Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Curry, F. R., Clark, J. F., Adamson, R. H. Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery. J. Vis. Exp. (103), e53210, doi:10.3791/53210 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ניסויים כדי למדוד את תכונות חדירות של microvessels perfused בנפרד מספקים גשר בין החקירה של מנגנונים מולקולריים ותאיים המסדירים חדירות כלי דם בmonolayers תרבית התא אנדותל ומאפייני תמורה הפונקציונליות של מיטות כלי דם שלמות. שיטה לcannulate וינקב microvessels venular של לפדר עכברוש ולמדוד את המוליכות הידראוליות של קיר microvessel מתוארת. הציוד העיקרי הדרוש כולל מיקרוסקופ intravital עם במה גדולה שונה, התומכת micromanipulators למצב את שלוש microtools שונה: (1) micropipette זכוכית משופעת לcannulate וינקב כלי-דם קטנים; (2) מיקרו-occluder זכוכית לחסום זמנית זלוף ולאפשר מדידה של זרימת מים בתנועת transvascular לחץ ההידרוסטטי נמדד, ו- (3) מוט זכוכית בוטה כדי לייצב את רקמות mesenteric באתר של cannulation. Techniq מיקרו-החסימה שונה לנדיסUE משתמש בתאים אדומים התלויים בperfusate המלאכותי כסמנים של תנועת נוזל transvascular, וגם מאפשר מדידות חוזרות ונשנות של זרמים אלה תנאי ניסוי כמשתנים והבדל לחץ האוסמוטי ההידרוסטטי וקולואיד פני microvessels נשלטות בזהירות. מדידות של מוליכות הידראוליות באמצעות ראשון perfusate שליטה, אז אחרי מחדש cannulation של אותו כלי-דם קטנים עם perfusates הבדיקה מאפשרות לזווג השוואות של תגובת microvessel בתנאים מבוקרים היטב אלה. ניסיונות להאריך את השיטה לmicrovessels בלפדר של עכברים עם שינויים גנטיים צפויים לשנות חדירות כלי דם היו מוגבלים בגלל היעדר microvessels ישר וunbranched הארוך בלפדר עכבר, אבל הזמינות האחרונה של החולדות עם שינויים גנטיים דומים באמצעות הטכנולוגיה / Cas9 CRISPR צפויה לפתוח אזורים חדשים של חקירה שבו ניתן ליישם השיטות שתוארו במסמך זה.

Introduction

Microperfusion בכלי הדם כרוך בהקמה מבוקרת זרימה של perfusate המלאכותי של הרכב ידוע באמצעות micropipette בכלי דם בדרך כלל פחות מ -40 מיקרומטר קוטר. כלי perfused נשאר בסביבת הרקמות הנורמלית שלה, והוא perfused עם הדם של החיה עד למועד cannulation. הפועל בשיתוף עם מגוון רחב של הדמיה וידאו או טכניקות fluorometric, בmicroperfusion האתר מאפשר מדידה של מים זורמים ומומס פני קירות microvessels בתנאים בהם הכוחות המניעים לזרמים אלה ידועים ותכונות החדירות של כלי דם הקיר יכולות להיות העריך באופן ישיר. יתר על כן, על ידי שליטה על הרכב הנוזלים המקיפים את כלי-דם קטנים ברקמות (perfusate וsuperfusate), הרגולציה של חדירות כלי-דם קטנים ובשערי חליפין יכולה להיחקר על ידי הפעלת תאי האנדותל המרכיבים את קיר כלי-דם קטנים להיחשף למגוון רחב של דוארתנאי xperimental (אגוניסטים, תנאי זלוף שונה, אינדיקטורים ניאון כדי למדוד את הרכב תאיים ואיתות) לתקופות שנמדדו בדיוק זמן (שניות לשעה). בנוסף, הערכות ultrastructural או cytochemical של מבנים מולקולריים תאיים מפתח המסדירים את המחסום יכולות להיחקר באותו microvessels בי חדירות נמדדות ישירות. הגישה ובכך יוצרת גשר בין החקירה של המנגנונים התאיים ומולקולריים לשנות תפקוד מחסום אנדותל בתרבית monolayers אנדותל תא והחקירה בmicrovessels שלמה. ראה את הביקורות להערכה נוספת 1-6 הבאה.

הגבלה של microperfusion היא שניתן להשתמש בו רק במיטות כלי דם, כי הם דקים, שקופים ויש לי שלמות מבנית מספיק כדי לאפשר cannulation עם micropipette זכוכית. בעוד חקירות מוקדמות משמשות microvessels צפרדע בלפדר ומטר אנגינה עורית דקuscle 7,8, בהרבה ההכנה הנפוצה ביותר במודלים של יונקים היא לפדר עכברוש 9-15. רוב החקירות התמקדו בשינויים חריפים בחדירות כלי דם למדו על פני תקופות של 1-4 שעות, אבל יותר חקירות האחרונות הורחבו למדידות על כלי פרט 24-72 שעות לאחר זלוף ראשוני 12,16. הטכנולוגיה שפותחה לאחרונה CRISPR, אשר מבטיחה להפוך את המודלים של עכברים מהונדסים גנטי יותר זמינים ללימוד תקנת חדירות כלי דם 17 צריכים לאפשר השיטות שתוארו בתקשורת זה להיות מיושמת בmicrovessels venular של לפדר במודלים של העכברים חדשים החשובים אלה.

השיטה דורשת מיקרוסקופ הפוך מצוידים בבמת מיקרוסקופ נבנה מותאם אישית גדולה מספיק כדי להכיל שתי הכנת בעלי החיים ולפחות שלוש micromanipulators משמשת לmicrotools העמדה קרוב לכלי perfused וליישר micropipette זלוף עם הכלילומן. לדוגמא פלטפורמה מותאמת אישית לבמת מיקרוסקופ XY (כ -90 × 60 סנטימטרים) יכולה להיות מפוברקת מפלדה בעובי 1 סנטימטר עם ציפוי חלודה הוכחה. השלב מחובר לשולחן מדד הנדסה או שתי שקופיות יונה-זנב רכובים בזוויות ישרות ונתמכות על עמודי טפלון או העברות כדור לתנועה במישור האופקי. אסדה טיפוסית (ראה איור 2) יש הרבה מן המשותף עם ציוד מיקרוסקופ וmicropositioning משמש למגוון רחב של ניסויי זרימת דם intravital כגון אלה כדי למדוד את זרימת דם חד כלי והמטוקריט, אספקת חמצן מקומית על ידי microvessels דם perfused, רגולציה של חלק בכלי דם טונוס שרירים, והצטברות כלי הדם המקומית של קליעים נותבים ניאון הוזרקו לכל מחזור. 18-26

ההיבט הבסיסי של הטכניקה הוא המדידה של נפח זרימה (J v) על פני שטח מוגדר שטח (S) של קיר כלי-דם קטנים. כדי להשיגזה באמצעות הטכניקה לנדיס שונה שתוארה במסמך זה מיקרוסקופ ההפוך פשוט הוא נאות. מצלמת וידאו קטנה היא רכובה על נמל התמונה ואות וידאו, עם בסיס זמן הוסיף, מוצג על צג וידאו ונרשם גם בצורה דיגיטלית במחשב או כאות דיגיטלית או אנלוגי במצלמת וידאו. ברגע שהכלי-הדם הקטן הוא cannulated החלק מהכלי-הדם הקטן הגלוי למצלמה ניתן לשנות על ידי הזזת הבמה ומניפולטורים כיחידה מבלי לשבש את cannulation.

מדידה של תזרימי transvascular יכולה גם להיות משולבת עם חקירות מפורטות יותר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוחכם עם מסננים מתאימים כגון אסדות המשמשות למדידות של חדירות מומסות, ניטור יחס ניאון של סידן cytoplasmic או מנגנונים תאיים אחרים, והדמיה confocal 6,12,13, 27. יתרון עיקרי של כל גישות microperfusion הוא היכולת לבצע מדידות חוזרות, על אותו הכלי, תחת שינוי מבוקר של כוח מניע כגון לחצים ההידרוסטטי וoncotic, או שינוי מושרה בתגובות כלי למצבים דלקתיים. העיצוב הנפוץ ביותר הוא השוואה לזווג של מוליכות הידראוליות נמדדו (עמ 'יב) באותו כלי עם הכלי perfused הראשון באמצעות micropipette מלא perfusate שליטה והשעית התא האדום להקמת מדינת חדירות תחילת המחקר, ולאחר מכן עם טפטפת שני עם סוכן מבחן נוסף לperfusate. cannulations מרובה אפשרי עם המחזור חזר לאחר reperfusion עם פיפטה השליטה.

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את cannulation וmicroperfusion של כלי venular בלפדר עכברוש להקליט והנתיבים מים על פני קיר כלי-דם קטנים ולמדוד את p L של קיר הכלי, מדד שימושי של החדירות של המסלול המשותף למים ומומסים פני שלם מחסום אנדותל. ההליך נקרא techniq נדיס שונהUE כי העיקרון המקורי לנדיס של שימוש בתנועה היחסית של תאים אדומים כמדד להחלפת נוזל transvascular לאחר זלוף חסום נשמרה 28, אבל מגוון של תנאי ניסוי (למשל, הבדלים בלחץ ההידרוסטטי oncotic ואלבומין פני קיר כלי-דם קטנים) זמין לאחר microperfusion הוא הרבה יותר גדול מאשר בmicrovessels דם perfused uncannulated 8,29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים.

1. ייצור ראשוני של Micropipettes, Restrainers, וחוסמים

  1. משוך כמה צינורות נימי הזכוכית בורוסיליקט נקיים במחצית באמצעות חולץ אלקטרוני מותאם כך, כאשר משכו, החלק המתוח של הצינור הוא כ 1 ס"מ האורך ושני חצאים הם סימטריים במידה מסוימת. ודא שלהתחדד עולה בקנה אחד עם הממדים באיור 1. השתמש בשני חצאים לmicropipettes, restrainers וחוסמים.
    1. פוע micropipettes באמצעות גלגל שחיקה אוויר מונע 30 עם 0.5 מיקרומטר נייר מחוספס רחץ במים. הגדר את הזווית של בעל micropipette כך שזה בערך 30 מעלות מאופקיות.
    2. ביסודיות לשטוף ולייבש את micropipettes באמצעות יניקה למשוך אצטון הנקי באמצעות הקצה ועד הפיר. בדוק את micropipettes (איור 1 א) באמצעות מיקרוסקופ זקוף קטן עם 4 × 40 × מטרות מצוידות בבעל micropipette קליפ התנין וreticle עינית.
    3. micropipettes בחר עם פתיחת טיפ כ -50 מיקרומטר ארוכים עם שיפוע שאורכו / רוחב יחס הוא בין 3.1 ו -3.5 ועם נקודה בחדות מחודדת אשר מסייעת לחדור את סיבי הקולגן הקשים בלפדר.
    4. אחסן 15-20 micropipettes בגדלים שונים מעט בתיבה נטולת אבק.
  2. הפוך restrainers באמצעות צינורות נימים משכו מוכנים בשלב 1.1). החזק צינור נימי זכוכית משך זמן קצר ליד microflame כדי ליצור קצה קהה (איור 1). אחסן כמה בקופסא ללא אבק.
  3. הפוך microoccluders באמצעות צינורות נימים משכו מוכנים בשלב 1.1). החזק צינור נימים משך תחת microflame ועדינות לכופף (באמצעות מתאם צינור, למשל., 23G) טיפ הנאה (כ 4 מ"מ מקצה) כדי להפוך את הזווית של קרוב ל 120 מעלות לפיר (

2. הכנת בעלי חיים וניתוח

  1. הרדימי זכר (350-450 גר ') או Sprague-Dawley חולדות נקבות (200-300 גרם) עם נתרן pentobarbital (80-100 מ"ג / קילוגרם, סיגמא אולדריץ, P3761) באמצעות הזרקה תת עורית; להגן לפדר על ידי לא באמצעות זריקת intraperitoneal.
  2. לאורך ניתוחים ופרוטוקולים ניסיוניים, לשמור על הרדמה על ידי זריקות משלימות (30 מ"ג / קילוגרם) לפי צורך. לקבוע עומק ההרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הבוהן או קרני. לאחר השלמת ההליך ניסיוני, להרדים את העכברוש באמצעות מנת יתר של pentobarbital או הזרקה תוך לב של אשלגן כלורי רווי בהרדמה.

3. להכין פתרונות ואריתרוציטים לשימוש כסמני זרימה

  1. הכן את הפתרון של רינגר היונקים לsuperfusate ופתרון perfusate השליטה (בדרך כלל הפתרון של רינגר המכיל 10 מ"ג / מיליליטר חומצת שומן יונקיםאלבומין החופשי שור בסרום, BSA).
    1. perfusate סינון באמצעות מסנני מזרק 0.2 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים זעירים שעלולה לחסום את קצה micropipette; לסנן לתוך מיכל נקי קטן.
  2. הכן אריתרוציטים על ידי ציור על 0.2 מיליליטר דם מוריד הזנב של העכברוש הרדים למחט 20G במזרק קטן המכיל 0.05 מיליליטר הפרין (1000 U / ml) ולהעביר לצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות המכיל כ -14 פתרון של רינגר יונקים מ"ל פתרון .
    1. צנטריפוגה לארוז בעדינות תאים אדומים (כ 200 גרם × מקסימום 7 דקות). לצייר את supernatant מחדש להשעות את התאים האדומים בפתרון של רינגר.
    2. לאחר צנטריפוגה והסרת שלוש פעמים supernatant לעזוב את התאים אדומים ארוזים בחלק התחתון של הצינור לשימוש מאוחר יותר. שים לב שהליך זה מפחית טסיות perfusates הסופי פחות מ -0.1% מרמות נורמליות 31.

4. מסדרים את רקמות בבעלי החייםמגש

  1. לגלח את הבטן של החולדה הרדים ממתחת לטבור לתהליך xiphoid. ודא שהאזור המגולח משתרע סביב הצד הימני (לעכברוש הניח בצד ימין), כך ששיער אינו מהווה פתיל לצייר superfusate מתוך הרקמה היטב. להסיר שערות חתך עם תחבושת רטובה או רקמה.
    1. את העור עם מלקחיים משוננים בוטים ולעשות חתך מרכז-קו (ארוך 2-3 סנטימטר) דרך העור באמצעות מספריים חסון. באמצעות קנס מספריים (איריס) לעשות חתך דומה באמצעות alba Linea, הרמת דופן הבטן עם מלקחיים משוננים כדי למנוע נזק למעי.
    2. עם בעלי החיים בצד השני שלה על המגש של בעלי החיים, משוך בעדינות את הבטן מחלל הבטן באמצעות החלת כותנה שקצה (עץ מקל) ספוגה בתמיסת רינגר ומלקחיים משוננים בוטים. מסדרים את הבטן ברקמה כל כך טוב שלפדרו מונח על העמוד לצפייה מבעד למיקרוסקופ לטפל כדי למנוע נגיעה לפדר (potentially נזק microvessels) עם או מלקחיים או כותנה.
      הערה: מגש בעלי החיים (איור 2 א) ניתן לבנות מפלסטיק ודורשת רקמות היטב (למשל, קוורץ המלוטש בערך 2 סנטימטרים קוטר 5 מ"מ וגבוה.) (כ -3 מ"מ עמוק), עמוד ברור אופטי, וכרית חימום הותאם כדי לשמור על הטמפרטורה של בעל החיים. העובי של העמוד לא יעלה על מרחק העבודה של המטרה.
  2. מקם את מגש בעלי החיים על הבמה מיקרוסקופ כדי שלפדר גלוי דרך העיני.
  3. מקם קו טפטוף כובד-הפד Superfuse לפדר עם הפתרון של רינגר היונקים שמרו על 35-37 מעלות צלזיוס ברציפות. השתמש פדה גזה להחזיק הבטן במקום, לעזור לשמור על לחות, ופתיל הפתרון של רינגר העודף מעל פני השטח. התאם את הזרימה ולשאוב את השפכים כדי לשמור על עובי superfusate עקבי.
  4. לזהות microvessels venular היעד, שהםמגזרי unbranched במורד הזרם של זרימה מתכנס, ענפים אחד או שניים דיסטלי לנימים האמיתיות. מצא את כלי unbranched (באופן אידיאלי, 600 עד 1,000 מיקרומטר באורך) שיש זרימת דם מהירה וחופשית של תאים לבנים דבק על קיר הכלי.
  5. מקם את כלי-דם קטנים מבחן במרכז שדה מיקרוסקופ ולעבור עוצר לעמדה בסמוך לאתר cannulation בחר.

5. מילוי micropipette והר במחזיק

  1. רק לפני cannulating, להשעות את התאים האדומים בperfusate. להוסיף 7 μl של תאים אדומים ארוזים 0.5 מיליליטר perfusate במבחנה ורוסיליקט נקייה. הערה: Hematocrits של 1-3% יכול לשמש, אבל המטוקריט עקבי יביא לריכוזי perfusate עקביים של כל חומרים שוחררו מהתאים האדומים.
  2. להתאים מזרק 1 מיליליטר עם מתאם צינור 23G וצינורות PE 50 (אורך סנטימטר 5-15). צייר את תערובת perfusate / אדום התא לתוך המזרק. הפוך מזרק לערבב ולגרש את כל הבועות מצינורות ומתאם. להתייעלות, צינורות לנכון כמה מזרקים לפני תחילת הניסוי ולשמור אותם בקופסא ללא אבק או שקית ניילון.
  3. מלא את micropipette על ידי קידום צינורות לתוך הסוף הגדול של micropipette עד שנוגע באזור המחודד. החל לדחוף מהיר עדין על בוכנת המזרק כדי למלא את קצה micropipette. הערה: זרם או טיפה זעיר צריך להיות גלוי בקצה לראיות מילוי מלא.
  4. למשוך את צינורות תוך דחיפה קלה על הבוכנה כדי למלא את החלק הרחב יותר של פיר micropipette. הסר בועות קטנות בפיר הרחב על ידי מצליף פיר micropipette בזהירות. הערה: הליך דומה כבר מאויר 32.
  5. מניחים את micropipette לבעל פיפטה עם יציאת צד המאפשר חיבור רציף לנוזל מד לחץ מים. ודא שבעל, שמצורף לדיסק הידראולי משמש לשליטה קידום יפה מאוד של micropipette, הוא בזווית קלה (15-25 מעלות)לאופקי כך שהקצה של להתחדד micropipette לא פגע בבטן או מגש.
  6. הר הכונן ההידראולי על micromanipulator ניד, שבו יש x, y, z וכוננים כדי לאפשר קרוב יישור לכלי בדיקה (איור 2).
  7. התאם את הלחץ ההידרוסטטי להחיל את הנוזל בmicropipette באמצעות מזרק או הנורה גומי מלא מים כדי לשנות את גובה נוזל בעמודת המים של מד הלחץ לכ -40 CMH 2 O מעל לפדר.
  8. Cannulate כלי-דם קטנים בהקדם האפשרי לאחר מילוי פיפטה; תאים אדומים ליישב לתחתית של פיפטה, כך שלאחר כ -40 דקות מעט מאוד תאים אדומים יזרמו לתוך הכלי.

6. מדידת לחץ Microcannulation וכלי הדם

  1. לפני מיצוב micropipette המלא תחת מיקרוסקופ, לחץ בעדינות על עוצר את הרקמה ליד כלי-דם קטנים הפעלת כוח מספיק כדי אחיזת הרקמה. צייר אתעוצר בחזרה, מעט מתיחת הרקמה בקנה אחד עם כלי-דם קטנים, כך שהלחצים בסיבי קולגן mesenteric מיושרים עם הכלי.
    1. יישר את micropipette עם הכלי ולהוריד אותו לעין דרך העיני. הנח את הקצה רק במעלה הזרם של אתר cannulation נבחר ומוריד אותה אל הרקמה, כך שהוא חוסם באופן חלקי זרימה בתוך הכלי, אבל לא לחסום אותו.
  2. Cannulate הכלי על ידי הנהיגה קצה פיפטה לאט לתוך לום הכלי באמצעות הכונן ההידראולי. היזהר שלא לדחוף דרך הצד התחתון של כלי השיט.
    הערה: כmicropipette נכנס ללום, perfusate מהירות שוטף את הדם בכלי מחוץ ללום וperfusate חופשיות זורם לתוך דיסטלי מחזור של בעלי החיים לכלי-הדם הקטן מבחן, עקירת חלק מזלוף הדם הנורמלי בכלי מורד הזרם.
  3. מנמיכים את לחץ זלוף על ידי התאמת מד הלחץ עד הדם (כפי שמצויןעל ידי התאים האדומים של בעלי החיים) נמשך בחזרה למגזר perfused; זה קובע את לחץ האיזון שבו התאים האדומים בעדינות להתנדנד בלומן הכלי ומודד את הלחץ ההידרוסטטי כלי-דם קטנים (P ג) בקצה הדיסטלי של מגזר כלי-דם קטנים. לשמור זלוף כלי בכל הלחצים מעל לחץ איזון זה.

7. Microocclusion ואיסוף נתונים

  1. שלב אופציונאלי: לפני השימוש במייקרו-occluder לחסום את הכלי, לחץ עליו לתוך הרקמה באזור בשימוש שאינו של לפדר רחוק מכל כלי, כך שהקצה מצטבר כרית קנס של רקמה שמגנה על הכלי הניסיוני במהלך מייקר חזר חסימות.
  2. מניחים את החוסם מעל כלי perfused ליד הקצה התחתון של שדה מיקרוסקופ.
  3. רשום את הבא עם וידאו ואודיו.
    1. מילולי להקליט את מיקומו של האתר ולחסום קצה המסך נמוך יותר כפי שניתן לראות בreticle העינית.
    2. עם טיפשל החוסם ממוקם בדיוק מעל כלי-דם קטנים, להשתמש בשליטת z הקנס של micromanipulator להוריד בעדינות את החוסם עד הזרימה בכלי הוא יחסום. שים לב ללחץ מד הלחץ (P ג) באודיו. החל חסימה בדרך כלל עבור 3-10 שניות, ולאחר מכן שחרר, שחזור זלוף החופשי. הזז את האתר לחסום את כלי לעבר קצה פיפטה ב5-10 מיקרומטר צעדים המבוססים על זמן (> 5 דקות אחרי בלוק ראשוני באתר), מספר החסימות (3-5), כדי למנוע נזק קיר כלי באתר הבלוק .

8. ניתוח של נתונים ומדידה של p L (חדירות מים)

  1. במהלך הפעלת וידאו, לקבוע את המרחק הראשוני (ℓ 0) מתא אדום סמן לאתר החסימה על ידי שימוש בתמונה של מיקרומטר במה והעמדות הידועות על התמונות. לקבוע את המהירות ההתחלתית (dℓ / DT) של תא הסמן מתפקידו בכמה מסגרות בשנייה 3-10 של תמונות שתועדו. להרתיעשלי רדיוס הכלי (r) מהתמונות שצולמו במהלך חסימה (איור 3).
  2. לחשב J נ / S עבור כל חסימה כ× (dℓ / DT) (1 / ℓ 0) × (R / 2). חישוב p L בלחץ מתמיד כ( v J / S) מחולק בלחץ הנהיגה (לחץ כלי-דם קטנים - לחץ האוסמוטי קולואיד יעיל; ראה דיון).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 4 מראה את התוצאות מהמדידה במהלך השינויים בעמ L הזמן בחולדת venular microvessel cannulated ברציפות עם ארבע perfusates. 33 עמ 'גודל L מחושב בלחץ מתמיד שימש כמדד לשינויים בקיר חדירות כלי-דם קטנים, ראשון במדינה עם שליטת perfusate המכיל 1% אלבומין בסרום שור לאחר מכן כאשר כלי נחשפו לברדיקינין הסוכן הדלקתי (BK) באמצעות micropipette שני מכיל 10 ננומטר Bk. ברדיקינין גרם לעלייה חולפת בעמ L שחזרה לכיוון ערך שליטה דקות 10-15 שלאחר מכן. הספינה אז מחדש perfused עם perfusate שליטה למשך 30 דקות כדי להקים מחדש בסיס יציב. כאשר כלי-דם קטנים היה perfused באמצעות micropipette רביעי עם אותו הריכוז של Bk כמו גם 1 מיקרומטר sphingosine-1-phospate (S1P) בperfusate, התגובה לBk הוחלשה באופן משמעותי. מידתהנחתה כאשר Bk וS1P היו perfused באותו הזמן נמצאה דומה לזה שנמדד בניסויים אחרים שבי S1P התווסף לperfusate עד 20 דקות לפני החשיפה לBk. תוצאות אלו מראות את הכח של יכולת לבצע מדידות מרובות של p L בכלי אחד, ולהראות שהפעולה של סוכן כגון S1P לייצב את קיר הכלי בנוכחות סוכן דלקתי יכולה להיפתר לתקופות זמן ב בסדר הגודל של כמה שניות. בכלים נפרדים מחקרי שליטה בוצעו בפרוטוקול דומה בהעדר S1P להראות שההנחתה של תגובת Bk לא הייתה בשל אנפילקסיס.

עבור חלק מעיצובים ניסיוניים חשוב להעריך גם את ההשתקפות מקדם המומס למקרומולקולה (σ) ועמ 'L. המטרה זו מושגת על ידי מיטב מדידת J v בלחצים מרובים בכל כלי-דם קטנים בודד. איור 5 מראה ניסוי שn ששני p L והלחץ האפקטיבי oncotic של אלבומין 5% בperfusate (π אלבומין = 27 CMH 2 O על 37 מעלות צלזיוס) נאמד בתנאים בם לא היה אלבומין ברקמות המקיפות את כלי-דם קטנים חולדה. באלה נ J ניסויים / S נמדד בשלושה לחצים שונים. P L הוא השיפוע של הקשר בין J נ / S ולחץ, וליירט על ציר הלחץ הוא הבדל לחץ oncotic היעיל על פני קיר הכלי (σΔπ).

איור 1
איור 1. Microtools לטפטוף של microvessels הבודד. () Micropipette לcannulation של microvessels עכברוש עם קצה משופע. (ב) עוצר להחזקת רקמה לפדר יציבה בסמוך למקום cannulation. (ג) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. אסדת Intravital לmicroperfusion. שלב מתכת גדול סקירה של מגש חיה עם micromanipulators וmicrotools אוריינטציה על עמוד זכוכית (). (ב) רכוב על שולחן הנדסה ומסבי תמיכה. (ג) מורדם עכברוש עם microtools בעמדה לmicroperfusion של כלי-דם קטנים. נוף לסגור (D) של לפדר במהלך ניסוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figu זה מחדש.

איור 3
מדידת איור 3. של קצב סינון ליחידת שטח באמצעות טכניקה לנדיס שונה. סכמטי זה מראה כלי-דם קטנים אחת cannulated עם micropipette ומוט מיסוך ממוקם מעל הכלי. מייד לאחר הגורם לחסימת כלי-דם קטנים, המרחק (ℓ 0) בין הסמן RBC נוסע באמצע של כלי-דם קטנים החסום ואתר החסימה נרשם כך שמסלול התא יכול להיות במעקב במשך 5-10 שניות לאחר חסימה. העמדה הראשונית (ℓ 0) ומהירות ההתחלתית (dℓ / DT) של התא משמשים לחישוב קצב הסינון הממוצע ליחידת שטח של קיר כלי-דם קטנים בין תא הסמן והאתר של חסימה. Microoccluder לאחר מכן העלה, וזלוף החופשי הוקם לפני מדידות נוספות עשויות.com / קבצים / ftp_upload / 53,210 / "target =" _ 53210fig3large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
4. נציגי נתונים איור מראים כי sphingosine-1-פוספט עיכוב (S1P) פועל מהר מאוד ברדיקינין (BK; 10 ננומטר). גרם לעלייה חולפת בעמ L כלי-דם קטנים. S1P מיושם כמו במקביל לברדיקינין השני מבחן (BK) מעוכב החריפה Bk התגובה ביחס לBk הראשון. נתונים אלה מראים כי הזמן של חשיפה לסוכן בדיקה יכול להיות שונה כדי להעריך את קינטיקה של הפעלה של תגובה מעכבת. באופן ספציפי, S1P מיושם במקביל רק עם Bk מאוד עכבות תגובת Bk. S1P היה 1 מיקרומטר וBk היה 10 ננומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.


איור 5. מדידה של J נ / S בלחצים מרובים מאפשר שני p L ולחץ oncotic היעיל כדי להימדד. שטף הסינון, J נ / S, נמדד בכלי זה בלחצים ההידרוסטטי microvessel שונים במהלך זלוף עם BSA (50 מ"ג מיליליטר - 1; π = 27 CMH 2 O) ואילו לפדר היה שטוף עם הפתרון של רינגר ללא חלבון. השיפוע של הקשר בין J נ / S ולחץ הוא p L וליירט על ציר הלחץ מציין את הבדל לחץ oncotic היעיל על פני קיר הכלי. בניסוי זה Lp היה 1.2 × 10 -7 (שניות סנטימטר -1 CMH 2 O -1) וσΔπ היה 24 CMH 2 O. <href = יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרטים של חישובי p L. למרות שתנועת נוזל transvascular מתרחשת בזמן שהספינה היא perfused בחופשיות, משא ומתן כזה הוא קטן מכדי להימדד בזלוף החופשי משום שהוא בדרך כלל פחות מ 0.01% משיעור זלוף הכלי. עם זאת, כאשר זלוף הוא נעצר על ידי הגורם לחסימה זמני כלי-דם קטנים, זרימת transvascular (כלומר, סינון) נמדד מהתנועה של תאים אדומים סמן בלומן כטור של נוזל בין תאים אדומים סמן והאתר של חסימה מקצר כפי שמוצג ב איור 3. בהתאם למורכבות ואורכו של פרוטוקול ניסוי כלי unbranched נדרש 600 עד 1,000 מיקרומטר באורך.

כאשר הכלי לא יחסום ולחץ מד הלחץ הוא נוהג זרימה דרך כלי-דם קטנים, הירידה בלחץ על פני קצה פיפטה היא גדולה כל כך שלחץ כלי-דם קטנים בזלוף החופשי הוא בדרך כלל רקכמה CMH 2 0 מעל הלחץ במורד הזרם. לעומת זאת, במהלך חסימת הירידה בלחץ על פני פיפטה היא קטנה מאוד בשל נוזל שנכנס לאט לומן הכלי להחלפת סינון נוזלים מעבר לקיר הכלי. כך במהלך חסימת הלחץ ההידרוסטטי בלומן הכלי (P ג) שווה סט שעל ידי מד הלחץ. לחץ oncotic ברקמת mesenteric הוא זניח, ולכן מייד לאחר חסימה, תנועות נוזל transvascular מתאי סמן אדום נמדדות בי הלחץ ההידרוסטטי ידועה ולחץ oncotic בלומן הכלי שווה לזה שנקבע בperfusate. עם מדידות רצופות של p L, אורך כלי הולך לאיבוד בכל פעם שאתר הבלוק מתקדמת. בנוסף, recannulation רצוף מפחית אורך כלי זמין.

זרימת נוזל transvascular ליחידת שטח של קיר כלי (v J / S) מוערכת מהשיעור שאורך מדוד של עמודת מים בmicrovלומן Essel בין תא אדום סמן ואתר החסימה או מקצר (סינון נטו) או מתארך (ספיגה נטו). ההנחה היא שהתאים אדומים ניטראלי קלילים נעו לאורך האמצע של לומן הכלי ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ממוצע המהירות של עמודת המים המקיפה את התא (היחס של מהירות תא אדומה לאומרת מהירות מים קרוב ל -1.8 למיקרומטר 6 תא אדום בכלי 30 מיקרומטר קוטר). 8,14 לכן, אם המהירות של תא סמן (במיקרומטר / sec) לקראת החוסם היא מיקרומטר / sec V במהלך 2-5 שניות הראשונות לאחר חסימה, ואת רדיוס הכלי הוא r, נפח הנוזל המסונן על פני קיר כלי-דם קטנים בין שהתא אדום והאתר של החסימה (v J) הוא πr 2 V מיקרומטר 3 / sec בהנחת כלי-דם קטנים הוא גלילי. נוסף על השטח של כלי-דם קטנים גלילי (S) בין שתא הסמן ואתר החסימה הוא 2πrℓ, בי ℓ הוא המרחק הראשוני בין תא הסמןואתר החסימה. כך הזרימה הממוצעת הראשונית transvascular ליחידת שטח (J v / S) בלחץ שנקבע על ידי מד לחץ המים Vr / (2ℓ).

ההערכה הפשוטה של p L הכלי נעשתה אם לחץ oncotic של perfusate נקבע נמוך יחסית ללחץ הדם הקטן (בדרך כלל 3.6 CMH 2 O, לחץ oncotic של אלבומין בסרום שור בריכוז של 10 מ"ג / מיליליטר ונימים לחץ גדול יותר מאשר 30 CMH 2 O). p L מחושב כ( v J / S) / H (P ג -3) סנטימטר / sec / 2 סנטימטר O כי ההשתקפות מקדם אלבומין (σ אלבומין) במדינת השליטה הוא קרוב ל -0.9. עם שינויים מהירים בגישה זו בעמ 'L עם רזולוציה של סדר 1 דקות זמן ניתן למדוד על ידי הקמת זרימה חופשית בין צעדים הרצופים של J נ / S בלחץ קבוע, כפי שמוצג בתוצאות הנציג באיור 4. IG הגישה מעלnores שינויים קטנים בלחץ oncotic של אלבומין אשר נופלים על פחות מ 1 CMH 2 O כאשר ההשתקפות מקדם נופל מתחת 0.5, אבל הטעות בהערכה של p L נשארה פחות מ -5%, כאשר P c הוא גדול יותר מ -30 CMH 2 O .

כאשר מדידה מדויקת של שני מקדם p L וההשתקפות נדרש, J נ / S נמדד בסדרה של לחצי כלי-דם קטנים מתחת ללחץ oncotic היעיל הצפוי של מקרומולקולה המבחן. השיפוע של הקשר בין J נ / p L S ואמצעי לחץ וליירט על ציר לחץ כאשר זרימה נטו הוא σπ אמצעי אפס (איור 5). ההפגנה שהנצחון של מי קשור באופן ליניארי ללחץ היא גם אימות חשובה של השימוש במדידות לחץ יחידים באמצעות הפרוטוקול הפשוט שתואר לעיל (איור 4) כאשר הבדל לחץ oncotic נמוך יחסית לעיתונות ההידרוסטטייור.

מקורות אפשריים של שגיאה. יש כמה בעיות שתתפשרנה מדידה מדויקת. כישלון כדי לחסום כראוי את הכלי או נזק לדופן כלי הדם בתוצאות אתר חסימה בדליפת נוזל עבר אתר החסימה, ותנועה של תאי סמן לכיוון אתר החסימה מהר יותר כי בשל חילופי transvascular. ואילו תאי סמן בדרך כלל לנוע באיטיות לכיוון אתר החסימה, אבל לא להגיע אליו, דליפה מצויינים אם תאי סמן לעקוב אחר כל הדרך לoccluder. מצד שני, אי לאטום את פיפטה לתוך לום כלי-דם קטנים באתר cannulation תוצאות בהערכה נמוכה מדי של J נ / S. דליפת נוזל מפיפטה superfusate או ללומן הכלי במעלה הזרם של אתר cannulation גורמת לירידת לחץ משמעותית על פני קצה פיפטה. כגון דליפה מזוהה כאשר תאים בזרימת קצה micropipette במהירות גבוהה יותר מאלו בlu הכלי במורד הזרםגברים של כלי השיט החסום. מיצוב מחדש זהיר של micropipette בדרך כלל חותם נזילה כזו. נושא אחר שעולה אם p L של קיר הכלי אינו אחיד, בדרך כלל שיש עם אתר אחד או יותר של נזק או דלקת מקומיות. תאי מרקר לעקוב אחר לאתר אם רוב זרימת transvascular מרוכזת שם. תנועת תא אדומה עדיין מודדת זרימת transvascular, אבל v J המדד / S הוא לא נציג של רוב קיר האזור בתוך מגזר המבחן.

משמעות של השיטה ביחס לשיטות קיימות. שתי שיטות הנפוצות ביותר לחקור את הרגולציה של חדירות מחסום אנדותל ותמורת transvascular הם (1) במבחנה מדידה של תמורה פני monolayers תא האנדותל בתרבית ו( 2) מדידת ההצטברות נותב ב דגימת רקמה לאחר נותב מוזרקת לוריד לכל בעלי החיים. ניסויים בmonolayers תא אנדותל בתרבית favored כי התפקודים התאיים יכולים להיות שונה באופן ישיר יותר ויש חומר מספיק סלולארי זמין להערכה מפורטת של אירועים מולקולריים בתאי האנדותל. עם זאת ברוב תנאי תרבות תאי האנדותל בדרך כלל לא מהווים את נציג המחסום של חדירות כלי דם בגוף חי. הטכניקה לנדיס שונה שתוארה לעיל הוכחה להיות טכניקה חזקה ואמינה כדי לחקור את הרגולציה של תפקוד מחסום אנדותל בmicrovessels venular שלמה. בידיו של חוקר מנוסה לזווג מדידות של חדירות בתנאי בקרה ובדיקה שבו חלק מהגישות משמשות בתרבית תאים (לדוגמא, הדמיה של מרכיבים תאיים, שינוי של מסלולי איתות) יכול להיות מיושמת. החשיבות של ניסויים בmicrovessels שלמה הודגמה על ידי הצגת הבדלים משמעותיים בין המנגנונים המווסתים את חדירות מחסום בmicrove perfused בנפרדssels ואלה לעתים קרובות מתוארים בmonolayers אנדותל בתרבית. דוגמאות כוללות תגובות לגזירה, חשיפת תרומבין, ותרומה של מנגנוני התכווצות להיווצרות פער דלקתי 2-6,9,16. מדידות של הצטברות נותב במיטת כלי דם שלמה משמרת פונקציה יותר נורמלית פיזיולוגית אבל חקירה ישירה של שינויים אמיתיים בחדירות כלי דם נמצאים בסכנה בגלל הצטברות נותב עשויה להגדיל כתוצאה מטפטוף מוגבר (הגדלת שטח פנים לחליפין) עם או בלי עלייה ב חדירות של הקיר. כך המידה של עליית חדירות ניתן להפריז בחשיבותו כאשר התרחבות מגדילה את מספר כלי perfused ובכך סך צבירה מומסת היא גדולה יותר מזה בשל עלייה בחדירות כלי דם לבד 34.

יישומים עתידיים. המגוון הרחב של אפשרויות לשנות מבנה ותפקוד תאיים באותם תנאים כמו חדירות של הזמנה אישיתכלי vidual הוא ישירות נמדדו במהלך microperfusion צפוי להגדיל. יתר על כן צפוי כי היישום של השיטות בלפדר עכברוש מהונדס גנטי עשוי לפתור בעיה לטווח ארוך שקיימת כבר עכברים מהונדסים גנטי. באופן ספציפי, כאשר עכברים מהונדסים גנטי הפכו זמינים זה היה צפוי שmicroperfusion ניתן יהיה להרחיב לחקור microvessels בכלי mesenteric. בעוד כמה ניסויי microperfusion הושלמו בmicrovessels של לפדר עכבר 35, יש לי עכברים בדרך כלל פחות microvessels ברקמת mesenteric מאשר חולדות, והכלים האלה הם בדרך כלל קצרים ומסועפים מאוד, בניגוד ל(> 500 מיקרומטר) כלי ישר יותר מתאימים יותר ש ניתן למצוא בחולדות. כך ניסויים לחקור האפנון של חילופי transvascular בגנטי עכברים יש לסמוך על מבחני כמו מיילס 34 או הניסויים נותב תובעניים מבחינה טכנית, אבל אמין יותר שמידהשינויים בשני כלי דם והצטברות extravascular של ניאון של בדיקות בדיקת radiolabelled 36.

שינויים בשיטה. בפרוטוקולים לעיל, שינויים בהרכב perfusate נדרשו שינוי של micropipettes. גישה חלופית היא למלא micropipette באתר באמצעות מנגנון מילוי. הליך זה הושג כמתואר בפירוט 37. המגבלה היא שהזמן לשנות את ההרכב של perfusate בפיפטה הוא לא מהר כמו שהושג על ידי החלפת פיפטה, אבל ההליך הוא שימושי במיוחד אם יש צורך perfuse כלי-דם קטנים לפרקי זמן ארוכים.

אותו microperfusion פנה ניתן להאריך למדוד מקדמי חדירות לכותרתו fluorescently מומס 31,38-40. במקרה זה micropipette קנה אחד מוחלף על ידי כפול (תטא) קנה פיפטה 41 והספינה היא perfusedלסירוגין עם מומס ניאון מבחן למדידה יחסי הצטברות רקמות ללומן תוכן, ואותו perfusate ללא מומס הניאון כדי לנקות את הרקמה ומאפשר מדידה חוזרת ונשנית של הצטברות מומסת. כאשר מדידות של מים זורם transvascular הן להיות בשילוב עם מדידות של מקדם חדירות מומס באמצעות מומסים מבחן שכותרתו fluorescently, אינדיקטורים ניאון של הרכב תאיים, או הדמיה confocal של מרכיבים תאיים, נדרש מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוקר מחשב מתוחכם יותר. מאז חקירות אלה דורשים בדרך כלל עדשות עם הגדלה גבוהה יותר ומרחק עבודה קצר בהרבה, עמוד קוורץ משמש להחזיק את לפדר הוא הוחלף על ידי להחליק את מכסה זכוכית מודבקת לתמיכת פרספקס בתוך הרקמה היטב על מגש מיקרוסקופ. הזמינות המוגברת של מדפסות 3-D, תאפשר ייצור דיוק גבוה של מגשים מותאמים אישית, אשר עומדים בסובלנות הצרה נדרשה למצב את diamete הגדולעדשות r עם מרחק עבודה קצר יותר ביחס לmicrovessels נבחרה.

הזמינות של microvessels שמישה בלפדר משתנה עם גיל, מין, ומתח. לכן, הבחירה של זן של עכברים והשימוש בזכר או נקבה יהיה תלוי בשאלות הספציפיות שפונים. עבור רבים מהמחקרים האחרונים שלנו השתמשנו חולדות זכרי Sprague-Dawley שהתאקלמו במתקן בעלי החיים שלנו בשבוע אחד לפחות לפני השימוש בסביבות גיל 3-4 חודשים שבזמן שאנו מוצאים שיש להם בדרך כלל זמינה microvessels הארוכה, ישר mesenteric. לעומת זאת, עמיתינו השתמשו בהצלחה Sprague-Dawley חולדות נקבות של 2-3 חודשים בגיל 13.

התפקיד של התאים האדומים. התפקיד העיקרי של תאים אדומים כפי שתואר לעיל היה לעקוב אחר transvascular תנועת מים בהנחת התא פעל אינרטי כ, ניטראלי אינדיקטורים קלילים של מים זורמים לאחר microvessels הייתה אטומה. בנוסף לתפקיד בסיסי זה, זהעכשיו הוא הכיר בכך שהתאים האדומים תורמים ליציבותו של המכשול על ידי אספקת S1P לperfusate כאשר אלבומין בהווה 31,42,43. ישנן מספר השלכות חשובות של תצפיות אלה. בהיעדרם של תאים אדומים או עם השימוש בזרימת אינרטי סמנים חלופיים חדירות הבסיס עשויה להיות פחות יציב. מומלצת שהמדידות של S1P צריכים להיעשות בכל perfusates משמש בניסויי microperfusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות המענקים HL44485 וHL28607.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example Olympus CK-40 try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example Leica DMIL try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example Nikon Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel welding shop this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides Velmex AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example Pulnix TM-7CN (no longer available) no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3) Prior/Stoelting (no longer available) look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way FHC 50-12-1C need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive  FHC 50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way Siskiyou Corporation MX610 (1-way) or MX630 (3-way) great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders Siskiyou Corporation MXC-2.5, MXB etc.
pin vise Starrett 162C to hold restrainer
pipette holder World Prescision Instruments MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall Quartz Scientific Inc. custom  (or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well NuSil MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W Cole Parmer EW-03125-20 heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC Cole Parmer EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out Cole Parmer EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller Sutter Instrument Company P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing Sutter Instrument Company B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II RX Honing Machine Corporation MAC-10700 Rx System II Machine alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
   with ceramic sharpening disc RX Honing Machine Corporation use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um 3M part no. 051144 80827 268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
  2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
  4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
  5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
  6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
  7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
  8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
  9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
  10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
  11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 279-H2023 (2000).
  12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
  14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
  15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
  16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
  17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
  18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
  19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
  20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
  21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
  22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
  23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
  24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
  25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
  26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
  27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
  28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
  29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
  30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
  31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
  32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. (2011).
  33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
  34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
  35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
  36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
  37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
  38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
  39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
  40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
  41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
  42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
  43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. H306-H363 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics