VDJ-のSeq:B細胞リンパ腫のクローン進化のパターンを明らかに転位免疫グロブリン重鎖遺伝子のディープシーケンシング解析

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Jiang, Y., Nie, K., Redmond, D., Melnick, A. M., Tam, W., Elemento, O. VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma. J. Vis. Exp. (106), e53215, doi:10.3791/53215 (2015).

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Abstract

腫瘍クローン性を理解することは、腫瘍形成および疾患の進行に関与するメカニズムを理解するために重要です。また、特定の微小環境または治療に反応して腫瘍内で発生するクローン組成変化を理解することは、腫瘍細胞を根絶するために、より洗練され、効果的なアプローチの設計につながる可能性があります。しかし、腫瘍クローンのサブ集団を追跡することは、識別可能なマーカーの欠如に挑戦しています。この問題に対処するために、VDJ-seqのプロトコルは、VDJ組換えおよび体細胞超変異(SHM)、B細胞リンパ腫の2つのユニークな機能を利用することにより、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)再発のクローン進化パターンを追跡するために作成されました。

このプロトコルでは、索引付けの可能性を秘めた次世代シーケンシング(NGS)ライブラリは、一次診断と再発DLBCL SAMPの組からの増幅された再配列免疫グロブリン重鎖(IgH遺伝子)VDJ地域から構築しましたレ。サンプルあたりの平均万人以上のVDJ配列は、VDJ再配列とSHM情報の両方が含まれているシーケンシング、後に得た上で。また、カスタマイズされたバイオインフォマティクスパイプラインは完全にこれらのサンプル内のIgH-VDJレパートリーの特徴付けのための配列情報を利用するために開発されました。また、パイプラインは、復興と診断腫瘍と診断し、再発腫瘍対間のクローン進化パターンの控除内クローン不均一性の検査を可能に個々の腫瘍のクローンアーキテクチャの比較を可能にします。いくつかの診断・再発のペアにこの分析を適用するとき、我々は、複数の特徴的な腫瘍の進化のパターンはDLBCLの再発につながることを重要な証拠を発見しました。さらに、このアプローチは、微小残存病変の同定、再発の進行および治療応答をモニターし、免疫repertoirの調査のような他の臨床面、に展開することができ非リンパ腫文脈におけるES。

Introduction

がんはクローン病です。ピーターC. Nowellが癌クローン進化モデル1を提案したときに30年前から、多くの研究は、腫瘍サンプル内のクローン集団を分析し、腫瘍形成プロセス2の根底にあるクローン拡大と進化パターンを再構築しようとしています。最近では、全ゲノム配列決定は、クローン異質と進化3,4で深く見てみるために研究者を可能にしました。しかし、多くの細胞型で扱いやすいマーカーの欠如に起因し、それは正確なクローンのアーキテクチャおよび進化の経路を推測することは困難です。幸いDLBCLを含む多くのリンパ系悪性腫瘍は、発信元の成熟B細胞における天然クローン性マーカーがあります。抗原刺激に応答して、これらのセグメントの大きなプールから一緒にセグメントを、各B細胞は、V H(可変)、D(多様性)を結合することによって、単一の生産のIgH VDJ配列を形成することができ、およびJ Hの (参加します)。このPRの間にocessは、元の配列の小さな部分を削除することができ、追加の非鋳型ヌクレオチドはユニークなVDJ再構成を作成するために添加されてもよいです。この特定のVDJ再配列は、したがって、個々の成熟B細胞およびその子孫5をタグ付け、このB細胞のすべての子孫に継承することができます。また、SHMは、抗体プールの拡大や抗体アフィニティー6の強化のための追加の突然変異を導入するために、その後の胚中心(GC)反応における再結合VDJ配列に発生します。したがって、比較し、これらのプロセスを経たリンパ腫サンプルのVDJ及びSHMパターンを対比することによって、腫瘍内の不均一性を描写することができ、疾患のクローン進化経路を推定することができます。

以前は、VDJ再構成とSHMのPCR産物をクローニングし、再結合領域を増幅するPCRによって同定することができ、配列情報を得るために、その後サンガー配列決定。このアプローチの私全体再結​​合VDJレパートリーのごく小さな部分を取得し、与えられたサンプル中のクローン集団の全体的な表現の特性を妨げ、低スループットと低収量です。修正されたアプローチは、VDJ PCR産物からNGSインデックスさシーケンシングライブラリーを作製し、サンプルあたり万人以上の組換えVDJ配列を得るために、PE 2x150 bpの塩基配列決定を行うことによって作成されました。また、カスタムパイプラインは、フィルタVDJ配列決定は、各リードの再配置とSHMSを識別し、各サンプルのクローンアーキテクチャに系統学的解析を実行するために読み出して、品質管理(QC)を行う位置合わせするために開発されました。また、新たなアプローチは、さらに、様々な病期で収集したサンプルについて、クローン進化パターンを特徴付けるために確立されています。

私たちは、DLBCL患者試料にこの手法を適用しています。 DLBCLは、1回目までに頻繁に再発と非ホジキンリンパ腫の積極的な形であります患者7のIRD。いくつかは、5年8後に発生するんがDLBCLの再発は、通常、最初の診断の2〜3年以内に、早期に発生します。再発患者の予後は10%だけが原因限られた治療選択肢に3年無増悪生存率を達成することで、不良です。これは、DLBCLの再発9,10を治療するための新規なアプローチが緊急に必要に基礎です。しかし、DLBCLの再発に関連する分子メカニズムはまだ不明な点が多いです。特に、DLBCLの再発の開発中に診断し、クローン進化でクローン異質の役割は、それが困難な再発を予測するために、正確かつ有用なバイオマーカーを定義すること、現在特徴付けられていないです。これらの質問に対処するために、我々は一致した一次診断、再発DLBCLサンプルのペアの複数のペアに私たちのVDJシーケンシングアプローチを適用しました。再発2つの異なるクローン進化のシナリオは、診断と再発SAMPの間にクローンアーキテクチャの比較から登場しましたレ複数の分子機構は、DLBCLの再発に関与する可能性があることを示唆しています。

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Protocol

1. VDJ増幅

腫瘍試料から1.1)のDNA抽出

  1. 冷凍10月埋め込み正常または悪性組織の薄い切片(10〜20ミクロン)からDNAを抽出します。
    1. プロテイナーゼK(0.5 mg / mlの最終濃度で4 mlの核酸の溶解緩衝液(0.002 MのNa 2 EDTA; 0.3 MのNaCl 0.0075 MトリスHCl、pHは8.2)でクリオスタットミクロトームにより切断包埋組織の10-30薄い部分をダイジェスト)、一晩37℃の水浴中で15 mlの遠心管中で0.625%SDS。
    2. 消化混合物を飽和NaCl(5 M)の1ミリリットルを加え、15秒間激しく振ります。
    3. 室温で15分間1100×gで遠心分離します。
    4. 新しい15ミリリットルの遠心チューブに上清を移し、100%の2容量のエタノールを追加します。
    5. チューブを6-8回転倒混和します。 4℃で60分間、5,000×gで遠心分離し、沈殿したDNAを収集します。
    6. 70%エタノールで2回DNAペレットを洗浄します。 CENTR15分ペレットを収集するたびに、5,000×gでifuge。
    7. シェーカーで一晩の室温で100-400μlのTEバッファーでDNAを溶解します。 DNAの収量は、組織の大きさに応じて5〜200μgの(50-500 ngの/μlの間の最終濃度)であります
  2. ホルマリン固定、パラフィン包埋(FFPE)正常または悪性組織の薄い切片(10〜20ミクロン)からDNAを抽出します。
    1. - パラフィンを塗るを解除1.5 mlのマイクロ遠心チューブに毎回10分間、室温で二回キシレン1ml中パラフィン切片をインキュベートします。室温で5分間、13,000×gで回転させて組織切片を収集します。
    2. 室温で10分間2回1 mlの100%エタノールに残留キシレンを除去するたびに、切片をインキュベートします。室温で5分間、13,000×gで回転させて組織切片を収集します。パラフィンは、完全にこの時点で溶解し、唯一の組織切片が残っています。
    3. 部屋teにおけるセクションを空気乾燥10〜15分間mperature。
    4. (ヌクレアーゼフリー水で10倍PCR緩衝液から希釈)を1×PCRバッファーで0.5 mg / mlのプロテ​​イナーゼK溶液を作ります。 50〜100μlの最終容量で、サンプルのプロテイナーゼK溶液を加え、37℃で一晩インキュベートします。
    5. プロテイナーゼKを不活性化するために10分間95℃でサンプルを加熱します
      注:このステップでは、サンプルのDNAは、PCR緩衝液に溶解し、直接ステップ1.2および1.3で使用することができます。 DNAの収量は、組織の大きさに応じて、0.5〜20μgの(10-200 ngの/μlの間の最終濃度)です。

1.2)のDNAの品質評価

  1. PCRチューブの商業ラダーキットからマスターミックスの45μlの0.25μlのTaq DNAポリメラーゼを混ぜます。
  2. PCRチューブに1.1.1.7または1.1.2.5から調製され、少なくとも5回のピペッティングによりよく混ぜ5μlのDNAを追加します。
  3. 95°Cの場合:DNAを増幅するために、以下の条件を使用して、7分。 95℃で45秒の35サイクル、60℃45秒間、および72℃で90秒間、続い。その後、72℃で10分間、15℃で保持します。
  4. TBE(トリス/ホウ酸塩/ EDTA)中の2%アガロースゲルを準備します。
  5. 4μlの6×ローディング色素と20μlのPCR反応をミックスし、2%アガロースゲル上にロードします。
  6. 0.5μg/ mlの臭化エチジウム溶液でアガロースゲルを染色し、ゲル想像システムでPCR産物を検出します。注:100、200、300、400、600塩基対のサイズで5 PCR産物を得たサンプルVDJアンプリコンを生成するために継続されます。
    注意:エチジウムブロマイドは、強力な変異原です。保護具、 すなわち手袋を身に着けていることによって細心の注意を払って処理し、機関のガイドラインに従って、特定の容器に廃棄してください。

1.3)VDJ PCR

1.3.1フレームワーク領域1(IgVHFR1)から)を増幅再結合のIgH VDJセグメント

  1. チューブラベルから45μlのマスターミックスを混ぜますED商業体細胞超変異IGHアッセイゲル検出のためのキットの「ミックス2」、Taq DNAポリメラーゼμlの0.25、およびPCRチューブに1.1.1.7または1.1.2.5から調製された5μlのサンプルDNAとして。
  2. DNAを増幅するために、以下の条件を使用してください:95℃7分間。 95℃で45秒の35サイクル、60℃45秒間、および72℃で90秒間、続い。その後、72℃で10分間、15℃で保持します。
  3. 電気泳動による2%アガロースゲルで全体のPCR産物を解決します。
  4. 0.5μg/ mlの臭化エチジウム溶液でアガロースゲルを染色し、ゲル画像化システムを用いてPCR産物を検出します。モノクローナルアンプリコンは、310から380塩基対のサイズ範囲と予想されます。
  5. 310から380塩基対の間のモノクローナルアンプリコンを含むゲル部分を切り出します。
  6. 製造業者のプロトコルに従って、標準的なゲル抽出キットを使用して切り出したゲルからDNAを精製します。注意:FR1の断片が得られたサンプルに対して、のIgVを十分にする必要はありませんHFR2とIgVHFR3。

1.3.2フレームワーク領域2(IgVHFR2)から)を増幅再結合のIgH VDJセグメント

  1. PCRチューブに1.1.1.7または1.1.2.5から調製したゲル検出キット用の市販IGH遺伝子クローン性アッセイの「チューブB」、Taq DNAポリメラーゼμlの0.25、および5μlのサンプルDNAとしてラベルチューブから45μlのマスターミックスを混ぜます。
  2. DNAを増幅するために、以下の条件を使用してください:95℃7分間。 95℃で45秒の35サイクル、60℃45秒間、および72℃で90秒間、続い。その後、72℃で10分間、15℃で残します。
  3. 電気泳動による2%アガロースゲルで全体のPCR産物を解決します。
  4. 0.5μg/ mlのエチジウムブロマイド染色によってPCR産物(単数または複数)を視覚化します。モノクローナルアンプリコンは、250から295塩基対のサイズ範囲内で観察することができます。
  5. 250から295塩基対の間のモノクローナルアンプリコンを含むゲル部分を切り出します。
  6. 標準ゲルエキスを使用して切り出したゲルからDNAを精製製造業者のプロトコールに従って、イオンのキット。

1.4)の最適化VDJ PCR

  1. 7分、60秒、60秒、60℃95℃の40サイクル、および90秒間72℃、の最終伸長95℃:IgVHFR1とIgVHFR2は次善のDNAを用いて増幅するために、次の修正PCR条件を使用してください10分間72℃です。

2. VDJアンプリコンライブラリの準備とシーケンシング

2.1)ライブラリの準備

2.1.1)エンド・修理

  1. PCRチューブに1.3からVDJ PCR産物を移し、60μlにボリュームを起動するためのDNAサンプル調製キットの再懸濁バッファーを追加します。
  2. 最後の40μlのDNAサンプル調製キットからミックスを修復し、十分に混合を追加します。
  3. 100℃に予熱された蓋で予熱されたサーモ(30°C)で30分間30℃で反応をインキュベートします。
  4. 136μlの磁気ビーズと24μlのPCRグラムを混ぜますRADE水は最初の1.5mlチューブに、その後、1.5mlチューブに2.1.1.3から全体エンド修復反応を転送し、ビーズ溶液とよく混ぜます。
  5. 溶液からのビーズの分離を可能にするために2分間の磁気スタンドにチューブを置きます。上清を吸引除去し、チューブを磁気スタンド上にある間に二度80%の新鮮な準備EtOHでビーズを洗浄します。
  6. 完全にエタノール溶液を吸引し、15分間、室温で15分間空気乾燥したビーズを可能にします。
  7. 17.5μlの再懸濁バッファーに磁気スタンド再懸濁ビーズからチューブを取ります。
  8. バック再懸濁バッファーとは別個のビーズに2分間磁気スタンドの上に置きチューブ。きれいなPCRチューブに再懸濁バッファーを(エンド修復製品は現在、再懸濁緩衝液に再懸濁する)を外します。

2.1.2)A-テーリング

  1. エンド修復製品を含むPCRチューブに12.5μlのA-テーリングミックスを加え、よく混ぜます。 100℃に予熱された蓋で予熱されたサーモ(37°C)で30分間37℃でPCR管をインキュベートします。

2.1.3)アダプターライゲーション

  1. A-テーリング反応に2.5μlの再懸濁バッファー、2.5μlのライゲーションミックス、および2.5μlのDNAアダプターのインデックスを追加します。
  2. 100℃に予熱された蓋で予熱されたサーモ(30°C)で30 minl 30℃で反応をインキュベートします。
  3. 各反応に5μlの停止ライゲーションバッファーを添加し、十分に混合します。
  4. 2.1.1.5 2.1.1.8への手順は以下の反応をきれいに42.5μL、よく混合した磁気ビーズを混ぜます。アダプターライゲーション生成物を溶出するために50μlの再懸濁バッファーを追加します。
  5. 50μlのよく混合さAMPure XPビーズを使用して二度目のアダプター連結産物を清掃し、クリーンPCRチューブに25μlの再懸濁バッファー中で生成物を溶出。

2.1.4)を増幅したDNA断片

  1. アダプター連結産物を含むPCRチューブに5μlのPCRプライマーのカクテルと25μlのPCRマスターミックスを加え、よく混ぜます。
  2. 以下の条件で事前にプログラムされたサーマルサイクラーで増幅を実行します。30秒間、98℃; 30秒30秒、72℃10秒、60℃98℃の10サイクル;その後、72℃で5分間、10℃で保持します。
  3. 50μlのよく混合した磁気ビーズを使用して反応をクリーンアップし、30μlの再懸濁バッファーの最終生成物を溶出。

2.1.5)ライブラリの検証

  1. 製造業者のプロトコルを使用して、蛍光光度計を用いて、最終生成物を定量します。最終ライブラリー濃度は2.5〜20 ngの/μlの間です。
  2. 製造業者のプロトコルに従って高感度DNAチップで分析機器を使用して、最終製品の品質を評価します。 IGVHFR1、IGVHFR2またはIGVHFR3のいずれかの予想サイズの単一のバンドを期待しています。電子ライブラリ製品のxpectedサイズはオリジナルのVDJアンプリコンのサイズ+アダプタ(〜125塩基対)の大きさに等しいです。

2.2)VDJ-PCRライブラリプールとシーケンシング

  1. 次の式を使用して、各ライブラリー画分のモル濃度を計算します。nMで= [(NG /千)/ BP * 660] NGはステップ2.1.5.1で測定されたVDJ-PCRライブラリーの濃度であり、BPがピークである10 9 xはVDJ-PCRライブラリーのサイズは、ステップ2.1.5.2で測定。
  2. DNアーゼを含まない水で2 nMの(10μlの合計)にライブラリを希釈します。
  3. 1.5mlチューブに一緒に希釈した2 nMのライブラリの10μLを結合します。
  4. 1.5mlチューブにPHIXスパイクインコントロール等量のを追加します。
  5. フローセル上に7 PM濃度でプールをロードします。
  6. シーケンス製造業者のプロトコルに従って、ペアエンド150サイクルシーケンサーを使用してライブラリ。

3.データ分析

注:SUMMこのセクションで使用されているバイオインフォマティクスの進スクリプトは、補助コードファイルとして求めることができます。

3.1)アラインメントとQC

  1. 地図ペアエンド配列決定、2のギャップオープンペナルティ、NCBIから入手可能な「BLASTN」に基づく適応ヌクレオチドBLASTアルゴリズムを使用して、IMGTのウェブサイト11からダウンロードした人IGH V、DおよびJ領域データベース、1のギャップ伸長ペナルティに対して読み込み7のワード長、および10 -4の電子値しきい値。 IGH VおよびJ領域の両方にマップされない読み取りペアを捨てます。
  2. すべてにわたってVJの組み合わせに一致する周波数を得るためにIGH VおよびJマッピングが残りの読み取りペアを数えるサンプルのシークエンスの実行から得たペアをお読みください。それはIGH VおよびJ遺伝子の両方にマップされている場合は、読み取りペアをカウントした後、特定のVJの組み合わせで対応するカウントにその対立遺伝子を追加します。
  3. 高いから3.1.2から得られた各再結合VDJ領域についてカウントランク最低のEST。 VDJ領域が最も高いが、カウントが主要な再配置の組み合わせとして定義されて読み込みがあります。
  4. 3.1.3で同定されたドメインの主要な転位の35%未満をカバーする整列された配列を破棄します。

3.2)SHMのプロファイル識別

  1. ステップ3.1.3からの読み取りを越え、すべてのSHMパターンをカウントします。サブクローンとして各SHMパターンを定義します。
  2. 異なるユニークなSHMパターンに対応しているサブクローンの数、および個々のサブクローンにマッピングされている読み込みの数をカウントします。

3.3)結果をグラフィカルに

  1. 製造業者のプロトコルに従ってRパッケージ「猿」から接合方法近所を使用して、それらに対応するSHMパターンを使用してサブクローンの系統解析を実行します。 Vの生殖細胞系配列に根ざしたサブクローンの系統発生を再作成するために、個々の異なるアラインメントからの距離行列を計算します各ペアのサンプルセットのための問題のJの組み合わせ。
  2. 文字ベクトルとして各サブクローンのヌクレオチド配列を使用する二つの整列の間の距離をdとX、Yによって与えられる数学的に診断し、レーベンシュタイン距離の尺度を使用して、対応する再発試料の両方の主要なVJ再配列内のすべてのサブクローン間の近似文字列の距離を計算します私はそれ以外の場合は、J≠0とし、その後の配列iとjのヌクレオチド配列に対応する文字列の長さにわたって、この関数を合計すると(i、j)は、 ここで、d 、X、Y(i、j) 1 =。
  3. グラフィカルに、以下の2つの方法でサブクローン距離とそれに対応するサブクローンカウントの結果の行列を表示します。
    1. 使用Rパッケージ「質量」とは、サブクローン距離行列に多次元スケーリングを適用し、2次元の原理を生成するために、製造業者のプロトコルによれば、その後対数と一緒にプロットされているマップを、座標円の半径としてsubclonalカウント。
    2. 頂点が主要なVJ再配列から生じる各個別のサブクローンに対応レーベンシュタイン距離に基づいて、無向グラフを構築します。
      注:二つの異なるクローン間の距離が1に等しい場合には、これらの2つの頂点の間にエッジが存在します。距離が1より大きい場合には、それらを連結するいかなるエッジが存在しません。
    3. 製造業者のプロトコルに従って鎌田河合レイアウトで「IGRAPH「Rパッケージのtkplot機能を使用して3.3.3.2のグラフをプロットします。頂点の半径はそれにマッピングされたクローンの総数の三乗根に比例し、シェーディングが診断(青)に属しているいずれかのクローンの割合または再発(赤)のサンプルを表すために赤と青の範囲を使用しています。

3.4)異質性(エントロピー)の測定

  1. の番号とサブクローン数を調べサンプルの各ペアのセットのための主要なVJ再配列に生じる体細胞超変異の個々のパターン。
  2. 標準ヒストグラムベースのエントロピー推定を使用して、各サンプル中の異なるクローンの数に合わせて調整経験的エントロピーと残留経験的エントロピーを計算します。

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Representative Results

DNAの抽出を含むVDJ配列決定(VDJ-SEQ)の全体的な手順は、ライブラリー構築の配列決定、VDJ領域の増幅および精製を再結合し、処理、および系統学的解析を読み出し、 図1に示されている。日常5-200μgのDNAをから検索することができます凍結固体組織切片またはホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を0.5から20μgのDNAを。品質、再配置パターン、および個々のサンプルのSHMの程度に応じて、異なるサンプルからのVDJ PCR産物の多様を得ることができた( 図2)、IGVHFR1(310から380塩基対)、FR2(250から295塩基対)を含みますFR3(70-120 bp)の。唯一FR3断片はVDJ PCRから入手することが可能なサンプルが起因下流のデータ分析の目的のために配列情報を十分に提供しない短い製品に残っている試験から除外しました。主要FR1またはFR2 PCR産物が目に可視化することができる唯一の​​サンプル電子アガロースゲルは、シークエンシングライブラリーを生成するために処理されます。ゲル精製後の主要なPCR産物の収率を合計で10〜50 ngの範囲です。

全体の精製されたPCR産物をシーケンシングライブラリーの後続ライブラリーの構築のために使用しました。アダプター連結後、各サンプルは、独自のインデックスを取得します。ライブラリー増幅の間、PCRの10サイクルは、最終的なライブラリ製品など30以上のNGをもたらす可能性が行われました。ライブラリ品質はバイオアナライザーによってアクセスされました。 図3に示すように 、〜125塩基対のサイズシフトを有するライブラリーのサンプル中の1つの製品は、アダプタの追加のを示す元のVDJ PCRアンプリコン産物の形成があります。各シークエンスの実行については、5-10ライブラリは7μMで一緒にプールしました。 VDJ PCR産物との間の高い配列類似性のために加え、では、ライブラリープールは、ベースの実行、正しい識別の複雑性を確保するために、50%PHIXスパイクインと混合し、各シークエンシングサイクル後に追加。ライブラリーDNA断片を系統学的分析のために十分なFR1フラグメントためVD及びDJ接合部にまたがる配列情報の量、及びSHM変異パターンの検索を可能にし、両端に150塩基対のために配列決定しました。

以前、我々は12、上記の条件を用いて、(数人の患者が診断や再発段階のいずれかで複数のサンプルを採取していた)14人の患者からの診断や再発で収集32 DLBCLサンプルにVDJシーケンシングを行いました。対のサンプル、「早期発散」とDLBCLの再発に関連するクローン進化の「レイト発散」モードとの間の主なV H DJ Hの再配列のSHMプロファイルの系統解析を行うことで12を同定しました。本明細書において、同じアプローチは、新たに収集したDLBCLを診断および再発対に印加しました。 FR1領域はP後の両方のサンプルで得られましたCR増幅。 (バイオアナライザーによって測定される)の周りに344 bpのサイズの主なPCR産物を診断および再発試料の両方から得られました。 (0.38-配列決定の後、0.70百万ペアエンドの合計は、診断サンプルについて得られた読み取りおよび073万ペアエンドは以前の研究でサンプル毎に取得した読み取りの数の範囲内であった再発サンプル用の読み込み142万、0.75±026万平均)12。マッピングペアエンドはIMGTデータベースに対して読み込みした後、すべての3つのVでヒットを持っていないことを読み込み、DおよびJ領域を廃棄しました。 V H DJ Hの配置は、各ペアエンドリードに割り当てられていました。 0.64百万0.67百万V H DJ H結合の合計が90%以上の配向率を表し、それぞれの診断および再発サンプルで同定されました。何回をカウントすることにより、V H DJ Hの各組み合わせは、個々のサンプルで発見された、808の個別のV H </サブ> DJ H接合は再発サンプルで診断サンプルと581の異なるV H DJ H接合部で発見されました。両方のサンプル中の支配的なV H DJ H接合部は、彼らはクローン的に関連していることを確認し、IGHV4-34 * 2 IGHD5-5 * 01 * 01 IGHJ2です。この支配的なV H DJ H接合部は、マッピングされ V H DJ H接合は診断サンプルおよび再発サンプルの両方で読み込み、全体の97%を占めました。

このDLBCLの再発例クローン進化をトレースするには、診断および再発サンプルのこのペアの間の主なV H DJ Hの再配列のSHMプロファイルの系統解析を行いました。我々は、このペアのクローン進化パターンは診断からサ ​​ブクローンと再発腫瘍は系統樹の同じ枝に一緒にクラスタ化することを、「後期発散」パス( 図4)以下、及び支配していることが確認され診断サブクローンと支配的な再発のサブクローンは、いくつかの追加の突然変異と同様のSHMパターンを共有し、再発のサブクローンで発生しました。これらの結果は、潜在的にいずれかの化学療法抵抗性であったか、治療から脱出した後、最終的には再発腫瘍に発展診断腫瘍中のサブクローンがあったことを示唆しています。

さらに特徴付け、再発プロセス中に各サンプルおよびクローン進化パターンのクローンアーキテクチャを視覚化するために、2つの新しい分析が開発されています。これらの分析では、各サンプル中の主要なVJ再配置のサブクローンのセット全体は、SHMのそれらのパターンによって定義されるすべてのサブクローン間の対列の距離を計算するために使用しました。そして、多次元スケーリング( 図5A、5B)を使用するか、またはデータ分析に記載されているように無向グラフ( 図5C、5D)を構築することにより、サブクローンの分布と異質性を表すプロットが作成されました。として図4に示され 、MDSプロットは、初期発散例( 図5B)に比べて遅れて発散例( 図5A)の主要なサブクローン間ではるかに少ない配列の多様性を示します。また、初期の発散場合の診断サンプルのサブクローンおよび再発サンプルのサブクローンは、同じVDJ再配列を運ぶにもかかわらず、これらの腫瘍の間SHMパターンの類似性の欠如を示す、互いに完全に分離します。同様に、( 図5C)と( 図5D)で無向グラフが遅く発散場合( 図5C)でサブクローン数の分布は早期発散( 図5D)とは異なることを示しています。後者は、診断から再発までのより目立つが、遺伝的に多様な主要なクローンを持っています。また、の主要な診断と再発クローン間のエッジの欠如と小さいサブクローンの接続初期の発散場合( 図5D)、初期の発散再発例配列の多様性の性質を示しています。

図1
図1:VDJ-seqのアプローチのステップフローチャートによりステップ VDJシーケンシングの全体的な手順が示されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
2:VDJ PCRアンプリコン生成物の代表的な画像 。 DNAからのPCR産物を代表IGVH-FR1(左パネル)を示すとIGVH-FR2(右パネル)のゲル画像は、リンパ腫患者試料から抽出しました。 PCR産物は、おそらく低いいずれかに試料5で得られませんでしたPCR反応を損なわプライマー部位での試料DNAの品質やSHM。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3:VDJ PCRアンプリコンとバイオアナライザーによるその後のシーケンシングライブラリーのQC代表バイオアナライザは、ライブラリー構築(上のパネル)の前およびライブラリー構築(下のパネル)の後に、同じVDJのアンプリコンのトレース。アダプタの追加を示す459塩基対の334塩基対からサ ​​イズのずれに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4: DLBCLの診断と再発サンプルのペアのクローン進化分析。「後期発散」クローン進化モードを示す診断再発DLBCLサンプルペアの系統解析。色のティッカーは、変異状態を表している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。


図5
5:後期発散再発モード(A)と早期発散再発モードを示すサンプル対Bを示すサンプル・ペアのSHMプロファイルとサブクローンの数を統合クローン進化パターンを可視化する新しいグラフィカルな方法 (A、B)多次元スケーリングプロット(B)。円の半径はsubclの数を示します特定のSHMプロファイルに対応したものと診断(青)のサンプルまたは再発(赤)のサンプルに対応する色。 X軸とY軸は、MDAのトップ2の構成要素を表します。サンプルペアの(C、D)無向グラフ後期再発発散モード(C) ​​および早期再発発散モード(D)を示すサンプルペアBを示します。エッジは一文字分離の文字列距離を有する2 SHMプロファイルに対応し、シェーディング(カラースケールバー)を卒業診断(赤)のサンプルまたは再発(黄色)のサンプルに対応する特定SHMプロファイルにシーケンス・マッピングの割合を示す。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。

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Discussion

そのため、ヒトB細胞のIGH遺伝子座にVDJ再配列とSHMによってコード化された配列情報の反復のほぼ無制限の数の、ハイスループットディープシークエンシングにより全体IGHレパートリーの検査は、クローン描写するための効率的かつ包括的な方法であることが判明しましたサブクローン性B細胞集団。さらに、この方法は、疾患の種々の段階に沿って収集された患者サンプルのクローンおよびサブクローンのアーキテクチャを比較することにより、B細胞腫瘍の発生、寛解および再発のクローン進化経路を研究するために使用することができます。一次サンプルからのDNA再配列VDJ配列の増幅を容易に商業的に入手可能なプライマーを用いて、実験室の設定で行われるが、増幅の効率は、試料DNAの品質に大きく依存します。具体的には、FFPEサンプルから抽出したDNAは、低い増幅効率を示し、しばしばわずかFR3断片が正常これらから増幅することができますサンプル、その後の分析のためにそれらは不適当。本明細書中に記載の我々の研究は、1つまたは腫瘍全体を支配するいくつかの主要なクローンとクローン性疾患であるB細胞リンパ腫のクローン性を理解するために設計されたので、私たちは、収集され、主要なVDJ-PCR産物を配列決定しました。全B細胞のクローン集団をカタログに興味が研究のために、例えば、末梢血は、複数VDJ-PCR産物(複数のバンドまたはゲル上スミア)が含まれたゲルの大部分を切除し、配列決定することができます。しかし、それは、特定のSHMがどこプライマー標的で発生し、これらVDJsの増幅を損なう可能性があるため、全体の再配列IGHレパートリーを捕捉することができないことを指摘することは重要です。また、最近では、市販のアッセイは、直接結合IGH再配列の増幅およびMiSeqのシークエンシングは、導入されています。このアッセイは、サンプル調製プロセスを合理化します。しかし、ではないので、すべての腫瘍サンプルは、属にできるようになりますFR1フラグメントTE、我々はまだ配列決定のために試料をプールする前に、PCR反応の産物を確認するために、ゲル電気泳動工程を含むお勧めします。

VDJ断片の両末端の配列の150bp(300bpの配列情報の合計)は、以下の利点を有する:1)で300 bpの配列決定は、VDJ再配列を同定するための十分な配列情報を提供し、FR1全体FR2フラグメントの大部分をカバーすることができると体細胞超変異; 2)プラットフォームは、48時間の下にVDJ配列決定の全体の300サイクルを完了し、高速シーケンシングのターンアラウンドタイムを提供します。 3)それぞれのランは12サンプルに多重化を可能にし、まだ周りに百万ペアエンドサンプル出力ごとに読み込む実現します。同じVDJ再配列を有するクローン間の高い配列類似ため、特にB細胞リンパ腫サンプル中で、それはスパイクにするために20〜50%PHIXシーケンシングの実行中に正確にベース呼び出し行列を定義できるようにすることが重要です。最近では、MiSeqソフトウェアは、この問題に対処するために更新されました。これは、低複雑度のライブラリ配列決定のためにわずか5%PHIXスパイクインを使用することをお勧めします。しかし、私たちのシーケンシング機能は、複雑性の低いシーケンシングの結果を危うくするメーカーが提供するPHIXスパイクインコントロールDNAの一貫性のない濃度を経験しています。そのため、現在実際には、我々はまだVDJ配列決定のために10〜20%PHIXスパイクインを使用します。通常、異なるVDJ配置の多数を含んでいる全体の末梢血B細胞レパートリーの配列決定のために、それはPHIXスパイクインの量を低減することができます。数がシーケンス読み込むと、各サンプルの同定されたクローンおよびサブクローンの数は正の相関されていますが、ペアエンドの百万の半分は、サンプルごとに読み込むサンプル間のクローンの構造を比較し、異なる時に採取したサンプル間のクローン進化パターンを推定するのに十分です同じ患者12の病期。それはPE 150 bpの塩基配列決定は、それらの長いFR1フラグメント( すなわち 350〜380塩基対)の十分なカバレッジを達成しない可能性が。いくつかのケースでは、Dセグメントの配列情報が収集されていないか、またはSHMSによってサブクローンを区別するためのVセグメントに十分な配列情報が存在しない場合があります。しかし、配列決定技術の進歩と共に、より長い配列および全体FR1アンプリコンをカバーすることが可能となりました。

B細胞のIGHレパートリーの配列決定を介して、個々のB細胞クローンの拡大を追跡し、診断から再発にかけクローン進化を推測することが可能でした。 SHMパターンによって生成されたサブクローンの集団の分析を使用すると、我々は彼らの系統発生を調べることにより、再発への癌の進行の二つのモードを区別することができました。さらにレーベンシュタイン距離に基づいて、多次元スケーリングプロットと無向グラフを使用して、最新のグラフィック表現アロ私たちは、それぞれのサブクローンは、疾患の進行中に進化する方法)が互いに、および3に関連している2)どのように個々のサブクローン、各腫瘍の1)subclonal構成を理解するためにwを。また、統計的分析は、これらの系統発生学的構造が明らかに異なるとsubclonal集団が、その異質に関してように異なることがあることを示しました。最後に、VDJ配列決定により得られたクローン進化の軌跡がよく、遺伝的進化と相関し、exomeまたは標的リシーケンス12のいずれかによって特徴づけることができます。したがって、これらの2つのアプローチを組み合わせることリンパ腫およびリンパ腫の再発時にドライバの変異を同定する可能性を有します

B細胞IGHレパートリーを規定し、リンパ腫の進行のクローン進化を追跡することに加えて、VDJ-SEQアプローチは、潜在的に、最小の残留疾患を追跡治療に対する腫瘍反応をモニタリングし、潜在的な存在を同定するための高感度な方法として使用することができ薬剤耐性クローンの。同様のアプローチは、T細胞受容体のレパートリーをマッピングするためにT細胞に適用することができ、癌に対する免疫監視の応答を調べるために使用することができます。また、VDJ-配列はまた、ハンナから入手可能なプライマーを用いてマウスモデルで実行することができる。13これは、今後数年間でこのアプローチによって収集された情報は、腫瘍発生のダイナミクスのよりよい理解につながるだけでなく、できることを予想されます免疫系の知識や腫瘍の浸潤から私たちの体を守る中でその役割を展開します。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR 89125-170 200 proof, for molecular biology
TE buffer Life Technologies 12090-015 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10 mM EDTA
Xylenes VWR EM-XX0055-6 500 ml
Proteinase K  Life Technonogies 25530-015 100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix Promega U1515 10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer  Roche 11699105001 Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 Life Technonogies 4311806 50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder Invivoscribe Technologies  2-096-0020 33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection Invivoscribe Technologies  5-101-0030 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection Invivoscribe Technologies  1-101-0020 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase Promega M8291 20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer Corning (cellgro) 46-011-CM 6x1 L
50x TAE BUFFER   VWR 101414-298 1 L
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich E1510 10 mg/ml
25 bp DNA Ladder Life Technologies 10597011 1 µg/µl
100 bp DNA Ladder Life Technologies 15628-019 1 µg/µl
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 500 g
40% Acrylamide/Bis Solution Bio-Rad Laboratories 1610144 500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 50 columns
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Life Technologies Q32854
High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001
MiSeq Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer Life Technologies Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) Illumina FC-121-2001
Magnetic stand Life Technologies 4457858
Gel imaging system Bio-Rad Laboratories 170-8370

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References

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  2. Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481, (7381), 306-313 (2012).
  3. Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481, (7382), 506-510 (2012).
  4. Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
  5. Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11, (4), 251-263 (2011).
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