생성 및 펄스 저주파 초음파의 정량 분석​​은 종 양성 세포를 치료하지의 소닉 감도를 결정하고 치료합니다

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Trendowski, M., Christen, T. D., Zoino, J. N., Acquafondata, C., Fondy, T. P. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (101), e53060, doi:10.3791/53060 (2015).

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Abstract

Introduction

초음파는 인간의 청각 능력의 상한보다 큰 주파수 (~ 20 kHz에서) 어떠한 진동 음압 파를 말한다. 20-60 kHz의 범위에서 저주파 초음파는 조직 파쇄, 핵산 추출을 위해 세포 시료를 조제 에멀젼을 생성하는 수단으로 실험실에서 이용하​​고, 다른 시험 다양한되었다. 저주파 초음파의 유틸리티는 다양한 재료를 청소, 용접 산업 설정을 확장하고, 재료 처리되었습니다. 시판 초음파 발생기는 100-1,200 W.에서 램프 전력을 18-60 kHz의 범위의 주파수에 와서 본격적인

초음파가 긴 진단 이미징을위한 임상에 사용 하였지만, 그것은 단지 최근 중요한 요법으로서 적용되었다. 초음파 ≥1 MHz의 일에 안전하게 요로 결석 (신장 결석) 및 담도 결석을 방해 (돌 수있다환자의 전자 담낭이나 간에서)의 증상 2,3를 줄일 수 있습니다. 체외 충격파 쇄석술 (ESWL)로 알려진이 방법은 널리 병원 (백만 명 이상의 환자가 혼자 미국에서 ESWL으로 매년 4 처리)에 적용하고, 양상을 제공을하는 비 침습적으로 결석을 분해한다 외부 적으로 적용, 집중, 높은 강도 음향 펄스 2-4의 사용을 통해 최소한의 부수적 인 피해.

때문에 높은 강도의 초음파에 의해 생성 된 고유 직접 전단력뿐만 아니라, 캐비테이션 버블에, 이들 방법론이 고강도로 알려진 접근법에서 거세 저항 전립선 암 및 췌장 선암의 치료를위한 암 치료에서 조사 된 집속 초음파 (HIFU ) 5-8. ESWL 매우 유사한 방식으로, 여러 HIFU 초음파 빔을 사용하고, 60 ° C 또는 HIG의 온도를 생성하도록 선택된 초점 영역에 초점을 맞추고 그들을그녀 표적 조직 5 응고 괴사를 유도하는 음향 에너지의 사용을 통해. 열 제거의 다른 양식은 (고주파 열 치료 및 마이크로 웨이브 절제) 존재하지만, HIFU는 유일한 비 침습적 온열 양상 5 인 것을 이러한 방법에 비해 뚜렷한 장점을 제공합니다. HIFU는 병원에서 혼합 된 결과를 달성하고 현재 임상 시험 8-11에서만 사용할 수있다. 그럼에도 불구하고,이 달성 제한된 성공 및 전임상 포유 동물 모델에서 얻은 생체 데이터는 매우 유망한 암 치료 초음파의 가능성을 증명 하였다.

HIFU를 개선하기 위해, 연구자 sonochemotherapy의 형태를 생성하는 데 적합한 항신 생물 제와 초음파를 결합하려고 시도했다. Sonodynamic 치료 (SDT)는 체외에서 모두 인상적인 항 종양 활성을 보여 주었다 유망한 새로운 치료 방법입니다 1. 그것은 손해를 우선적으로 이러한 세포와 정상 조직 학적 1,5의 그 사이의 크기 차이를 기반으로 악성 세포를 그 초음파를 보였다. SDT는 종양 세포에 의해 가해진 초음파 우선적 손상 정도를 증가 sonosensitizers 알려진 전문 에이전트를 포함한다. SDT의 치료 프로그램이 이전 검토되었지만, 사용되는 초음파 시스템은 일반적으로 높은 주파수의 초음파 (메가 헤르츠 ≥1)을 사용하고, 낮은 주파수 kHz의 초음파의 영향은 아직 완전히 탐구한다. 초음파의 낮은 주파수에 의한 물리 화학적 손상 12-14을 유도 마이크로 버블의 급격한 붕괴에 자주 관성 캐비테이션, 세포의 파괴를 초래하는 현상을 생산에 더 능숙하다. MHz 및 저 kHz의 초음파 간의 관성 캐비테이션의 발생의 차이가 낮은 전파는 주파수 미세 기포를 사용한다는 사실에 기인 한다음 압축 하프 사이클 12 동안에 따라서 더 강력한 붕괴 제조, 팽창 하프 사이클에서 정류 된 확산에 의해 성장하는 데 더 많은 시간이야.

우리는 이전에 U937 인간 단핵구 백혈병 세포가 저주파 초음파 (23.5 kHz에서)에 민감한 것으로 나타났습니다, 그리고이 감도는 크게 세포 골격 (15)를 교란 항 종양 제의 적용을 통해 증가시킬 수있다. 또한, 우리는 세포가 우선적으로 더 높은 초음파 감도를 나타내는 큰 세포, 크기에 따라 손상된 것을 증명하고있다. 또한, 비교 셀 크기에 정상적인 인간 조혈 줄기 세포 (hHSCs)과 백혈구 잠정적 저주파 초음파 우선적 정상 조직의 존재하에 종양 세포를 손상하는 데 사용될 수 있음을 시사 그들의 생물 대응 15보다 초음파 처리에 더 내성이다.

더 독특한 소품을 검사하려면잠재적 인 치료 용도를위한 저주파 초음파 erties, 우리는 우리의 현재 초음파 시스템 중 하나의 효능 및 안정성을 증가시키기 위해 세정 및 안정화 과정을 개발, 20mm 혼 구비 브랜슨 모델 SLPe 150 W, 40 kHz의 셀 교란이 끼워 7.62 CM 컵에. 또, 하이드로와 캐비테이션 미터 및 오실로스코프를 사용하여 40 kHz의 범위 내에서 정확한 샘플 캐비테이션 에너지뿐만 아니라 일관성 파형과 진폭을 결정할 수 있었다. 정제 및 우리의 프로토콜을 체계화함으로써, 우리는 우리가 정량적으로 다른 histogenetic 계통의 종양과 정상 세포의 음향 감도를 비교 할 수 있도록, 우리의 실험 sonications의 일관성을 확립 할 수 있었다. 40 kHz의 시스템에 대한 우리의 프로토콜은 관심이 실험실의 순서를 비교 실험을 수행 할 수 있어야하고,에 의해 유발 항 종양 효과의 우리의 연구 결과를 평가하기 위해 광범위한 상세하게 제시저주파 초음파. (도 1 MeβCD), 콜레스테롤 파괴 제, U937의 초음파 감도와 THP1 인간 단핵구 백혈병 세포의 증가에 더하여, 우리는 메틸 - β - 시클로 덱스트린의 농도 의존적 효과를 검토한다.

Protocol

1. 청소 전지 Sonifier 시스템

  1. 혼 컨버터 사용하여 클로로포름과면의 면봉 사이의 결합을 청소합니다. 또한 금속 부스러기, 녹 또는 산화의 축적을 제거하기 위해 혼과 컨버터의 스레드 경유 또는 미네랄 오일을 적용합니다.
  2. 기름 스레드를 닦은 다음 조합에서 오일 및 기타 오염 물질을 제거하기 위해 클로로포름을 사용합니다.

2. 셀 Sonifier 재 조립 및 시스템 설정

  1. 컨버터에 혼을 다시 연결합니다. 제대로 시스템을 토크, 컵 (그림 2A)의 바닥에서 경적을 잡아 당겨 컵 어셈블리에서 조립 컨버터와 뿔을 제거합니다. 컨버터 (그림 2B)의 상단에있는 세 개의 작은 구멍 하나 내부 슬롯 렌치를 놓습니다. 그런 다음, 혼 (그림 2B)의 슬롯 부분에 1/2 인치 까마귀의 발 장착 된 토크 렌치를 배치합니다. 의에 조토크 미터는 54.23 N 표시 될 때까지 시계 방향을 tandard. M (그림 2C), 제조업 (16)가 권장하는 토크를. 강화 컨버터를 장착하고 다시 컵에 경적 및 수직 위치에 링 스탠드에 혼과 컨버터를 탑재합니다. 실험 펄스 투약을 위해 시스템을 설정하기 전에 전원을 다시 연결 변환기.
  2. 펄스 사이의 1 초와 초음파의 1 초를 사용하여 펄스 투약에 대한 시스템을 설정합니다. 다른 투약 모델은 다른 실험 조건을 위해 사용될 수있다. 물 볼륨과 혼 직경과 같은 많은 변수는 잠재적으로이 투약을 변경해야합니다. 상기 세포 샘플 종류, 양 및 농도를 사용하여, 데이터 및 경험적 관찰이 용법의 제형 이끌어왔다.
  3. 원하는 크기로 시스템을 조정합니다. 이 프로토콜에서, sonosensit의 효능을 렌더링 할 완전한 세포의 파괴를 막기 위해 33 % 및 50 %의 진폭을 사용하여어렵거나 불가능 izers을 측정한다.
    참고 : 진폭을 비교 본 연구에서는.

3. 시스템의 강도와 기능을 평가

  1. 샘플 초음파의 레벨 1.5 cm에서 캐비테이션 미터를 잡습니다. 시스템은 예상 된 강도로 실행되고 있는지 평가하는 수치를 참고. 현재 시스템 및 물 수준의 사용, 100-110 W / 33 %의 진폭과 115-125 W / 50 % 진폭 CM 2 cm 2 사이에 기대하고있다. 직접 / W CM 2 캐비테이션 에너지를 나타내는 미터 디스플레이에서 캐비테이션 미터 판독을합니다. 물의 표면에이 판독을 가지고, 그리고 기포가 미터 프로브의 표면에 존재하지 보장.
    참고 :이 절차가 뿔 위의 액세스를위한 캡없이 수행되는 것이 중요합니다. 그들은 모든 초음파을 반복 할 필요가 없다. 오히려, 그들은 단지, 세정 재 조립 및 시스템 설정 이후에 수행되어야한다. 완전히 하이드로 센서 몰입하기 위해 물 12.5 mL를 함유하는 샘플 유리 병에 청음기를 놓는다. 링 스탠드를 사용하여 수중 청음기를 일시 중단합니다.
  2. 파형 특성을 평가하기 위해 오실로스코프의 입력 하이드로 첨부. 비정상적인 파도가 제조업체의 사양에서 시스템의 주파수를 변경할 수있는, 명확한 사인파의 오실로스코프를 검사합니다. 캐비테이션 미터와 오실로스코프 모두 결함이있는 시스템 또는 부적절한 조립을 가리킨다 비정상적인 파도가 표시됩니다 주파수 읽기, 만 오실로스코프를 제공합니다.

세포 및 중간 4. 준비

  1. 240 ml의 Iscove 개변 Dubecco 배지 (IMDM), 50 ml의 소 태아 혈청을 사용하여 배지를 준비. 온도의 급격한 증가는 혈청 안정성을 손상시킬 수 있으므로, 온수 욕에서 소 태아 혈청을 해동하지 마십시오. μL 젠타 마이신 50 ㎎ / ㎖ (240) 및 5 ㎖ 페니실린 결합/ 표준 문화 플라스크에 100 배를 스트렙토 마이신, 및 매체에 추가 할 수 있습니다. 4 ° C에서 매체를 저장합니다.
  2. 종자 U937 세포에서 ~ 4 × 10 준비된 매체를 이용하여 25cm이 플라스크에서 104 세포 / ㎖. TC20 세포 계수기를 사용하여 농도에 대한 세포 생존율을 평가하고, 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 및 15-20 μL의 트리 판 블루 15-20 μl를 배치하고 내용물을 혼합하여 트리 판 블루 배제. Pipette15-20 TC20 샘플링 슬라이드에이 혼합물의 μL, 그리고 TC20 셀 카운터에 슬라이드를 배치하여 카운트를 시작합니다.
  3. 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 품어 및 트리 판 블루 배제하고 TC20 셀 카운터를 사용하여 세포 생존 확인합니다. 세포는 적절한 농도 및 / 또는 적당한 시간 프레임 sonosensitizers, 전사 20 ㎖ 유리 섬광 바이알로 배양 플라스크로부터 세포를 3 ㎖로 처리되었을 때. 이 프로토콜에서, 48 시간 동안 U937 세포를 성장 후 0.5, 1, 치료30 분 동안 5 mM의 MeβCD 충분히 초음파 이전에 세포의 콜레스테롤을 소모합니다.

5. 셀 초음파 처리

  1. 드가는 탈 진공 흐너 플라스크를 사용하여 증류수. 컵 호른에 물을 전송하고, 호온의 맨 위 15mm의 레벨로 채운다. 초음파 처리는 몇 분의 기간 동안 물이 추가로 탈기를 발생시키고 시스템은 초음파를 샘플링하기 전에 실행하지 않는 경우의 실험 과정 동안의 불일치가 발생할 수있다. 따라서, 초음파를 샘플링하기 전에 ~ 7 분 동안 시스템을 실행.
  2. 유지 장치에 세포를 포함하는 섬광 바이알 첨부. 그리고, 컵 호른의 상단에 유지 장치를 부착하고 (슬라이딩기구를 이용하여 물 표면에서) 호온의 상단에서 15mm의 상승으로 설정.
  3. 세포는 통상적으로 1 초 다음 각 펄스 사이에서 간격으로 초음파 세 1 초 펄스들을 이용하여 초음파 처리된다. 이를 위해프로토콜, 전술 한 펄스 투여를 사용하여 33 %와 50 %의 진폭에 초음파 처리 세포.

6. 손상 후 초음파에 대한 세포 평가

  1. 트리 판 블루와 TC20 셀 카운터를 사용하여 손상과 생존을위한 일시 중단 된 세포를 평가합니다. 또한, Z2 계수기를 사용하여 샘​​플을 분석한다. (1 200 비율) Z2 카운터 분석을 위해, 20 ml의 식염수로 100 ㎕의 세포 현탁액을 피펫. 분석 전에, 등장 성 식염수를 이용하여 적어도 두 Z2 입자 분석기의 개구를 플러시. 카운터 홀더에 Z2 샘플을 놓고 카운트를 시작하기 전에 조리개에 플랫폼을 올립니다.
  2. 제조자에 의해 제공된 소프트웨어를 사용 TC20 및 Z2 카운터로부터 데이터를 획득. 세포 손상, 생존, 그리고 초음파에서 세포 파편의 창조에 대한 이러한 데이터를 분석 할 수 있습니다.

7. XTT 분석은 세포 생존을 결정하고 치료 U937과 THP1 세포의 미토콘드리아 활동에

  1. 프리 오XTT 분석법에 R은 동일 조건에서 U937과 THP1 세포 성장. 종래의 초음파로 30 분간 MeβCD 동일한 농도 범위로 세포를 전처리. 세포는 이제 하나 1-3 초 펄스의 범위를 사용하여 초음파 처리 된 것을 제외하고 이전과 동일한 초음파 매개 변수를 사용하여 평가할 수는 XTT 키트 손상의 범위를 개발 한 초 이격.
    참고 :이 단계의 대부분은 XTT 키트 설명서에서 직접 촬영에만 관심이 실험실의 편의를 위해 반복된다.
  2. 10 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. 성장 배지에 재현 탁 된 세포 펠렛은 전술. ~ 1 × 105 세포 / ml로 재현 탁 세포. 다음 (100) 중으로의 평탄한 바닥 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에 웰 당 μL 및 종자에서 U937 세포는 별도의 96 웰 플레이트를 이용 THP1 세포에 대해 반복. 전체 성장 매체 혼자 빈 흡광도 수치의 100 μl를 포함하는 3 제어 우물을 포함합니다. 이어서, 2 판을 배양 접종4 시간.
  3. XTT 시약 및 사용 전에 37 ℃에서 활성화 시약의 두 분액 제상. 소용돌이 분취 량을 부드럽게 명확한 솔루션을 얻을 때까지. 하나의 96- 웰 미세 역가 플레이트 분석법을위한 충분한 활성화 XTT 용액을 형성 XTT 시약, 5.0 ml의 활성화 시약 0.1㎖를 추가. 다른 판의 과정을 반복합니다.
  4. 각 웰에 활성화 된-XTT 솔루션의 50 μl를 추가합니다. 2 시간 동안 세포 배양 CO 2 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. 부드럽게 고르게 긍정적 인 우물에 오렌지 색을 배포 할 수있는 잠복기 다음 판을 흔들어. 마이크로 타이 터 플레이트 판독기를 사용하여 450-500 nm의 파장 사이의 파장에서 세포를 포함하는 분석 웰 및 빈 배경 대조군 웰의 흡광도를 측정한다.
  5. 어느 블랭크 대조군 웰을 이용하여 마이크로 타이 터 플레이트 판독기 없거나 특정 결과로부터 그 평균값을 뺀다. waveleng 다시 모든 분석 우물의 흡광도를 측정한다제 630-690 nm의 사이에 얻은 450-500 nm의 값에서 값을 뺍니다. 주 :이 두 번째의 흡광도 측정 분석 결과로부터 비 특정 수치를 제거하는 데 도움이. XTT 분석은 두 세포주 네 번 반복 하였다.

Representative Results

시스템 안정성이 반복 가능하고 신뢰성있는 결과를 얻는데 가장 중요하다. 54.23 N. m의 적절한 토크 사양도 3b는 시료 바이알 내부 측정을 도시한다. 파형의 일관성은 오실로스코프 청음기 (도 3a)의 사용을 통해 평가되면서, 변환기 및 sonotrode (2)의 적절한 결합을 달성하고, 그림 3c는 컵 혼 내에서 안정성을 평가한다. 예상대로 일부 에너지에 유리에 흡수되는 때문에, 진폭은 약간 감소 하였다. 그러나, 파형은 교란 또는 샘플에 음향 에너지의 안정적인 배달에 필요한 두 패널 B 또는 C, 왜곡되지 않았습니다. 명확한 단일 사인파로 표시하지 않는 파형은 결함이 변환기 또는 부적절한 설정을 나타냅니다. 이것은 여러 비정상적인 파를 나타내고도 3d, 사인파 명확한 부재로 표현되고, 주파수 판독 값T는 제대로 작동 시스템으로 기대했다. 캐비테이션 에너지 생성 (도 4)를 측정하기 위해 사용 캐비테이션 미터 100-110 W / 33 % 진폭 cm 2, 125-130 W / 50 % 진폭에서 2 cm으로 소리 세기를 발견했다.

40 kHz의 시스템이 적절하게 교정과 전체 (그림 5)에서 조립 된 후 모두 TC20 및 Z2 카운터 (그림 6)에 의해 결정되는, 신뢰할 수있는 세포 파괴 쉽게, 달성했다. 예상대로, 더 광범위한 세포 손상 오히려 33 % 진폭에서보다 50 % 초음파 세포 집단에서 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 33 % 진폭은 눈에 띄는 손상 발생으로 투여 제제의 잠재적 소닉 증감 효과를 검출하기위한 시작점으로서 유용하지만, 에이전트 초음파 감도들의 상승 작용을 평가하기 위해 적용될 때 더 손상 탐지 할 여지를 남긴다. 이 그림 7A에 입증되는 경우U937 세포의 초음파 감도를 증강에 MeβCD의 농도 의존적​​ 효과가되게됩니다. 비 초음파 MeβCD 처리 된 세포는 비 초음파, 치료 세포 생존에 매우 유사했지만, 가능성은 현저하게 적용되었다 1 초 40 kHz에서 초음파의 세 가지 펄스 후 떨어졌다. 또한, 초음파 처리 후 생존 능력의 감소는 5 mM의 MeβCD 최대 1 mM의 다음 세포 수의 감소, 다음 0.5 mM의 MeβCD 생산으로, 따라 투여 량 인 것처럼 보인다.

세포 생존 및 미토콘드리아 활성에 대한 유사한 효과가 XTT 키트 (도 7b)으로 평가 된대로, 종래의 초음파에 MeβCD의 다양한 농도로 처리 한 두 U937과 THP1 세포에서 관찰되었다. THP1 세포가 U937 세포보다 내성이 약간 더 소닉 것으로 보인다 있지만, 모두 인간의 백혈병 라인은 용량 의존적으로 손상 될 수 있습니다. MeβCD의 높은 농도와 초음파 자극의 더 펄스세포 생존과 미토콘드리아의 활동을 낮출 대응, U937과 THP1 세포 모두에 대한 가용성, 밝은 색상의 오렌지 유도체 XTT의 가장 낮은 감소를 uced.

그림 1
메틸 β - 시클로 덱스트린의 그림 1. 분자 구조. (A) 메틸 - β - 사이클로 덱스트린 (MeβCD)의 전체 구조. (B) MeβCD는 H 또는 CH 3 중 하나의 R 기와 일곱 반복 단위의 중합체이다. 분자식 : C 56 H 98 O (35). 분자량 = 1331.36.

그림 2
그림 2. 제대로 40 kHz에서 초음파 시스템을 torqueing. (A) 혼과 컨버터 컵 PRI에서 제거또는 torqueing합니다. (B) 각각의 위치에서 슬롯 렌치와 토크 렌치를 배치합니다. (C) 컵에 혼과 컨버터를 다시 연결하기 전에 시계 방향으로 토크의 54.23 N. M을 적용합니다.

그림 3
초음파 시스템의 파형을 특징 오실로스코프 3. 그림. (A)와 하이드로 오실로스코프 파형 진폭 및 일관성을 평가할 수있다. (B)의 기록은 1.5 cm에 직접 뿔 위의 컵으로 촬영하고 33 % 진폭 설정. (C) 여기에 사진 파형은 수중 청음기는 20 ㎖ 유리 섬광 유리 병 내에 배치 될 때 획득 한 독서에서입니다. 바이알을 상기 혼 1.5 cm에 위치 된 후 다시 33 % 진폭으로 설정된다. (D) 오실로스코프 스크린 샷 오결함이있는 시스템이나 혼 컨버터 조합의 부적절한 커플 링 예상되는 바와 같이 비정상적인 주파수와 FA 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
캐비테이션 미터의 사용도 4는 초음파 시스템의 소리 세기를 특성화한다. 여기에 본 캐비테이션 m은 W / cm 2에서 캐비테이션 에너지를 나타내는 데 사용된다. 이 샘플에 대하여 에너지의 일관성을 평가하기위한 중요한 도구이다.

그림 5
40 kHz에서 초음파 시스템의 그림 5. 주요 구성 요소. 초음파 시스템은 컵 경적 완료 표시됩니다 ( (B), 컨버터 (C), 및 샘플 위치 결정기구 (D). 이 디자인은 혼 (F) 위의 예제 (E)의 쉬운 위치 수 있습니다.

그림 6
TC20 및 Z2 카운터를 이용하여 U937 세포의 초음파 분해에 진폭의 다른 수준의 효과도 6. 세포는 각각의 사이에서 1 초 간격으로, 초음파 세 1 초 펄스들을 이용하여 33 %의 진폭 40㎑, 셀 dismembrator (100-110 W / cm 2) 또는 50 %의 진폭 (125-130 W / cm 2)로 초음파 처리 하였다 이러한 펄스. (A) Z2 카운터 소프트웨어로부터의 스크린 샷은 U937 세포에 초음파의 효과를 보여준다. TC20 카운터로부터 (B) 데이터는 결과의 재현성을 입증 그래프로 컴파일 된의. 이러한 데이터는 전체 및 생균뿐만 트리 판 블루로 평가 된 세포 생존 능력을 포함한다. 바 4 독립적 인 세포 집단에 대한 평균 (SEM)의 표준 오차를 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
U937 및 THP1 세포의 초음파 감도를 증강에 메틸 β-덱스트린도 7 효과. (A) U937 세포는 종래 40 kHz의 초음파 (105 W / cm로 초음파 처리되고, 30 분 MeβCD 다양한 농도로 처리 한 ) 세 1 초 펄스를 사용하여 1 초 간격으로 이격. 세포 집단은 ≥12 μm의 ≥17 μm의로 분류되었다. (B) U937 또는 THP1 세포는 다시 다양한 승낙 처리 하였다30 분 전 1 초 초음파의 1-3 펄스를 사용하여 40 kHz의 시스템과 초음파되기 MeβCD의 식량은 1 초 간격을두고. 세포 생존과 미토콘드리아의 활동은 XTT 키트와 함께 평가 하였다. 세포를 100 ㎕은 편평한 바닥 96- 웰 마이크로 타이 터 플레이트에 웰 당 시딩 하였다. 플레이트는 종래 XTT 용액의 첨가로 24 시간 동안 인큐베이션 하였다. 파장이 판독되기 전에 세포는 추가로 2 시간 동안 배양 하였다. 바 4 독립적 인 세포 집단에 대한 SEM을 반영한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

최적의 결과를 달성하기 위해 특별한주의가 신중하게 샘플을 놓고 컨버터 혼 노조를 청소주의해야한다. 호온의 샘플 위치는 혼으로부터 거리를 변경하는 것은 샘플이 노출되는 에너지를 변경할 수 있으므로 탄성 초점을 변경 한 바와 같이, 일치 셀의 파괴를 얻기 위해 중요하다. 컵 호른 내의 음향 에너지는 최대 캐비테이션의 위치를​​ 찾기 위해 캐비​​테이션 미터를 사용하여 매핑 될 수있다. 또한, 오실로스코프와 함께 캐비테이션 m은, 세포에 노출되는 소리의 강도뿐만 아니라, 파형의 균질성을 결정하기에 매우 중요하다. 따라서 이러한 장비는 시스템에 문제를 감지하고 문제 해결에 시스템 불안정을 해결하기 위해 필요할 수있다을 결정하는 데 도움이되어야한다.

앞서 언급 한 바와 같이, 저주파 시스템에 대해 실행되지 않을 경우 상기 실험 내내 탈기 물 작용할 수도초음파를 샘플링하는 데 몇 분 전에. 이 초기 실행은 실험 기간 동안 상대적으로 탈기 초음파 매체 따라서 일관성있는 결과를 산출하기 위해 수행해야합니다. 감작의 진정한 범위는 평가하기 어렵다 같이 sonosensitizers의 효능을 평가하는 경우뿐만 아니라, 세포에서 또는 근처에서 최대 진폭 초음파 처리되어서는 안된다. 40 kHz의 시스템에서 33 %의 진폭을 사용하는 것은 주목할만한 손상을 생산하는 등의 이상적인 설정이지만, U937과 THP1 세포 (그림 7)에 대해 MeβCD으로 입증 된 바와 같이, 그 효능을 입증하는 sonosensitizers 충분한 공간을 제공합니다. 이러한 데이터는 또한 MeβCD이 용량 의존적으로 저주파 초음파 여러 백혈병 라인을 민감하게 확인합니다.

초음파 분해를 통해 생성되는 17-19 intramembrane 캐비테이션 기포의 증거를 나타내는 8 MHz의 0.75 MHz의 주파수 범위 내에서 더 높은 빈도로 수행 실험있어왔다. 그러나 questio여전히 초음파 - 유도 된 세포 용해 (18)의 정확한 메커니즘에 관해서 남아 NS. 우리는 저주파 초음파 (15), 다른 실험실 20 입증 현상을 이용하여 세포 골격 유동화 사이의 링크를 도시하고 소닉 감도를 증가하고있다 (21). 또, 이러한 사이토 B로서 미사 교란 에이전트가 여러 백혈병 초음파 감도를 강화시킬 수 있음을 발견 하였다 액틴의 중합 반응의 억제를 제안 라인,하지만 hHSCs 또는 22 백혈구, 특히 관심이 sonosensitizing 메커니즘 수있다. 또한 현저 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프 성 백혈병을 포함한 시험 관내 백혈병 다른 종류의 초음파의 감도를 증가시킨다, 즉 빈 크리스틴, 튜 불린 중합에 23, 24을 억제 미세 소관 붕괴 제를 관찰했다. 대조적으로, 세포 골격 성분을 안정화 골격 지시 제 (파클리탁셀D의 jasplakinolide)는 세포 용해 (22)의 낮은 가격으로 반영, 초음파에 세포를 방지하기 위해 나타납니다. 종합 해 보면, 이러한 데이터는 종양 세포의 세포 골격 성분을 유동화 가설 실제로 SDT (25)의 효능을 높이는 중요한 요소이다 지원한다. 본 연구는 또한 콜레스테롤 고갈 MeβCD 처리 된 U937 세포가 현저하게 40 kHz에서 초음파에 민감로 추가로, 종양 세포의 초음파 감도를 강화시킬 수있는 또 다른 방법이 될 수 있음을 보여줍니다.

우리의 초음파 프로토콜 체외에서 현저한 항 종양 활성을 증명하고 있지만, 현재의 방법은 초음파에 사용되는 유리 병에 맞게 할 수있는 문화와 작은 척추 동물 모델에서 작동하도록 제한된다. 우리는 안전하게 펄스 저주파 초음파 (20 kHz에서)를 사용하여 초음파 처리 할 수​​있는 제브라 피쉬를 보여 주었다, 및 화학 요법 제에 자신의 허용 오차를 정량적으로 비교입니다그 담암 제브라 제안 뮤린 모델 (26)에 의해 허용 투여 량은 이들 프로토콜의 생체 내 항 종양 활성을 평가하기위한 예비 조사에 사용될 수있다. 그럼에도 불구하고, 종래 포유 동물 모델의 초음파로 화학 요법 제를 투여하는 것은 MHz의 범위 (1)에보고되어 있으며, 이러한 프로토콜은 예상 저주파 초음파뿐만 아니라 콜레스테롤 파괴 및 세포 골격 - 지향 제를 포함하도록 확장 될 수있다.

SDT 이런 형태의 잠재적 인 임상 응용 프로그램은 항 종양 제를 정맥 투여 (IV) 혈액에 앞서이 초음파 (25) 제거되고있는 혈액의 체외 초음파를 포함 할 수있다. 이 방법은 인체 해부학로 인한 잠재적 인 사운드 장벽을 제거하고, 고형 종양에서 백혈병 모세포뿐만 아니라 전이를 손상시킬 수있는 효과적인 방법 일 수있다. 그것은 그 콜레스테롤 파괴 및 세포 골격 지시 에이전트가 할 수 있었던 것도 가능하다이미이 치료 방법의 효능을 개선하기위한 시도는 병원에서 시험되고 HIFU 프로토콜에서 사용될.

본 연구에 기재된 방법이 유틸리티를 향상시킬 수있는 잠재력 sonosensitizers의 값 및 상기 시스템을 평가 정제 할 수있다. 그러나, 전원의 품질, 탄성 초점 및 컨버터 중 개인차 포함한 초음파 심지를 사용할 때 고려 될 수있는 많은 변수가있다. 따라서, 향후 연구는 음파를 시각화하고 결과에 미치는 영향을 이해에 초점을 맞출 것이다. SDT는 체외에서 세포 용해를 향상시키기 위해 표시하고 취득 포유 동물 모델에서 생체 데이터에 더 많은 경우 임상 적으로 가능한 것을 입증 할 수있다. 여러 에이전트와 초음파를 포함하는 악성 세포의 다른 잠재적으로 악용 특성뿐만 아니라 다양한 결합 된 양상을 조사 실험은 우리 실험실에서 계속합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes  Life Technologies 12440079
Amphotericin B Solution  Sigma-Aldrich A2942 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution  Life Technologies 10378-016
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn Branson Ultrasonics 101-063-726 sonication device
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater Brisk Heat SDCJF1A-GBH1000-1 heater used for temperature control
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software Beckman-Coulter 6605700
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Gentamicin 50 mg/ml Sigma-Aldrich G1397 
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
Falcon 50 ml & 25 ml Vented Culture Flasks Fisher Scientific 353082
Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl Lonza 17-605C 
Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps Beckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet  BrandTech Scientific 26330
USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets USA Scientific 1071-0810
Tip One 100 μl and 1,000 μl Filter Tips USA Scientific 1120-1840, 1126-7810
100 μl Micropipette  Wheaton 851164
1,000 μl Micropipette Wheaton 851168
BioRad Dual Chamber Counting Slides Bio-Rad 145-0015
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator Forma Scientific 3131
Tektronix  DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix DPO2002B used to measure the ultrasonic waveform
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter PPB Megasonics PB-500  used to assess the sound intensity in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone Teledyne TC4013-1  connects to the oscilloscope 
Wheaton 250 ml Flasks Sigma-Aldrich Z364827
20 ml Glass Scintillation Vials  Sigma-Aldrich Z190527
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution  Beckman-Coulter N/A diluent for Z2 counter
Chloroform 99% Sigma-Aldrich C2432
Ethanol 200 Proof Anhydrous  Sigma-Aldrich 459836
Mineral Oil N/A
XTT Cell Proliferation Assay Kit ATCC 30-1011K
96-Well Microplate Reader Cole-Palmer  EW-13055-54
U937 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC CRL­1593.2
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC TIB-202

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References

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