VDJ-SEQ: Глубокий анализ последовательности перестроенных тяжелой цепи иммуноглобулина ген Reveal Клональный Evolution Узоры клеточной лимфомой

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jiang, Y., Nie, K., Redmond, D., Melnick, A. M., Tam, W., Elemento, O. VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma. J. Vis. Exp. (106), e53215, doi:10.3791/53215 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Понимание клональность опухоли имеет решающее значение для понимания механизмов, участвующих в онкогенеза и прогрессирования заболевания. Кроме того, понимание клоновых изменения состава, которые происходят в опухоли в ответ на определенный микро-среды или лечения, может привести к разработке более совершенных и эффективных подходов к искоренению опухолевые клетки. Тем не менее, отслеживание опухолевые клоновых субпопуляций был сложным из-за отсутствия различимых маркеров. Чтобы решить эту проблему, А VDJ-след протокол был создан, чтобы проследить закономерности эволюции клоновых диффузного большой клеточной лимфомой (В-ККЛ) рецидива эксплуатации VDJ рекомбинации и соматической Гипермутационный (ГИМ), два уникальных особенностей клеточных лимфом.

В этом протоколе, следующего поколения секвенирования (NGS) библиотеки с индексирования потенциала были построены из усиливается переставить тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) VDJ области от пар первичной диагностики и рецидивов В-ККЛ SAMPле. В среднем более полумиллиона VDJ последовательности в образце были получены после секвенирования, которые содержат как VDJ перестройку и информацию SHM. Кроме того, индивидуальные трубопроводы биоинформатики были разработаны, чтобы полностью использовать информацию о последовательности для характеризации IgH-VDJ репертуара в этих образцах. Кроме того, трубопровод позволяет реконструировать и сравнение клонального архитектуры отдельных опухолей, что позволяет рассмотрение клонального неоднородности в диагностике опухолей и вычета клоновых линий развития между диагнозом и рецидивом опухоли пар. При применении этого анализа к нескольким парам диагноз рецидива, мы обнаружили ключевую доказательства, что несколько Отличительной опухолевые эволюционные модели может привести к ККЛ рецидива. Кроме того, этот подход может быть расширен в других клинических аспектов, таких, как определение минимальной остаточной болезни, мониторинга прогресса рецидивов и ответа на лечение, и исследование иммунного репертуараES в условиях не-лимфомы.

Introduction

Рак является заболеванием клональный. С тридцать лет назад, когда Питер К. Ноуэлл предложил рака клонов эволюции модель 1, многие исследования пытались вскрыть клоновых населения в образцах опухолей и реконструировать клоновых расширения и эволюции моделей, которые лежат в основе процесса онкогенеза 2. Недавно вся-секвенирование генома позволило следователям сделать глубокий взгляд на клоновых неоднородности и эволюции 3,4. Однако из-за отсутствия разрешимыми маркерами во многих типах клеток, трудно сделать вывод о точной клонального архитектуру и эволюционный путь. К счастью, есть естественный клональность маркер зрелых В-клеток, из которых многие лимфоидных злокачественных новообразований, в том числе ДВККЛ, происходят. В ответ на антигенной стимуляции, каждый В-клеток могут образовывать единую производительную последовательность IgH VDJ путем присоединения V H (переменная), А D (разнообразие), и J Н (присоединение) сегмент вместе с большим бассейном этих сегментов. В этот прocess, небольшие порции исходной последовательности могут быть удалены и дополнительные не-шаблонный нуклеотиды могут быть добавлены, чтобы создать уникальный VDJ перегруппировку. Эта специфическая VDJ перестановка может быть унаследован по всей потомства этого B-клетки, поэтому пометки индивидуальный зрелые B-клетки и ее потомства 5. Кроме того, ШМ происходит на рекомбинантных последовательностей VDJ в последующем зародышевых центров (GC) реакции вводить дополнительные мутации для расширения пула антител и повышению аффинности антител 6. Поэтому, сравнение и сопоставление VDJ и SHM модели образцов лимфомы, которые прошли эти процессы, внутри опухоли неоднородность может быть очерчен и клональной путь эволюции болезни может быть выведена.

Ранее VDJ перегруппировки и ШМ могут быть идентифицированы с помощью ПЦР амплификации рекомбинантных регионы, клонирование продуктов ПЦР, а впоследствии метод сэнгера получить информацию о последовательности. Этот подход яS низкой пропускной и низкий выход, получения лишь очень небольшую часть всей рекомбинированного VDJ репертуара, и препятствуя характеристику общей представленности клоновых населения в данном образце. Модифицированный подход был создан генерации NGS секвенирования индексированные библиотеки из продуктов ПЦР VDJ и выполнения PE 2х150 п.о. последовательности, чтобы получить более чем полмиллиона рекомбинированные VDJ последовательности на образец. Кроме того, пользовательский трубопровод был разработан для выполнения контроля качества (КК), выравнивания фильтр VDJ последовательности считывает чтобы идентифицировать и перегруппировки ГМС каждого считанного и выполнять филогенетического анализа на клональной архитектуры каждого образца. Кроме того, новый подход был создан для дальнейшего характеризуют клоновых модели эволюции для образцов, собранных на разных стадиях заболевания.

Мы применили этот метод к образцам пациентов DLBCL. В-ККЛ является агрессивная форма неходжкинской лимфомы с частыми рецидива в срок до одного-гоIRD пациентов 7. ККЛ рецидивы обычно возникают рано, в течение 2 3 лет с момента первоначального диагноза, хотя некоторые происходят через 5 лет 8. Прогноз на рецидив пациентов плохое, только с 10% достижения 3-летняя выживаемость без прогрессирования в связи с ограниченными возможностями лечения. Это является основой для настоятельной необходимости новых подходов для лечения В-ККЛ рецидив 9,10. Тем не менее, молекулярные механизмы, связанные с ККЛ рецидива по-прежнему в значительной степени неизвестны. В частности, роль клонального неоднородности в диагностике и клонального эволюции в процессе развития рецидивов В-ККЛ в настоящее охарактеризованных, что делает его трудно определить точную и полезную биомаркеров для прогнозирования рецидива. Для решения этих вопросов, мы применили наш VDJ-секвенирования подход на нескольких пар подобранных пар проб ККЛ первичный диагноз рецидива. Два различных клоновых эволюционные сценарии рецидива появились из сравнения клоновых архитектур между диагнозом и рецидивом SAMPле, что предполагает несколько молекулярных механизмов могут быть вовлечены в ККЛ рецидива.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Усиление VDJ

1.1) выделения ДНК из образцов опухолевых

  1. Извлечение ДНК из тонких срезов (10-20 мкм), замороженных ОКТ встроенных нормальных или злокачественных тканей.
    1. Дайджест 10-30 тонких срезов ткани встроенного режут криостата микротома в 4 мл лизирующего буфера нуклеиновых (0,0075 М трис-HCl, рН 8,2; 0,3 М NaCl; 0,002 М Na 2 EDTA) протеиназой К (0,5 мг / мл, конечная концентрация ) и 0,625% SDS в 15 мл центрифужную пробирку в водяной бане при 37 ° в течение ночи.
    2. Добавить 1 мл насыщенного NaCl (5 м) в обрабатываемой смеси и интенсивно встряхнуть в течение 15 сек.
    3. Центрифуга при 1100 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
    4. Передача супернатант к новому 15 мл центрифужную пробирку и добавить два тома 100% этанола.
    5. Смешать переворачивая пробирку 6-8 раз. Центрифуга при 5000 х г в течение 60 мин при 4 ° С для сбора осажденного ДНК.
    6. Промыть ДНК гранул в два раза 70% -ным этанолом. Центрifuge в 5000 мкг в течение 15 мин каждый раз собирать осадок.
    7. Растворите ДНК в 100-400 мкл ТЕ-буфера при комнатной температуре в на шейкере в течение ночи. Выход ДНК составляет от 5 до 200 мкг (конечная концентрация между 50-500 нг / мкл) в зависимости от размера ткани
  2. Извлечение ДНК из тонких срезов (10-20 мкм), фиксированных формалином, paraffin- встроенного (FFPE) нормальной или злокачественной ткани.
    1. Выдержите парафиновых срезов в 1 мл ксилола в два раза при комнатной температуре в течение 10 мин каждый раз в 1,5 мл трубки микроцентрифужных де-paraffinize. Сбор срезах тканей центрифугированием при 13000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Инкубируйте разделы в 1 мл 100% -ного этанола в два раза при комнатной температуре 10 мин, каждый раз, чтобы удалить остаточные ксилолы. Сбор срезах тканей центрифугированием при 13000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Парафин полностью растворяется в этой точке и только секция ткань остальные.
    3. Высушите разделы при комнатной Temperature в течение 10-15 мин.
    4. Делают 0,5 мг / мл протеиназы К раствора 1x ПЦР буфера (10x разбавленного из ПЦР буфера с нуклеазы без воды). Добавить раствор протеиназы К в образцах в конечном объеме 50-100 мкл на и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
    5. Тепло образцов при 95 ° С в течение 10 мин, чтобы инактивировать протеиназы К.
      Примечание: На этом этапе, образец ДНК растворяли в буфере для ПЦР и могут быть использованы на этапах 1.2 и 1.3 непосредственно. Выход ДНК составляет от 0,5 до 20 мкг (конечная концентрация между 10-200 нг / мкл) в зависимости от размера ткани.

1.2) Оценка качества ДНК

  1. Смешайте 0,25 мкл Taq ДНК-полимеразы с 45 мкл мастер смеси из коммерческого набора лестницы в ПЦР-пробирку.
  2. Добавьте 5 мкл ДНК, полученной из 1.1.1.7 или 1.1.2.5 в ПЦР-пробирку и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, по крайней мере в 5 раз.
  3. Используйте следующие условия для усиления ДНК: 95 ° C для7 мин; с последующими 35 циклами 45 секунд при 95 ° С, 45 сек при 60 ° С, 90 сек и при 72 ° С; Затем 72 ° С в течение 10 мин и выдержка при 15 ° С.
  4. Приготовьте 2% агарозном геле в ТВЕ (Трис / ЭДТА / боратном).
  5. Смешайте 20 мкл ПЦР-реакции с 4 мкл 6x красителем, и загружают на 2% агарозном геле.
  6. Пятно агарозный гель с 0,5 мкг мл этидия бромида раствор / и выявления продуктов ПЦР с системой гель воображения. Примечание: образцы, которые дают 5 продуктов ПЦР при размерах 100, 200, 300, 400, 600 и BP будут по-прежнему генерировать VDJ ампликоны.
    ВНИМАНИЕ: этидий бромид является мощным мутагенным. Обращайтесь с особой осторожностью носить защитные механизмы, т.е. перчатки, и выбросить в конкретных контейнеров в руководящих учреждения.

1.3) VDJ ПЦР

1.3.1) Усиление рекомбинированных IgH VDJ сегмента от Рамочной области 1 (IgVHFR1)

  1. Смешайте 45 мкл мастер смеси на этикетке трубкиред как "Mix 2" коммерческого соматических IGH Гипермутационный анализа для обнаружения гель комплект, 0,25 мкл полимеразы Taq ДНК, и 5 мкл образца ДНК, полученного из 1.1.1.7 или 1.1.2.5 в ПЦР-пробирку.
  2. Используйте следующие условия для усиления ДНК: 95 ° C в течение 7 мин; с последующими 35 циклами 45 секунд при 95 ° С, 45 сек при 60 ° С, 90 сек и при 72 ° С; Затем 72 ° С в течение 10 мин и выдержка при 15 ° С.
  3. Решение весь продукт ПЦР в 2% агарозном геле методом электрофореза.
  4. Пятно агарозный гель с 0,5 мкг мл этидия бромида раствор / и выявления продуктов ПЦР с системой визуализации геля. Моноклональное ампликона, как ожидается, с размером от 310-380 п.о..
  5. Вырежьте часть геля, содержащего моноклональное ампликон между 310-380 б.п..
  6. Очищают ДНК из вырезанной геля, используя стандартный набор Gel Extraction согласно протоколу производителя. Примечание: для образцов, которые FR1 фрагменты можно было бы получить, нет необходимости подробно IGVHFR2 и IgVHFR3.

1.3.2) Усиление рекомбинированных IgH VDJ сегмента от Рамочной области 2 (IgVHFR2)

  1. Смешайте 45 мкл мастер смеси из трубы, обозначенный как «Tube B" коммерческого IGH Джин Клональность анализа для обнаружения комплект гель, 0,25 мкл полимеразы Taq ДНК, и ДНК образца 5 мкл полученного из 1.1.1.7 или 1.1.2.5 в ПЦР-пробирку ,
  2. Используйте следующие условия для усиления ДНК: 95 ° C в течение 7 мин; с последующими 35 циклами 45 секунд при 95 ° С, 45 сек при 60 ° С, 90 сек и при 72 ° С; Затем 72 ° С в течение 10 мин и оставляют при температуре 15 ° С.
  3. Решение весь продукт ПЦР в 2% агарозном геле методом электрофореза.
  4. Представьте ПЦР продукт (ы) с помощью 0,5 мкг мл этидий окрашивания / бромид. Моноклональное ампликона может наблюдаться в диапазоне размеров от 250-295 п.о..
  5. Вырежьте часть геля, содержащего моноклональное ампликон между 250-295 б.п..
  6. Очищают ДНК из вырезанной геля с использованием стандартного гель экстрактионный комплект в соответствии с протоколом производителя.

1.4) Оптимизация VDJ ПЦР

  1. Используйте следующие модифицированные условий ПЦР амплификации IgVHFR1 и IgVHFR2 использованием субоптимального ДНК: 95 ° С в течение 7 мин, 40 циклов при 95 ° С в течение 60 сек, 60 ° С в течение 60 сек и 72 ° С в течение 90 сек, конечным удлинением при 72 ° С в течение 10 мин.

2. VDJ Amplicon Библиотека Подготовка и секвенирование

2.1) Подготовка Библиотека

2.1.1) Конец ремонтно-

  1. Перевести VDJ ПЦР-продукта от 1,3 в ПЦР-пробирку и добавить ресуспендирующего буфера от образца ДНК Подготовка комплекта, чтобы поднять объем до 60 мкл.
  2. Добавить 40 мкл Конец ремонтной смеси из образца ДНК комплектом подготовки и тщательно перемешать.
  3. Инкубируйте реакции при 30 ° С в течение 30 мин в предварительно нагретой амплификаторе (30 ° C) с предварительно нагретой крышкой при 100 ° С.
  4. Смешайте 136 мкл магнитные шарики и 24 мкл ПЦР гРаде вода сначала в 1,5 мл трубки, а затем перенести всю реакцию конечного ремонта от 2.1.1.3 в 1,5 мл трубки и хорошо перемешать с решением бисером.
  5. Место труб на магнитной подставке в течение 2 мин, чтобы позволить разделение гранул из раствора. Аспирируйте супернатант, и промыть шарики 80% свежеприготовленным EtOH дважды в то время как трубка на магнитной подставке.
  6. Аспирируйте этанольного раствора полностью и позволяют бусинки высохнуть на воздухе в течение 15 мин при комнатной температуре в течение 15 мин.
  7. Возьмите трубку от магнитных стоять и ресуспендируют бисером в 17,5 мкл буфера ресуспендирования.
  8. Место трубки назад на магнитной подставке на 2 мин в отдельных шариков из ресуспендирующего буфера. Снимите ресуспендирующего буфера (конец ремонтно-продукт суспендируют в буфере для ресуспендирования сейчас) в чистую ПЦР-пробирку.

2.1.2) А-хвостохранилище

  1. Добавить 12,5 мкл А-хвостохранилища смесь в пробирку, содержащую ПЦР Конец ремонта продукт и тщательно перемешать. Инкубируйте ПЦР-пробирку при 37 ° С в течение 30 мин в предварительно нагретой амплификаторе (37 ° C) с предварительно нагретой крышкой при 100 ° С.

2.1.3) Адаптер Лигирование

  1. Добавить 2,5 мкл буфера ресуспендирования, 2,5 мкл Ligation Mix, и 2,5 мкл ДНК Индекс Адаптер в реакции A-хвостов.
  2. Инкубируйте реакции при 30 ° С в течение 30 minl в предварительно нагретой амплификаторе (30 ° C) с предварительно нагретой крышкой при 100 ° С.
  3. Добавить 5 мкл буфера для лигирования Stop в каждой реакции и тщательно перемешать.
  4. Смешайте 42,5 мкл хорошо смешанные магнитных шариков, чтобы очистить реакцию, выполнив шаги 2.1.1.5 до 2.1.1.8. Добавить 50 мкл буфера ресуспендирования для элюирования адаптера лигируют-продукт.
  5. Очистите адаптер лигировали продукт во второй раз с помощью 50 мкл хорошо смешанные бусины AMPure XP, и элюируют продукт в 25 мкл буфера ресуспендирования в чистую ПЦР-пробирку.

2.1.4) Фрагменты ДНК Усиление

  1. Добавить 5 мкл ПЦР-праймер коктейль и 25 мкл ПЦР Master Mix для ПЦР пробирку, содержащую адаптера лигированную продукт и тщательно перемешать.
  2. Выполните усиления в запрограммированный амплификаторе при следующих условиях: 98 ° С в течение 30 сек; 10 циклов 98 ° С в течение 10 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 ° C в течение 30 сек; Затем 72 ° С в течение 5 мин и выдержка при 10 ° С.
  3. Очистка реакцию с помощью 50 мкл хорошо перемешанной магнитных шариков, и элюируют конечного продукта в 30 мкл буфера ресуспендирования.

2.1.5) библиотека проверки

  1. Количественно конечный продукт с использованием протокола флуорометра производителя. Конечная концентрация библиотека между 2,5 до 20 нг / мкл.
  2. Оценить качество конечного продукта с помощью аналитический инструмент с чипом Высокая чувствительность ДНК в соответствии с протоколом производителя. Ожидайте одну полосу с ожидаемым размером для любой IGVHFR1, IGVHFR2 или IGVHFR3. Электроннаяxpected размер библиотеки продукта равен размеру исходного VDJ ампликона плюс размер адаптеров (~ 125 п.н.).

2.2) VDJ-ПЦР Библиотека Объединение и последовательности

  1. Рассчитать молярность каждой фракции библиотеки, используя следующую формулу: = нМ [(нг / 1000) / BP * 660] · 10 9, где нг является концентрация библиотеки VDJ-ПЦР, полученного на шаге 2.1.5.1 и кип пик размер библиотеки VDJ-PCR измерять на стадии 2.1.5.2.
  2. Развести библиотеку на 2 нМ (всего 10 мкл) с ДНКазы без воды.
  3. Комбинат 10 мкл разбавленных 2 нм библиотек вместе в 1,5 мл трубки.
  4. Добавить равный объем PhiX шип-контроль в 1,5 мл трубки.
  5. Загрузите бассейн в концентрации 7 вечера на в проточной ячейке.
  6. Последовательность библиотеки, используя парноконцевое 150 цикла секвенсор в соответствии с протоколом производителя.

Анализ данных 3.

Примечание: Суммичных из биоинформатики сценариев, используемых в этом разделе можно найти в дополнительном файле кода.

3.1) Выравнивание и КК

  1. Карта парноконцевое последовательности читает против человека IGH V, D и базы данных J область с веб-сайта IMGT 11 с использованием адаптированной нуклеотидной алгоритм взрыва на основе "BLASTN" доступной из NCBI с зазором открытых казни 2, расширение гэпа 1, Длина слова 7, и адрес электронной пороговое значение 10 -4. Откажитесь от чтения-пару не отображаются на обоих с IGH V и J области.
  2. Граф оставшиеся чтения пар, которые имеют отображения IGH V и J, чтобы получить частоты соответствие комбинации VJ по всем прочитать пары, полученные от секвенирования перспективе на образце. Граф чтения-пару, если оно отображается как в IGH V и J ген, а затем добавить его аллель в соответствующем счете для конкретной комбинации VJ.
  3. Позиция счетчики для каждой рекомбинированного VDJ области, полученной из 3.1.2 с высокойТекущая к низшему. VDJ область имеет самый высокий читает количество определяется в качестве основного комбинации перегруппировки.
  4. Откажитесь выровненных последовательностей, которые охватывают менее 35% доменного крупной перегруппировки определены в 3.1.3.

3.2) ГИМ профиля Идентификация

  1. Граф все модели ГИМ поперек читает с шага 3.1.3. Определить каждого шаблона SHM как субклона.
  2. Подсчитайте количество субклонами, которые, соответствующих различным уникальных моделей СТМ и количество говорится, что отображаются на отдельных субклонами.

3.3) Графическое представление результатов

  1. Выполните филогенетического анализа на субклонами, используя свои соответствующие ГИМ шаблоны, используя окрестность метод соединения с R пакет "обезьяны" в соответствии с протоколом производителя. Рассчитать расстояние матрицу из отдельных различных группировок воссоздать Субклон филогенез корнями в последовательности зародышевой линии в VJ сочетание в вопросе для каждого парного набора образца.
  2. Используйте нуклеотидной последовательности каждого субклона как вектор символов и рассчитать приблизительное расстояние строку между всеми субклонами в крупной VJ перестройки как для диагностики и соответствующих образцов рецидивов с использованием расстояния Левенштейна меру, где математически расстояние между двумя выравнивания задается д х, у (I, J), где d х, у (I, J) = 1, если я ≠ J и 0 в противном случае, а затем подвести эту функцию по длине строки, соответствующие нуклеотидные последовательности I и J.
  3. Графически отобразить полученную матрицу расстояний субклон и их соответствующими пунктам субклон в следующих двух способов:
    1. Использование R пакет "масса" в соответствии с протоколом производителя для применения многомерного масштабирования с расстоянием субклон матрицы и формировать двумерную карту принцип координат, который затем нанесены по логарифмуиз субклональные пунктам, как радиус окружности.
    2. Построить неориентированный граф, основанный на расстоянии Левенштейна, где вершины соответствуют каждому отдельному субклона, вытекающие из основных VJ перестройки.
      Примечание: Если расстояние между двумя различными клонами равна один, то существует ребро между этими двумя вершинами. Если расстояние больше, чем один, то нет ребро, соединяющее их.
    3. Постройте график подпункте 3.3.3.2 с помощью функции tkplot в "iGraph" R пакете с макета Камада Каваи в соответствии с протоколом производителя. Радиус вершины пропорциональна кубу корню из общего числа клонов, отображенных на ней, и затенение используется красный и синий диапазон, чтобы обозначить долю клонов, которые либо принадлежат к диагностике (синий) или (красный) образцов рецидивов ,

3.4) Неоднородность Энтропия) Измерение (

  1. Изучите цифры и субклон отсчетовиндивидуальные картины соматической гипермутации, происходящие в крупной VJ перестройки для каждого парных набор образцов.
  2. Рассчитать эмпирическую энтропию и остаточного эмпирическую энтропию с поправкой на число различных клонов в каждом образце с помощью оценки энтропии стандарт гистограмма основе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В целом процедура VDJ последовательности (VDJ-след), в том числе выделения ДНК, рекомбинации VDJ область амплификации и очистки, библиотека последовательности строительства, читает обработку и филогенетического анализа, представлена ​​на рисунке 1. Регулярно 5-200 мкг ДНК может быть получена из замороженные срезы ткани или твердой 0,5-20 мкг ДНК из фиксированных формалином парафиновых срезах тканей. В зависимости от качества, перегруппировки рисунком, и SHM степени отдельных образцов, разнообразные VDJ продуктов ПЦР из различных образцов может быть получена (рисунок 2), в том числе IGVHFR1 (310-380 п.н.), FR2 (250-295 п.н.) и FR3 (70-120 б.п.). Образцы из которых только FR3 фрагмент могут быть получены из VDJ ПЦР были исключены из оставшихся исследовании из-за короткого продукт, который не дает достаточное количество информации о последовательности для последующего целью анализа данных. Только образцы которых основным продуктом FR1 или FR2 ПЦР могут быть визуализированы на гое агарозном геле обрабатываются для создания библиотеки секвенирования. Выход основного продукта ПЦР после очистки гель составляет от 10 до 50 нг в общей сложности.

Весь очищенный продукт ПЦР был использован для последующего строительства библиотеки для библиотеки секвенирования. После лигирования адаптеров, каждый образец получает собственный уникальный индекс. Во время усиления библиотеки, были выполнены 10 циклов ПЦР, который может дать более 30 нг как конечных продуктов библиотеки. Качество библиотека доступ в Bioanalyzer. Как показано на рисунке 3, существует один единый продукт в библиотеке образца с размером смещения ~ 125 п.н. образуют своеобразную ампликона продукт ПЦР VDJ указывающее дополнительный адаптера. Для каждого секвенирования перспективе, 5-10 библиотеки объединяются в 7 мкМ. Кроме того, из-за сходства последовательностей между высокой продуктов ПЦР VDJ, библиотека бассейн смешивали с 50% PhiX шипа в целях обеспечения сложность перспективе и правильной идентификации базыДополнительный после каждого цикла секвенирования. Библиотека фрагменты ДНК были секвенированы на 150 п.н. на обоих концах, что позволяет извлекать достаточное количество информации о последовательности, охватывающей VD и DJ переходов для фрагментов FR1, и мутации ШМ шаблоны для филогенетического анализа.

Ранее мы провели VDJ последовательности на 32 DLBCL образцов, собранных в диагностике и рецидива от 14 пациентов (несколько пациенты несколько образцов собраны в любом диагностики или рецидива стадии) используя условие, описанное выше 12. При выполнении филогенетического анализа профилей СТМ крупных V H DJ H перестановок между парных образцах, "ранний расходящийся" и "позднего" расходящегося-режиме клонального эволюции, связанной с В-ККЛ рецидива были определены 12. При этом тот же подход был применен к только что собранных диагностики ДВККЛ и рецидива пары. Области FR1 были получены в обоих образцах после РCR усиления. Основной продукт ПЦР с размером около 344 п.н. (измеряется Bioanalyzer) был получен как из диагностики и образцов рецидивов. После секвенирования, в общей сложности 0,70 млн парно-концевых чтений были получены для образца и диагноза 0730000 парноконцевое чтение для рецидива образца, которые были в пределах количества чтения, полученные на образец в предыдущем исследовании (0.38- 1420000, средняя 0,75 ± 0,26 миллионов) 12. После отображение парных конца читает против IMGT базе данных, говорится, что не хит-парад во всех трех V, D и J регионы были отброшены. V H DJ H договоренность присваивается каждому парных чтений. В общей сложности 0,64 млн и 0,67 млн V H DJ H переходов были определены в диагностике рецидивов и образцов соответственно, что составляет скорость выравнивания более чем на 90%. Подсчитав, сколько раз каждая комбинация V H DJ H был обнаружен в единичных образцов, 808 отличаются V H </ суб> DJ H-переходы были обнаружены в пробе диагноз и 581 различных V H DJ H переходов в образце рецидивов. Доминирующая V H DJ H переход в обоих образца IGHV4-34 * 2 * 01 IGHD5-5 IGHJ2 * 01, подтверждая, что они клонально связаны. Эта доминирующая V H DJ H перехода составила 97% от всего отображается V H DJ H перехода читает как в образце диагностики и образцом рецидивов.

Чтобы проследить эволюцию клонов этого рецидива случае ККЛ, была выполнена филогенетического анализа профилей СТМ крупных V H DJ H перестановок между этой парой диагностики и рецидивов образцов. Мы заметили, что эволюция клональный картины этой пары был после "Late-расходящийся" путь (рисунок 4), что субклоны от диагноза и рецидивов опухолей кластерных вместе на той же ветке филогенетического древа, и доминирующимДиагноз субклон и доминирующие субклоны рецидивов общие аналогичную картину SHM с несколькими дополнительными мутациями произошло в рецидивов субклона. Эти результаты показывают, что потенциально было субклон в опухоли, что было диагноза либо химико-стойкие или побег из лечения, а затем в итоге был разработан в опухоль рецидивов.

Для дальнейшего описания и визуализации клонального архитектура каждого образцов и шаблонов клональный эволюции во рецидива процесса, два новых анализы были разработаны. В этих анализов, весь набор субклонов основных VJ перестройки в каждом образце были использованы для расчета попарно расстояние между строк всех субклонами, определенных их форм ГИМ. Затем с помощью многомерного шкалирования (рис 5а, 5b) или путем строительства неориентированный граф (рис 5C, 5D), как описано в анализе данных, были созданы участки, представляющие распределение и неоднородность субклонами. В видепоказано на рисунке 4, сюжет MDS имеет гораздо меньше порядковый разнообразие между основными субклонами в конце расходящихся случаях (рис 5А), чем в начале расходящихся случаях (рис 5б). Кроме того, суб-клоны образца диагностики и суб-клоны образца рецидивов в начале расходящихся случае полностью отделить друг от друга, что указывает на отсутствие сходства узоров СТМ между этими опухолями, даже если они имеют одинаковый VDJ перегруппировку , Аналогичным образом, неориентированные графы в (рис 5С) и (рис 5D) показывают, что распределение субклон отсчетов в конце расходящихся случае (рис 5C) отличается от раннего расходящихся (рис 5D). Последнее имеет более видные, но генетически различные клоны основные от постановки диагноза до рецидива. Кроме того, отсутствие краев и меньше Субклоны соединения между основными диагностики и рецидивов клонов врано расходящихся случае (рис 5D), продемонстрировать последовательность разнообразие природы начале расходящихся рецидивов случае.

Рисунок 1
Рисунок 1:.. Шаг за шагом потока графике VDJ-след подхода Общая процедура VDJ последовательности показан Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Представитель изображения VDJ ПЦР ампликона продукции. Гель изображения, показывающие представителя IGVH-FR1 (слева) и IGVH-FR2 (правая панель) продуктов ПЦР из ДНК, выделенной из образцов лимфомы пациентов. ПЦР-продукт не может быть получена в случае образца 5 вероятно из-за низкой либообразец качества ДНК или ГИМ на праймеров сайтов, которые с нарушениями реакцию ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3:. КК VDJ ПЦР ампликона и последующего секвенирования по библиотеке Bioanalyzer представитель Bioanalyzer следы той же VDJ ампликоном до создания библиотеки (верхняя панель) и после создания библиотеки (нижняя панель). Обратите внимание на размер сдвига от 334 до 459 б.п. б.п., указывающее добавление адаптера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Клональный эволюция анализ пары DLBCL диагностики и рецидивов образцов. Филогенетического анализа из-ККЛ образца пары диагностики рецидива, показывая режим "Late-расходящийся" клонов эволюции. Цветовые бегущие строки представляют собой статус мутации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.


Рисунок 5
Рисунок 5: Новые графические методы визуализации клоновых модели эволюции (A, B) многомерного шкалирования участки интеграция профилей ГИМ и субклон пунктам образца пары показ режим конце расходящийся рецидивов (а) и образец пары В показывая раннего расходится режим рецидив. (Б). Радиус кругов указать кол subclте, соответствующие конкретному профилю SHM и цвета, соответствующие диагностике (синий) образца или рецидива (красный) образца. X- и Y-оси представляют верхние 2 компоненты MDA. (С, D) неориентированных графов образца пары показ режим конце расходящийся рецидивов (C) и образец пара B, показывая раннего расходящийся режим рецидивов (D). Края соответствуют двум профилям СТМ, имеющих строку расстояние одного отделения буквы и закончил затенения (цвет масштабную линейку), указывающий долю отображения последовательности к конкретному профилю ГИМ, соответствующей диагностики (красный) образца или рецидива (желтый) образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Из-за почти неограниченного количества итераций информации о последовательности кодируемого VDJ перегруппировки и СГМ в IGH локуса В-клеток человека, экспертиза всей IGH репертуар высокой пропускной глубокой последовательности оказался эффективным и всеобъемлющим образом, чтобы очертить клональный и суб-клоновых населения B-клеток. Кроме того, эта стратегия может быть использована для изучения клонального эволюции путь развития В-клеток опухоли, стадии ремиссии, и рецидива путем сравнения клоновых и суб-клоновых архитектур образцов пациентов, собранных вместе различных стадиях заболевания. Хотя усиление перестроенных последовательностей VDJ из первичного образца ДНК легко осуществляют в лабораторных условиях с использованием коммерчески доступных праймеров, эффективность амплификации в значительной степени зависит от качества образца ДНК. В частности, ДНК, выделенную из образцов FFPE проявляет низкую эффективность усиления, и часто только небольшой фрагмент FR3 может быть успешно амплифицировали из нихОбразцы, что делает их непригодными для последующего анализа. Так в нашем исследовании описано здесь был разработан, чтобы понять клональности из B-клеточной лимфомы, который является клональной болезни с одним или несколькими основными клонов доминирующей всю опухоль, мы только собирали и секвенировали главный продукт VDJ-PCR. Для исследований, заинтересованных в каталогизации всю В-клеток попул ции клонов, например, периферической крови, большую часть геля, содержащего несколько продуктов VDJ-ПЦР (несколько полос или мазок на гель) может быть вырезан и секвенировали. Тем не менее, важно отметить, что это не возможно, чтобы захватить всю переставить Igh репертуар, потому что определенное ШМ может произойти в том, где праймеров цели и ухудшают усиление этих VDJs. Кроме того, в последнее время, коммерческий анализ непосредственной связи IGH перегруппировки и усиления MiSeq последовательности был введен. Этот анализ упрощает процесс подготовки образца. Однако, поскольку не каждый Образцы опухоли смогут родовт.е фрагмент FR1, мы по-прежнему рекомендуем в том числе на стадии гель-электрофореза, чтобы проверить продукт реакции ПЦР, прежде чем объединение образцы для секвенирования.

Секвенирование 150 б.п. обоих концах VDJ фрагмента (всего информации последовательности 300 б.п.) имеет следующие преимущества: 1) 300 б.п. последовательности может покрыть большинство FR1 и всей фрагмента FR2, обеспечивающие достаточно информации о последовательности для идентификации VDJ перегруппировку и соматические мутации гипер-; 2) Платформа обеспечивает быстрый секвенирования время оборота, который завершает весь 300 циклов VDJ секвенирования под 48 ч; 3) Каждый прогон позволяет мультиплексирование до 12 образцов и до сих пор достигает около миллиона парноконцевое читает на выход выборки. Потому что высокое сходство последовательностей между клонами, несущими же VDJ перегруппировку, особенно в образцах клеточной лимфомы B, важно, чтобы шип в 20-50% PhiX во время секвенирования перспективе, чтобы точно определить базу вызова матрицы. В последнее время MiSeqПрограммное обеспечение было обновлено для решения этого вопроса. Рекомендуется использовать в качестве лишь 5% PhiX шип-ин для низкого библиотеки сложность последовательности. Тем не менее, наша последовательность объект пережил противоречивый концентрации PhiX шип в контрольной ДНК, представленной изготовителем, что бы скомпрометировать исход низкой сложности последовательности. Таким образом, в современной практике, мы по-прежнему использовать 10-20% PhiX шип-в для секвенирования VDJ. Для секвенирования всего репертуара периферической крови В-клеток, который обычно содержит большое количество различных механизмов VDJ, можно уменьшить количество PhiX шип-ин. Хотя число клонов и субклонами выявленных каждого образца положительно коррелирует с количеством читает последовательность, половина в один миллион парного читает за образец достаточно сравнить клоновых структуры между образцами и вывести клоновых модели эволюции между образцов, собранных в разные этапы болезни того же пациента 12. этоВозможно, что ПЭ 150 б.п. последовательности не может добиться достаточного охвата этих длинные фрагменты FR1 (т.е. 350-380 б.п.). В некоторых случаях информация Последовательность D сегмента не может быть собрана или там не может быть достаточно, информация о последовательности ДНК V сегмента дифференцировать субклоны по ГМС. Тем не менее, с развитием технологий секвенирования, это стало возможным, чтобы упорядочить и больше охватывают весь FR1 ампликон.

Через секвенирования IGH репертуара В-клеток можно было отслеживать расширение индивидуальных клонов В-клеток и вывод клонального эволюцию в течение от диагноза до рецидива. При использовании анализа на популяции субклонами порожденных СТМ моделей, мы смогли различать два режима прогрессии рака рецидива путем изучения их филогенез. Последние графические представления с использованием многомерного шкалирования участков и неориентированные графы в зависимости от расстояния Левенштейна дальнейшего аллож нам понять 1) субклональные состав каждой опухоли, 2), как отдельные субклоны связаны друг с другом, и 3), как каждый субклон развивается во прогрессирования заболевания. Кроме того, статистический анализ показал, что эти филогенетические структуры были явно отличается и что субклональные населения отличались в отношении к их неоднородности. Наконец, клональный эволюция траектории получается VDJ секвенирования может быть хорошо коррелирует с генетической эволюции и характеризуются либо ExoME или целевые ресеквенирование 12. Таким образом, комбинируя эти два подхода есть потенциал, чтобы определить мутации водитель во время lymphomagenesis и лимфомы рецидива

В дополнение к определению B клеток Igh репертуар и проследить эволюцию клональную прогрессирования лимфомы, то VDJ-сл ​​подход может быть потенциально использован в качестве высокочувствительного метода для отслеживания минимального остатка болезни, мониторинга ответа опухоли на терапию, и, возможно, идентификации присутствиялекарственно-устойчивых клонов. Аналогичный подход может быть применен к Т-клеткам, чтобы отобразить репертуар рецепторов Т-клеток, и может быть использовано, чтобы исследовать реакцию иммунного надзора к раку. Кроме того, VDJ-след может быть также выполнена в мышиных моделях с использованием праймеров, доступные из Ханна и др. 13 Можно предвидеть, что информация, собранная на основе такого подхода в ближайшие несколько лет может привести к лучшему пониманию динамики развития опухоли, а также расширить наши знания о иммунной системы и ее роли в защите наш организм от вторжения опухоли.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR 89125-170 200 proof, for molecular biology
TE buffer Life Technologies 12090-015 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
Xylenes VWR EM-XX0055-6 500 ml
Proteinase K  Life Technonogies 25530-015 100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix Promega U1515 10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer  Roche 11699105001 Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 Life Technonogies 4311806 50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder Invivoscribe Technologies  2-096-0020 33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection Invivoscribe Technologies  5-101-0030 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection Invivoscribe Technologies  1-101-0020 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega M8291 20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Corning (cellgro) 46-011-CM 6x1 L
50x TAE BUFFER   VWR 101414-298 1 L
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich E1510 10 mg/ml
25 bp DNA Ladder Life Technologies 10597011 1 µg/µl
100 bp DNA Ladder Life Technologies 15628-019 1 µg/µl
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 500 g
40% Acrylamide/Bis Solution Bio-Rad Laboratories 1610144 500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 50 columns
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Life Technologies Q32854
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
MiSeq Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer Life Technologies Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Magnetic stand Life Technologies 4457858
Gel imaging system Bio-Rad Laboratories 170-8370

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194, (4260), 23-28 (1976).
  2. Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481, (7381), 306-313 (2012).
  3. Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481, (7382), 506-510 (2012).
  4. Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
  5. Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11, (4), 251-263 (2011).
  6. Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354, (6352), 389-392 (1991).
  7. Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346, (4), 235-242 (2002).
  8. Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28, (12), 2094-2100 (2010).
  9. Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
  10. Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28, (27), 4184-4190 (2010).
  11. Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40, (1), 101-111 (2008).
  12. Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15, (8), 432 (2014).
  13. Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133, (2), 250-264 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics