Методы подавления бактериального Pyomelanin Производство и определить соответствующую увеличению чувствительности к окислительному стрессу

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ketelboeter, L. M., Bardy, S. L. Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress. J. Vis. Exp. (102), e53105, doi:10.3791/53105 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. Приготовление культуральных сред, антибиотики, и 2- [2-нитро-4- (трифторметил) бензоил] -1,3-циклогександиона (NTBC)

  1. Сделайте отвар LB (1% триптона, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,25% NaCl в H 2 O) и аликвоту в соответствующих объемах. Стерилизовать в автоклаве. Хранить при комнатной температуре.
  2. Сделайте 100 мл LB-агар (1% триптонового, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,25% NaCl, 1,5% агар в H 2 O) в 250 мл колбах. Стерилизовать в автоклаве и хранить при комнатной температуре. Убедитесь, что агар расплавляют перед заливкой в ​​пластинах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колбы, содержащие 100 мл LB-агар даст 4 пластины. Количество LB агаре могут быть изменены, чтобы соответствовать числу пластин, необходимых для анализа.
  3. Сделать PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ KH 2 PO 4) 16. Стерилизация в автоклаве или фильтрацией и хранят при комнатной температуре.
  4. Подготовка к антибиотикам растворы для гентамицина, канамицина, А.Н.д тобрамицин.
    1. Подготовьте соответствующие антибиотики концентрации акций для P. Штаммы, содержащие палочка 100 мг / мл гентамицина в дозе 30 мг / мл канамицина и 10 мг / мл тобрамицина. Растворить антибиотики в воде, стерилизуют фильтра (0,2 мкм) и хранят при температуре 4 ° С. Alter антибиотики и концентрации в зависимости от изучаемого бактерии.
  5. Подготовьте растворы NTBC. Растворите 10 мг NTBC в 400 мкл ДМСО. Это дает концентрацию 75,9 мМ NTBC. Храните NTBC растворы при температуре -20 ° C. Оттаивания растворах при комнатной температуре при необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разные источники NTBC имеют различия в растворимости. Определить подходящий автомобиль, в котором распускать NTBC на основе рекомендаций производителя и скорректировать Шаг 1,5 соответственно.

2. NTBC титрования бактериальных штаммов

  1. Настройка ночных культур штаммов для тестирования. Добавить 2 мл LB бульона до 16 х 150 мм пробирку(Один за деформации) и прививку с 1 изолированных колонии от каждого штамма. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с аэрацией на культуре ткани ротатора в воздушном инкубаторе.
  2. На следующий день, готовить титрования NTBC в LB бульоне. Используйте первоначальный диапазон от 0 до 900 мкМ NTBC, так как различные штаммы имеют различия в чувствительности к NTBC.
    1. Добавить 1 мл LB бульона 4 до 5 пробирок (16 х 150 мм) на линию.
    2. Добавьте исходный раствор NTBC (75,9 мм) до пробирках (16 х 150 мм) в диапазоне концентраций. В таблице 1 для концентраций NTBC и соответствующих объемов фондовых добавить 1 мл LB бульоне.
  3. Измерьте оптическую плотность 600 из ночных культур. Вымойте культур, прежде чем принимать OD 600 показания по ликвидации pyomelanin присутствует в средствах массовой информации.
    1. Вымойте культур путем центрифугирования 1 мл культуры в микроцентрифуге при 16000 мкг в течение 2 мин. Удалить супернатант и любые свободно осажденные клетки смикропипетки и ресуспендируют осадок клеток твердой в 1 мл LB.
  4. Привить титрования пробирки при OD 600 0,05. Рассчитать количество промытого культуры, необходимой для инокуляции пробирки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте мыть культур для прививок, так как pyomelanin не должны присутствовать.
  5. Инкубируют при титровании трубки в течение примерно 24 ч при 37 ° С с аэрацией, используя культуры ткани ротатор в воздушном инкубаторе.
  6. Сфотографировать титрования трубы и сравнивать производство пигмента внутри и между штаммами, чтобы определить количество NTBC использовать для ВПК и окислительного стресса анализов. Использование OD 600 показания для определения количества клеток в pyomelanin свободного культурального супернатанта и определить плотность клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отношение ОД 600 pyomelanin в культуральной супернатанта клеток может быть рассчитана для количественного различия в pyomelanin производства после лечения с NTBC.

3. Антибактериальная Минимальная Inhibiтори концентрацию (МИК) Анализ в 96-луночных планшетах

  1. Настройка ночных культур штаммов для испытания в LB и без NTBC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывается с помощью репрезентативной уровень 300 мкМ NTBC. Соответствующий уровень NTBC быть использованы при операции 2.6.
    1. Добавить 300 мкм NTBC 2 мл LB. Добавить эквивалентный объем носителя (ДМСО) 2 мл LB для условия не NTBC.
    2. Использование стерильных зубочистки, привить трубки с одной изолированной колонии бактерий. Там будет одна культура с NTBC и одна культура не NTBC для каждого штамма. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с аэрацией, используя культуры ткани ротатор в воздушном инкубаторе.
  2. На следующий день, чтобы LB + NTBC и LB + ДМСО мастер решения для настройки MIC анализа. Добавить NTBC в концентрации 600 мкМ, как это будет разбавлен в два раза, когда посевной материал добавляется, получая конечную концентрацию 300 мкМ.
    1. Чтобы проверить один antibiушные для одного штамма, добавить 600 мкм NTBC 2 мл LB и смешать, чтобы сделать главное решение NTBC. Добавить эквивалентный объем носителя (ДМСО) в 2 мл LB и смешать, чтобы сделать не NTBC главное решение. Используйте эти решения для создания антибиотиков растворы, а также для создания серии разбавления в 96-луночных планшетах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Препараты мастер решение даст дополнительный решение для учета ошибок пипеток. Мастер растворы можно масштабировать вверх или вниз по мере необходимости в зависимости от количества антибиотиков и штаммов.
  3. Подготовка к антибиотикам решения в мастер-решений LB + NTBC или LB + ДМСО.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антибиотика в этих растворов должен быть двойной финал требуемой концентрации. Достаточно раствор должен быть передать 100 мкл четырех скважин на 96-луночный планшет.
    1. Подготовьте гентамицин +/- NTBC маточного раствора при 64 мкг / мл. Для того, чтобы это решение, добавить 0,288 мкл гентамицин складе (100 мг / мл) до 450мкл LB + NTBC или LB + ДМСО мастер решение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная концентрация гентамицина для Р. палочки PAO1 32 мкг / мл.
    2. Сделайте канамицин +/- NTBC маточного раствора в 256 мкг / мл. Для того, чтобы это решение, добавьте 3.84 мкл канамицина (30 мг / мл), 450 мкл LB + NTBC или LB + ДМСО мастер решений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная концентрация канамицина для Р. палочки PAO1 128 мкг / мл.
    3. Подготовка тобрамицин +/- NTBC маточного раствора на 8 мкг / мл. Для того, чтобы это решение, добавить 0,36 мкл тобрамицина складе (10 мг / мл), 450 мкл LB + NTBC или LB + ДМСО мастер решений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для P. палочки PAO1, максимальная концентрация тобрамицина в 4 мкг / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: антибиотики и концентрации могут быть скорректированы для бактерий быть проверены.
  4. Добавить 100 мкл каждого 2x раствором антибиотика с четырех скважин в 96-луночный планшет. Поместите эти решения в ряд А. Для examplе, гентамицин должен быть помещен в А1-А4, канамицин должны быть помещены в A5 через A8, и тобрамицин должны быть помещены в A9 через A12. См фиг.1А для диаграммы 96-луночного планшета, созданной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько антибиотики могут быть проверены в одной тарелке, но только один штамм должен быть проверен на плите, чтобы устранить потенциал для перекрестного заражения от других штаммов.
  5. Добавьте 50 мкл мастер раствора LB + NTBC или LB + ДМСО строкам B-Н от 96-луночного планшета. Убедитесь, что одна плита LB + NTBC и один пластина LB + ДМСО. Смотрите рисунок 1А.
    1. Используйте LB + NTBC для антибиотиков в LB + NTBC. Используйте LB + ДМСО для антибиотиков в LB + ДМСО.
  6. Использование микропипетки выполнять два раза серийных разведений антибиотиков путем передачи 50 мкл раствора из ряда А грести Б. Смешивают раствор, изменить советы пипетки, и передавать 50 мкл раствора, из ряда В грести C. Повторите для remainiнг строк. После разбавления ряда G, удалить 50 мкл раствора из этой строки и выбросить. Используйте строку H как без контроля антибиотиков для бактериального роста. Смотрите рисунок 1В.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый хорошо в рядах от А до G в настоящее время содержит 50 мкл антибиотика в LB + NTBC или LB + ДМСО на 2X конечный целевой концентрации. Ряд Н содержит LB + NTBC или LB + ДМСО без каких-либо антибиотиков.
  7. Измерьте оптическую плотность 600 из ночных культур. Вымойте все культуры, прежде чем принимать OD 600 показания по ликвидации pyomelanin присутствующих в средствах массовой информации.
    1. Вымойте культур путем центрифугирования 1 мл культуры в микроцентрифуге при 16000 мкг в течение 2 мин. Удалить супернатант с микропипетки и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл LB.
  8. Развести в одночасье 2.75x10 культур в 5 КОЕ / мл в LB.
    Примечание: Предположим, что один OD 600 блок является эквивалентом 1х10 9 КОЕ / мл для P. палочки. ОД в КОЕ / мл преобразований может быть Different в других бактерий.
  9. Добавить 50 мкл разбавленного бактериальной культуры к соответствующему скважины.
    Примечание: культур, выращенных в NTBC должны быть добавлены к лункам, содержащим NTBC и культуры, выращенные в ДМСО должны быть добавлены к лункам, содержащим ДМСО. Смотрите рисунок 1В.
    1. Добавить бактерии трех скважин на каждого штамма и концентрации антибиотика. Добавить 50 мкл LB с четвертой скважины, чтобы действовать в качестве контроля для бактериального заражения. Смотрите рисунок 1В.
    2. Используйте микропипетки многоканальный привить скважин. Убедитесь, что пипетки советы в нижней части скважины при добавлении прививочный для предотвращения загрязнения соседних скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление бактериальной культуры в лунки будет разбавлять антибиотика и NTBC концентраций, два раза.
  10. Накройте 96-луночных планшетах с парафином и инкубируют примерно 24 ч при 37 ° С. Инкубируют 96-луночных планшетах в статике, в воздушном инкубаторе.
  11. Исследоватьпластины для роста бактерий в скважинах. МИК представляет собой наименьшую концентрацию антибиотика, в которой нет роста бактерий не наблюдается для всех трех повторностей каждого штамма.
    1. Визуально проверьте пластину для роста или читать с помощью ридере набор для OD 600.

4. Пятно планшете для окислительного стресса ответ

  1. Настройка ночных культур штаммов для испытания в LB с и без NTBC как описано на стадии 3.1.
  2. На следующий день, готовить агаром LB, содержащих H 2 O 2 в качестве окислительного стресса. 2 О 2 концентрации в диапазоне Н от 0 до 1 мм является хорошей отправной точкой.
    1. Растопить агар колб фунт. Классные СМИ примерно 50 ° C при комнатной температуре.
    2. Добавить H 2 O 2, непосредственно к охлаждаемой среде при требуемой концентрации. Вихревые колбы перемешать. В таблице 2 концентрации H 2 O 2и объемы концентрированной H 2 O 2, чтобы добавить. Эти значения основаны на 100 мл агара LB.
    3. Налейте пластин сразу после добавления Н 2 О 2 и пламя поверхность, чтобы удалить пузырьки. Выход 4 пластин в 100 мл LB-агар. Отметить пластины с концентрацией Н 2 О 2.
    4. Место пластин выявленные в капюшоне биологических потока с вентилятора, работающего в течение 30 мин, чтобы удалить лишнюю влагу из пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластины В этот же день готовы. Несоблюдение этого требования может привести к несогласованности данных.
      Примечание: Окислительные стресс-такие как паракват может быть заменен на H 2 O 2 в этом анализе. Концентрации, используемые для других окислительных стрессовых может отличаться от тех, которые используются для H 2 O 2.
  3. Вымойте и измерить OD 600 из ночных культур, как описано в шаге 3.7.
  4. Нормализовать ОП 600 всего ночь у.е.ltures к низкой стоимости для набора штаммов проходят испытания. П. палочки обычно имеет OD 600 приблизительно 2,5 при выращивали в течение ночи в LB + NTBC или LB + ДМСО.
    1. Определить объем культуры, необходимой для разбавления культуры к низкой OD 600 в общем объеме 1 мл. Например, если культура имеет OD 600 из 3 и самое низкое OD 600 для множества штаммов 2,5, выполнить следующий расчет: (2.5) (1 мл) = (3) (х). х = 0,833 мл. 0,833 мл культуры будут размещены в пробирке.
    2. Рассчитать количество LB + NTBC (300 мкМ) или ДМСО LB +, необходимого для доведения объема культуры до 1 мл. Для примера, на этапе 4.4.1, количество LB + NTBC или LB + ДМСО добавляли к культуре будет 0,167 мл (1 мл общий объем - 0,833 мл культуральной). Сделать исходные растворы LB + NTBC и LB + ДМСО использовать для этих разведений на основе объема, необходимого для разбавления все штаммы.
    3. Смешайте культуру и LB + NTBC или LB + ДМСО встряхиванием.
  5. Для поддержания культуры в постоянной концентрации NTBC или ДМСО, выполните десять раз серийные разведения нормированных ночных культур в PBS + NTBC или PBS + ДМСО.
    1. Сделать акции решения PBS + NTBC и PBS + ДМСО. Для одного набора разведений для одного штамма, смешайте 300 мкм NTBC или эквивалентный объем ДМСО с получением PBS, чтобы общий объем 720 мкл. Масштаб этих запасов вверх или вниз в зависимости от того, сколько штаммы испытываются.
    2. Этикетка микроцентрифужную трубы для 10 -1 через 10 -7 разведений. Серийными Добавить 90 мкл PBS + NTBC или PBS + ДМСО в соответствующие пробирки. Используйте PBS + NTBC для штаммов, выращенных в LB + NTBC и использовать PBS + ДМСО для штаммов, выращенных в LB + ДМСО.
    3. Добавить 10 мкл культуры к соответствующему 10 -1 разведения трубки. Смешайте встряхиванием и передачи 10 мкл разведения 10 -1 до 10 -2 разбавления трубки. Повторяйте, пока все разведения не было Перфоrmed. Изменить пипетки советы между разведениями.
  6. Местная 5 мкл 10 -3 до 10 -7 разведения на LB + H 2 O 2 в двух экземплярах пластин для каждого штамма. Используйте кончик пипетки одну если пятна высевают из самых разбавить до наименьшего разбавленной (10 -7 до 10 -3). Не наклоняйте или наклонить тарелку, пока жидкость не высохнет в тарелку.
  7. Инкубируйте пластин в течение 24-48 ч при 37 ° С (воздух) инкубатора, в зависимости от штамма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: П. палочки PAO1 будет иметь хорошие размера колонии на LB после 24 часов инкубации. Выдержите штаммов, пока они не колониям примерно тот же размер, как PAO1.
  8. Сфотографировать пластины, используя ПЗС-камеры над transluminator. При желании, редактировать фотографии для контраста и культуры на того же размера. Подсчитайте количество колоний в каждом месте, чтобы определить изменения в чувствительности к окислительному стрессу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NTBC титрования

Титрования NTBC были использованы для определения, если NTBC смог сократить производство pyomelanin в P. палочки, а также определить концентрацию NTBC, что исключает или снижает pyomelanin продукцию для использования в дополнительных анализов. Там может быть изменения в уровнях производства pyomelanin в различных повторений, но общие тенденции остаются неизменными. NTBC титрования анализ также может быть изменен, чтобы проверить другие соединения, которые могут повлиять на производство пигмента в других бактерий. Это будет только работать, тем не менее, если есть фенотипический изменение, которое может быть визуально определено количественно или.

Лечение pyomelanin производстве штаммов P. палочки с NTBC привело к дозозависимым снижением производства пигментов 12. Рисунок 2 показывает, что различные штаммы P. палочки имеют различия в чувствительности к NTBC, как указано уровней гнойнопроизводство меланина. Более высокие концентрации NTBC должны были сократить производство pyomelanin в клинической изолята PA1111 (17, полученного из Дара Frank) по сравнению с лабораторным штаммом hmgA :: TN 18 (Университет Вашингтона PAO1 транспозонов мутант библиотека). Штаммы, которые не производят pyomelanin [PAO1 (полученный из Кэрри Харвуд) и HpD :: TN 18 (Университет Вашингтона PAO1 транспозонов мутант библиотека)] не показали никаких изменений в пигментации с лечением NTBC. Мы решили использовать 300 мкм NTBC для наших анализов, потому что pyomelanin производства был существенно сокращен в лаборатории штамм hmgA :: TN с помощью этой концентрации (сравните 300 мкМ до 0 мкМ NTBC). Все штаммы, используемые в этом исследовании, были хранили при -80 ° C в 15% глицерине.

Антибиотик МИК

Антибиотик МИК могут быть проверены с использованием нескольких различных методов. Метод микропланшетном пластины описано здесь позволит использоватьR, чтобы проверить диапазон концентраций антибиотика и использовать минимум ресурсов. Результаты легко воспроизведены, и анализ может быть модифицирован, чтобы позволить различий в чувствительность к антибиотикам организма, подлежащего испытанию. Некоторые вариации можно увидеть между независимыми экспериментами, но тенденции достаточно последовательно. Технические повтора должен обладать тот же MIC.

В таблице 3 приведены результаты для различных P. штаммы палочка обрабатывали и без NTBC и различных аминогликозидов. Три независимых колоний тестировали трижды по методу, описанному. МИК записаны как самую низкую концентрацию антибиотика, которая ингибирует рост бактерий во всех трех повторах технических. Лечение NTBC не было никакого влияния на МПК аминогликозидов для штаммов.

Окислительный стресс пятно планшете

Пятно планшете для тестирования окислительного стресса дает reproduciblРезультаты е при более низких уровней H 2 O 2, чем те, которые используются в других тестах. Пластина без H 2 O 2 является контроль пластины, чтобы определить достоверность серии разведений для каждого штамма, а также определить, размеры колоний и число колоний в каждой точке, не подвергая клетки к окислительному стрессу. В правильной серии разбавления, окончательный пятно должно иметь очень мало колоний, в то время как первое пятно будет иметь несчетное число колоний на H 2 O 2 свободные СМИ. Там должно быть разница в десять раз в количестве колоний в каждой точке внутри серии разведений. Для всех штаммов, одинаковое число колоний следует рассматривать в том же разведении на H 2 O 2 свободного управления плиты.

Поскольку различные штаммы бактерий могут иметь разную чувствительность к окислительному стрессу, ряд H 2 O 2 концентрации должны быть проверены. Повышение концентрации H 2 O H 2 O 2 индуцированного окислительного стресса. Характеристики роста различных бактериальных штаммов, можно сравнить, чтобы определить чувствительность к окислительному стрессу под определенным H 2 O 2 концентрации. Анализ может быть изменен, чтобы определить влияние конкретного соединения или реагента, такого как NTBC, на одном бактериальном штамме, когда бактерии подвергаются окислительному стрессу. Колонии также можно пересчитать, чтобы определить процентное снижение бактериальной колониеобразующих единиц между различных экспериментальных условиях.

Фиг.3 показывает место планшете из pyomelanin и не pyomelanin производстве штаммов P. палочки обрабатывали и без NTBC и подвергаются Н 2 О 2 индуцированного окислительного стресса. Существует четкая differeсть в чувствительности к окислительному стрессу, когда pyomelanin бактерии, продуцирующие обрабатывают NTBC, а также между бактериями, которые не производят pyomelanin по сравнению с теми, что действительно производят пигмент. Штаммы, которые не производят pyomelanin, естественным путем или в результате лечения NTBC, были более чувствительны к окислительному стрессу, чем штаммы, которые производятся pyomelanin.

Фигура 1
Рисунок 1:. Схема антибактериальной МИК 96-луночного планшета настроить (А) 100 мкл 2x антибиотиков высшей исходной концентрации в ряда А. Строки B-Н заполнены 50 мкл либо LB + NTBC или LB + ДМСО без антибиотиков. (B) два раза серийных разведений выполняются в строках А через G, в результате чего 50 мкл разбавленного антибиотика в каждой лунке при 2х окончательной требуемой концентрации. Ряд Н контроль хорошо бacterial рост без антибиотиков. 50 мкл LB или инокулята добавляют в соответствующие лунки, разбавляя антибиотиков два раза до конечной концентрации. LB служит для контроля бактериального заражения в антибиотиков. Гм, гентамицин; Км, канамицин; Тов, тобрамицин.

Рисунок 2
Рисунок 2: NTBC титрования производителей pyomelanin и не-производителей P. палочки. NTBC снижается pyomelanin производства в зависимости от дозы в лабораторных и клинических производителей pyomelanin, но не имели никакого эффекта на производство пигмента в штаммов, которые не производят pyomelanin. Измененный ссылкой 12.

Рисунок 3
Рисунок 3: Точечная пластина тест для окислительного стресса Бактериальные ответ штаммы разбавленный.д той же OD 600, серийный разбавляют в 10 раз, и заметил на LB пластины, содержащие различные концентрации H 2 O 2. В 0 мм H 2 O Результат 2 пластины показали, что все штаммы были разбавлены должным образом, как указано такое же число колоний на каждой из точек на тот же разведении для различных штаммов. Планшеты, содержащие H 2 O 2, показывают, что штаммы были более чувствительны к окислительному стрессу, так как концентрация H 2 O 2 увеличена. Об этом свидетельствуют снизилась подсчета колоний в местах по сравнению с не H 2 O 2 состояния, а также уменьшение размера колоний. Измененный ссылкой 12.

Конечная концентрация NTBC (мкм) Объем NTBC (75,9 мМ), чтобы добавить (мкл)
0 0
50 </ TD> 0,659
100 1.318
200 2.64
300 3.95
600 7,91
900 11.86

Таблица 1: концентрации NTBC для создания титрования в LB. Эта таблица дает различные концентрации NTBC и соответствующее количество NTBC складе добавить 1 мл LB.

Конечная концентрация H 2 O 2 (мМ) Сумма 9,79 H 2 O 2 (30% мас), чтобы добавить (мкл)
0 0
0,2 2.04
0,4 4.09
0,6 6.13
0,8 8.17
1 10.21

Таблица 2:. Концентрации H 2 O 2, чтобы добавить к LB-агар для окислительного стресса место планшете Эта таблица дает различные H 2 O 2 концентрации и соответствующее количество концентрированной H 2 O 2 Чтобы добавить 100 мл LB-агар.

L65 "> PA1111 + NTBC
PAO1 - NTBC PAO1 + NTBC hmgA :: TN - NTBC hmgA :: TN + NTBC HPD :: TN - NTBC HPD :: TN + NTBC PA1111 - NTBC
Гентамицин 1 0,5 2 2 1 1 0,5 0,5
Канамицин 16 8 32 32 32 32 16 16
Тобрамицина 0,5 0,5 0,5 0,5 0,25 0,25 0,5 0,5

Таблица 3: Антибиотик МИК Три независимых колонии тестировали в трех экземплярах для каждой Стра.в. Re-печатается с разрешения автора из ссылки 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC) Sigma-Aldrich SML0269-50mg Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2 Sigma-Aldrich 216763-100ML 30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin Gold Bio G-400-100 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG Soluble in H2O.  Filter sterilize.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092 (2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics