דור וניתוח כמותי של תדר נמוך פעמו אולטראסאונד כדי לקבוע את הרגישות של סוניק שלא טופלו ותאים שטופלו neoplastic

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trendowski, M., Christen, T. D., Zoino, J. N., Acquafondata, C., Fondy, T. P. Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells. J. Vis. Exp. (101), e53060, doi:10.3791/53060 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

אולטראסאונד מתייחס לכל גל לחץ קול נדנוד בתדירות גבוהה יותר מהגבול העליון של יכולות שמיעה אנושיות (~ 20 קילו-הרץ) 1. אולטרסאונד בתדר נמוך בטווח 20-60 קילוהרץ נוצל במעבדה כאמצעי ליצירת תחליבים, הכנת דגימות סלולריות להפקת חומצות גרעין, לשיבוש רקמות, ועבור מגוון רחב של בדיקות אחרות. השירות של אולטרסאונד בתדר הנמוך גם הורחב להגדרה התעשייתית לריתוך, חומרי ניקוי שונים, ובטיפול בחומרים. מסחרי גנרטורים אולטרסאונד זמינים לבוא בתדרים הנעים 18-60 קילוהרץ, ובקנה מידה מלא wattages מ100-1,200 W.

למרות אולטרסאונד משמש כבר זמן רב בהגדרה הקלינית להדמיה לאבחון, זה כבר מיושם ככלים טיפוליים רק לאחרונה. אולטראסאונד ≥1 MHz מסוגל לשבש calculi שתן (אבנים בכליות) וcalculi מרה בשלום (אבנים בהכיס מרה דואר או בכבד) בחולים כדי להפחית סימפטומים 2,3. גישה זו ידועה כריסוק Shockwave extracorporeal (ESWL) עכשיו מיושמת באופן נרחב במרפאת (מטופלים חולים יותר ממיליון בשנה עם ESWL בארצות הברית לבדה 4), ומציעה שיטה שבי להלא פולשני לשבור את calculi עם ניזק סביבתי מינימאלי באמצעות פולסים אקוסטי לשימוש חיצוני בעוצמה גבוהה, ממוקדת, 2-4.

בשל הכוחות הייחודיים הישירים הגז, כמו גם בועות cavitation שנוצרו על ידי אולטרסאונד בעוצמה גבוה, מתודולוגיות אלה נבדקו בטיפול בסרטן לטיפול בסרטן הערמונית עמיד לסירוס ואדנוקרצינומה של לבלב בגישה הידועה כממוקדים בעוצמה גבוהה אולטרסאונד (HIFU ) 5-8. באופן דומה מאוד לESWL, HIFU משתמש קורות אולטרסאונד מרובים ומתמקד באזור מוקדי שנבחר כדי ליצור טמפרטורות של 60 מעלות צלזיוס או HIGשלה באמצעות השימוש באנרגיה האקוסטית, גרימת נמק מִתקַרֵשׁ ברקמות הממוקדות 5. למרות ששיטות אחרות של אבלציה תרמית קיימות כיום (אבלציה בתדר רדיו ואבלציה מיקרוגל), HIFU מציע יתרון ברור על פני שיטות אלה בכך שהוא השיטה hyperthermic לא פולשנית רק 5. HIFU השיג תוצאות מעורבות במרפאת וזמינה כרגע רק בניסויים קליניים 8-11. עם זאת, ההצלחה המוגבלת שהשיג, ומבטיח מאוד בנתונים vivo נרכשו מדגמי יונקים פרה-קליניים הדגימו את הפוטנציאל של אולטרסאונד בטיפול בסרטן.

במאמץ לשפר את HIFU, חוקרים ניסו לשלב אולטרסאונד עם סוכני antineoplastic מתאימים כדי ליצור צורה של sonochemotherapy. טיפול Sonodynamic (SDT) הוא שיטת טיפול חדשנית מבטיחה שהוכיחה פעילות antineoplastic מרשימה בהיא במבחנה 1. הוכח אולטרסאונד שמעדיף נזקי תאים ממאירים המבוססים על ההפרש בין גודל תאים כאלה ואלה של היסטולוגיה הרגילה 1,5. SDT משלב סוכנים מיוחדים הידועים כsonosensitizers להגדיל את היקף הנזק מועדף המופעל על ידי אולטרסאונד נגד תאי neoplastic. בעוד יישומים טיפוליים של SDT כבר נבדקו בעבר, מערכות אולטרא סאונד משמשות בדרך כלל להעסיק אולטרסאונד הגבוה תדר (≥1 MHz), ואת ההשפעות של אולטרסאונד בתדר kHz הנמוך טרם נחקרו באופן מלא. תדרים נמוכים של אולטרסאונד לעתים קרובות יותר בקיאים בהפקת cavitation אינרציה, תופעה שגורמת להרס של תאים עקב מתכווצת המהיר של microbubbles, גרימת נזק physicochemical 12-14. הבדל בדור של cavitation אינרציה בין MHz ואולטרסאונד kHz הנמוך זו יוחס לעובדה שתדרי גל נמוכים יאפשר microbubbleזה יותר זמן לגדול על ידי דיפוזיה לתקן במחצית הרחבת המעגל, וכתוצאה מכך הייצור מתמוטט אלים יותר במחצית המחזור 12 הדחיסה הבאה.

הראינו בעבר כי תאי monocytic אדם U937 לוקמיה רגישים לאולטרסאונד הנמוך תדר (23.5 kHz), ושרגישות זו יכולה להיות מוגברת במידה ניכרת באמצעות היישום של סוכני antineoplastic שלטרוד את שלד התא 15. יתר על כן, יש לנו הראינו שתאים באופן מועדף ניזק שמבוססים על גודל, עם תאים גדולים יותר מציגים רגישות קולית גבוהה יותר. בנוסף, תאים נורמלים אדם hematopoietic גזע (hHSCs) וכדוריות דם לבנות בגדלי תא דומים הרבה יותר עמידים לsonication מאשר עמיתיהם neoplastic 15, בהיסוס טוענים כי אולטרסאונד בתדר הנמוך ניתן להשתמש כדי לפגוע באופן מועדף תאים ממאירים בנוכחות של רקמה נורמלית.

כדי לבחון את האבזר הייחודי נוסףerties של אולטרסאונד בתדר הנמוך לשימוש טיפולי פוטנציאלי, פיתחנו תהליכי ניקוי וייצוב כדי להגדיל את היעילות ואמינה של אחת ממערכות sonication הנוכחיות שלנו, W ברנסון דגם SLPe 150, המשבש סלולארי 40 קילוהרץ, מצויד בצופר 20 מ"מ מצויד לתוך כוס 7.62 סנטימטר. בנוסף, יש לנו כבר הצליח לקבוע אנרגיות מדויקות cavitation המדגם, כמו גם גל עקבי ומשרעת בטווח של 40 קילוהרץ באמצעות מד cavitation ואוסצילוסקופ עם hydrophone. על ידי זיקוק ושיטתי הפרוטוקולים שלנו, יש לנו כבר הצליח להקים עקביות בsonications הניסוי שלנו, ומאפשר לנו להשוות כמותית הרגישויות קולית של תאי אנטינאופלסטיים ונורמלים של שושלות שונות histogenetic. הפרוטוקול שלנו למערכת 40 קילוהרץ מוצג בפירוט רב על מנת למעבדות מעוניינות להיות מסוגל לבצע ניסויים דומים, וכדי להעריך את הממצאים של השפעות antineoplastic שהושרו על ידיאולטרסאונד בתדר נמוך. בנוסף, אנו בוחנים את ההשפעות תלויות מינון של מתיל-β-cyclodextrin (MeβCD; איור 1), סוכן מדלל את כולסטרול, על הגדלת הרגישות קולית של U937 וTHP1 תאים לוקמיה monocytic אנושיים.

Protocol

1. תא ניקוי מערכת Sonifier

  1. נקה את האיחוד בין כלורופורם הקרן וממיר באמצעות ספוגית וכותנה. החל נפט אור או שמן מינרלים לאשכולות של הצופר וממיר כדי להסיר הצטברות של שבבי מתכת, חלודה, או חמצון נוסף.
  2. השתמש כלורופורם כדי להסיר את השמן וכל מזהמים אחרים מברית לאחר שנגב את החוטים עם שמן.

2. הרכבת התא Sonifier והגדרת המערכת

  1. חבר מחדש את הקרן לממיר. למומנט המערכת כראוי, להסיר את ממיר התאסף וקרן ממכלול הכוס על ידי משיכת הקרן מתוך תחתית הכוס (איור 2 א). מניחים ברגים חריץ בתוך אחד משלושת החורים הקטנים בחלק העליון של ממיר (איור 2). לאחר מכן, מקם מצוידים ברגל של עורב אינץ 'וחצי בחלק מחוררת של הקרן (איור 2) מומנט-מפתח ברגים. להדק ביםtandard כיוון השעון עד מטר המומנט קורא 54.23 N. מ '(איור 2 ג), המומנט המומלץ על ידי היצרן 16. התאם את ממיר התהדק וקרן חזרה לכוס, והר הקרן וממיר לעמדת טבעת בתנוחה זקופה. חבר מחדש את ממיר לאספקת החשמל לפני הגדרת המערכת למינון דופק ניסיוני.
  2. הגדר את המערכת למינון דופק באמצעות 1 שניות של sonication עם 1 שניות בין פולסים. מודלים מינון שונים עשויים לשמש לתנאי ניסוי אחרים. משתנים רבים, כגון נפח מים וקוטר קרן פוטנציאלי ידרשו שינויים במינון זה. שימוש בסוגים הנ"ל מדגם תא, הנפח, וריכוז, הנתונים ותצפיות אמפיריים הובילו לגיבוש משטר מינון זה.
  3. התאמת המערכת למשרעת הרצויה. בפרוטוקול זה, להשתמש 33% ו -50% משרעת כדי למנוע הרס תא שלם, אשר יהפוך את היעילות של sonosensitizers קשה או בלתי אפשרי לאמוד.
    הערה: במחקר זה אמפליטודות מושווה.

3. הערכת עצמת מערכת ופונקציה

  1. החזק את מד cavitation 1.5 סנטימטר, שהיא הרמה של sonication המדגם. שים לב לקריאות להעריך כי המערכת פועלת בעצמה צפויה. שימוש ברמות המערכת והמים הנוכחיות, מצפה בין 100-110 W / 2 סנטימטר למשרעת של 33% ו115-125 W / 2 סנטימטר למשרעת של 50%. שים לב לקריאות מונה cavitation מתצוגת המטר המייצגת אנרגיית cavitation בסנטימטרי W / 2 באופן ישיר. קח הקריאות הללו על פני השטח של המים, ולהבטיח שאין בועות נמצאות בפרצוף של חללית מטרים.
    הערה: חשוב לציין כי הליכים אלה נעשים ללא הכובע לגישה מעל הצופר. הם לא צריכים להיות חוזרים ונשנים אחרי כל sonication. במקום זאת, הם צריכים להתבצע רק לאחר הניקוי, הרכבה, והקמת המערכת. מניחים את hydrophone בבקבוקון המכיל מדגם 12.5 מיליליטר של מים כדי לטבול את חיישן hydrophone מלא. להשעות את hydrophone באמצעות דוכן הטבעת.
  2. צרף את hydrophone לקלט של אוסצילוסקופ כדי להעריך מאפייני צורת גל. בדוק את אוסצילוסקופ לגל סינוס ברור, כמו גלים חריגים יכולים לשנות את התדר של המערכת מהמפרט של היצרן. שני מטר cavitation ואוסצילוסקופ לתת קריאת תדר, אלא רק את אוסצילוסקופ יציג גלים חריגים שמעידים על מערכת פגומה או לא תקינה הרכבה.

4. הכנת תאים ובינוני

  1. הכן את המדיום באמצעות 240 מיליליטר בינוני של Dubecco (IMDM) השתנה של Iscove ו -50 מיליליטר בסרום שור עוברי. לא להפשיר בסרום שור עוברי באמבט מים חם, עם עלייה מהירה בטמפרטורה יכולה להוביל לפשרה ביציבות בסרום. לשלב 240 μl גנטמיצין 50 מ"ג / מיליליטר ו -5 מיליליטר פניצילין/ סטרפטומיצין 100x בבקבוק תרבות סטנדרטי, ולהוסיף לבינוני. אחסן הבינוני על 4 מעלות צלזיוס.
  2. תאי הזרע U937 ב ~ 4 x 10 4 תאים / מיליליטר בבקבוק 25 סנטימטר 2 באמצעות המדיום מוכן. להעריך תאים לריכוז ויכולת קיום באמצעות דלפק תא TC20 וtrypan הדרה כחולה על ידי הצבת 15-20 μl של תאים וtrypan כחול 15-20 μl לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות וערבוב את התוכן. μl Pipette15-20 של תערובת זו לשקופית דגימת TC20, וליזום ספירה על ידי הצבת את השקופית לדלפק תא TC20.
  3. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ולבדוק כדאיות תא באמצעות הרחקת trypan כחולה ודלפק תא TC20. כאשר התאים בריכוז מתאים ו / או טופלו בsonosensitizers למסגרת זמן מתאים, העברה 3 מיליליטר של תאים מהבקבוק התרבות לבקבוקון נצנץ זכוכית 20 מיליליטר. בפרוטוקול זה, לגדל תאי U937 במשך 48 שעות, ולאחר מכן לטפל עם 0.5, 1,או 5 מ"מ MeβCD למשך 30 דקות לרוקן מספיק הכולסטרול של תאים לפני sonication.

5. תא Sonication

  1. דגה deionized, מים מזוקקים באמצעות ואקום ובקבוק בוכנר. העבר את המים לכוס הקרן, ולמלא עד לרמה של 15 מ"מ מעל החלק העליון של הקרן. תהליך sonication גורם סילוק גזים נוספים של המים לתקופה של כמה דקות, ויכול להוביל לחוסר עקביות במהלך הניסוי אם המערכת לא תפעל לפני לטעום sonication. לכן, להפעיל את המערכת ל~ 7 דקות לפני לטעום sonication.
  2. צרף את בקבוקון הנצנץ המכיל את התאים למכשיר החזקה. לאחר מכן, חבר את מכשיר האחזקה לחלק העליון של קרן הכוס ולהגדיר לגובה של 15 מ"מ מהחלק העליון של הקרן (על פני המים באמצעות מנגנון הזזה).
  3. התאים בדרך כלל sonicated באמצעות שלושה 1 פולסים שניות של אולטרסאונד, עם 1 שניות מרווח בין כל אחד מאלה קטניות. לזהפרוטוקול, תאי sonicate ב 33% ומשרעת 50% באמצעות מינון הדופק הנ"ל.

6. הערכת תאים לניזק לאחר sonication

  1. להעריך את התאים הושעו לנזק וכדאיות באמצעות trypan כחול ודלפק תא TC20. בנוסף, לנתח את המדגם באמצעות דלפק Z2. לניתוח דלפק Z2, פיפטה השעיה תא 100 μl למלוח 20 מיליליטר איזוטוני (200: 1 יחס). לפני הניתוח, לשטוף את הצמצם של מנתח חלקיקי Z2 לפחות פעמיים באמצעות מלוח איזוטוני. מניחים את מדגם Z2 בבעל הדלפק, ולהעלות את הפלטפורמה לצמצם לפני ביצוע ספירה.
  2. לרכוש נתונים מדלפקי TC20 וZ2 באמצעות תוכנה המסופקת על ידי היצרן. לנתח נתונים אלה לנזק לתאים, כדאיות, ויצירת פסולת הסלולר מsonication.

7. XTT Assay לקביעת כדאיויות תא ומיטוכונדריאלי הפעילות של U937 טופל וTHP1 תאים

  1. PRIOr למבחני XTT, לגדול U937 וTHP1 תאים באותם תנאים. Pretreat תאים עם אותו טווח הריכוז של MeβCD למשך 30 דקות לפני sonication. השתמש באותם הפרמטרים אולטרסאונד כמו קודם, אלא שתאים עכשיו sonicated באמצעות מגוון של 1-3 אחד פולסים שניות במרווחים של שניות אחד לפתח מגוון של נזק לערכת XTT להעריך.
    הערה: רבים מהפעולות הבאות לקוחים ישירות מהמדריך לערכת XTT וחוזרים על עצמם רק לנוחיות של מעבדות מעוניינות.
  2. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 10 דקות. גלולה תא גלולה במדיום הגידול שתוארה קודם לכן. תאי Resuspend ב ~ 1 x 10 5 תאים / מיליליטר. תאי זרע U937 בכל טוב 100 μl לצלחת microtiter 96-גם שטוחות תחתונה בשלושת עותקים, ולאחר מכן לחזור לTHP1 תאים באמצעות צלחת 96-היטב נפרדת. כולל 3 בארות שליטה המכילות מדיום גידול להשלים לבד כמו קריאות ספיגה ריקה 100 μl. לאחר מכן, דגירה הצלחות המחוסנות עבור 24 שעות.
  3. להפשיר שני aliquots של מגיב XTT ומגיב הפעלה על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. aliquots מערבולת בעדינות עד פתרונות ברורים מתקבלים. להוסיף 0.1 מיליליטר של מגיב ההפעלה 5.0 מיליליטר של מגיב XTT, המהווה פתרון XTT הופעל מספיק עבור assay צלחת microtiter 96-גם אחד. חזור על התהליך עבור הצלחת אחרת.
  4. הוסף 50 μl של הפתרון מופעל-XTT היטב כל אחד. להחזיר את הצלחת לתרבות תא חממת CO 2 לשעה 2. לנער את הצלחת בעדינות לאחר תקופת הדגירה לפזר באופן אחיד את הצבע הכתום בבארות החיוביות. מדוד את הספיגה של בארות assay המכילות את התאים ואת בארות שליטת רקע ריקות באורך גל בין 450-500 גל ננומטר באמצעות קורא צלחת microtiter.
  5. או אפס קורא צלחת microtiter באמצעות בארות שליטה ריקות או לגרוע הערך הממוצע שלהם מהתוצאות הספציפיות. מדוד את הספיגה של כל בארות assay שוב בwavelengה בין 630-690 ננומטר ולהפחית את הערכים מ450-500 ערכי ננומטר הושגו. הערה: קביעת הספיגה שנייה זה עוזרת למנוע קריאות שאינן ספציפיות מתוצאות assay. Assay XTT חזר על עצמו ארבע פעמים לשתי שורות התאים.

Representative Results

יציבות מערכת היא בעל חשיבות עליונה בהשגת תוצאות הדיר ואמינות. מפרט המומנט הנכון של 54.23 N. מ 'השיג צימוד נאות של המתמר וsonotrode 2, עם העקביות של הגל שהוערכה באמצעות שימוש ב( איור 3 א) אוסצילוסקופ וhydrophone. איור 3 מתאר מדידות בתוך בקבוקון המדגם, ו איור 3 ג מעריך יציבות בקרן הכוס. כצפוי, משרעת היה מעט מופחת בשל כמה אנרגיה להיקלט על ידי הזכוכית. עם זאת, צורת הגל לא הייתי מוטרד או מעוותת בכל לוח ב 'או ג', אשר הוא הכרחי עבור אספקה ​​אמינה של אנרגיה קולית למדגם. צורת גל שאינו מופיע כגל סינוס יחיד ברור מצביעה על מתמר פגום או התקנה לא תקינה. זה בא לידי ביטוי באיור 3D שמראה גלים חריגים מרובים, היעדר ברור של גל סינוס, ותדירות קריאה לאלא צפוי עם מערכת מתפקדת כראוי. מטר cavitation משמש למדידת אנרגיית cavitation שנוצר (איור 4) מצא את עוצמת הקול להיות 100-110 W / 2 סנטימטר במשרעת של 33%, ו125-130 W / 2 סנטימטר במשרעת של 50%.

ברגע שמערכת 40 קילוהרץ הייתה כראוי מכוילת והורכבה בשלמותו (איור 5), הרס תא אמין היה בקלות השיג, כפי שנקבע על ידי שני דלפקי TC20 וZ2 (איור 6). כצפוי, נזק לתאים נרחבים יותר נצפו באוכלוסיות תאי sonicated ב 50%, ולא במשרעת של 33%. עם זאת, 33% משרעת שימושי כנקודת פתיחה לזיהוי תופעות רגישות קולית פוטנציאל של סוכנים מנוהלים, כפי שהיא מייצרת נזק ניכר, אבל משאיר מקום ליותר נזק להתגלות כאשר סוכנים מיושמים להעריך הגברתם של רגישות קולית. זו באה לידי ביטוי באיור 7 א, שבוהשפעות תלויות מינון של MeβCD על potentiating הרגישות קולית של תאי U937 מוצגות. למרות שהתאים שטופלו MeβCD אינו sonicated היו דומים מאוד ביכולת קיום לתאים-sonicated עישון, שלא טופלו, הכדאיות ירדה במידה ניכרת לאחר שלושה פולסים של אולטרסאונד kHz 1 שניות 40 יושם. בנוסף, הירידה בכדאיות לאחר sonication נראה היו תלוי מינון, כמו 5 מ"מ MeβCD מיוצר הירידה הגדולה ביותר בספירת תאים, ואחריו 1 מ"מ, ולאחר מכן 0.5 מ"מ MeβCD.

השפעות דומות על כדאיות תא ופעילות המיטוכונדריה נצפו בשני תאי U937 וTHP1 שטופלו בריכוזים שונים של MeβCD לפני sonication, כפי שהוערך עם ערכת XTT (איור 7). למרות THP1 תאים נראים מעט יותר קולי עמיד מאשר תאי U937, שני הקווים לוקמיה ניזוק באופן תלוי מינון. ריכוזים גבוהים יותר של MeβCD ויותר פולסים של לדרבן אולטרסאונדuced ההפחתה הנמוכה ביותר של XTT לנגזר מסיס, צבעוני כתום לשני U937 וTHP1 תאים, המתאים להורדת כדאיות תא ופעילות המיטוכונדריה.

איור 1
איור 1. מבנה מולקולרי של β-cyclodextrin methyl-. () מבנה שלם של מתיל-β-cyclodextrin (MeβCD). (ב) MeβCD הוא פולימר של שבע יחידות חוזרות עם קבוצת R של שני H או CH 3. נוסחה מולקולרית: C 56 H 98 O 35. משקל מולקולרי = 1,331.36.

איור 2
איור 2. torqueing מערכת אולטרסאונד 40 קילוהרץ כראוי. (א) הקרן וממיר יוסרו מן פרי הכוסאו לtorqueing. (ב) מקם את מפתח הברגים חריץ ומפתח מומנט בעמדותיהם. (ג) החל 54.23 N. מ 'של מומנט בכיוון השעון לפני reattaching הקרן וממיר לכוס.

איור 3
איור 3. שימוש באוסצילוסקופ לאפיין את צורת הגל של המערכת קולית. () אוסצילוסקופ עם hydrophone ניתן להשתמש כדי להעריך עקביות משרעת וצורת גל. הקלטה (ב ') שצולמה בכוס ישירות מעל הקרן 1.5 סנטימטר ונקבעה על משרעת של 33%. (ג) צורת הגל בתמונה כאן היא מקריאה רכשה כאשר hydrophone ממוקם בתוך בקבוקון נצנץ זכוכית 20 מיליליטר. הבקבוקון ממוקם ב -1.5 סנטימטרים מעל הקרן וקבע שוב במשרעת של 33%. O מסך אוסצילוסקופ (D)מערכה ה- FA עם תדרים חריגים כפי שניתן היה לצפות עם מערכת פגומה או לא תקין של צימוד איחוד ממיר קרן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
שימוש איור 4. מטר cavitation לאפיין את עוצמת הקול של המערכת קולית. מטר cavitation ראה כאן משמש כדי לייצג אנרגיית cavitation בW / 2 סנטימטר. זה מכשיר מאוד חשוב להערכת עקביות של אנרגיה ביחס למדגם.

איור 5
5. מרכיבי מפתח איור של מערכת אולטרסאונד 40 קילוהרץ. המערכת קולית מוצגים להשלים עם קרן כוס ( (ב '), ממיר (C), ומנגנון מיצוב מדגם (ד'). עיצוב זה מאפשר למיצוב קל של המדגם (E) מעל הצופר (F).

איור 6
6. אפקטי איור של רמות שונות של משרעת על תמוגה קולית של תאי U937 באמצעות מוני TC20 וZ2. תאים היו sonicated עם dismembrator 40 קילוהרץ התא במשרעת של 33% (100-110 W / 2 סנטימטר) או משרעת 50% (125-130 W / 2 סנטימטר) באמצעות שלושה 1 פולסים שניות של אולטרסאונד, עם מרווח 1 שניות בין כל פולסים אלה. (א) צילום מסך מהתוכנה דלפק Z2 מדגים את ההשפעה של sonication על תאי U937. (ב) נתונים מדלפק TC20 לוקטו בגרף כדי להדגים את שחזור של התוצאהים. נתונים אלה כוללים את הסעיפים המוחלט ולחיות תא, כמו גם trypan הכחול העריך כדאיות תא. ברים משקפים את סטיית התקן של הממוצע (SEM) במשך 4 אוכלוסיות תאים עצמאיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. השפעות של β-cyclodextrin methyl- על potentiating הרגישות קולית של U937 וTHP1 תאים. טופלו () תאי U937 עם משתנה ריכוז של MeβCD במשך 30 דקות לפני שsonicated עם אולטרסאונד kHz 40 (105 W / 2 סנטימטר ) באמצעות שלוש 1 פולסים שניות במרווחים 1 שניות זה מזה. אוכלוסיות תאים קובצו ל≥12 מיקרומטר ו≥17 מיקרומטר. תאים שטופלו (ב) U937 או THP1 שוב עם concent שונהמנות של MeβCD במשך 30 דקות לפני שsonicated עם מערכת 40 קילוהרץ באמצעות 1-3 פולסים של אולטרסאונד 1 שניות במרווחים של 1 שניות. כדאיות תא ופעילות המיטוכונדריה הוערכו עם ערכת XTT. של תאים 100 μl היו זרע לכל גם לצלחת microtiter 96-גם שטוח תחתונה. צלחת הודגר למשך 24 שעות לפני התוספת של פתרון XTT. תאים אז הודגרו לשעה 2 נוספת לפני הגל היה לקרוא. ברים משקפים SEM ל4 אוכלוסיות תאים עצמאיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

כדי להשיג תוצאות אופטימליות, יש לנקוט זהירות מיוחדת למצב בזהירות את המדגם ולנקות את איחוד ממיר-קרן. המיקום של המדגם בקרן הוא חשוב להשגת הרס תא עקבי, כמו שינוי המרחק מהקרן ישנה את המוקדים אקוסטי, ולכן משנה את אנרגיית המדגם חשופה ל. האנרגיה אקוסטית בתוך קרן הכוס יכולה להיות ממופה באמצעות מד cavitation כדי למצוא את המיקום של cavitation המרבי. בנוסף, מטר cavitation, יחד עם אוסצילוסקופ הוא חיוניים לקביעת עוצמת צליל התאים נחשפים ל, כמו גם את ההומוגניות של צורת הגל. לכן, יש להשתמש במכשירים אלה כדי לזהות בעיות במערכת, ולעזור לקבוע מה עשוי להיות נחוצים לפתרון בעיות כדי לתקן חוסר יציבות של מערכת.

כאמור, מערכת התדירות הנמוכה עשויה לפעול לדגה נוספת המים לאורך כל הניסוי אם לא לרוץ לכמה דקות לפני לטעום sonication. זה ראשוני ריצה יש לבצע להניב בינוני יחסית degassed sonication ותוצאות וכך עולות בקנה אחד במהלך ניסויים. בנוסף, לא צריכים להיות sonicated תאים ליד או משרעת המרבי כאשר להערכת היעילות של sonosensitizers, כמידה נכונה של רגישות תהיה קשה להעריך. שימוש במשרעת של 33% על מערכת קילוהרץ 40 היא הגדרה אידיאלית, כפי שהיא מייצרת נזק בולט, אבל מספק מספיק מקום sonosensitizers להפגין יעילותם, כפי שהודגם בMeβCD נגד U937 ותאי THP1 (איור 7). נתונים אלה גם לאשר שMeβCD sensitizes קווי לוקמיה מרובים לאולטרסאונד בתדר הנמוך באופן תלוי מינון.

יש כבר מספר הניסויים שנעשו בתדירות גבוהה יותר בטווח של 0.75 MHz עד 8 ​​מגה-הרץ מציג ראיות של בועות cavitation intramembrane שנוצר באמצעות sonication 17-19. עם זאת, questioNS עדיין יישאר בכל הקשור למנגנון של תמוגה תא מושרה אולטרסאונד 18 המדויק. הראינו קשר בין fluidizing שלד התא והגדיל את רגישות קולית באמצעות אולטרסאונד הנמוך תדר 15, תופעה שהפגינה מעבדות אחרות 20, 21. בנוסף, מצאנו כי סוכני שיבוש-microfilament כגון cytochalasin B להגביר רגישות קולית בלוקמיה מרובה קווים, אך לא hHSCs או כדוריות דם לבנות 22, המצביע על עיכוב של פילמור אקטין עשויה להיות מנגנון sonosensitizing עניין מיוחד. ראינו גם שvincristine, סוכן שיבוש-microtubule שמעכב פילמור טובולין 23, 24, במידה ניכרת מגבירה את הרגישות קולית סוגים שונים של סרטן דם במבחנה כוללים לוקמיה חריפה מיאלואידית, לוקמיה מיאלואידית הכרונית, ולוקמיה החריפה הלימפה. לעומת זאת, סוכנים מכוונים cytoskeletal שלייצב רכיבי cytoskeletal (paclitaxeljasplakinolide ד) מופיע כדי להפוך לתאים עמידים לsonication, באו לידי ביטוי בשיעורים נמוכים יותר של תא תמוגה 22. יחדיו, נתונים אלה תומכים בהשערה כי fluidizing רכיבי cytoskeletal של תאי neoplastic היא אכן גורם חשוב בהגדלת היעילות של SDT 25. המחקר הנוכחי מוכיח כי גם דלדול כולסטרול עשוי להיות שיטה אחרת שבו להגברה נוספת הרגישות קולית של תאי neoplastic, כמו תאי U937 טופל MeβCD במידה ניכרת רגישים עד 40 קילוהרץ אולטרסאונד.

בעוד פרוטוקולי sonication שלנו הוכיחו פעילות antineoplastic מסומנת במבחנה, המתודולוגיה הנוכחית מוגבלת לעבודה במודלי תרבות וחוליות קטנות שיכולים להתאים בבקבוקונים המשמשים לsonication. הראינו דג הזברה שניתן sonicated בבטחה באמצעות אולטרסאונד פעמו תדירות נמוכה (20 קילו-הרץ), ושהסובלנות שלהם לתרופות כימותרפיות היא כמותית דומה למינונים נסבלים על ידי מודלים עכברי 26, המצביעים על כך דג הזברה גידול נושאות ניתן להשתמש בחקירות מקדימות כדי להעריך את פעילות antineoplastic vivo של פרוטוקולים אלה. עם זאת, מתן תרופות כימותרפיות לפני sonication של דגמי יונקים דווח בטווח MHz 1, ויכולים להניח יוארכו פרוטוקולים כגון לשלב אולטרסאונד נמוך תדר, כמו גם כולסטרול-מרוקן וסוכנים מכוונים cytoskeletal.

יישומים קליניים אפשריים של צורה זו של SDT עשויים להיות כרוכים sonication דם extracorporeal בי סוכני antineoplastic מנוהלים דרך הווריד (IV) לפני הוצאתו לדם sonication 25. שיטה זו מסירה מחסומי קול פוטנציאליים שמציבים האנטומיה אנושית, ועשויה להיות דרך יעילה לניזק תקיעות leukemic, כמו גם גרורות מגידולים מוצקים. ייתכן גם שיכלו כולסטרול-מרוקן וסוכנים מכוונים cytoskeletalניתן להשתמש בפרוטוקולי HIFU שכבר נבחנו במרפאת בניסיון לשפר את היעילות של שיטת טיפול זו.

השיטות שתוארו במחקר הנוכחי הן מסוגלים להעריך את הערך של sonosensitizers הפוטנציאלי, ועידון מערכת נוסף עשויים לשפר את השירות הזה. עם זאת, יש הרבה משתנה שיש להתחשב בעת שימוש ממציא קולי כגון, כולל איכות אספקת חשמל, מוקדי אקוסטי, ווריאציה בודדת בין ממירים. לכן, מחקר עתידי יתמקד בלדמיין את הגלים על-קוליים והבנה השפעתם על תוצאות. SDT הוכיח כדי לשפר את תמוגה תא במבחנה ועשוי להיות בר-קיימא מבחינה קלינית, אם יותר בנתונים vivo במודלים של יונקים נרכשים. ניסויים בוחנים מאפיינים אחרים ניתן לנצלם של תאים ממאירים, וכן דרכים משולבות שונים מעורבים סוכנים ואולטרסאונד מרובים להמשיך במעבדה שלנו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's Modified Dulbecco's Medium w/ NaHCO3 & 25mM Hepes  Life Technologies 12440079
Amphotericin B Solution  Sigma-Aldrich A2942 
Penicillin/Streptomycin 100x Solution  Life Technologies 10378-016
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12105
Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn Branson Ultrasonics 101-063-726 sonication device
Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000 ml Beaker Heater Brisk Heat SDCJF1A-GBH1000-1 heater used for temperature control
Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp® Software Beckman-Coulter 6605700
Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad 145-0102
Gentamicin 50 mg/ml Sigma-Aldrich G1397 
Trypan Blue Solution Sigma-Aldrich T8154
Falcon 50 ml & 25 ml Vented Culture Flasks Fisher Scientific 353082
Lonza L-Glutamine 200 mM 0.85% NaCl Lonza 17-605C 
Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Vials and caps Beckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet  BrandTech Scientific 26330
USA Scientific 10 ml Disposable Serological Pipets USA Scientific 1071-0810
Tip One 100 μl and 1,000 μl Filter Tips USA Scientific 1120-1840, 1126-7810
100 μl Micropipette  Wheaton 851164
1,000 μl Micropipette Wheaton 851168
BioRad Dual Chamber Counting Slides Bio-Rad 145-0015
Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator Forma Scientific 3131
Tektronix  DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope Tektronix DPO2002B used to measure the ultrasonic waveform
PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter PPB Megasonics PB-500  used to assess the sound intensity in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone Teledyne TC4013-1  connects to the oscilloscope 
Wheaton 250 ml Flasks Sigma-Aldrich Z364827
20 ml Glass Scintillation Vials  Sigma-Aldrich Z190527
Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution  Beckman-Coulter N/A diluent for Z2 counter
Chloroform 99% Sigma-Aldrich C2432
Ethanol 200 Proof Anhydrous  Sigma-Aldrich 459836
Mineral Oil N/A
XTT Cell Proliferation Assay Kit ATCC 30-1011K
96-Well Microplate Reader Cole-Palmer  EW-13055-54
U937 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC CRL­1593.2
THP1 Human Monocytic Leukemia Cells ATCC TIB-202

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trendowski, M. The promise of sonodynamic therapy. Cancer Metastasis Rev. 33, (1), 143-160 (2014).
  2. Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis. J Urol. 179, (1), 194-197 (2008).
  3. Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial. J Urol. 174, (2), 595-599 (2005).
  4. McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review. Rev Urol. 15, (2), 49-60 (2013).
  5. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 4, (3), 255-260 (2005).
  6. Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer. BJU Int. 110, (9), 1228-1242 (2012).
  7. Li, P. Z., et al. High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11, (6), 655-660 (2012).
  8. Xiaoping, L., Leizhen, Z. Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer. Int J Hyperthermia. 29, (7), 678-682 (2013).
  9. Lukka, H., et al. High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review. Clin Oncol (R Coll Radiol). 23, (2), 117-127 (2011).
  10. So, A. I. HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer). Can Urol Assoc J. 5, (6), 424-426 (2011).
  11. Crouzet, S., et al. Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients. Eur Urol. 65, (5), 907-914 (2014).
  12. Tezel, A., Mitragotri, S. Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis. Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).
  13. Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport. Pharm Res. 19, (8), 1160-1169 (2002).
  14. Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull. 32, (5), 916-920 (2009).
  15. Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells. Anticancer Res. 34, (5), 2195-2202 (2014).
  16. Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. Branson Ultrasonics Corporation. Available from: http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf (2010).
  17. Lagneaux, L., et al. Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells. Exp Hematol. 30, (11), 1293-1301 (2002).
  18. Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects. Proc Natl Acad Sci USA. 108, (8), 3258-3263 (2011).
  19. Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes. Biophys J. 84, (5), 3087-3101 (2003).
  20. Mizrahi, N., et al. Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics. Soft Matter. 8, (8), 2438-2443 (2012).
  21. Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization. J R Soc Interface. 11, (95), 20140071 (2014).
  22. Trendowski, M., et al. Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound. Cancer Lett. In press, (2015).
  23. Dumontet, C., Sikic, B. I. Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death. J Clin Oncol. 17, (3), 1061-1070 (1999).
  24. Verrills, N. M., Kavallaris, M. Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies. Curr Pharm Des. 11, (13), 1719-1733 (2005).
  25. Trendowski, M. The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy. Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).
  26. Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo. In Vivo. 28, (6), 1021-1031 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics