प्रोस्टेट कैंसर के रोगी की पीढ़ी परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं से xenograft मॉडल व्युत्पन्न

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Williams, E. S., Rodriguez-Bravo, V., Chippada-Venkata, U., De Ia Iglesia-Vicente, J., Gong, Y., Galsky, M., Oh, W., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells. J. Vis. Exp. (104), e53182, doi:10.3791/53182 (2015).

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Abstract

Introduction

रोगी निकाली गई xenografts कैंसर अनुसंधान के लिए इस्तेमाल तेजी से लोकप्रिय प्रयोगात्मक मॉडल हैं। वे बायोमार्कर और जैविक रास्ते, पूर्व नैदानिक ​​दवा की प्रभावकारिता का मूल्यांकन, और व्यक्तिगत कैंसर उपचार 1,2 के लिए बदलते रूपों की सृष्टि के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इससे पहले, अन्य अनुसंधान समूहों दाखिल या immunocompromised चूहों 1 में ही ट्यूमर सेल निलंबन या पूरे ट्यूमर explants इंजेक्शन द्वारा या तो PDX मॉडल विकसित किया है। ये PDX मॉडल ताजा ठोस ट्यूमर की शल्य चिकित्सा संग्रह, घातक जलोदर या महंगा दोनों है और चिकित्सकजनित रुग्णता का खतरा बढ़ करने के लिए रोगी को उजागर करता है, जो एक शल्य प्रक्रिया के दौर से गुजर एक मरीज से फुफ्फुस बहाव की आवश्यकता होती है।

कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण हाल ही में विकास ट्यूमर कोशिकाओं घूम का पता लगाने, अलगाव और लक्षण वर्णन किया गया है। ये ट्यूमर कोशिकाओं प्राथमिक ट्यूमर जन से बचने के लिए और संचलन में प्रवेशवे मेटास्टेसिस और पतन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जहां कैंसर का सबसे आम कारण मृत्यु दर 3 से संबंधित। कई ठोस ट्यूमर प्रकार से CTCs के मूल्यांकन और लक्षण निदान, रोग का निदान, और अवशिष्ट रोग 3 की निगरानी के लिए नैदानिक ​​जानकारी उपलब्ध कराई है। या तो शारीरिक गुण, बायोमार्कर की अभिव्यक्ति, या CTCs के कार्यात्मक विशेषताओं पर भरोसा वर्तमान में इस्तेमाल किया दृष्टिकोण की एक किस्म कुशलता CTCs 4 अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मौजूदा macroscale सीटीसी अलगाव तरीकों सतह अणुओं के खिलाफ घनत्व ढाल centrifugation, फिल्टर pores के साथ शारीरिक निस्पंदन और जुदाई में शामिल हैं। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल सीटीसी अलगाव के तरीके CTCs की एंटीबॉडी आधारित पकड़ने पर आधारित हैं। दोनों कोशिका की सतह मार्करों के सकारात्मक और नकारात्मक चयन परिधीय रक्त से CTCs को अलग-थलग करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। परिधीय संचलन में CTCs के लिए सकारात्मक चयन सामान्यतः उपकला मार्कर (जैसे, EpCAM) का उपयोग करता है, जो एकCTCs लेकिन hematopoietic नहीं कोशिकाओं पर व्यक्त कर रहे हैं। इस विधि का नुकसान मेटास्टेटिक क्षमता के साथ CTCs अक्सर उपकला करने वाली mesenchymal 3 उपकला सतह मार्कर downregulates जो संक्रमण (EMT), आया है कि है। मेटास्टेटिक क्षमता के साथ CTCs को अलग-थलग करने के लिए, hematopoietic सतह मार्कर, CD45 कार्यरत हैं जो एक नकारात्मक चयन पद्धति, ल्यूकोसाइट्स के सामान्य सेल की आबादी 5 इस्तेमाल किया जा सकता व्यय करना।

प्रोस्टेट कैंसर सबसे आम तौर पर निदान कैंसर और पुरुषों 6 में कैंसर से संबंधित मौतों का एक प्रमुख कारण है। ट्यूमर प्रगति और आक्रामकता के तंत्र को पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं और इसलिए पीढ़ी और प्रोस्टेट कैंसर के आणविक विविधता पुनरावृत्ति कि प्रयोगात्मक मॉडल के लक्षण वर्णन महत्वपूर्ण ब्याज की हैं। प्रोस्टेट कैंसर के PDX मॉडल किया गया है immunocom में मानव प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के engraftment द्वारा पहले से उत्पन्नवादा किया चूहों 7.8। हालांकि इस तरह के मॉडल की पीढ़ी के लिए मुख्य रूप से इस बीमारी के अकर्मण्य प्रकृति को जिम्मेदार ठहराया है जो immunocompromised चूहों में प्रोस्टेट कैंसर के कम engraftment दर, के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। हाल ही में, CTCs स्तन कैंसर 9, फेफड़ों के कैंसर के 10 और प्रोस्टेट कैंसर के 11 PDX मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ये सबूत की अवधारणा अध्ययन शल्य नमूना संग्रह के लिए जरूरत के PDX मॉडल स्वतंत्र पैदा करने की संभावना की शुरुआत की। इस लेख में हम विस्तार से इस उपन्यास प्रयोगात्मक मॉडल की पीढ़ी के लिए एक विधि का वर्णन है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल संस्थागत अनुसंधान नैतिकता बोर्ड से अनुमोदन के साथ हमारी संस्था में आयोजित किया गया और मानव कल्याण के लिए सभी, संस्थागत, राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुपालन में किया गया है।

उन्नत प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों से परिधीय रक्त की 1. संग्रह

नोट: मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों का चयन करें। लिखा रोगी सहमति प्राप्त और अलगाव में उम्र और पिछले कीमोथेरेपी और हार्मोनल उपचार सहित रोगियों के नैदानिक ​​विशेषताओं, रिकॉर्ड है। मेटास्टेटिक रोग के साथ मरीजों को संभावित परिधीय रक्त में CTCs के सर्वोच्च एकाग्रता होगा।

  1. सूचित सहमति के बाद और एक उपयुक्त संस्थागत समीक्षा बोर्ड प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी तहत रक्त के नमूने ले लीजिए। लेटेक्स दस्ताने और प्रक्रिया के दौरान एक प्रयोगशाला कोट पहनें।
  2. सुई धारक को 25 जी तितली सुई और ट्यूबिंग कनेक्ट करें। के क्षेत्र को साफ करने के लिए एक शराब झाड़ू का प्रयोग करेंbicep और प्रकोष्ठ के बीच कोहनी के सामने नस, तो मरीज की ऊपरी भुजा के लिए बंधन लागू होते हैं।
  3. कोहनी के सामने नस में तितली सुई डालें और संग्रह शुरू करने के लिए सुई धारक में रक्त संग्रह ट्यूब धक्का। थक्के रोकने के लिए ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) होते हैं कि संग्रह नलियों में रक्त के लगभग 10 मिलीलीटर लीजिए।
  4. रोगी से तितली सुई निकालें और 1 मिनट के लिए नस पंचर की साइट पर बाँझ धुंध पैड के साथ दबाव लागू होते हैं। एक बाँझ पट्टी के साथ कवर साइट।

मोनोन्यूक्लियर प्रकोष्ठों के 2. अलगाव

नोट: चरण 1 से एकत्र रक्त मोनोन्यूक्लियर CTCs के अलावा परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) (जैसे, लिम्फोसाइट और monocytes) में शामिल होंगे।

  1. : 1 के अनुपात पिपेट पूरे एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ 50 मिलीलीटर polystyrene शंक्वाकार ट्यूब में रक्त और एक 1 में हैंक्स बैलेंस्ड नमक समाधान (HBSS) जोड़ें। धीरे पिपेट मिश्रण homogenize करने के लिए।
  2. एक खाली 50 मिलीलीटर polystyrene शंक्वाकार ट्यूब को कम गति घनत्व ढाल centrifugation द्वारा रक्त घटकों को अलग करने के लिए एक व्यावसायिक तौर पर तैयार समाधान (Ficoll-Paque) के 15 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. धीरे अलग शीर्ष परत के रूप में, 2.2 कदम से polystyrene ट्यूब में, 2.1 कदम से, पूरे रक्त और HBSS मिश्रण विंदुक। समाधान के मिश्रण को कम से कम करने के लिए सबसे कम सेटिंग करने के लिए सेट पिपेट, यह कुशल जुदाई सुनिश्चित करेगा।
  4. आरटी पर 30 मिनट के लिए 400 XG (25 डिग्री सेल्सियस) पर अपकेंद्रित्र। सबसे कम सेटिंग करने के लिए सेट मंदी जुदाई के बाद समाधान के मिश्रण को रोकने के लिए। त्वरण किसी भी गति को सेट किया जा सकता है।
  5. Centrifugation के बाद, ट्यूब के नीचे ऊपर और जुदाई समाधान पर प्लाज्मा के बीच PBMCs और CTCs बैठा परत की पतली सफेद ग्रे पट्टी की पहचान।
  6. एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर एक 50 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में 2.5 चरण में सफेद ग्रे पट्टी से कोशिकाओं को ले लीजिए।
  7. PBMCs और CTCs और सी के साथ 50 मिलीलीटर polystyrene शंक्वाकार ट्यूब HBSS जोड़ें10 मिनट आरटी धोने के लिए 400 XG पर फिर entrifuge।
  8. धोने के लिए आरटी पर 3 मिनट के लिए 400 XG पर फिर से HBSS और सेंट्रीफ्यूज की 50 मिलीलीटर में तरल और resuspend गोली छानना।
  9. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, लाल रक्त सेल बफर के 5 मिलीलीटर के साथ शेष गोली resuspend और आरटी पर 5 मिनट के लिए समाधान सेते हैं।
  10. आरटी पर 3 मिनट के लिए 400 XG पर centrifugation द्वारा लाल रक्त सेल बफर निकालें।
  11. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पूर्व एंटीबॉडी धुंधला करने के लिए ब्लॉक करने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक 1 मिलीलीटर पीबीएस 1x में गोली resuspend।

प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई के लिए CD45-FITC एंटीबॉडी के साथ 3. धुंधला मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (FACS)

  1. एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग (कदम 2.11 से) व्यवहार्य (trypan नीले-नकारात्मक) कोशिकाओं की संख्या यों। (10% FBS के साथ पीबीएस 1x में) एक 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल निलंबन को तैयार है और 1 घंटे के लिए बर्फ पर जगह है।
  2. मात्रा निर्धारित बांटोदो ट्यूबों में पिछले चरण से सेल निलंबन। नियंत्रण और CD45 धुंधला के रूप में लेबल ट्यूबों।
  3. 250: नियंत्रण ट्यूब में, एक के कमजोर पड़ने पर IgG1κ-FITC (2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें। CD45 धुंधला ट्यूब में, एक के कमजोर पड़ने पर CD45 FITC (2.5 माइक्रोग्राम / एमएल) संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें: 250 और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन सेते हैं। CD45 प्रतिजन लेबलिंग hematopoietic कोशिकाओं को बाहर करने के लिए किया जाता है।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  5. बाँझ 1 एक्स पीबीएस के साथ प्रत्येक गोली निलंबित द्वारा, दो बार कोशिकाओं को धो 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 400 XG पर centrifugation द्वारा पीछा 10% FBS के साथ पूरक।
  6. 10 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) युक्त पीबीएस 1x के 1 मिलीलीटर समाधान में कोशिकाओं Resuspend।
  7. 12 मिमी x 75 मिमी polystyrene ट्यूबों में 35 माइक्रोन झरनी टोपियां के माध्यम से अंतिम समाधान फ़िल्टर।

प्रोस्टेट CTCs 4. अलगाव सेFACS

नोट: लाइव CD45 नकारात्मक CTCs इकट्ठा करने के लिए एक प्रवाह cytometer का उपयोग।

  1. लेबल ट्यूब से कोशिकाओं का उपयोग कर सेट मुआवजा नियंत्रण "नियंत्रण।"
  2. मलबा और उचित आगे-बिखराव और पक्ष तितर बितर मापदंडों का उपयोग कोशिकाओं के समूहों को बाहर कर कि फाटक बनाएँ।
  3. लेबल ट्यूब, से सेल निलंबन का उपयोग कर FITC फाटक स्थापित "CD45-FITC।"
  4. प्रशांत ब्लू-ए चैनल का उपयोग गेट व्यवहार्य (DAPI नकारात्मक) कोशिकाओं।
  5. 10% FBS के साथ पूरक रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) 1640 के 2 मिलीग्राम से युक्त एक बाँझ 15 मिलीलीटर polystyrene शंक्वाकार ट्यूब में CD45 नकारात्मक आबादी लीजिए।
  6. 10% FBS के साथ पूरक RPMI के 500 μl - अपकेंद्रित्र 3 मिनट के लिए 400 XG पर छाँटे गए प्रोस्टेट ट्यूमर सेल निलंबन, तो 200 में छर्रों resuspend।

Xenograft विकास के चूहे और निगरानी में CTCs 5. इंजेक्शन

ध्यान दें:संस्थागत पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुपालन में सभी पशु प्रक्रियाओं का संचालन। इस प्रोटोकॉल में सभी प्रासंगिक नियामक और संस्थागत एजेंसियों, नियमों और दिशा निर्देशों के अनुसार और अनुपालन में हमारे पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित एक विशिष्ट पशु का उपयोग प्रोटोकॉल के तहत हमारी संस्था में आयोजित किया गया है।

  1. बर्फ पर 1 के अनुपात में और जगह एक 1: पर बाह्य मैट्रिक्स के साथ हल प्रोस्टेट ट्यूमर सेल निलंबन मिलाएं।
  2. ऑक्सीजन की / मिनट 1 एल में 5% (वी / वी) साँस isoflurane की आपूर्ति एक कक्ष में चमड़े के नीचे दाखिल करने से पहले माउस anesthetize। माउस में कार्निया और पैर के अंगूठे पलटा के नुकसान के लिए जाँच के द्वारा उचित संज्ञाहरण सुनिश्चित करें।
  3. एक 25 जी सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, एक 8-10 सप्ताह पुराने पुरुष immunodeficient माउस के दोनों ऊपरी किनारों में प्रोस्टेट ट्यूमर सेल और बाह्य मैट्रिक्स सेल निलंबन subcutaneously के 250 μl इंजेक्षन। इंजेक्शन की मात्रा मैं है के रूप में 250 μl की परवाह किए बिना सीटीसी एकाग्रता का इंजेक्षनmportant मूल्य। माउस में अधिकतम वर्ग प्रशासन से अधिक नहीं 1 मिलीलीटर है।  
  4. चमड़े के नीचे गांठदार घनत्व के विकास के लिए माउस इंजेक्शन साइटों की साप्ताहिक टटोलने का कार्य प्रदर्शन से और एक सप्ताह में दो बार चूहों के वजन को मापने के द्वारा चूहों की निगरानी करें।
  5. ट्यूमर के आकार आणविक विश्लेषण और सीरियल पारित होने के लिए पर्याप्त ट्यूमर के ऊतक सुनिश्चित करने के लिए अधिक से अधिक 0.5 सेमी और सबसे बड़ी व्यास में कम से कम 1 सेमी है जब गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और फसल चमड़े के नीचे मानव प्रोस्टेट कैंसर xenografts द्वारा पीछा कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation द्वारा चूहों euthanize। कोई ट्यूमर के बावजूद संकट या 15% की वजन घटाने के संकेत के साथ चूहों euthanize साफ नजर आती है।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल पृथक CD45 नकारात्मक प्रोस्टेट कैंसर CTCs से PDX मॉडल की पीढ़ी को बढ़ावा मिलेगा। हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल नकारात्मक चयन पद्धति के आधार पर यह DAPI दाग का उपयोग कर मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए आवश्यक है। फ्लो से पता लगाया CD45 नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत चर रहा है और रोगी (चित्रा 1 ए) के ट्यूमर बोझ पर निर्भर करता है। सफेद तीर (चित्रा 1 बी) ने संकेत के रूप में (सेल नाभिक की पहचान करने के लिए) CD45 और DAPI का उपयोग कर अवर्गीकृत कोशिकाओं की Immunofluorescent धुंधला, CD45 नकारात्मक कोशिकाओं का पता चलता है। चित्रा 1C में, चमड़े के नीचे गांठदार घनत्व माउस के दोनों किनारों पर देखा जा सकता है। प्रत्येक गांठदार घनत्व जेनोग्राफ्ट विकास का प्रतिनिधित्व करता है और यह माउस के पृष्ठीय मांसलता से protrudes और बनावट में मजबूत है के रूप में स्वस्थ ऊतकों से अलग रूप में सराहना की जा सकती। आरोपण और जेनोग्राफ्ट विकास के बीच समय अंतराल patie की सीटीसी बोझ के आधार पर भिन्न हो सकते हैंNT नमूना, प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या और CTCs की जैविक आक्रामकता। CTCs से उत्पन्न प्रोस्टेट PDX hematoxylin और eosin धुंधला द्वारा देखा के रूप में मानव प्रोस्टेट ट्यूमर पुनरावृत्ति, और जैसे एण्ड्रोजन रिसेप्टर (ए आर) और प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन झिल्ली (PSMA) (चित्रा -1) के रूप में प्रोस्टेट विशिष्ट सेलुलर मार्करों, के लिए immunohistochemistry द्वारा।

चित्र 1
मानव प्रोस्टेट कैंसर CTCs से प्रोस्टेट कैंसर PDX मॉडल 1. पीढ़ी चित्रा। (ए) प्रोस्टेट कैंसर के साथ एक रोगी के परिधीय रक्त से विशिष्ट CD45 धुंधला सेल आबादी को दर्शाता हुआ भूखंड प्रवाह cytometry। । सकारात्मक DAPI दाग के साथ कोशिकाओं मर चुका है और केवल व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए gating से बाहर रखा गया है अवर्गीकृत जनसंख्या का (बी) CD45 immunofluorescence धुंधला CD45 की उपस्थिति की पुष्टि -। कोशिकाओं (सफेद तीर) (सी) विवो में और ट्यूमर फसल के बाद प्रतिनिधि PDX ट्यूमर दिखाता पारंपरिक Hematoxylin और Eosin और विशिष्ट प्रोस्टेट मार्कर का उपयोग सीटीसी PDX मॉडल (डी) विश्लेषण। एण्ड्रोजन रिसेप्टर (ए आर) और प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन झिल्ली (PSMA)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह पांडुलिपि CTCs से प्रोस्टेट कैंसर PDX मॉडल की पीढ़ी के लिए एक विधि का वर्णन है। PDX की पीढ़ी के लिए CTCs का उपयोग मौजूदा तरीकों की तुलना में जब मॉडल कई संभावित महत्वपूर्ण लाभ है। सबसे पहले, परिधीय रक्त से CTCs की सुलभ संग्रह विभिन्न रोग चरणों में एक ही मरीज से प्रयोगात्मक मॉडल की पीढ़ी के लिए सक्षम बनाता है। दूसरा, रक्त संग्रह ट्यूमर कोशिकाओं के संग्रह के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता है कि मौजूदा तरीके की तुलना में जब ट्यूमर कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सुरक्षित और सस्ती विधि का प्रतिनिधित्व करता है।

सीटीसी संवर्धन के कई तरीकों कई कारण धन और संसाधनों की सीमाओं के लिए हर प्रयोगशाला के लिए सुलभ नहीं हैं फिर भी वर्णन किया गया है। हम FACS, कई प्रयोगशालाओं के लिए एक सुविधाजनक, सस्ती और सुलभ पद्धति के उपयोग में भुनाने सकता है कि हमारी प्रयोगशाला में एक परख विकसित करने की मांग की। इस पद्धति का एक संभावित सीमा हैउच्च ट्यूमर बोझ के साथ रोगियों के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग को सीमित कर सकता है जो दुर्लभ कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अपर्याप्त संवेदनशीलता। उपकला कोशिकाओं के शारीरिक या जैविक गुणों को रोजगार जो कई अतिरिक्त प्रौद्योगिकियों पर इस सीमा को कम करने और इस दुर्लभ सेल की आबादी 4 का पता लगाने और अलगाव को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित सीटीसी संवर्धन के लिए विधि नकारात्मक चयन को रोजगार; CD45 + ल्यूकोसाइट्स त्याग और CD45 कर रहे हैं - CTCs रखा जाता है। तत्वों सेल निलंबन से प्रवाह cytometry द्वारा छँटाई जब (जैसे, अलाभकारी कोशिकाओं।) - यह CD45 दूषित संभावित दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, लाल रक्त सेल बफर के उपयोग और DAPI धुंधला द्वारा nonviable कोशिकाओं की चूक महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं। इन उपायों गैर सीटीसी तत्वों CD45 दूषित नहीं है कि गारंटी नहीं दे सकता है - जनसंख्या, हमारे पिछले अध्ययनों से संकेत मिलता है कि वांछित सेल पीopulation पर्याप्त इन तरीकों 11 से समृद्ध है। यह सीटीसी आबादी की शुद्धता प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं से 3 अद्वितीय सतह मार्कर सेल एंटीबॉडी का उपयोग कर, सकारात्मक चयन के माध्यम से सुधार किया जा सकता है कि संभव है। इसके अलावा, नमूने में मौजूद उपकला कोशिकाओं की सीटीसी विविधता और संख्या EpCAM या अन्य उपयुक्त दाग उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है। कुल उपज को कम करते हुए हालांकि परिधीय रक्त नमूने के अतिरिक्त संसाधन अंततः पवित्रता को बढ़ा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में हम आसान आरोपण और विकासशील ट्यूमर की निगरानी के लिए अनुमति देता है जो पृथक CTCs के चमड़े के नीचे इंजेक्शन प्रदर्शन किया। हालांकि, चमड़े के नीचे मॉडल ट्यूमर engraftment और ट्यूमर सेल उप-जनसंख्या के नुकसान समझौता हो सकता है कि अपर्याप्त पोषण की आपूर्ति है। ऐसे succ को बढ़ाता है जो एक प्रोस्टेट microenvironment बढ़ावा देता है जो माउस प्रोस्टेट (orthotropic), और subrenal कैप्सूल इंजेक्शन के रूप में वैकल्पिक इंजेक्शन साइटोंessful engraftment और ट्यूमर विविधता को बरकरार रखता है, अन्वेषक वरीयता 1,2 के आधार पर किया जा सकता है। बेहतर, इशारा / SCID / IL2λ रिसेप्टर अशक्त (एनएसजी) के माउस मॉडल हालांकि immunocompromised चूहों (नग्न इशारा / SCID या, SCID / बेज) के अन्य उपभेदों भी सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, जेनोग्राफ्ट engraftment 12 की दर में वृद्धि करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ठोस ट्यूमर की पीढ़ी में PDX मॉडल 1 निकाली गई। सृजित PDX मॉडल क्रमानुसार passaged जा सकता है और मूल ट्यूमर विशेषताओं की स्थिरता की स्थापना की आनुवंशिक तरीकों 9-11,13 उपयोग पर नजर रखी।

व्यवहार्य प्रोस्टेट कैंसर CTCs की उच्च संख्या की वसूली रोग के मंच पर निर्भर है। CTCs उच्च मेटास्टेटिक बोझ के साथ रोगियों के रक्त से अलग कर रहे हैं जब PDX मॉडल के सफल पीढ़ी सबसे अच्छा आश्वासन दिया है। हम सफलतापूर्वक 100 से 10,000 CTCs की एक सीमा के साथ रक्त के नमूनों से PDX मॉडल उत्पन्न किया है। हमारे अनुभव में, यह अच्छी तरह से प्रशिक्षित श्रम के लिए आवश्यक हैatory कर्मियों रक्त के नमूनों से प्रोस्टेट CTCs के सफल अलगाव को आश्वस्त करने के क्रम में अक्सर प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए। हम प्रयोगशाला कर्मियों शुरू में ट्यूमर सेल लाइनों से कोशिकाओं के साथ नुकीला सामान्य स्वस्थ व्यक्तियों से रक्त के नमूनों का उपयोग करके इस प्रोटोकॉल में प्रशिक्षित किया है कि सलाह देते हैं। अभाव या प्राथमिक प्रोस्टेट कैंसर में CTCs की कम संख्या मेटास्टेटिक प्रोस्टेट कैंसर के लिए इस पद्धति के उपयोग को सीमित कर सकता है।

सीटीसी की पीढ़ी के लिए विधि बाद में आणविक प्रोस्टेट कैंसर के लक्षण, दवा स्क्रीनिंग, निगरानी चिकित्सा प्रतिक्रिया, बायोमार्कर विकास, और व्यक्तिगत कैंसर के उपचार में अन्य प्रगति सहित कई अनुसंधान अनुप्रयोगों में नियोजित किया जा सकता इस प्रोटोकॉल में वर्णित PDX मॉडल निकाली गई।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Gibco Life Technologies 11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco Life Technologies 10437-028
Penicillin Streptomycin Gibco Life Technologies 15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS) Corning Cell Gro 21-031-CM
35 µm Cell Strainer BD Falcon 352340
50 ml polystyrene conical tube Crystalgen 23-2263
Red blood cell lysing buffer Sigma R7757
DAPI Invitrogen d3571
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap BD Falcon 352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:

Veronica Rodriquez-Bravo

to:

Veronica Rodriguez-Bravo

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