Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Immunology and Infection

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Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J. Vis. Exp. (104), e53124, doi:10.3791/53124 (2015).

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Abstract

Protocol

Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren, die Zellkultur und Virusinfektion sind in zertifizierten biologischen Sicherheit Hauben, die für die Sicherheitsstufe der Proben entsprechende gehandhabt werden durchgeführt. Für den Zweck der Beschreibung der Protokolle wird Gaussia-Luciferase-Reporter-markierten HCV als Modellvirus 32 benutzt. Im Zusammenhang mit den repräsentativen Ergebnissen, sind die Verbindungen chebulagic Säure (CHLA) und Punicalagin (PUG) als Kandidaten Virostatika, die virale Glycoprotein Wechselwirkungen mit Zelloberflächen Glycosaminoglycane Target während der frühen viralen Eintritt Stufen 31 verwendet. Heparin, das dafür bekannt ist, mit der Eingabe von vielen Viren 30,31,33,34 eingreifen, wird als positive Kontrolle der Behandlung in diesem Kontext verwendet wird. Für grundlegende Hintergrund Virologie Techniken Vermehrung von Viren, die Bestimmung der Virustiter und die Expression von infektiösen Dosis in plaquebildenden Einheiten (PFU), Fokus-bildenden Einheiten (FFU) oder Multiplizität der Infektion (MOI) ist, worin Re der Leserübertragen auf Bezugs 35. Der vorherigen Beispiele und Viren in den repräsentativen gezeigten Ergebnisse verwendet optimierten Bedingungen wird der Leser auf die in Tabelle 1, 1A und 2A aufgeführten Referenzen 30-32,36-39 sowie Einzelheiten bezeichnet.

1. Zellkultur, Compound Vorbereitung, und die Verbindung Zytotoxizität

  1. Wachsen die jeweilige Zelllinie für die Virusinfektion zu analysierende System (Tabelle 1). Für HCV, wachsen die Huh-7,5-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 200 U / ml Penicillin G, 200 ug / ml Streptomycin und 0,5 ug / ml Amphotericin B.
  2. Bereiten Sie die Testverbindungen und Kontrollen unter Verwendung ihres jeweiligen Lösemittel: beispielsweise aufzulösen CHLA und PUG in Dimethylsulfoxid (DMSO); vorzubereiten Heparin in sterilem doppelt destilliertem Wasser. Für alle nachfolgenden Verdünnungen verwenden Kulturmedien.
    Hinweis: Die endgültige concentRation von DMSO in der Testverbindung Behandlungen ist weniger als 1% in den Experimenten; 1% DMSO als ein negativer Kontrollbehandlung in den Tests zum Vergleich eingeschlossen.
  3. Bestimmung der Zytotoxizität der Testverbindungen (zB CHLA und PUG) auf die Zellen für die Virusinfektion durch die Verwendung eines Zell-Lebensfähigkeit Bestimmen Reagens wie XTT (2,3-Bis [2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl] -5-phenylamino) carbonyl] -2H-tetrazolium Hydroxid):
    1. Für HCV, Samen Huh-7,5-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen (1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator O / N um eine Monoschicht zu erhalten.
    2. Gelten DMSO-Kontrolle (1%) oder steigenden Konzentrationen der Testverbindungen CHLA und PUG (ex. 0, 10, 50, 100, und 500 & mgr; M) zu den Kulturvertiefungen in dreifacher Ausführung.
    3. Bei 37 ° C für 72 Stunden und wirf dann das Medium in der Platte und waschen Sie die Zellen mit 200 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zweimal.
    4. 100 l assaying Lösung aus dem XTT-basierte in vitro-Toxikologie-Assay-Kit, um jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für weitere 3 h auf XTT ermöglichen Formazan-Produktion.
    5. Die Optische mit einem Mikroplattenleser bei einer Testwellenlänge von 492 nm und einer Referenzwellenlänge von 690 nm.
    6. Der prozentuale Anteil der überlebenden Zellen nach der folgenden Formel: Zelllebensfähigkeit (%) = An / Wie × 100%, wobei 'An' und 'Wie' beziehen sich auf die Absorption der Testverbindungen und die Lösungsmittelkontrolle (ex 1% DMSO. ) Behandlungen sind. Bestimmung der Konzentration von 50% zelluläre Zytotoxizität (CC 50) der Testverbindungen aus einer analytischen Software wie GraphPad Prism nach dem Protokoll des Herstellers.

2. Auslesen der Virusinfektion

Hinweis: Das Auslesen der Virusinfektion hängt von der Virus-System verwendet und können Methoden wie Plaque-Assays oder mea beinhaltensuring Reporter Signale von Reporter-markierten Viren. Methode für das Erfassen Reporter-HCV-Infektion auf der Basis der Luciferase-Reporteraktivität wird nachstehend beschrieben.

  1. Sammeln der Überstände aus den infizierten Vertiefungen und Klärung bei 17.000 xg in einer Mikrozentrifuge für 5 min bei 4 ° C.
  2. Mix 20 ul Testüberstand wurde in 50 ul Luciferase-Substrat aus der Gaussia-Luciferase-Assay-Kits und direkt mit einem Luminometer gemessen nach den Angaben des Herstellers.
  3. Auszudrücken HCV Infektiosität als log 10 der relativen Lichteinheiten (RLU) zum Bestimmen virale Inhibition (%) und die Berechnung der 50% effektive Konzentration (EC 50) der Testverbindungen gegen die HCV-Infektion unter Verwendung von Algorithmen von GraphPad Prism Software gemäß dem Protokoll des Herstellers.

3. Vireninaktivierung Assay

Hinweis: Beispiele für Inkubationszeit und Virusdosis für verschiedene Viren einwieder in 1A aufgeführt. Höhere Konzentrationen des Virus kann auch durch Erhöhung der MOI / PFU getestet werden.

  1. Samen Huh-7,5-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen (1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator O / N um eine Monoschicht zu erhalten.
  2. Inkubieren Sie die Testverbindungen oder Kontrollen (Endkonzentrationen: CHLA = 50 & mgr; M; PUG = 50 & mgr; M; Heparin = 1.000 ug / ml; DMSO = 1%) mit den HCV-Partikel bei 37 ° C (1A, "Long-Term ' ) in einem Verhältnis 1: 1. Beispielsweise auf einen 100 & mgr; Virusinokulum enthaltend 1 x 10 4 FFU wird mit 100 ul einer 100 uM CHLA Arbeitsverdünnung; Dies ergibt CHLA Behandlung bei einer Endkonzentration von 50 uM.
  3. Verdünnt das virus-Wirkstoff-Mischung "sub-therapeutische" (unwirksam) Konzentration der Testverbindungen. Zum Beispiel ist die unwirksame Konzentration CHLA und PUG gegen HCV bei 1 & mgr; M 31; deshalbdies erfordert eine 50-fache Verdünnung des Virus-Wirkstoff-Mischung, die mit 9,8 ml Basalmedium (Zellkulturmedium mit 2% FBS) erreicht werden kann.
    Anmerkung: Die Verdünnung auf subtherapeutische Konzentration verhindert erhebliche Wechselwirkung zwischen der Testverbindungen und der Oberfläche der Wirtszelle und ermöglicht die Untersuchung der Wirkung der Behandlung auf den zellfreien Virionen. Beachten Sie, dass diese Verdünnung hängt von der antivirale Dosis-Antwort der Testverbindungen gegen die insbesondere virale Infektion und vor der Durchführung dieses bestimmten Test 31 ermittelt.
  4. Zum Vergleich, mischen das Virus mit den Testverbindungen und sofort zu verdünnen (kein Inkubationszeit), um Unter therapeutische Konzentration vor der Infektion (1A, "Short-Term).
  5. Zugabe von 100 ul der verdünnten HCV-Wirkstoff-Mischung auf die Huh-7,5 Zellmonolayer (die Virusmenge ist nun auf 1 x 10 2 FFU; final MOI = 0,01) und Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C viral, damitAdsorption.
  6. Nach der Infektion, entfernen Sie die Inokula verdünnt und vorsichtig waschen die Vertiefungen zweimal mit 200 ul PBS.
    Hinweis: Führen Sie die wäscht vorsichtig, um zu vermeiden, heben Sie die Zellen.
  7. Gelten 100 ul Basalmedium in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 72 Std.
  8. Analyse des resultierenden Infektion durch Untersuchung des Überstandes auf Luciferase-Aktivität wie in '2 beschrieben. Auslesen der Virusinfektion.

4. Viral Befestigung Assay

Hinweis: Beispiele für Inkubationszeit und Virusdosis für verschiedene Viren sind in 2A aufgeführt, "Anhang". Höhere Konzentrationen des Virus kann auch durch Erhöhung der MOI / PFU getestet werden.

  1. Samen Huh-7,5-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen (1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator O / N um eine Monoschicht zu erhalten.
  2. Pre-Chill die Zellmonoschichten in Platten bei 4 ° C for 1 Std.
  3. Co-Behandlung der Zellen mit HCV Inokulum (MOI = 0,01) und die Testverbindungen oder Kontrollen (Endkonzentrationen: CHLA = 50 uM; PUG = 50 uM; Heparin = 1,000 & mgr; g / ml; DMSO = 1%) bei 4 ° C für 3 Std. Zum Beispiel, um eine 90 & mgr; l Virusinokulum mit 1 x 10 2 FFU, fügen Sie 10 ul einer 500 uM CHLA Arbeitsverdünnung; Dies ergibt CHLA Behandlung bei einer Endkonzentration von 50 uM und eine Infektion durch HCV bei MOI = 0,01 auf der Zell-Monoschicht.
    Hinweis: Es ist wichtig, für die Durchführung des Experiments bei 4 ° C, da es eine Virusbindung, sondern schließt Eintrag, der am effizientesten bei 37 ° C auftritt. Führen die Zugabe des Virus und die Testverbindungen auf Eis und der anschließenden Inkubation in einem 4ºC Kühlraum, um sicherzustellen, dass die Temperatur auf 4 ° C gehalten.
  4. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie sich leicht die Zellmonoschicht mit 200 ul eiskaltem PBS zweimal.
    Hinweis: Führen Sie die wäscht vorsichtig, um zu vermeiden, heben Sie die Zellen <./ li>
  5. Gelten 100 ul Basalmedium in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 72 Std.
  6. Analyse des resultierenden Infektion durch Untersuchung des Überstandes auf Luciferase-Aktivität wie in '2 beschrieben. Auslesen der Virusinfektion.

5. Viral Entry / Fusion Assay

Hinweis: Beispiel für Inkubationszeiten und Virusdosis für verschiedene Viren sind in 2A 'Entry / Fusion "aufgeführt. Höhere Konzentrationen des Virus kann auch durch Erhöhung der MOI / PFU getestet werden.

  1. Samen Huh-7,5-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen (1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung) und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator O / N um eine Monoschicht zu erhalten.
  2. Pre-Chill die Zellmonoschichten in Platten bei 4 ° C für 1 Stunde.
  3. Infizieren die Zellen mit HCV (MOI = 0,01) bei 4 ° C für 3 Stunden. Verwenden Sie beispielsweise eine 100 ul Virusinokulum mit 1 x 10 2 FFU.
    Hinweis: Führen Sie die addition des viralen Inokulum auf Eis und der anschließenden Inkubation in einem 4ºC Kühlraum, die Temperatur auf 4 ° C, die die virale Bindung jedoch keine Ausgabe ermöglicht aufrechtzuerhalten.
  4. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie sich leicht die Zellmonoschichten zweimal mit 200 ul eiskaltem PBS.
    Hinweis: Führen Sie die wäscht vorsichtig, um zu vermeiden, heben Sie die Zellen.
  5. Behandeln Sie die Vertiefungen mit den Testverbindungen oder Kontrollen (Endkonzentrationen: CHLA = 50 & mgr; M; PUG = 50 & mgr; M; Heparin = 1.000 ug / ml; DMSO = 1%) und bei 37 ° C für 3 Stunden. Fügen Sie beispielsweise 10 & mgr; l einer 500 & mgr; M CHLA Arbeitsverdünnung auf 90 ul Medium, zu mischen und zu behandeln, die Brunnen; Dies ergibt CHLA Behandlung bei einer Endkonzentration von 50 uM.
    Hinweis: Der Wechsel von 4 ° C bis 37 ° C ermöglicht nun den Viruseintritt / Fusion Veranstaltung und ermöglicht somit Beurteilung der Testverbindungen "-Effekt an diesem Schritt.
  6. Saugen Sie das Arzneimittel enthaltende Überstand und entfernen Sie nicht internalisiertextrazellulären Viren durch Waschen mit 200 ul Citratpuffer (50 mM Natriumcitrat, 4 mM Kaliumchlorid, pH 3.0) oder PBS. Gelten 100 ul des Grundmediums vor der Inkubation bei 37 ° C für 72 Std.
  7. Analyse des resultierenden Infektion durch Untersuchung des Überstandes auf Luciferase-Aktivität wie in '2 beschrieben. Auslesen der Virusinfektion.

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Representative Results

In Abbildung 1 wurde die "Virus-Inaktivierung Test" durchgeführt, um zu prüfen, ob zwei bestimmte natürliche Verbindungen CHLA und PUG könnten die verschiedenen umhüllten Viren in zellfreien Zustand zu inaktivieren und zu verhindern nachfolgende Infektion. Die Zytotoxizität und antivirale Dosis-Antwort dieser Verbindungen vor der Durchführung der mechanistische Studie 31 bestimmt. Die Viren wurden mit den Testverbindungen vorbehandelt und anschließend die Virus-Wirkstoff-Mischungen wurden zu subtherapeutischen Konzentrationen vor der Impfung auf die jeweilige Zellmonoschicht für jede Virus-System verdünnt. Wie in 1 gezeigt, sowohl CHLA und PUG schienen mit den zellfreien Virionen interagieren, was irreversible Effekte, die die Zell-Monoschicht von der nachfolgenden Infektion geschützt. Die beiden Testverbindungen erreicht eine nahezu 100% ige Hemmung gegen HCMV, HCV und DENV-2, während eine 60 bis 80% Block wurde gegen MV und RSV beobachtet. Diese Ergebnisse suggest, dass CHLA und PUG haben direkten Einfluss auf diese freie Viruspartikel durch Inaktivierung von ihnen und zur Neutralisierung ihrer Infektiosität.

In 2 wurden die Befestigung und Ein- / Fusion-Assays durchgeführt, um die Wirkung von CHLA und PUG gegen diesen frühen Viruseintritt bezogene Ereignisse von HCMV, HCV, DENV-2, MV und RSV erkunden. Sowohl CHLA und PUG wirksam verhindert die Bindung der untersuchten Viren auf die jeweilige Wirtszelle, wie durch Hemmung auf die resultierende Virusinfektion (Abbildung 2, "Anhänge": hellgraue Balken) gezeigt. Die inhibitorische Wirkung auf die Virus Befestigung von beiden Verbindungen war ähnlich gegen HCMV (2B), HCV (2C), DENV-2 (2D) und RSV (2F), im Bereich von 90 - 100%. Andererseits erschien PUG wirksamer als CHLA gegen MV Bindung (2E) zu sein, wobei der Hemmungsrate von twO-Verbindungen zwischen 50 - 80%. Die Kontrollbehandlung Heparin, von dem bekannt ist, um den Eintritt von vielen Viren, inhibierte auch die Anbringung von HCMV, DENV-2, RSV, ad MV blockieren, war aber weniger wirksam gegen HCV. Die darauf folgende 'Viruseintritt / Fusionstest "untersucht, ob CHLA und PUG während der Viruseintritt / Schmelzphase behielten ihre Aktivität (Abbildung 2," Entry / Fusion ": dunkelgraue Balken). Auch hier sowohl CHLA und PUG wurden beobachtet, um das Eindringen des Virus / Fusionsschritt der untersuchten Viren (2B - F) wirksam zu beeinträchtigen, was zu einer 50 bis 90% schützende Wirkung auf die jeweilige Zellmonolayer. Heparin auch potent gehemmt Eintrag / Fusion in DENV-2 und RSV-Infektionen, war aber gegen HCMV, HCV, und MV (<40% ige Hemmung im Durchschnitt) weniger wirksam.

<td> HEL
Virus Zellen-Art
HCMV
HCV Huh-7.5
DENV-2 Vero
MV CHO-SLAM
RSV HEp-2

Tabelle 1:. Wirtszelltyp für die virale Infektion der Zelltyp für jeden der repräsentativen Ergebnisse beschriebenen viralen Infektionssystem verwendet wird, angegeben. Weitere Einzelheiten zu den Zellen in Referenz 31 gefunden werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Inaktivierung von Virusinfektionen durch die Testverbindungen CHLA und PUG Verschiedene Viren wurden mit den Testverbindungen für einen langen Zeitraum behandelt werden. (1,5 inkubiert - 3 Stunden vor der Titration, hellgraue Balken) oder kurzen Zeitraum (sofort verdünnt; dunkelgrau bar) bei 37 ° C, bevor eine Verdünnung auf subtherapeutischen Konzentrationention und anschließender Analyse der Infektion auf den jeweiligen Wirtszellen. (A) Schematische Darstellung des Experiments (links dargestellt) mit der endgültigen Viruskonzentration (PFU / Vertiefung oder MOI), Langzeit-Virus-Medikament Inkubationszeit (i), und anschließender Inkubation (ii) angegeben für jedes Virus in der Tabelle auf der rechten Seite. Die Analysen für (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, und (F) RSV in jedem zusätzlichen Platte angezeigt. Ergebnisse werden mit dem DMSO negative Kontrolle Behandlung für Virusinfektion und die gezeigten Daten wurden die Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus drei unabhängigen Experimenten aufgetragen sind. Diese Zahl hat sich von Referenz 31 modifiziert worden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Evaluierung von antiviralen Aktivitäten der Testverbindungen CHLA und PUG Viren Befestigung und Ein- / Fusion. (A) Die experimentelle Vorgehensweise, Viruskonzentration (PFU / Vertiefung oder MOI), und der Zeitpunkt der Zugabe und die Behandlung mit den Testverbindungen (i, ii, iii) für jedes Virus in den Schemata und den zugehörigen Tabellen dargestellt. In Virusanheftung Analyse (hellgraue Balken) Monoschichten aus verschiedenen Zelltypen wurden bei 4 ° C für 1 h vorgekühlt, wobei die jeweiligen Viren und Testverbindungen dann mitbehandelt bei 4 ° C (1,5 - 3 h, i) vor dem Waschen die Inokulate und die Testverbindungen für die anschließende Inkubation (37 ° C, ii) und Prüfung der Virusinfektion. In virus entry / Schmelzanalyse (dunkelgraue Balken), wurden ausgesät Zellmonoschichten vorgekühlte bei 4 ° C für 1 Stunde und dann mit den entsprechenden Viren bei 4 ° C für 1,5 in Frage gestellt - 3 h (i). Zellen wurden danngewaschen und mit den Testverbindungen für eine weitere Inkubationsperiode (ii), während der die Temperatur auf 37 ° C verschoben, um das Eindringen des Virus / Fusionsereignis erleichtern behandelt. Am Ende der Inkubation wurden die extrazellulären Viren entweder durch Citratpuffer (pH 3.0) oder PBS Waschschritten entfernt und die Zellen wurden für weitere Analyse der Virus-Infektion inkubiert (iii). Ergebnisse für (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, und (F) RSV in jedem zusätzlichen Platte angezeigt. Daten werden gegen die DMSO negative Kontrolle Behandlung einer Virusinfektion, aufgetragen und werden als Mittel ± SEM von drei unabhängigen Experimenten. Diese Zahl hat sich von Referenz 31 modifiziert worden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO 11995-040
FBS GIBCO 26140-079
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
Amphotericin B GIBCO 15290-018
DMSO Sigma D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
PBS pH 7.4  GIBCO 10010023
Microplate reader Thermo Scientific 89087-320
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit New England Biolabs E3300L   
Luminometer Promega GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate Sigma 71402
Potassium chloride Sigma P5405

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