Un dispositivo semplice da preparare rapidamente intere Monti della Intestino mouse

Medicine

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Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (104), e53042, doi:10.3791/53042 (2015).

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Abstract

Preparazione supporti interi dell'intestino tenue e del colon del mouse per la successiva analisi o la quantificazione può essere lunga e difficile. Descriviamo l'uso di un dispositivo semplice da tagliare e intestini 'roll' del mouse per preparare rapidamente intere preparazioni montaggio di qualità superiore ed uniforme a quello che può essere ottenuto manualmente. Il dispositivo comprende una base che contiene 4 barre in acciaio inox e una parte superiore, che funge da guida per il taglio. Le aste sono inseriti nel lume dell'intestino tenue [diviso in terzi] e il colon. Le aste ed i campioni vengono poi poste su un pezzo di carta da filtro o carta nelle scanalature di tenuta nella base del dispositivo. La parte superiore del dispositivo viene quindi posizionato e funge da guida per il taglio. Le due sezioni ad angolo al centro del pezzo superiore sono utilizzati per guidare un coltello o bisturi e tagliare gli intestini longitudinalmente sulla parte superiore delle aste. Una volta che le sezioni intestinali sono stati tagliati, la parte superiore viene rimosso e la carta, tissue e aste delicatamente rimosso dal dispositivo e posto in panchina. Le aste sono poi delicatamente arrotolate lateralmente per appiattire e incollare i segmenti intestinali sul pezzo di carta da filtro sottostante o carta. La preparazione finale può essere esaminato o fisso e memorizzati per una successiva analisi. I preparativi sono preziosi per lo studio dei cambiamenti intestinali nei modelli normali o geneticamente modificati mouse. I preparativi sono stati utilizzati per lo studio e la quantificazione degli effetti di infiammazione (colite), danni, lesioni pre-cancerose (aberranti crypt foci (ACFS) e Mucin impoverito focolai (MDF)) e polipi o tumori.

Introduction

Il mouse e il topo geneticamente modificato 1-3 sono un modello prezioso per lo studio di diverse patologie soprattutto tumorali e il suo rapporto infiammazione nel tratto gastrointestinale. Questo spesso richiede la preparazione di supporti interi del piccolo intestino e / o del colon.

La preparazione di supporti integrali può essere fatto con un paio di forbici precisione di offset ma può richiedere circa 20 minuti per topo 4. Questo non è molto pratico per studi comparativi, che richiedono una notevole quantità di topi (dire 10 per gruppo in analisi statistica). Inoltre, il tempo necessario aumenta il rischio di degradazione dei tessuti. Un tentativo di alleviare questo problema ha portato alla sperimentazione di vari aiuti di preparazione taglio. Il primo era basato su una serie di piastre metalliche, con alberi di taglio, ma i piatti oscurata il tessuto e il taglio era così difficile da controllare.

Un conventional matita sei facce finalmente fornito l'ispirazione per il dispositivo di taglio, come abbiamo potuto poi vedere come una forma di mezza matita sarebbe una buona guida per un bisturi (Figura 1). Ciò ha provocato un disegno per un telaio con quattro guide di taglio 5. L'efficacia di questo dispositivo era drammatica come le preparazioni in Figura 4 mostrano la differenza tra la preparazione e la preparazione forbice dispositivo.

Le cime dei dispositivi originali è stato costruito da diversi pezzi di metallo, ma quelli successivi, e il modello attuale è stata lavorata da un solido pezzo di duralluminio. La base è stata lavorata su qualità resina ad alta densità.

Il dispositivo ha dimostrato di essere di grande utilità per la preparazione di supporti interi di topo dell'intestino in quanto accelera notevolmente e migliora la qualità e la consistenza delle preparazioni, che hanno una vasta gamma di applicazioni.

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Protocol

Le varie procedure sperimentali e l'eutanasia umana sono approvati dal comitato etico istituzioni ospitanti e dai competenti organismi di regolamentazione. L'eutanasia è normalmente realizzato utilizzando CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale.

1. Dispositivo

  1. Macchina la porzione principale della base del dispositivo di un blocco solido di alta densità resina acetalica, come descritto in questo manoscritto. A ciascuna estremità creare 3 mm strisce alti elevati, e la macchina parte da questi 2,5 mm boschetti per prendere le aste (vedi Figura 2 e Figura 3).
  2. Fai barre di acciaio inossidabile di diametro 2,4 millimetri con estremità arrotondate-off.
    NOTA: Il telaio principale del coperchio è stata lavorata su piastra duralluminio. Un numero limitato di dispositivi finiti sono disponibili presso Dr. Goodlad.

2. Uso del dispositivo

  1. Sezionare l'intestino tenue e del colon dalla cavità addominale con le forbicie le dita guantate. Rimuovere il mesentere tenendola con pinze curve e delicatamente tirando via dall'intestino.
  2. Sciacquare l'intestino con fosfato freddo salina tamponata (PBS, pH 7,4) con un puntale tipo Gilson, che era stato abbattuto alla sua estremità più larga in modo che possa andare bene su un 10 o 20 ml luer siringa di plastica.
  3. Disporre il piccolo intestino (SB) su un foglio di carta assorbente e dividere in tre parti uguali di lunghezza (prossimale, medio e distale - SB1, SB2 e SB3) con le forbici. Rimuovere il cieco e il layout del colon.
  4. Fai diverse molto piccoli tagli nelle segmenti intestinali con le forbici per consentire al fluido di fuggire e mettere un foglio di carta assorbente sopra l'intestino e delicatamente eseguire un dito sopra i preparativi per spremere il liquido e asciugare.
  5. Sollevare le sezioni e inserire le barre di acciaio inossidabile che in precedenza erano bagnati immergendo in un bicchiere di tampone fosfato.
    NOTA: L'intestino può essereconvertito se lo si desidera (rovesciato).
  6. Etichettare un pezzo di carta o un filtro di carta tagliata a misura per adattarsi alla base del dispositivo. Pencil è migliore, in quanto non è influenzato da praticamente tutte le soluzioni. Data Autopsia, codice sperimentale ed il numero di identificazione degli animali sono suggeriti.
  7. Posizionare la carta o carta da filtro nella base del dispositivo. Inserire le aste e gli intestini nelle fessure alla base del dispositivo. Assicurarsi che l'estremità prossimale dei segmenti è posizionato in maniera standard. Le estremità prossimali devono essere vicino le etichette di carta.
  8. Posizionare la parte superiore del dispositivo sopra la base. Utilizzare le barre angolari per guidare una lama di bisturi per tagliare longitudinalmente sezioni.
    NOTA: Aiuta se il tessuto è delicatamente e accuratamente tenuto con un dito per garantire che non si muove con il coltello.
  9. Rimuovere la parte superiore del dispositivo. Rimuovere con cura la carta e tessuti di filtro (ancora sulla loro aste).
    NOTA: Un pezzo di carta rigida posto sotto il filcarta ter aiuterà sollevamento.
  10. Leggermente umido (con un dito guantato immerso in PBS) i segmenti. Arrotolare la verga, lato a lato per aprire l'intestino e diffonderla piatta. Il tessuto viene quindi aderire alla carta da filtro.
  11. Esaminare visivamente i preparativi per eventuali lesioni macroscopiche.
  12. Trasferire il tessuto aderito alla carta da filtro per un bagno poco profondo (o casella di sandwich) contenente fissativo.
    NOTA: Dopo il tessuto aderisce alla carta da filtro o di carta rimarrà saldamente collegato. Una vasta gamma di fissativi può essere utilizzata per mantenere la preparazione. Si raccomanda che il liquido di Carnoy dovrebbe essere utilizzato per lo studio delle proliferazioni cellulari intestinali 6, che è la fissazione ideale per i migliori metodi di proliferazione cellulare; tuttavia formalina o molti altri fissativi possono essere utilizzati anche se sono necessari altri endpoint.
  13. Dopo la fissazione (solitamente 3 ore), trasferire i preparativi in ​​etanolo al 70%. I campioni possono essere conservati fino al momento. Le preparazioni cun essere studiati en face e / o utilizzati per la preparazione di campioni istologici per H & E o altre tecniche di colorazione istologiche, immunoistochimica e / o ibridazione in situ.
    NOTA: fissazione prolungata può ridurre la reattività immunoistochimica e / o ibridazione in situ reattività. Scatole panino polipropilene sono ideali per la memorizzazione di un gran numero di preparazioni.
  14. Se necessario i tessuti fissati dai vari segmenti intestinali può essere fatto in 'rotoli svizzera e colorate con l'intera gamma di metodi istologici 6 compresi quelli sopra descritti. Per fare un 'Swiss roll' i segmenti intestinali vengono rimossi dalla carta da filtro, arrotolata intorno ad un bastoncino da cocktail o uno stuzzicadenti, fissato con un perno entomologico e trattati a cera incorporamento 6.
  15. Se necessario, macchia il tessuto all'ingrosso con blu di metilene di visualizzare aberranti cripta foci 7.
  16. Punteggio preparativi fissatitempo libero.

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Representative Results

Polipi sono facili da identificare sotto uno stereomicroscopio con fonte luminosa all'altra illuminare il tessuto (Figura 4). E 'utile per segnare la carta con segni di matita quando un polipo si osserva in modo che punteggio può essere discusso più tardi e diversi operatori in grado di raggiungere un accordo. Il tessuto può anche essere massa macchiato [con blu di metilene] per identificare aberranti foci 8 o mucina foci impoverito (MDF) 9 dall'illuminazione dall'alto o dall'illuminazione trans (figura 5).

La posizione delle lesioni può essere ottenuto su una base 8 posizionale. Per fare questo si deve prima di preparare una griglia di 10 quadrato in un pacchetto di disegno computer, copia diverse volte e poi allungare i più griglie di diverse dimensioni note e stampare su un foglio di acetato (vedere Figura 6) [Intaglio è un utile e programma relativamente semplice per fare questo]. Si può quindi trovare una griglia che si adatta al l ength della sezione e usarlo per segnare gli eventi di interesse.

Una volta segnato, parte o tutto il tessuto può essere rimosso per ulteriori analisi o l'intero sezioni può essere arrotolato in un 'Swiss roll' per sezionamento istologico. Anche se questa procedura è stata descritta come tecnicamente impegnativo 10 la natura pianeggiante e anche dei preparativi rende questa procedura molto più semplice. La preparazione macro può essere utilizzata per segnare 'polipi macro' ei rulli svizzeri utilizzati per segnare 'micro polipi' 11,12 (figura 7).

Figura 1
Figura 1. Come l'ispirazione del dispositivo proveniva da una matita. Discussioni nell'unità piombo Servizio biologica per l'idea di utilizzare una forma di mezza matita per fungere da guida per il taglio.53042 / 53042fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Foto del dispositivo originale. Il dispositivo originale è stato costruito da diversi pezzi di metallo, preparati a mano. (A) Il dispositivo assemblato. (B) La parte superiore del dispositivo è stato rimosso per mostrare le aste in posizione. Favore clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Foto di dispositivo ridisegnato. (A) La struttura principale del coperchio viene lavorato su piastra duralluminio. (B) La base (visto in nero)è costituito da un blocco solido di alta densità resina acetalica, con 4 aste rimovibili seduto in un canale. Viene mostrato un filtro di carta (bianco) posto sulla parte superiore della base (nero) (C) La vista finale del dispositivo:. Il coperchio (A) è posto sulla parte superiore della vasca (B). Sono mostrati Dimensioni in centimetri. Le aste sono 2,4 mm di diametro con estremità arrotondate-off. Vedere di riferimento 5 per maggiori dettagli. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Preparazione Gut realizzato con compensato forbice e utilizzando il dispositivo. (A) L'intestino preparati utilizzando forbici offset. (B) l'intestino preparati con la taglierina budello mostra la stessa larghezza per tutta l'intestino e la migliore presentazione del tessuto, che rende il conteggio, e l'osservazione di polipi molto più facile. Modificato da figura 3 nella proliferazione cellulare 6. Barra di scala con l'unità è indicata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. foci cripta aberranti visto in tutta monte di colon colorato con blu di metilene. L'intero montaggio colon è stato sfuso macchiato di blu di metilene per identificare i focolai aberranti cripta, indicato dalle frecce. Barra di scala con l'unità è indicata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 6. Modello per fogli di acetato per il punteggio posizionale. Varie dimensioni di griglia di 10 caselle vengono stampati su fogli di acetato. L'intestino taglio è posto sulla griglia che si adatta alla lunghezza della sezione, e gli eventi di interesse sono valutate come numero di conteggio di lesioni in ogni quadrato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. Swiss roll di un tenue del mouse H & E macchiato. Il piccolo intestino tenue rullo svizzero mostrata è da un Apc (min + /) del mouse, un pozzo caratterizzato dal modello vivo di tumore intestinale genesi. Le frecce indicano adenomi rappresentativi. È mostrato Barra di scala con l'unità.42 / 53042fig7large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il dispositivo accelera notevolmente il processo in modo che due operatori possono autopsia completamente un mouse all'interno 6 min. Ciò includerà un controllo visivo per lesioni macroscopiche evidenti e la pesatura e alla fissazione degli organi principali. Essa consentirà inoltre agli operatori di lavare, asciugare e pesare lo stomaco, intestino cieco, intestino tenue e del colon e preparare l'intero monti. Il tessuto appiattita può essere fissato molto rapidamente e così evitare artefatti degradazione.

Uno dei principali vantaggi del dispositivo (tranne velocità) è che il dispositivo può generare la produzione di preparazioni di qualità migliore, che poi rende successiva analisi e quantificazione molto più facile. En face punteggio è ideale per quantificare le lesioni cancerogene e pre-cancerogene macroscopici (come il numero di polipi, il diametro e il volume degli oneri). La anche la natura dei preparativi li rende ideali per la successiva rotazione in 'panini svizzeri' e sezionamento in modo che l'analisi istologica di 'micro pnumero olyp 'può anche essere quantificato. Aberrant focolai cripta e altre lesioni pre-neoplastiche possono anche essere visualizzati utilizzando l'intera monti.

Cambiamenti infiammatori in diversi modelli di colite possono osservare anche utilizzando l'intera monti.

Inoltre la posizione quantitativa e spaziale di questi eventi in diverse regioni del budello può essere determinato. Limitazione della tecnica è che l'uso del dispositivo richiede una certa destrezza, soprattutto nel punteggio del tessuto con il bisturi. La maggior parte degli operatori possono apprendere la tecnica in breve tempo, dopo pochi minuti di pratica. Le preparazioni prendere solo pochi minuti, ma se è necessaria la conservazione istantanea piccoli campioni possono essere presi per la fissazione o congelati e poi il resto del tessuto preparato come al solito.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Delrin Ryan Plastics, Earls Barton, UK High-density acetal resin similar material would suffice
Duralumin plate Metal Supplies Ltd, Park Road,Dukinfield. SK16 5LP UK Aluminium allow dating back to 1909 so alterative suppliers are available 
Finished device(s) ready for use Contact Dr Goodlad  r.goodlad@imperial.ac.uk Contact  r.goodlad@imperial.ac.uk for supply details

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodlad, R. A. Cancer Handbook. Alison, M. R. John Wiley and Sons, Ltd. 243-262 (2007).
  2. Ward, J. M., Treuting, P. M. Rodent intestinal epithelial carcinogenesis: pathology and preclinical models. Toxicol Pathol. 42, 148-161 (2014).
  3. Sundberg, J. P., Hogenesch, H., Nikitin, A. Y., Treuting, P. M., Ward, J. M. Training mouse pathologists: ten years of workshops on the Pathology of Mouse Models of Human Disease. Toxicol Pathol. 40, 823-825 (2012).
  4. Wasan, H. S., Novelli, M., Bee, J., Bodmer, W. F. Dietary fat influences on polyp phenotype in multiple intestinal neoplasia mice. Proc Natl Acade Sci USA. 94, 3308-3313 (1997).
  5. Rudling, R., Hassan, A. B., Kitau, J., Mandir, N., Goodlad, R. A. A simple device to rapidly prepare whole mounts of murine intestine. Cell Prolif. 39, 415-420 (2006).
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  7. Park, H. S., Goodlad, R. A., Wright, N. A. The incidence of aberrant crypt foci and colonic carcinoma in dimethylhydrazine-treated rats varies in a site-specific manner and depends on tumor histology. Cancer Res. 57, 4507-4510 (1997).
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  9. Femia, A. P., Dolara, P., Caderni, G. Mucin-depleted foci (MDF) in the colon of rats treated with azoxymethane (AOM) are useful biomarkers for colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 25, 277-281 (2004).
  10. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
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