L'isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Biology

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Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements. J. Vis. Exp. (105), e53217, doi:10.3791/53217 (2015).

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Abstract

Disfunzionali mitocondri dei muscoli scheletrici hanno un ruolo nel metabolismo alterato osservata con l'invecchiamento, l'obesità e il diabete di tipo II. Saggi respirometrici mitocondriali da isolate preparati mitocondriali consentono la valutazione della funzione mitocondriale, nonché la determinazione del meccanismo (s) d'azione dei farmaci e proteine ​​che modulano il metabolismo. Procedure di isolamento attuali richiedono spesso grandi quantità di tessuto per produrre mitocondri di alta qualità necessari per le analisi respirometrici. I metodi qui presentati descrivono come di alta qualità mitocondri purificato (~ 450 mg) può essere isolato da quantità minime (~ 75-100 mg) di topo muscolo scheletrico per l'uso in misure respiratorie throughput elevato. Abbiamo determinato che il nostro metodo di isolamento si ottiene il 92,5 ± 2,0% mitocondri intatti misurando l'attività citrato sintasi spettrofotometricamente. Inoltre, l'analisi Western Blot in mitocondri isolati portato alla debole espressione del cytosoproteine ​​lic, GAPDH, e il robusto espressione della proteina mitocondriale, COXIV. L'assenza di una banda di GAPDH prominente nei mitocondri isolati è indicativo di poco la contaminazione da fonti non-mitocondriali durante la procedura di isolamento. Soprattutto, la misura di O 2 tasso di consumo con tecnologia basata micropiastra e determinare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) per saggi respirometrici accoppiati mostra altamente accoppiate (RCR;> 6 per tutti i saggi) e mitocondri funzionali. In conclusione, l'aggiunta di una fase di macinazione separata e riducendo significativamente motorizzato velocità omogeneizzazione di un metodo riportato in precedenza ha permesso l'isolamento di alta qualità e mitocondri purificati da piccole quantità di topo muscoli scheletrici che si traduce nei mitocondri altamente accoppiate che respirano con alta funzione durante micropiastra saggi respirometirc.

Protocol

Gli studi su animali sono stati effettuati nel quadro di un protocollo approvato dalla cura degli animali istituzionale e utilizzano Comitato al Virginia Polytechnic Institute e State University.

1. Setup (Tempo: ~ 45 min)

  1. Scongelare depositi congelati di 0,25% tripsina, isolamento tampone per mitocondri (IBM) 1 e IBM2 in un bagno d'acqua a 37 ° C.
  2. Sciacquare vetreria e strumenti di dissezione in etanolo al 70% e poi con acqua ad elevata purezza.
  3. Preparare la soluzione tripsina 0,05% dal 0,25% tripsina magazzino diluendo 1 parte di tripsina in 4 parti IBM1.
  4. Mescolare proteasi e fosfatasi inibitore cocktail con tampone di lisi cellulare (1: 100 ratio) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga con tappo a vite.
  5. Aliquote 5 ml (5 ml / topo) di 0,05% tripsina in un tubo di plastica da 15 ml.
  6. Impostare motorizzato omogeneizzatore tessuto a 80 giri.

2. Isolamento del muscolo scheletrico mitocondri (Tempo: ~ 90 min)

  1. L'eutanasia di un mouse da CO 2
  2. Rimuovere muscolo rosso dal quadricipite e del muscolo gastrocnemio, che comprende il soleo (~ 75-100 mg totale) come descritto nei seguenti passaggi:
    1. Sbucciare la pelle verso il mouse.
    2. Rimuovere il cuscinetto di grasso sopra il punto di origine del quadricipite. Tagliare il tendine del quadricipite che è collegato alla rotula con sottili forbici a punta.
      Nota: Il quadricipite è identificato dalla sua posizione anatomica sulla parte anteriore del femore prossimale.
    3. Lentamente tagliare l'aponeurosi tra l'osso e il quadricipite, evitando l'arteria femorale, per liberare i quadricipiti dall'osso. Tagliare il tendine con sottili forbici a punta in corrispondenza del punto di origine sul femore per liberare il muscolo quadricipite e posizionare il muscolo quadricipite in refrigerate PBS.
    4. Rimuovere il tessuto adiposo visibile sopra il quadricipite con le forbici. Vibrazione quadricipiti sopra in modo che la porzione del muscolo che è stato sovrapposto il femore sta affrontando up. Aprire il muscolo quadricipite con una pinza in un movimento rotatorio. Rimuovere le due porzioni muscolari rosse visibili da ogni lobo con ammenda forbici a punta e mettere in un bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1.
      Nota: muscolo quadricipite appaiono come due lobi con una striscia di muscolo rosso si trova vicino al bordo laterale di ciascun lobo.
    5. Tagliare la pelle sovrastante il tendine di Achille con ammenda punta forbici e sbucciare la pelle verso il mouse. Tagliare il tendine di Achille esposto e staccare il muscolo verso il corpo del mouse.
    6. Tagliare il tendine ai condili mediale e laterale del femore con sottili forbici a punta per liberare il gastrocnemio e collocare il gastrocnemio attaccato ai suoi tendini in refrigerata PBS.
    7. Capovolgere il gastrocnemio sopra e staccare il muscolo soleo e mettere nel bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1. Fan aprire il gastrocnemio. Rimuovere le tre porzioni visive rosse muscolari (due strisce rosse laterali e uno mediale superficiale) con multa forbice a puntas e trasferirli al bicchiere contenente 5 ml di acqua refrigerata IBM1.
  3. Rimuovere un'altra ~ 75-100 mg di muscolo rosso dalla altra gamba del mouse (come descritto al punto 2.2) e posto in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga con proteasi e fosfatasi inibitore cocktail e tampone di lisi cellulare (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, NaCl 150 mm, 1% dodecil solfato di sodio, 0,5% deossicolato di sodio, 1% Poliossietilene (9) nonylphenylether, ramificata. Subito lampeggiare-freeze questo secondo campione in azoto liquido per un uso successivo a assorbente occidentale (vedi punto 6.1).
  4. Mettere una superficie di plastica piatta pre-raffreddata su ghiaccio in un grande secchio. Versare una goccia di IBM1 sulla superficie di plastica e utilizzare pinzette per mettere tutti del muscolo rosso sezionato (passo 2.2.4 e 2.2.7) in IBM1 goccia. Tritare il tessuto muscolare per 2 minuti utilizzando 3 singole lame di rasoio bordo cambiando rasoi ogni 40 sec.
  5. Trasferire il tessuto tritato in un becher con 5 ml di IBM1 fresco tenendo superficie plastica sopra the becher e raschiare il muscolo nel becher con una lama di rasoio. Prendete questa soluzione e di scarico attraverso un colino cella di 100 micron collocato su un tubo da 50 ml.
  6. Tamponare il tessuto con un tergicristallo compito delicato e poi trasferisce in 5 ml della soluzione di tripsina 0,05%. Utilizzare pinzette per rimuovere il tessuto dal tergicristallo compito.
  7. Incubare il tessuto muscolare in ghiaccio per 30 minuti in soluzione tripsina 0,05%.
  8. Gira le tubo da 15 ml miscela contenente tripsina / muscolo a 200 xg per 3 min a 4 ° C.
  9. Versare il surnatante tripsina in un contenitore per rifiuti e risospendere il pellet con 3 ml di ghiaccio freddo IBM1. Trasferire il tessuto 45 ml tubo omogeneizzatore vetro. Sciacquare i tubo da 15 ml con un altro 1,5 ml IBM1 raccogliere qualsiasi campione rimanente e aggiungere questo al tubo omogeneizzatore vetro.
  10. Posizionare il tubo di omogeneizzatore vetro in un bicchiere o contenitore di plastica pieno di ghiaccio a metà strada quindi l'omogeneizzatore vetro si muove minimamente all'interno del bicchiere.
  11. Trasferire il tessuto omogenato di un nuovo tubo da 15 ml conica e sciacquare il tubo omogeneizzatore vetro con 6,5 ml di IBM1. Versare il IBM1 nel tubo da 15 ml contenente tessuto omogenato.
  12. Spin tubo conico da 15 ml a 700 g per 10 minuti a 4 ° C. Delicatamente versare il surnatante in una provetta da centrifuga ad alta resistenza vetro e scartare il pellet.
  13. Spin il supernatante dal passo a 8000 xg per 10 min a 4 ° C.
  14. Rimuovere il surnatante IBM1 e risospendere il pellet aggiungendo lentamente 500 ml di IBM2. Tagliare la fine di un puntale e omogeneizzare delicatamente il pellet in IBM2 con miscelazione e agitazione movimenti. Aggiungere altri 4,5 ml di IBM2 alla miscela dopo il pellet è completamente sospesa.
    Nota: Evitare l'eccessiva triturazione mentre rompendo pezzi pellet più grandi come tla sua può danneggiare le membrane mitocondriali.
  15. Spin l'omogeneizzato / tessuto IBM2 a 8000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
    Nota: Questo passaggio può essere ripetuto in una provetta pulita centrifuga ad alta resistenza per più precisa quantificazione delle proteine ​​di mitocondri isolati al punto 4 dal residuo BSA può contribuire al contenuto totale di proteine.
  16. Rimuovere il surnatante e delicatamente, ma completamente risospendere il pellet con l'aggiunta di due incrementi 25 microlitri di IBM2 con un puntale con il suo punto di taglio. Mescolare delicatamente e miscelare il pellet dopo ogni aggiunta di 25 ml di IBM2. Mettere questo stock mitocondriale su ghiaccio.

3. omogeneizzazione di tutto il tessuto lisato (Tempo: ~ 45 min; può essere effettuato durante Passo 7)

  1. Rimuovere il muscolo da che è stato posto in azoto liquido dal punto 2.3 e incubare a temperatura ambiente fino completamente scongelati.
  2. Tritare il tessuto per ~ 30 secondi sul ghiaccio con pregiati forbici a punta.
  3. Aggiungere due cucchiai 100 microlitri di ZircoPerline in ossido di zirconio alla provetta da 1,5 ml microcentrifuga con tappo a vite dal punto 3.2 che contiene il tessuto tritato. Omogeneizzare il tessuto in un omogeneizzatore tessuto mulino tallone con due o tre cicli di 5 min ad una impostazione di velocità di 4-6 (regolazione media).
  4. Spin la miscela dal punto 3.3 a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con una pipetta 1000 ml punta dopo lo spin e il trasferimento in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Eliminare il pellet e posizionare il surnatante su ghiaccio.

4. Determinazione delle proteine ​​(Tempo: ~ 30 min)

  1. Determinare la concentrazione di proteine ​​di tutto il lisato tissutale (punto 3.4) e magazzino mitocondriale (passo 2.17) utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​BCA secondo le specifiche del costruttore.

5. I mitocondri Membrana di integrità; Citrato sintasi (CS) Attività (Tempo: ~ 15 min)

  1. Fare due separati 1: 20 diluizioni dello stock mitocondriale in acqua ad elevata purezza. Aggiungere0,1% di Triton 100-X per un campione e sonicare è a un livello basso (765 watt, l'ampiezza di 2). Lasciare l'altra soluzione sul ghiaccio. Riportare il campione ghiaccio dopo sonicazione.
  2. Eseguire un test citrato sintasi sia con il non-sonicato e sonicato diluizioni mitocondriali utilizzando un saggio spettrofotometrico precedentemente descritto 11,12.
  3. Determinare la percentuale delle membrane mitocondriali intatte in base alle seguenti equazioni:
    (Attività CS non sonicato ÷ sonicato CS attività) * 100


100- N (cento raggiunto da sopra)

6. I mitocondri isolamento di qualità; Western Blotting (Tempo: Secondo Lab Protocol)

  1. Eseguire Western blotting su tutta lisato tissutale e mitocondri isolati come descritto in precedenza 12.
    Nota: Utilizzare anticorpi primari per GAPDH (1: 1.000 diluizione 5% BSA / TBS-T) e COXIV (1: 1.000 diluizione 5% senza grassiLatte / TBS-T), seguita da anti-capra, e anticorpi secondari di coniglio, rispettivamente, (1: 10.000).

7. respirometrici Assay Run (Tempo: ~ 90 min)

  1. Effettuare test respirometrici desiderati usando basato O 2 tecnologia di misurazione del consumo di micropiastre come descritto in precedenza (vedi articolo correlato e Rogers et al 8).
  2. Determinare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) dividendo Stato 3 per Stato 4o (RCR) o dividere 3u Stato per Stato 4o. Utilizzare il mezzo (media) il punto, o il più alto (Stato 3) e tariffe più basse (4o Stato) dal punto a punto le tracce per determinare RCR.

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Representative Results

Attività citrato sintasi serve come misura per l'integrità della membrana dal citrato sintasi si trova nella membrana mitocondriale interna, e quindi non dovrebbero essere presenti nelle sospensioni di mitocondri con membrane intatte. La Figura 1 rappresenta l'attività citrato sintasi in campioni non sonicato mitocondriali rispetto sonicato campioni dello stesso isolamento. Sonicating i risultati dei mitocondri in un aumento statisticamente significativo nell'attività citrato sintasi (P <0,01). È importante sottolineare che il 92,5 ± 2,0% dei mitocondri erano intatti dopo l'isolamento.

La figura 2 illustra GAPDH ed espressione COXIV nei mitocondri isolati e l'intero lisato tessuto muscolare scheletrico. GAPDH è una proteina localizzata nel citosol, ma può anche essere trovato nel nucleo dopo traslocazione, mentre COXIV è una proteina trova nella membrana mitocondriale interna. L'espressione di GAPDH e COXIV sono evidenti in tutta tisslisato ue. Nel mitocondri isolati, espressione di COXIV si osserva, mentre solo deboli bande di GAPDH sono evidenti. Questi risultati indicano buoni isolamenti mitocondriali, con poca contaminazione da componenti non mitocondriali durante la procedura di isolamento.

La figura 3 è un tracciato rappresentante dei tassi di consumo di O 2 (OCR) in funzione del tempo per un test di accoppiamento (malate 10 mM di piruvato / 5 mm) eseguite dai mitocondri isolati utilizzando questo protocollo e eseguite con base di O 2 tecnologia consumo micropiastre. Ogni pannello rappresenta consumo di O 2 in diversi stati mitocondriali come descritto da Chance e Williams 13. Il primo pannello rappresenta basale consumo di O 2, o Stato 2. Il secondo pannello, dopo l'iniezione di ADP, rappresenta la massima accoppiato respirazione, o Stato 3. Il terzo pannello, dopo l'iniezione di oligomicina A (un inibitore del Complesso V), representi respirazione a causa della perdita di protoni, o dello Stato 4o. Il quarto pannello, dopo l'iniezione di FCCP, rappresenta la massima respirazione disaccoppiati, o 3U Stato. Infine, il quinto pannello, dopo l'iniezione di Antimicina A, rappresenta l'inibizione della respirazione ossidativa. Il rapporto di controllo respiratorio (RCR), una misura della funzione mitocondriale 1, è stato calcolato dividendo Stato 3 per Stato 4o. Tabella 4 sono riportati i valori medi RCR per le prove di accoppiamento substrato alternative che possono essere eseguite dal rendimento mitocondri da questo protocollo. È importante sottolineare che il consumo di O 2 tracciamento e gli alti valori RCR rappresentano altamente funzionante e mitocondri accoppiati. RCR valori qui riportati sono superiori o simili di quanto precedentemente riportato mediante protocolli di isolamento simili a murino muscolo scheletrico 7,14,15, accentuando così l'alta qualità dei mitocondri isolati durante questa procedura.


Figura 1: citrato sintasi attività. Citrato sintasi attività enzimatica come determinato spettrofotometricamente in preparazioni non sonicati e sonicati mitocondri. I valori sono espressi come media ± SEM. ** p <0.01. I dati rappresentano n = 3 accoppiato repliche biologiche e relativa espressa in mg di proteina.
Figura 1

Figura 2:. Citosolico e l'espressione della proteina mitocondriale in mitocondri isolati e intero lisato tessuto Sia mitocondri isolati e intere lisati di tessuto sono stati immunoblotted con COXIV e anticorpi GAPDH. La proteina mitocondriale, COXIV, era evidente in entrambi i campioni, tuttavia GAPDH era solo debolmente evidente nei mitocondri isolati. L'assenza di una banda GAPDH prominente in the mitocondri isolati è indicativo di poco la contaminazione da fonti non-mitocondriali durante la procedura di isolamento.

Figura 3
Figura 3:. Tracciamento Rappresentante di test accoppiamento con mitocondri isolati da topo muscoli scheletrici 10 malato mM piruvato / 5 mm accoppiato mitocondriali tracciati del test di respirazione come determinato dalla misurazione multi-bene di consumo di O 2. I valori sono espressi come media ± SD. Proteina mitocondriale caricato per bene era di 2,5 mg. OCR = O 2 tasso di consumo; ADP = adenosina difosfato; Oligo = Oligomicina A; FCCP = carbonile cyanide- 4 - (trifluorometossi) fenilidrazone; Anti-A = Antimicina A.

Reagente Concentrazione di stock Volume finale Messa Aggiunto
(M) (g / mol) (ml) (g)
Tris / HCl, pH 7,4 2 157.56 250 78,8
Tris / HCl, pH 7,4 1 157.56 250 39.39
KCL 1 74.55 500 37.28
Tris Base 1 121.14 100 12.11
EDTA, pH 8 0.5 416,2 100 ml (in 1 M Tris Base) 20.81
EGTA, pH 7,2 0.1 380,35 100 (in 1 M Tris Base) 3,801

Tabella 1: preparazione delle soluzioni madre.

Reagente Concentrazione di stock Messa Aggiunto Molarità Finale / Percentuale
(M) (go ml)
Saccarosio - 11.47 g 67 mM
Tris / HCl, pH 7,4 2 12,5 ml 50 mm
KCL 1 25 ml 50 mm
EDTA / Tris Base, pH 8 0.5 10 ml 10 mM
Essenzialmente FA gratuito BSA - 1 g 0.20%
pH 7.4, 500 ml: Aliquota 50 ml e congelare

Tabella 2: Preparazione di isolamento tampone per mitocondri 1 (IBM1).

Reagente Concentrazione di stock Messa Aggiunto Molarità Finale / Percentuale
(M) (go ml)
D-mannitolo - 10,9 g 200 MM
Saccarosio - 7,188 g 70 MM
EGTA / Tris Base 0.1 15 ml 5 mM
Tris-HCl, pH 7.4 1 3 ml 10 mM
pH 7.4, 300 ml: Aliquota 15 ml e congelare

Tabella 3: Preparazione di isolamento tampone per mitocondri 2 (IBM2).

Substrato media Concentrazione finale RCR
Piruvato / Malate 10 mM / 5 mM 16.2 ± 4.6
Succinate / Rotenone 10 mm / 2 micron 10.6 ± 3.8
Palmitoil L-Carnitina / Malate 40 mM / 1 Malate mM 6,7 ± 0,6
Il glutammato / Malate 10 mM / 10 mM 8.6 ± 0.4

Tabella 4: Rapporti di controllo delle vie respiratorie per Coupled rapporti di controllo mitocondriale respirazione Assays respiratorie come determinato dalla prima misurazione O 2 consumi con test respirometrici su micropiastra, seguiti dividendo massima accoppiato respirazione (ADP stimolata Stato 3) con la respirazione a causa di perdita protonica (Oligomicina. Uno Stato 4o risposta). I valori sono espressi come meuna SE ±. Proteina mitocondriale caricato per bene era di 2,5 mg per il piruvato / malato e succinato / saggi rotenone, e 3,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto per il palmitoil L-carnitina / malato e glutammato / saggi malate.

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Discussion

I metodi qui presentati forniscono una descrizione dettagliata di una procedura di isolamento mitocondriale da quantità minime (~ 75-100 mg) di topo muscoli scheletrici. Questa procedura di isolamento è in grado di produrre ad alto funzionamento, i mitocondri puro (~ 450 mg) come evidenziato da O 2 tassi di consumo, valori RCR, la massima attività citrato sintasi e di espressione proteica da immunoblotting. È importante sottolineare che i mitocondri isolati da questa procedura può essere utilizzato per più saggi respirometirc con tecnologia basata consumo micropiastra O 2 che consente un throughput elevato.

L'isolamento dei mitocondri dei muscoli scheletrici spesso richiede metodi duri per liberare i mitocondri da tessuto connettivo circostante e proteine ​​strutturali 7,16. Di conseguenza, le membrane mitocondriali possono diventare perturbato, compromettendo così l'attività (e quindi l'accuratezza) mitocondriale consumo di O 2 durante la successiva respiromesaggi elettriche. Includendo un passaggio aggiuntivo di tessuto macinazione usando lame di rasoio dopo l'asportazione del tessuto di un protocollo precedentemente descritto 7, una velocità del rotore significativamente ridotta per motore omogeneizzazione guidato era possibile (80 rpm vs. 1.600 rpm). Queste tecniche di omogeneizzazione e risospensione dolci porta ad una elevata percentuale di mitocondri con membrane intatte (92,5 ± 2,0%), come valutato dall'attività citrato sintasi seguendo la procedura di isolamento. I nostri risultati sono coerenti con Asmann et al. 17, che riportano tra 90-95% intatte preparati mitocondriali seguente isolamento dal muscolo scheletrico umano. È importante notare che la misurazione dell'attività citrato sintasi è più adatto per misurare l'integrità fisica delle membrane mitocondriali e non deve essere usato per valutare l'integrità funzionale dei mitocondri isolati. D'altra parte, O 2 saggi di consumo e determinare RCR ottenuti in questi test dovrebbero essere utilizzati per meache la funzione di mitocondri isolati 1. Inoltre, RCR può anche essere utilizzato come indicatore di mitocondri accoppiati. Pertanto, l'OCR e stati mitocondriali entro un intervallo tipico dal piruvato / malato dosaggio 8, ei valori elevati RCR ottenuti da una varietà di saggi respirometrici indica che i mitocondri derivati ​​da questo protocollo sono strettamente accoppiati e altamente funzionale.

Isolamento dei mitocondri intatti e puri ha importanti implicazioni per le analisi respirometic. La contaminazione di proteine ​​non mitocondriali nella preparazione mitocondriale finale può causare caricamento quantità di proteina mitocondriale disuguali ad ogni pozzetto durante le misurazioni consumo di O 2, diminuendo così la precisione di qualsiasi confronto tra esperimenti effettuati utilizzando diverse preparazioni di mitocondri. Inoltre, la contaminazione della preparazione mitocondriale con altri organelli che respirano (ad esempio, perossisomi) can diminuire ulteriormente la precisione delle misurazioni consumo di O 2. La presenza della proteina mitocondriale interna, COXIV, e l'assenza di una fascia importante della citosolica (e potenzialmente nucleare) proteine, GAPDH, nella nostra preparazione isolato mitocondriale seguente immunoblotting è indicativo di scarsa contaminazione da fonti non mitocondriali durante la procedura di isolamento .

È importante notare che, sebbene l'isolamento di una preparazione mitocondriale purificata è importante rispetto a quanto sopra citato, il mantenimento dell'integrità mitocondriale è di estrema importanza in saggi respirazione. La membrana mitocondriale esterna può essere facilmente danneggiata durante la procedura di isolamento, che porta alla fuga di citocromo c nel buffer isolamento e divenendo così limitante nel consumo di O 2 e la sintesi di ATP 18. Pertanto, l'integrità dei mitocondri isolati può essere ulteriormente valutata quantificando citocromoec espressione della proteina nel supernatante della preparazione mitocondriale (passo 2.15, prima della risospensione) e nei mitocondri isolati con Western blotting. Citocromo c non dovrebbe essere presente nella preparazione supernatante mitocondriale se le membrane mitocondriali sono intatte seguendo le procedure di isolamento.

Tutte le fasi di questo protocollo sono importanti, ma ci sono tre passaggi critici di questo protocollo. In primo luogo, la macinazione di rosso muscolo scheletrico con tre differenti lame (punto 2.4) è fondamentale, perché questo passaggio permette velocità del rotore più lente durante la fase di omogeneizzazione (passo 2.11). In secondo luogo, le prestazioni di molti passaggi su ghiaccio o in tamponi refrigerati è fondamentale per mantenere i mitocondri in uno stato di riposo prima saggi respirometrici su micropiastra. Infine, la risospensione dolce del pellet mitocondri in IBM2 è della massima importanza. Mescolare delicatamente mantiene l'integrità mitocondriale, che è cruciale per resp precisosaggi irometic.

Alcuni limiti di questa tecnica sono degni di nota. Innanzitutto, l'apparecchiatura necessaria (ad esempio, ultracentrifuge, motorizzato omogeneizzatore, etc.) per eseguire la procedura di isolamento può essere costoso. Inoltre, sono necessari diversi metodi di controllo della qualità al fine di garantire mitocondri puliti e intatti. Tuttavia, una volta che il ricercatore è esperto nella procedura di isolamento, mitocondri alta qualità sono ceduti che può essere utilizzato in una moltitudine di misurazioni compresi, ma non limitati a: Western blot, saggi enzimatici, RT-PCR, PCR, H 2 O 2 saggi , misure e alta produttività micropiastre respiratorie. È importante notare che questa procedura di isolamento è stato ottimizzato e modificato per piccole quantità di topo muscoli scheletrici e cautela dovrebbe essere presa quando si tenta di applicare tecniche di isolamento da un dato tessuto dalla stessa specie (e anche allo stesso tessuto da specie diverse ) ad altri tessuti / species. Per ottenere risultati ottimali, la ricerca della letteratura sarà l'opzione migliore quando si cerca di trovare il miglior metodo di isolamento per i tessuti / specie destinate.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Essentially Fatty Sigma Aldrich A6003 N/A
Acid Free- BSA
Tris/HCl Promega H5123 N/A
KCL Sigma Aldrich P9541 N/A
Tris Base Promega H5135 N/A
EDTA Sigma Aldrich E6511 N/A
EGTA Sigma Aldrich E4378 N/A
Sucrose Sigma Aldrich S7903 N/A
D-Mannitol Sigma Aldrich 63559 N/A
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Thermo Scientific 25200-056 N/A
Sodium Chloride
White Crystals or Crystalline Powder
≥99.0 %
Fisher Scientific BP3581 N/A
Sodium dodecyl sulfate Sigma Aldrich L3771  N/A
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750  N/A
Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched Sigma Aldrich 238651 N/A
Single Edge Razor Blades Fisher Scientific 12-640 N/A
Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers Fisher Scientific 352360 N/A
Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 1861284 N/A
1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap Thermo Scientific 3474 N/A
Zirconium Oxide beads Fisher Scientific C9012112 N/A
GAPDH antibody (1D4) Santa Cruz Biotechnology sc-59540 N/A
Anti- COXIV antibody Cell Signaling 4844s Any mitochondrial inner membrane protein will suffice
Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearh 711-035-152 N/A
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearh 115-001-003 N/A
Triton-X100 Sigma Aldrich X100 N/A
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23225 N/A
Pyruvic Acid, 98% Sigma Aldrich 107360 Store at 4 °C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Succinic Acid Sigma Aldrich S9512 Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% Sigma Aldrich M6413 Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
L-Glutamic acid Sigma Aldrich G1251 Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Palmitoyl L-carnitine chloride Sigma Aldrich P1645 Store at -20 °C
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) Sigma Aldrich 75351 Store at -20 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) Sigma Aldrich C2920 Store at 2-8 °C
phenylhydrazone
≥98% (TLC), powder [FCCP]
Antimycin A from streptomyces sp. Sigma Aldrich A8674 Store at -20 °C
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] Sigma Aldrich A5285 Store at -20 °C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay
Rotenone Sigma Aldrich R8875 Store at room temperature

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References

  1. Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
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1 Comment

  1. I've looked up in reference 11 and 12 but I found no detail information on citrate synthase activity measurement. Is there other material I can refer to?

    Reply
    Posted by: Weishun Y.
    December 27, 2016 - 8:23 PM

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