静的器官培養を使用して口蓋の融合を研究の方法

Developmental Biology

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Summary

口蓋開発の研究は、口蓋裂、驚異的な健康の負担を課し、外観を損なうを持続残すことができ先天異常の発生率が動機とされています。ここでは口蓋の開発および融合に関与する種々のシグナル伝達経路を研究するために使用することができる培養口蓋棚の技術を実証します。

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Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

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Abstract

口唇口蓋裂は、すべての先天性欠損症の最も一般的なの一つです。正中上皮縫い目を形成するために付着上皮で覆われた間葉系の棚からの二次口蓋の形(MES)。理論は、MESの細胞が融合した口蓋1を作り、間葉移行(EMT)、アポトーシスおよび移行に対する上皮に従うことを示唆しています。 MESの完全な崩壊は、間葉系細胞とその周辺口蓋合流の最終不可欠相です。私たちは、口蓋の器官培養のための方法を提供します。 試験管プロトコルで開発された溶融中に生物学的および分子プロセスの研究を可能にします。この技術の用途は、外因性の化学薬剤に対する応答を評価するなど、規制および増殖因子と特定のタンパク質の効果数多くあります。口蓋器官培養 、インビボ研究で使用したことはできない開発の様々な段階での操作を含む、多くの利点を有します。

Introduction

口腔顔面裂が最も優勢な頭蓋顔面の先天性欠損症です。また、考慮して可能なすべての頭蓋顔面の欠陥を取って、これらは、新生児2における第二の最も一般的な先天異常があります。裂口蓋は毎年約1米国ではすべての700の出産(米国)で発生し、口蓋裂の発生率は、裂け目月額味覚または3日目あたり裂と15人の子供を持って生まれた475人の子供に等しいです。毎年の展示世界中で生まれた子供の約1%頭蓋顔面​​異形学のいくつかのフォーム。

口蓋や唇の裂け目は、この異常を有する患者のための生涯の影響で非常に高価で複雑な手続きが必要です。経口裂と各患者の推定コストはおよそ$ 100,000個の4です。口唇口蓋裂を有する患者の治療は、頭蓋顔面外科医、耳鼻咽喉科医、遺伝学者、麻酔科医を含む医師のチームを必要とします音声言語病理学者、栄養士、歯科矯正医、補綴、心理学者、神経外科医、および眼科医。

palatogenesisでは、二次口蓋は最初垂直方向に成長し、舌の背の上口蓋棚の上昇を受けて対になった派生物として発生します。標高に続いて、対になった口蓋棚は(ヒトではマウスではE14.5 -E15で週9)正中線に向かって成長します。棚の先端をカバー内側縁上皮(MEE)は正中上皮縫い目を形成する接着します。

これは間葉合流を可能にするために間葉移行、および/またはアポトーシスの上皮が続きます。 MEEに反対の接着は、その変更口蓋裂の原因となる不可欠なイベントです。しかし、研究はわずか口蓋棚5の初期接着性を検討しました。骨芽細胞への間葉細胞の分化により硬口蓋フォーム。音部記号を生成することができます口蓋の発達異常tはまたは唇の関与なしに味覚。

口蓋器官培養技術は、過去30年間6,7に比べて多くのラボのために広く使用されていました。

このプロトコルでは、詳細に口蓋解剖し、静的な器官培養する方法を説明します。静止器官培養の利点は、口蓋棚の融合を可能にすることです。この技術は、多くの融合とシグナル伝達の実験8,9のために私たちの研究室で首尾よく使用されていました。しかし、技術の範囲は膨大であり、静的な器官培養系は、外因性の化学薬剤に対する応答の評価、異なる経路および特定のタンパク質における調節増殖因子の効果を含めて、必要なときにいつでも使用することができます。

図1
図1.マウスPalatogenesis。マウス口蓋の発達段階。(BF)走査 ELE代表的な発達時期に二次口蓋のCTRON顕微鏡写真(SEM)。赤矢印:口蓋接着および融合の最初の部分を示しています。黄色の矢印:ポイント(PLOS 1から許可を得てカウフマン11より転載)融合後に消えますプライマリとセカンダリの口蓋との間の空間に。

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Protocol

記載されている全ての手順は、ローカル機関動物実験委員会の事前承認を含む、脊椎動物の使用のためのガイドラインと規則に従って実行されなければなりません。

解剖インスツルメンツおよび培養培地の調製

  1. 予備洗浄全ての機器は、3%過酸化水素で20分間121℃でオートクレーブに切開に使用します。フード内の真空吸引と0.22μmの細孔サイズのフィルターを使用して、抗生物質や抗真菌溶液でBGJbメディアをフィルタリングします。

文化機器の調製

  1. 70%のアルコールでスプレー、小さな三角形で口蓋器官をサポートするポリカーボネートメンブレンフィルターをカットし、それらを乾燥させます。器官培養プレート上で、清潔で滅菌正三角形状のワイヤグリッド(20ミリメートル)を配置することにより、センターウェル器官培養皿(60x15 mm)を用意します。そして、Bの1ミリリットルとよくを埋めますGJBメディア培養培地。注:メディアは舌を沈めることなく、グリッドのレベルに達するのに十分であるべきです。メンブレンフィルターを配置し、光沢のある側を下に、グリッドの上に(グリッドあたり3-4膜)実験に.Depending、治療(タンパク質、抗体または阻害剤)を培地に添加することができます

3.マウスの胚収集と文化のための準備

  1. 野生型マウスの胚を得るために、使用は13.5妊娠CD-1マウスの遺伝的背景の歪みをタイムアウトしました。 70%エタノールで解剖エリアを清掃してください。
    注:マウスの​​他の系統を使用することができます。私たちが原因大きなごみ番号のCD-1マウスを好みます。
  2. 承認されたプロトコルを使用して死を保証するために、頸椎脱臼に続いて5%イソフルランとE13.5 DPC(日性交後)で妊娠マウスを安楽死させます。
  3. 商品に腹部ヘアスティックを回避するために腹側腹部表面に70%エタノールをスプレーします。その後、腹側腹腔を開き子宮を見つけるために鋭い鈍い動作はさみとマイクロ解剖ピンセットを使用して。鉗子を使用して、子宮全体を持ち上げ、子宮体部で切断することにより、ライト動作ハサミで子宮角の先端に体から分離。
  4. (ケアおよび実験動物の使用のためのプロトコルガイドによる)を氷の上に清潔なペーパータオル上で子宮を置きます。汚染を防止するための別の清潔なペーパータオルで子宮をカバー。さらに使用する前に、70%エタノールのスプレーを使用して器具を滅菌します。子宮胚を氷上で実験室に輸送することができます。
  5. オープン層流フードでは、慎重に鋭い鈍い動作はさみとマイクロ解剖ピンセットを用いて卵黄嚢の小さな開口部を作ります。開口部が広いことを確認した後、静かに卵黄嚢から胚を体外に出すためにそれを押してください。
  6. 冷リン酸緩衝生理食塩水1X(PBS)pH7.4でペトリ皿にすぐに胚を移します。適切な段階を保証するために、元ボディ、頭の大きさ及び四肢の形態のための解剖顕微鏡下で胚アミン。
    注:開発の権利の段階ではない胚を実験に使用されていません。

図2
図2.肢芽形態。前部と後肢が数字の間ウェビングインデント度がチェックされます。 E13.5では、すべての桁の縮合は非常に明確な登場数字の間のウェビングと遠位くぼみで、顕著です。後肢の桁が半日によって背後にある12上段:前肢、下段:後肢。

4.口蓋解剖

  1. 解剖顕微鏡下でのPBSでペトリ皿の中で一度に一つの胚を置きます。小さな解剖ハサミとピンセットを使用すると、胚の本体からヘッドを分離します。
  2. 慎重にピンセットで目の高さ以上のマウスの頭蓋骨を保持する(回避上顎プロセス)は、リップラインの両側にある2つの切開を行います。そして、下顎と舌を削除します。目の高さにカットすることによって上顎処理領域を分離し、脳、目、鼻中隔と隣接する組織を除去します。

図3
3. 口蓋組織が ​​口蓋棚が上昇した13.5胚から採取したが、接触が行われていない。口蓋棚は静的モデルで72時間空気メディアインタフェースでのフィルタに器官培養に入れた。(A)レベル培養皿のE13.5胚の解剖。台形フィルター膜上に配置された解剖口蓋棚の(B)ブルー星解剖時に鉗子で組織を保持するための領域の境界を定める。(C)の表示。(D)は側面図の配置後味覚及び培地の添加を解剖しました。

  1. 後部に前方から東洋それを助けるために取り付けられた第一の味覚を保ち、口蓋口側を置き、鼻中隔とその周囲の組織を除去します。スプーンヘラを使用し、非常に慎重に培養皿にグリッド上に準備されたフィルターに(鼻側を下)口蓋棚を転送します。注:適切な空気メディア・インターフェースを可能にするために、メディアの音量を調整します。
  2. 実体顕微鏡下では、一次口蓋を分析し、互いに近接口蓋棚を配置するためにピンセットを使用しています。彼らが接触するように配置されていない場合、口蓋棚が融合されません。口蓋の前方部分が配置されている三角形の膜フィル​​ターをカットします。台形形状は、口蓋の前方部分を局所化に役立ちます。
  3. 培養口蓋棚単独で又は二種BGJb培地を使用して、同じ器官培養皿三有します。

5.培養マウス口蓋棚

  1. TISSUをインキュベート72時間、加湿気体混合物(5%CO 2及び95%空気)中で37℃ES、及び培地を24時間毎に変更します。

組織学的分析のために6口蓋処理

  1. 4℃で4%ホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水のO / Nと文化の中で72時間後に舌を修正  C.次に、静かに転送ピペットを用いてPBSで培養皿に組織を洗います。カセットを埋め込むには、実験室のワイプと場所の一部で舌を包みます。
    注:実験用ワイプで口蓋をラップは、脱水工程の間に彼らの損失を防ぎます。
  2. 70%、80%以下の、通常のパラフィン包埋手順に続いて1時間100%エタノール洗浄、まで組織を脱水。埋め込むために、トレイに直面して口蓋の前方部分を配置します。
  3. 後部に前方から冠状方向で連続6μmのセクションをカット。完全なセクションの口蓋は、350〜450 sectiが得られますアドオン。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)。10得点、以前に説明した平均融 ​​合スコアを使用して、すべての20 番目のセクション (MFS)スケール(表1)を持つセクションを染色。8

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Representative Results

技術は研究が口蓋融合のin vitroでのニコチンの催奇形効果をテストするために設計された以下のexperiments.Theの異なる種類に適用することができます。 2系統のマウスは、この実験のために利用された、CD1とC57.Palatal組織は、ニコチンヘミ硫酸塩の0.06と6 mMの濃度で処理しました。これは、口蓋融合パターンとタイミングは、2つの異なる株で異なっていたことが観察されました。 CD1マウスでは、対照群から口蓋棚は、時間依存的に融合し続けました。しかし、処理群のニコチンに特に6mMのニコチン濃度( 図4A)での融合を遅らせました。 CD1マウスの味覚の組織学のセクションでは、コントロール標本における72時間後の全融合を示しました。ニコチンの低用量で口蓋棚が付着するが、上皮細胞は、培養3日後に残っています。ニコチンの高用量でインキュベート口蓋棚は、インキュベーションの72時間後に接触していませんでした。

図4B)はニコチンの0.6 mMの濃度でインキュベートした試験片と比較して、48時間インキュベートしたときただし、C57マウスの口蓋棚6 mMの濃度で、より高いスコアを示しました。 C57マウスの味覚の組織学のセクションでは、治療群で連続上皮継ぎ目が正中線に固執していることを示しました。融合は72時間でちょうど対照群で観察されました。

我々は、マウスの両方の種類の口蓋融合はニコチンの高用量によって影響を受けたことを観察しました。しかし、C57から口蓋は、ニコチンへのより賢明でした。結論として、我々の結果は、マウスの遺伝的背景は、口蓋組織におけるニコチンの応答に影響を与えることを示しています。

図4
2つの24のためのニコチンの存在下で培養したマウスの味覚の株、48、または72時間。マウス系統は、異なる程度でニコチンに反応しました。ニコチンの高用量(6ミリモル)に公開されているすべての口蓋は24時間で、味覚のいずれも閉じられていなかったとMFSは1〜(口蓋棚は触れていない)の範囲であったことを、低い平均融合スコア(MFS)。注を融合するために失敗しましたすべてのグループで(部分的融合)3。 48時間では、制御口蓋の多くは、部分的に(3以上のスコア)を融合させた、72時間まで、CD1の味覚を完全に(5のスコア)を融合させたが、C57コントロールは完全に(3.67)融合していませんでした。 (マリア・セラーノと博士キャシースヴォボダから未発表データ)。

スコア基準
1 無接着性を有する非融合。
2 いくつかの明白な接着性を有する非融合。
3 いくつかのMEE層の崩壊とクリア部分間葉合流との接着。
4 MEE細胞またはシーム残りのいくつかの痕跡との完全な融合。
5 MEE細胞またはシーム見えるの証拠との完全な融合。

表1:平均融 ​​合スコア(MFS)スケール (カンとスヴォボダ、2002)。前方の各口蓋のスコアを計算します(セクション1-150)、ミドル(セクション150-300)と後部(セクション300〜450)。8

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Discussion

この記事のプロトコルは、胎生13.5で胚から口蓋棚を解剖する方法を提供します。マウス胚から口蓋棚を、37℃で95%O 2、5%CO 2雰囲気中で無血清培地中で培養しました。成功口蓋解剖を安楽死させたマウスの胚時から培養終了までの手順の間、各段階で複数の要因に決定的に依存しています。口蓋融合に影響を与える最も重要な要因の一つは、器官培養を開始するのに要する時間です。胚は胎生13.5二次口蓋棚が水平であるようにする必要がありますが、( 図1)を融合させるために開始していません。

処置中の別の重要な点は、卵黄嚢から胚の具象化です。このステップでは、顔の構造への損傷を防ぐために細心の注意が必要です。胚を嚢から除去されると、ヘッドから除去され本体両側から光ファイバ照明を有する実体顕微鏡で観察するペトリ皿に入れました。下顎と舌が口蓋を露出し、削除されます。脳と残留組織は、目の高さで除去されます。この時点では、棚の周りに上皮層を考慮することが重要です。これは、これらの細胞の完全性を維持するために非常に慎重に組織を操作するために必要です。上皮細胞は、MESの付着および形成に関与しています。

各解剖口蓋は、鼻中隔から任意の軟骨をきれいに口側を断っています。この組織は、口蓋の前方側にあり、より白く、より凝縮された表示されます。不要な組織の自由口蓋棚は、培養皿に移動し、フィルター膜の上に配置されています。棚の位置は、立体解剖顕微鏡下で再びチェックされます。彼らは、口蓋融合に遵守し、さらにを可能にするために一緒にプッシュする必要があります。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

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References

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