cole Parmer  NCI-00141PG temperature controllers
Dissecting microscope  Olympus  SZ40 surgical setup
Heat pump with warming pad Gaymar  TP700 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
5-0 silk suture  Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063  eye dryness prevention 
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mannitol Sigma M4125 in vivo TTC
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)  Sigma T8877 in vivo TTC
Vibratome Stoelting 51425 brain section for in vivo TTC 
Digital microscope Dino-Lite AM2111 whole-brain imaging
O.C.T compound Sakura Finetek 4583
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Cryostat Vibratome ultrapro 5000 brain section for IHC
Evans blue Sigma E2129 Detecting vascular perfusion
Microtome Electron Microscopy Sciences 5000 brain section for histology
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Fluorescent microscope Olympus DP73
Meloxicam SR ZooPharm NSAID analgesia

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References

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