Um dispositivo simples de preparar rapidamente inteiras Mounts do mouse Intestino

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Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (104), e53042, doi:10.3791/53042 (2015).

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Abstract

Preparar as peças inteiras do rato intestino delgado e cólon para análise subsequente ou quantificação pode ser demorado e difícil. Descreve-se a utilização de um dispositivo simples para cortar e intestinos "rolo" de rato para preparar rapidamente preparações integrais de montagem de qualidade superior e uniforme para o que pode ser conseguido com a mão. O dispositivo compreende uma base que contém de 4 hastes de aço inoxidável e uma parte superior, que actua como um guia de corte. As hastes são inseridas no lúmen do intestino delgado [dividida em terços] e do cólon. As varetas e as amostras são, em seguida, colocada sobre um pedaço de papel de filtro ou o cartão dentro das ranhuras de detenção na base do dispositivo. A parte superior do dispositivo é então posicionado e serve como uma guia de corte. As duas secções inclinadas do centro da peça superior são utilizadas para orientar uma faca ou bisturi, e cortar o intestino longitudinalmente no topo das hastes. Uma vez que as secções intestinais foram cortados, o topo é removido e o cartão, tissue hastes e cuidadosamente retirado do dispositivo e colocado na bancada. As hastes são então suavemente rolou de lado para nivelar e manter os segmentos intestinais para o pedaço de papel de filtro subjacente ou cartão. A preparação final pode então ser examinado ou fixo e armazenado para análise posterior. As preparações são de valor inestimável para o estudo das alterações intestinais em modelos normais ou geneticamente modificados do mouse. As preparações foram usadas para o estudo e a quantificação dos efeitos da inflamação (colite), danos, lesões pré-cancerosas (focos de criptas aberrantes (ACFs) e mucina empobrecido focos (MDF)) e pólipos ou tumores.

Introduction

O rato eo camundongo geneticamente modificado 1-3 são um modelo de valor inestimável para o estudo de diversas patologias, especialmente câncer e sua relação com a inflamação no trato gastrointestinal. Isso muitas vezes requer a preparação de peças inteiras de intestino delgado e / ou cólon.

A preparação de peças inteiras pode ser feito com um par de tesouras de deslocamento de precisão, mas pode demorar cerca de 20 minutos por ratinho 4. Isto não é muito prático para estudos comparativos, as quais requerem uma quantidade significativa de ratinhos (10 por grupo dizer sujeitas a análise estatística). Além disso, o comprimento de tempo necessário aumenta o risco de degradação do tecido. Uma tentativa de aliviar este problema levou ao julgamento de vários auxílios de preparação de corte. O primeiro foi baseado numa série de placas de metal, com os bosques de corte, mas as placas obscurecido o tecido e, portanto, o corte era difícil de controlar.

A conventional lápis de seis lados, finalmente, forneceu a inspiração para o dispositivo de corte, como pudemos ver então como uma forma de meia lápis faria um bom guia para um bisturi (Figura 1). Isto resultou em um projeto para um quadro com quatro guias de corte 5. A eficácia deste dispositivo foi dramático como as preparações na Figura 4 demonstram a diferença entre a preparação e a preparação de tesoura dispositivo.

Os topos dos dispositivos originais foi construída a partir de várias peças de metal, mas os posteriores, eo modelo atual foi usinado a partir de uma sólida peça de duralumínio. A base foi usinado de resina de alta densidade mais alta qualidade.

O dispositivo tem provado ser de grande utilidade para a preparação de peças inteiras de rato intestino, uma vez que acelera significativamente e melhora a qualidade e consistência das preparações, que têm uma ampla gama de aplicações.

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Protocol

Os vários procedimentos experimentais e a eutanásia humanitária são aprovados pelo comitê de ética instituições de acolhimento e pelos órgãos reguladores competentes. Eutanásia é normalmente conseguido usando asfixia com CO2, seguido por deslocação cervical.

1. Dispositivo

  1. Máquina de a parte principal da base do dispositivo a partir de um bloco sólido de resina de acetil de alta densidade, como descrito neste manuscrito. Em cada extremidade criar 3 mm de alto elevado tiras e máquina parte fora destes 2,5 mm bosques para levar as hastes (ver Figura 2 e Figura 3).
  2. Faça hastes de aço inoxidável 2,4 milímetros de diâmetro com extremidades arredondadas.
    NOTA: A estrutura principal da tampa foi usinado fora da placa de duralumínio. Um número limitado de dispositivos acabados estão disponíveis a partir Dr. Goodlad.

2. Utilização do Dispositivo

  1. Dissecar o intestino delgado e cólon a partir da cavidade abdominal com uma tesourae os dedos enluvados. Remova o mesentério, segurando-o com uma pinça curva e puxando-a do intestino.
  2. Enxaguar os intestinos com fosfato frio tamponado salino (PBS, pH 7,4) utilizando uma ponta de pipeta Gilson tipo, que tinha sido cortado para baixo na sua extremidade mais larga de modo que possa caber num 10 ou 20 ml de encaixe do luer da seringa de plástico.
  3. Coloque para fora do intestino delgado (SB) para uma folha de papel toalha e dividir em três partes iguais em comprimento (proximal, médio e distal - SB1, SB2 e SB3) com uma tesoura. Remover o ceco e colocar para fora do cólon.
  4. Faça várias muito pequenos cortes nos segmentos intestinais com uma tesoura para permitir que o fluido escapar e coloque uma folha de papel toalha sobre os intestinos e gentilmente executar um dedo sobre os preparativos para espremer para fora o líquido e secar.
  5. Levantar as secções e insere as hastes de aço inoxidável que foram previamente molhadas por imersão num recipiente com solução salina tamponada com fosfato.
    NOTA: O intestino pode estar emvertidos se assim o desejar (virado do avesso).
  6. Rotular um pedaço de cartão ou papel de filtro cortado à medida para encaixar na base do dispositivo. Lápis é melhor, uma vez que não é afectada por praticamente todas as soluções. Data da autópsia, código experimental e número de identificação animal são sugeridas.
  7. Colocar a placa de papel de filtro ou para a base do dispositivo. Insira as hastes e os intestinos para as ranhuras na base do dispositivo. Certifique-se da extremidade proximal dos segmentos é posicionado de um modo padronizado. As extremidades proximais deve ser perto os rótulos de cartão.
  8. Coloque a parte superior do dispositivo através da base. Use as barras inclinadas para guiar uma lâmina de bisturi para cortar longitudinalmente as seções.
    NOTA: Ajuda se o tecido é suavemente e cuidadosamente mantida com um dedo para garantir que ele não se mova com a faca.
  9. Remover a parte superior do dispositivo. Remova cuidadosamente o papel e tecidos de filtro (ainda em suas varas).
    NOTA: Um pedaço de cartão rígido colocado debaixo da filpapel ter ajudará elevação.
  10. Ligeiramente úmido (com a ponta do dedo com luva mergulhado em PBS) os segmentos. Role a vara, lado a lado para abrir o intestino e espalhá-lo plana. O tecido irá então aderir ao papel de filtro.
  11. Examine visualmente os preparativos para quaisquer lesões graves.
  12. Transferir o tecido aderiu ao papel de filtro a um banho superficial (ou caixa de sanduíche) contendo fixador.
    NOTA: Depois que o tecido adere ao papel de filtro ou de cartão permanecerá firmemente fixada. Uma ampla gama de agentes fixadores podem ser usados ​​para preservar a preparação. Recomenda-se que o fluido de Carnoy deve ser usado para o estudo de proliferações de células intestinais 6, o qual é ideal para a fixação dos melhores métodos de proliferação celular; No entanto formalina ou outros fixadores muitos também podem ser utilizados se forem necessários outros pontos de extremidade.
  13. Após a fixação (geralmente 3 horas), transferir os preparativos em etanol a 70%. As amostras podem então ser armazenadas até serem necessárias. As preparações cum ser estudada en face e / ou utilizados para a preparação de amostras histológicas para a H & E ou outras técnicas de coloração histológicos, imuno-histoquímica e / ou hibridação in situ.
    NOTA: prolongada fixação pode reduzir a reactividade imuno-histoquímica e / ou in situ reactividade hibridação. Caixas sanduíche polipropileno são ideais para armazenar um grande número de preparações.
  14. Se necessário os tecidos fixos a partir dos vários segmentos intestinais pode ser feita em rolos suíços '' e coradas com toda a variedade de métodos histológicos 6, incluindo as descritas acima. Para fazer uma 'roll suíça "os segmentos intestinais são removidos do papel de filtro, enroladas em torno de um palito ou um palito de dente, presa com um alfinete entomológico e processados ​​para a incorporação de cera 6.
  15. Se necessário, manchar o tecido grosso com azul de metileno para visualizar focos de criptas aberrantes 7.
  16. Pontuação dos preparativos fixos emlazer.

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Representative Results

Os pólipos são fáceis de identificar sob um estereomicroscópio com uma fonte de luz fria para iluminar o lado do tecido (Figura 4). É útil para marcar o cartão com marcas de lápis quando um pólipo é observado a fim de que scoring pode ser discutido mais tarde e diferentes operadores podem chegar a um acordo. O tecido também pode ser volume coradas [com azul de metileno] para identificar focos de criptas aberrantes 8 ou mucina focos empobrecido (MDF) 9 por iluminação a partir de cima ou por trans iluminação (Figura 5).

A localização das lesões também pode ser marcado em uma base posicional 8. Para fazer isso é preciso primeiro preparar uma grade de 10 quadrados em um pacote de desenho computador, copie isso várias vezes e, em seguida, esticar as várias redes para vários tamanhos conhecidas e imprimir em uma folha de acetato (ver Figura 6) [Intaglio é uma útil e programa relativamente simples para fazer isso]. Pode-se, então, encontrar uma grade que se encaixa o l ength da seção e usá-lo para marcar os eventos de interesse.

Uma vez marcados, parte ou todo o tecido pode ser removido para posterior análise ou os segmentos inteiros podem ser enroladas em um "rolo suíço" para seccionamento histológico. Embora este processo tenha sido descrito como um desafio técnico a natureza plana 10 e mesmo das preparações torna este processo muito mais simples. A preparação macro pode ser usado para marcar 'pólipos macro' e os rolos suíços utilizados para marcar 'micro' pólipos 11,12 (Figura 7).

figura 1
Figura 1. Como a inspiração do dispositivo veio de um lápis. As discussões na unidade de chumbo Serviço Biológica para a idéia de usar uma forma de meia lápis para agir como um guia de corte.53042 / "target =" _ blank 53042fig1large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Fotografias do dispositivo original. O dispositivo original foi construído a partir de várias peças de metal, preparado à mão. (A) O dispositivo montado. (B) A parte superior do dispositivo foi removida para mostrar as hastes na posição. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Fotos de dispositivo redesenhado. (A) O quadro principal da tampa é usinados de chapa de duralumínio. (B) à Base (visto em preto)é feito de um bloco sólido de resina de acetil de alta densidade, tendo 4 varetas removíveis sentam-se num canal. É mostrado um papel de filtro (branco) colocado na parte superior da base (preto) (C) A vista final do dispositivo:. A tampa (A) está colocado na parte superior da bacia (B). Dimensões em centímetros são mostrados. As barras foram de 2,4 mm de diâmetro, com extremidades arredondadas. Ver referência 5 para obter mais detalhes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Gut preparação feita com a diferença de tesoura e utilizando o dispositivo. (A) Os intestinos preparados utilizando tesouras offset. (B) os intestinos preparados com o cortador de intestino que mostra o mesmo em toda a largura e o intestino a melhor apresentação do tecido, o que faz com que a contagem, e a observação de pólipos muito mais fácil. Modificação da Figura 3 na Proliferação de Células 6. Barra de escala com a unidade é indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. focos de criptas aberrantes vi em toda montagem de dois pontos corados com azul de metileno. O conjunto de montagem de cólon foi granel corados com azul de metileno para identificar focos de criptas aberrantes, mostrado pelas setas. Barra de escala com a unidade é indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6. Modelo de folhas de acetato para marcar posição. Vários tamanhos de grade de 10 quadrados são impressos em folhas de acetato. O intestino corte é colocado no grid que se encaixa o comprimento da seção, e os eventos de interesse são marcados como número contagem de lesões em cada quadrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. rocambole de um rato H & E manchada intestino delgado. O pequeno rolo intestino Swiss mostrada é de uma (/ + Min) Apc rato, um bem caracterizado modelo vivo de tumor intestinal-genesis. As setas indicam adenomas representativas. Barra de escala com a unidade é mostrado.42 / "target =" _ blank "53042fig7large.jpg> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O dispositivo acelera muito o processo para que dois operadores podem autópsia totalmente um rato dentro de 6 min. Isso vai incluir uma verificação visual para as lesões graves e evidentes de pesagem e fixa os principais órgãos. Ele também irá permitir que os operadores de lavar, limpar e pesar o estômago, ceco, intestino delgado e cólon e preparar as peças inteiras. O tecido pode ser achatada fixa muito rapidamente e, assim, evitar artefactos de degradação.

Uma das principais vantagens do dispositivo (para além de velocidade) é que o dispositivo pode gerar a produção de preparações muito melhor qualidade, o qual, em seguida, torna a análise e quantificação subsequente mais fácil. En rosto de pontuação é ideal para quantificar lesões cancerígenas e pré-cancerígenas macroscópicos (tais como número de pólipos, diâmetro e volume de carga). A natureza ainda dos preparativos torna ideais para depois rolar em 'rolos suíços' e seccionamento de modo que a análise histológica de 'micro pnúmero olyp 'pode também ser quantificado. Focos de criptas aberrantes e outras lesões pré-neoplásicas podem também ser visualizadas utilizando as peças inteiras.

As alterações inflamatórias em vários modelos da colite pode também ser observada utilizando as peças inteiras.

Além disso, a localização destes eventos em diferentes regiões do intestino quantitativa e espacial pode ser determinada. A limitação da técnica é que a utilização do dispositivo requer alguma destreza, especialmente na pontuação do tecido com o bisturi. A maioria dos operadores pode dominar a técnica em um curto espaço de tempo depois de alguns minutos de prática. Os preparativos levar apenas alguns minutos, mas se pequenas amostras preservação instantânea é necessária pode ser tomada para a fixação ou congelada e depois o resto do tecido preparado como de costume.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delrin Ryan Plastics, Earls Barton, UK High-density acetal resin similar material would suffice
Duralumin plate Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available 
Finished device(s) ready for use Contact Dr Goodlad  r.goodlad@imperial.ac.uk Contact  r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
  2. Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
  3. Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
  4. Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
  5. Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
  6. Alferez, D., Goodlad, R. A. To best measure cell proliferation in samples from the intestine. Cell Prolif. 40, 231-240 (2007).
  7. Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
  8. Park, H. S., et al. Effects of epidermal growth factor and dimethylhydrazine on crypt size, cell proliferation, and crypt fission in the rat colon. Cell proliferation and crypt fission are controlled independently. Am J Pathol. 151, 843-852 (1997).
  9. Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
  10. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
  11. Goodlad, R. A., et al. Inhibiting vascular endothelial growth factor receptor-2 signaling reduces tumor burden in the ApcMin/+ mouse model of early intestinal cancer. Carcinogenesis. 27, 2133-2139 (2006).
  12. Mandir, N., Englyst, H., Goodlad, R. A. Resistant carbohydrates stimulate cell proliferation and crypt fission in wild-type mice and in the Apc(Min/+) mouse model of intestinal cancer, association with enhanced polyp development. Br J Nutr. 100, 711-721 (2008).

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