Méthode d'étude Palatal Fusion utilisant statique Organ Culture

Developmental Biology

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Summary

Des études de développement du palais sont motivés par l'incidence de la fente palatine, un défaut de naissance qui impose un fardeau de santé énorme et peut laisser durablement défigurée. Nous démontrons ici d'une technique de culture étagères palatines qui peuvent être utilisés pour étudier différentes voies de signalisation impliquées dans le développement palatine et de la fusion.

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Ibrahim, I., Serrano, M. J., Svoboda, K. K. Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture. J. Vis. Exp. (103), e53063, doi:10.3791/53063 (2015).

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Abstract

Fente labiale et palatine sont parmi les plus communs de toutes les anomalies congénitales. Les formes de palais secondaire des tablettes mésenchymateuses couverts par un épithélium qui adhère à former la couture médiane épithéliale (MES). Les théories suggèrent que les cellules MES suivent une transition épithélio-mésenchymateuses (EMT), l'apoptose et la migration, faisant un palais fusionné 1. Désintégration complète du MES est la phase essentielle finale de palatine confluence avec entourant les cellules mésenchymateuses. Nous fournissons une méthode de culture d'organe de palais. Le point dans le protocole vitro permet l'étude des processus biologiques et moléculaires lors de la fusion. Les applications de cette technique sont nombreux, y compris les réponses à l'évaluation des agents chimiques exogènes, des effets des facteurs réglementaires et de croissance et des protéines spécifiques. Culture d'organe palatine a un certain nombre d'avantages, y compris la manipulation à différents stades de développement qui est pas possible en utilisant des études in vivo.

Introduction

Fentes faciales sont prédominants défauts de naissance les cranio-faciales. Aussi, en prenant en considération tous les défauts cranio-faciales possibles, ceux-ci sont la deuxième anomalie de naissance le plus commun chez les nouveaux nés 2. Fentes palatines se produisent à environ 1 pour 700 naissances aux États-Unis (US) chaque année, l'incidence de la fente palatine est égale à 475 enfants nés avec une fente palatine par mois ou 15 enfants atteints de fentes par jour 3. Environ 1% des enfants nés dans le monde chaque année présentent une certaine forme de dysmorphie cranio-faciale.

Fentes du palais et la lèvre ont besoin d'une procédure très coûteuse et complexe avec des implications pour la vie pour les patients qui ont cette anomalie. Le coût estimé pour chaque patient avec fente orale est d'environ 100 000 $ 4. Le traitement d'un patient avec fente labiale et palatine nécessite une équipe de médecins, y compris cranio-faciales chirurgiens, orl, des généticiens, des anesthésistes,-orthophonistes, des nutritionnistes, des orthodontistes, prothésistes, des psychologues, des neurochirurgiens, et les ophtalmologistes.

Dans palatogenesis, le palais secondaire se pose excroissances paires, qui se développent d'abord verticalement et subissent palatine plateau élévation au-dessus du dos de la langue. Après l'élévation, les étagères palatines appariés poussent vers la ligne médiane (à E14.5 -E15 chez la souris et chez l'homme la semaine 9). L'épithélium de bord médial (MEE) qui couvre la pointe du plateau adhère formant la couture médiane épithéliale.

Ceci est suivi par transition épithélio-mésenchymateuse et / ou de l'apoptose pour permettre mésenchymateuses confluence. Adhésion d'opposer MEE est un événement essentiel dont l'altération provoque une fente palatine. Cependant, peu d'études ont étudié l'adhérence initiale des lames palatines 5. Les formes palais dur par la différenciation des cellules mésenchymateuses en ostéoblastes de. Le développement anormal du palais peut produire cleft palais avec ou sans la participation de la lèvre.

Techniques de culture d'organes palais avaient été largement utilisés pour de nombreux laboratoires au cours des 30 dernières années 6,7.

Dans ce protocole, nous décrivons en détail une méthode de dissection palatine et de la culture d'organe statique. L'avantage d'une culture d'organe immobile est qu'il permet de fusionner étagères palatines. Cette technique a été utilisée avec succès dans notre laboratoire pour de nombreuses fusion et de signalisation expériences 8,9. Toutefois, le champ d'application de la technique est très grande et peut être utilisé chaque fois que système de culture d'organe statique est nécessaire, y compris l'évaluation des réponses à des agents chimiques exogènes, les effets de facteurs de croissance dans différentes voies de régulation et des protéines spécifiques.

Figure 1
Figure 1. Souris Palatogenesis. Les stades de développement de la bouche de souris. (BF) ele de numérisationmicrographies cTRON (SEM) du palais secondaire à des moments représentatifs de développement. Les flèches rouges montrent: la partie initiale de l'adhésion palatine et de la fusion. Les flèches jaunes: le point à l'espace entre les palais primaires et secondaires qui vont disparaître après la fusion (Repris de Kaufman 11 avec la permission de la revue PLoS ONE).

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Protocol

Toutes les procédures décrites doivent être effectuées en conformité avec les directives et règlements pour l'utilisation d'animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux locale.

1. Préparation des instruments de dissection et Culture Media

  1. Prélavage tous les instruments à utiliser dans la dissection avec 3% de peroxyde d'hydrogène, puis autoclave à 121 ° C pendant 20 min. Filtre BGJb support avec une solution antibiotique et antimycotique en utilisant un filtre de 0,22 um de taille de pore avec aspiration par le vide dans une hotte.

2. Préparation de l'équipement Culture

  1. Couper filtres à membrane de polycarbonate qui soutiendront les organes palatines en petits triangles, pulvériser avec 70% d'alcool et laissez-les sécher. Préparer Centre-Well Organ Culture Dish (60x15 mm) en plaçant une grille propre et stérilisée triangle équilatéral-forme de fil (20 mm) sur la plaque de culture de l'orgue. Ensuite, remplissez le puits avec 1 ml de BGJB milieux de culture des médias. NOTE: Les médias devraient être suffisantes pour atteindre le niveau de la grille sans submerger les palais. Placez les filtres à membrane, côté brillant vers le bas, sur le dessus de la grille (3-4 membranes par grille) .Depending sur l'expérience, de traitement (protéines, anticorps ou inhibiteurs) peuvent être ajoutés aux médias

3. Mouse Embryo prélèvement et la préparation de la Culture

  1. Pour obtenir des embryons de souris de type sauvage, l'utilisation chronométré 13,5 enceinte souris CD-1 souche de fond génétique. Nettoyer la zone de dissection avec 70% d'éthanol.
    REMARQUE: Les autres souches de souris peuvent être utilisés. Nous préférons souris CD-1 en raison du nombre plus grand de la litière.
  2. Euthanasier les souris enceintes à E13.5 DPC (jours après le coït) avec 5% d'isoflurane suivie par dislocation cervicale pour assurer la mort en utilisant des protocoles approuvés.
  3. Vaporiser éthanol à 70% sur la surface abdominale ventrale pour éviter d'avoir les cheveux abdominale bâton pour les instruments. Puis ouvrir la cavité abdominale ventraleutilisant un pointus-blunt ciseaux d'exploitation et de micro-pinces à disséquer pour localiser l'utérus. Utilisation de la pince, soulever l'ensemble de l'utérus et le séparer du corps de coupe au niveau du corps de l'utérus et à la pointe des cornes utérines avec une lumière ciseaux de fonctionnement.
  4. Placez l'utérus sur une serviette en papier propre sur de la glace (Selon le guide de protocole pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire). Couvrir l'utérus avec une autre serviette de papier propre pour éviter la contamination. Stériliser les instruments utilisant 70% d'éthanol pulvérisation avant l'utilisation ultérieure. L'utérus et les embryons peuvent être transportés au laboratoire sur de la glace.
  5. Dans une hotte à flux laminaire ouverte, assurez attentivement une petite ouverture dans le sac jaune avec des ciseaux d'exploitation nettes et les micro-blunt-pinces à disséquer. Faire l'ouverture plus large, puis poussez-le doucement d'extérioriser l'embryon de la vésicule ombilicale.
  6. Transférer les embryons immédiatement à une boîte de Pétri avec froid saline tamponnée au phosphate 1X (PBS) pH 7,4. Pour assurer le bon stade, exl'embryon amine sous un microscope à dissection pour le corps, la taille de la tête et du membre morphologie.
    NOTE: Les embryons qui ne sont pas au bon stade de développement ne sont pas utilisés pour l'expérience.

Figure 2
Figure 2. Limb Bud Morphologie. L'avant et membres postérieurs sont vérifiés pour le degré de sangle indentation entre les chiffres. À E13.5, tous les condensations chiffres sont de premier plan, avec la sangle et indentations distales entre les chiffres apparaissant très distincte. Les chiffres de derrière sont derrière par une demi-journée 12 Rangée supérieure:. Membres antérieurs, rangée inférieure: membre postérieur.

4. Bouche Dissection

  1. Placer un embryon à la fois dans une boîte de Pétri avec du PBS sous le microscope à dissection. Utilisation de petits ciseaux de dissection et pincettes séparer la tête du corps de l'embryon.
  2. Tenant délicatement le crâne de la souris au-dessus du niveau des yeux avec une pince (en évitantle processus maxillaire) faire deux incisions sur les deux côtés de la ligne de la lèvre. Ensuite, retirer la mandibule et la langue. Isoler la région de processus maxillaire en faisant une coupure au niveau des yeux et retirer le cerveau, les yeux, la cloison nasale et des tissus attenants.

Figure 3
Figure tissus 3. Bouche recueillies auprès 13,5 embryons, lorsque les rayons du palais avaient élevées mais pas en contact. Les étagères palatines ont été mises en culture d'organes sur un filtre à l'interface des médias de l'air pendant 72 heures dans le modèle statique. (A) Niveau de dissection sur E13.5 embryons. (B) Blue Stars délimitent les zones à maintenir le tissu avec une pince lors de la dissection. (C) Vue de lames palatines disséqués placés sur une membrane filtrante de trapèze. (D) Vue de côté de la boîte de culture après le placement de la palais disséqués et plus de milieux de culture.

  1. Placez le côté orale palatine et retirer la cloison nasale et le tissu autour d'elle, en gardant le palais primaire fixé pour l'aider à orienter d'avant en arrière. Utilisez une spatule en cuillère et transférer très soigneusement les étagères palatines (côté nasal bas) pour les filtres préparés sur les grilles dans les boîtes de culture. REMARQUE: Régler le volume des médias pour permettre interface appropriée air-médias.
  2. Sous le microscope stéréo, disséquer le palais primaire et utiliser des pinces pour placer les étagères palatines près de l'autre. Les étagères palatines ne seront pas fusionner si elles ne sont pas mises en contact. Couper le filtre à membrane triangulaire où la partie antérieure du palais est situé. La forme trapézoïdale aidera à localiser la partie antérieure du palais.
  3. Culture les étagères palatines individuellement ou avec deux ou trois dans la même boîte de culture d'organes, selon BGJb milieux de culture.

5. La culture souris Tablettes palatines

  1. Incuber le tissues à 37 ° C dans un mélange de gaz humidifié (CO 2 et 95% d'air de 5%) pendant 72 heures, et de changer le milieu tous les 24 heures.

6. Traitement Palais pour l'analyse histologique

  1. Fixer les palais après 72 h en culture avec 4% de formaldéhyde / tampon phosphate salin O / N à 4 °   C. Puis, doucement avec une pipette de transfert laver le tissu dans la boîte de culture avec du PBS. Enveloppez les palais dans un morceau de lingettes de laboratoire et dans l'intégration des cassettes.
    REMARQUE: Emballage dans les palais des lingettes de laboratoire à prévenir leur perte au cours du processus de déshydratation.
  2. Déshydrater le tissu après 70%, 80% et jusqu'à 100% de lavages d'éthanol pendant 1 heure, suivi par la procédure régulière de paraffine d'intégration. Pour l'enrobage, placer la partie antérieure du palais face au plateau.
  3. Couper 6 um sections en série dans l'orientation coronale d'avant en arrière. Une section complète du palais donnera 350-450 sections. Colorer les sections avec hématoxyline et l'éosine (H & E). 10 Score chaque section 20 ème utilisant le décrit précédemment Score Fusion Mean (MFS) échelle (tableau 1). 8

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Representative Results

La technique peut être appliquée à différents types de experiments.The étude suivante a été conçu pour tester l'effet tératogène de la nicotine in vitro sur palatine fusion. Deux souches de souris ont été utilisées pour cette expérience, CD1 et C57.Palatal tissu a été traitée avec 0,06 mM et 6 concentrations de nicotine hémisulfate. Il a été observé que les schémas de fusion palatines et le calendrier étaient différents dans les deux souches différentes. Chez la souris CD1, des étagères palatines du groupe témoin ont continué fusion d'une manière dépendant du temps. Toutefois, dans le groupe traité fusion retardée de nicotine en particulier à une concentration de 6 mM nicotine (figure 4A). Coupes histologiques de palais de souris CD1 ont montré fusion totale après 72 h dans les échantillons de contrôle. À des doses plus faibles de la nicotine les étagères palatines adhèrent mais les cellules épithéliales demeurent après 3 jours de culture. Étagères palatines incubées à de fortes doses de nicotine ne font contact après 72 heures d'incubation.

(figure 4B). Coupes histologiques de C57 palais de souris ont montré que dans les groupes de traitement d'une couture continue épithéliale a persisté dans la ligne médiane. La fusion a été observé seulement dans le groupe témoin à 72 h.

Nous avons observé que palatine fusion dans les deux types de souris a été affectée par de fortes doses de nicotine. Cependant, les palais de C57 étaient plus sensibles à la nicotine. En conclusion, nos résultats montrent que les souris de fond génétique influence les réponses à la nicotine dans les tissus palatins.

Figure 4
Deux souches de souris palais cultivées en présence de nicotine pendant 24, 48 ou 72, h. Les souches de souris ont répondu à la nicotine à des degrés différents. Tous les palais exposés à la dose élevée de nicotine (6 mM) a échoué à fusionner et avait faible score de fusion moyen (MFS) .Note qu'à 24 h, aucun des palais avait fermé et la MFS variait de 1 (étagères palatines ne pas toucher) à 3 (fusion partielle) dans tous les groupes. En 48 heures, la plupart des palais de contrôle avaient partiellement fondu (scores plus 3) et de 72 h, les palais CD1 ont été complètement fondue (score de 5), mais les contrôles C57 avaient pas complètement fondue (3,67). (Données non publiées de Maria Serrano et le Dr Kathy Svoboda).

But Critères
1 Non-fusion avec aucune adhérence.
2 Non-fusion avec une certaine adhérence apparente.
3 Adhérence avec une certaine désintégration des couches MEE et la confluence mésenchymateuses partielle clair.
4 Fusion complète avec quelques traces de cellules MEE ou couture restante.
5 Fusion complète avec aucune preuve de cellules MEE ou couture visible.

Tableau 1: Fusion Score moyen (MFS) échelle (Kang et Svoboda, 2002). Calcul des scores pour chaque bouche pour la partie antérieure (sections 1-150), moyen (articles 150-300) et postérieure (articles 300-450) 8.

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Discussion

Le protocole à cet article fournit une méthode de disséquer étagères palatines à partir d'embryons au jour embryonnaire 13,5. Étagères palatines des embryons de souris ont été cultivées dans un milieu de culture exempt de sérum dans une atmosphère de 95% d'O 2 5% de CO2 à 37 ° C. Palatal dissection réussie dépend de manière critique de plusieurs facteurs, à chaque étape au cours de la procédure à partir du moment embryonnaire des souris euthanasiés à la fin de la culture. Un des facteurs les plus importants influençant la fusion palatine est le temps nécessaire pour commencer la culture d'organes; embryons doivent être à jour embryonnaire 13,5 que les étagères de palais secondaire sont horizontales, mais n'a pas commencé à fusionner (figure 1).

Un autre point critique lors de la procédure est l'extériorisation des embryons de la vésicule ombilicale. Cette étape requiert le plus grand soin pour éviter d'endommager les structures faciales. Une fois que l'embryon est retiré du sac, la tête est retirée dele corps et placé dans une boîte de Petri à être considérée avec un stéréomicroscope avec éclairage à fibre optique des deux côtés. La mandibule et la langue sont supprimés, exposant le palais. Le cerveau et les tissus résiduels sont éliminés au niveau des yeux. À ce stade, il est important de considérer la couche épithéliale autour des étagères. Il est nécessaire de manipuler le tissu très soigneusement afin de maintenir l'intégrité de ces cellules. Les cellules épithéliales sont responsables du respect et de la formation du MES.

Chaque palais disséqué est tourné face orale vers le bas pour nettoyer le cartilage de la cloison nasale. Ce tissu est sur le côté antérieur de la bouche et semble plus condensé et plus blanches. Étagères palatines libres de tissus indésirables sont déplacés vers une boîte de culture et placés sur le dessus de la membrane du filtre. La position des plateaux est vérifié à nouveau sous la loupe binoculaire stéréo. Ils doivent être rapprochés pour permettre l'adhésion et plus loin palatine fusion.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
BGJb Invitrogen
Penicillin/Streptomycin Lonza Inc. 17-602E 100X
Petri dishes VWR 25384-088 100 x15 mm
Center-well organ culture dish Falcon  #353037 60 x15 mm
Wire triangular grid Custom made with stainless steel wire mesh to fit the organ culture dish well.  
Polycarbonate filter GE& Water and Process Technologies K04BP04700 Black 0.4 micron, 47 mm
Stereo microscope ZEISS  Stemi SR
Culture hood NUAIRE Laminar Flow
Microdissecting forceps Dumont Medical  #5
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14003-G Vannas Scissors, straight, 8 cm long, 0.1mm tips, 5 mm blades, German made
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS500086 Vannas Scissors, straight, 8.5 cm long, 0.025 mm x 0.015 mm tips, 7 mm blades
Microdissecting scissors Kent Scientific Corporation INS14127-G Spring scissors curved curved, 10.5 cm long, 8 mm blades, German made
Surgical currete (spoon spatula) Hu-friedy CM 2/4
Protector laboratory hood Labconco
Incubator Thermo Scientific Farma
Series11 water Jacket
CO2 incubator
PBS  GIBCO 10010-023  1X
Fiber optic Light source Fiber-light  Dolan-Jenner PL-750
Embedding cassette  Statlab EC301
Kim Wipes VWR 470173-504

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References

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