Caracterização de leucócito-rico em plaquetas de fibrina, A Novel Biomaterial

1Department of General Practice, School of Dentistry, Virginia Commonwealth University, 2Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University, 3Department of Periodontics, School of Dentistry, Virginia Commonwealth University
Bioengineering

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Madurantakam, P., Yoganarasimha, S., Hasan, F. K. Characterization of Leukocyte-platelet Rich Fibrin, A Novel Biomaterial. J. Vis. Exp. (103), e53221, doi:10.3791/53221 (2015).

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Abstract

Protocol

Todos os procedimentos sangue-desenho deve ser feito por profissionais licenciados e certificados. Uso de seres humanos para a pesquisa envolve a aprovação do Conselho de Revisão Institucional ou outra autoridade. Precauções especiais relativas consentimento informado e proteção de identificação do participante precisa ser seguido. Todos os experimentos listados neste protocolo impliquem a manipulação do sangue humano e / ou produtos derivados do sangue e equipamento de protecção individual adequado precisa ser usado em todos os momentos. Os resíduos devem ser consideradas como de risco biológico e eliminados de acordo com os regulamentos.

1. Venipuntura

  1. Identificar o paciente / participante e confirme com registros existentes. Explique o estudo em detalhe e para obter um consentimento informado.
  2. Ter uma bandeja configurada para cada paciente com tubos marcados em uma superfície plana estável.
  3. Explique o processo e fazer o assento paciente confortavelmente com o braço apoiado. Informar o paciente que ele ou she vai se sentir uma pequena pitada e deve ainda permanecem durante todo o procedimento.
  4. Coloque a agulha para o adaptador.
  5. Lavar as mãos e usar luvas.
  6. Prepare a fossa antecubital para punção venosa com a limpeza com 70% de álcool isopropílico em círculos concêntricos do centro para fora. Permitir que o site para o ar seco por 30 s.
  7. Identifique a veia adequada por palpação.
  8. Aplique o torniquete 3-4 em cima do local da punção certificando-se de que não é muito apertado (enquanto ainda sentir o pulso radial).
  9. Realize a punção venosa pela inserção do bisel da agulha 15-30 graus para a pele em um movimento suave. Empurrar o tubo de recolha de sangue através da agulha e recolher 9 ml de sangue total.
  10. Remover o torniquete. Remover o tubo da agulha.
  11. Retire a agulha e aplicar o quadrado de gaze no local da punção antes da remoção da agulha. Descarte a agulha em um recipiente adequado de risco biológico.
  12. Perguntar ao paciente para manter a prEssure no local da punção.
  13. Rotular os tubos
  14. Verifique o local da punção para ter certeza de sangramento parou.
  15. Aplicar curativo adesivo ou fita adesiva sobre o quadrado de gaze, pergunte se o paciente está se sentindo bem (sem dor, inchaço ou tonturas)
  16. Obrigado o paciente / participante antes da descarga.

2. Preparação de L-PRF

  1. Imediatamente após a coleta do sangue venoso em tubo de vidro seco vermelho-coberto, coloque-o na centrífuga.
  2. Centrifugar a 400 xg durante 12 min à temperatura ambiente após a colocação de um contrapeso adequado.
  3. Remover o tubo no final do ciclo. Observe a três camadas: o plasma pobre em plaquetas (PPP), fibrina rico em plaquetas (PRF-G) e base de RBC (Figura 1).
  4. Aspirar o PPP, utilizando uma pipeta. Usando uma pinça puxe a L-PRF para fora e coloque-a em uma malha de metal perfurado estéril.
  5. Usando bisturi cirúrgico, raspar a maior parte da camada RBC deixando cuidadosamente o lustrey casaco intacto.
  6. Gentilmente comprimir o coágulo L-PRF (usando a placa de metal estéril, peso aproximado de 225 g) durante 30 segundos. Plasma pobre em plaquetas será espremido para fora.
  7. Retirar a placa e levante com cuidado a membrana L-PRF. A membrana L-PRF está pronto para uso em experimentos 12.

3. Uniaxial ensaio de tração

  1. Coloque membranas L-PRF (n = 6) em um papel de filtro para facilitar o manuseio e soco em "ossos de cão" usando custom-made de metal morre (2,75 mm de largura em seu ponto mais estreito, com um comprimento de calibre de 7,5 mm).
  2. Medir a espessura de cada amostra a três pontos e tirar a média.
  3. Envolver a membrana cuidadosamente L-PRF no centro dos apertos de maxilas do sistema de teste uniaxial.
  4. Retire com cuidado o suporte de papel filer para expor a membrana L-PRF.
  5. Programa do instrumento para que a cabeça móvel está a funcionar a uma velocidade constante (10.0 mm / min) e iniciar a experiência quando a L-PRF ainda está molhado.
  6. Grave o módulo de elasticidade, energia para quebrar, e tensão na ruptura do software que acompanha o sistema de teste uniaxial. Estes valores são calculados automaticamente e nenhuma entrada definido pelo usuário é necessária. Por favor, consulte a Figura 3.

4. Sutura de retenção da resistência

  1. Coloque membranas de G-PRF (n = 3), sobre um papel de filtro para facilidade de manuseamento e corte em amostras rectangulares medindo 10 mm x (25 mm) utilizando um bisturi cirúrgico.
  2. Medir a espessura de cada amostra (média de 3).
  3. Adicione um orifício no centro da amostra, utilizando o arame de aço inoxidável ligadura ortodôntico (220 um de diâmetro).
  4. Passe o fio através da ligadura pinhole para formar um laço e prenda-a na máquina de ensaio de tração. Coloque a borda da membrana L-PRF para o aperto de mandíbula inferior 13.
  5. Programar o instrumento para que a cabeça móvel está a funcionar a uma taxa constante (10 mm / min) e de inícioo experimento.
  6. Grave o módulo de elasticidade, energia para quebrar, e tensão na ruptura do software que acompanha o sistema de teste uniaxial. Estes valores são calculados automaticamente e nenhuma entrada definido pelo usuário é necessária. Por favor, consulte a Figura 3.

5. O exame morfológico

  1. Prepare as amostras G-PRF para exame SEM usando um 10 milímetros biópsia cutânea soco e colocá-los em uma placa de 24 poços.
  2. Lavam-se as amostras com PBS e fixar com glutaraldeído a 2,5% (em PBS) durante 20 min.
  3. Desidratar as amostras por imersão em concentrações sequencialmente crescente de etanol (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) durante 5 minutos cada.
  4. Trata-se com 0,5 ml de 100% de HMDS (hexametildisilazano) durante 5 min. Arejar O / N para remover o excesso de HMDS 14.
  5. Amostras montar em tocos usando uma fita dupla face, por pulverização catódica-coat de platina por 70 seg e examinar em um microscópio eletrônico de varredura a funcionar a uma aceleraçãoperação tensão de 20 kV (ou contexto adequado).

6. genipina reticulação de L-PRF, tripsina e ninidrina Ensaio de Susceptibilidade

  1. Para preparar a genipina reticulado L-PRF, enxaguar as membranas com PBS e embeber em 4 ml de solução de genipina 1% (em etanol a 70%) durante 48 horas. Lavar com PBS antes de experimentos para remover o excesso de genipina 15, 16.
  2. Avaliar a estabilidade de reticulação genipina de L-PRF pela sua resistência à degradação pela tripsina. Ponto de L-PRF membrana (n = 3) e genipina reticulado L-PRF em 500 mL de 0,01% de tripsina e incubaram-se a 37 ° C durante 3 dias com uma mudança diária de tripsina.
    1. Pesar amostras no dia 1 antes da enzima exposição e no dia 3. A diferença de peso inicial e final representa uma degradação enzimática 17.
  3. Quantificar a quantidade de ligação cruzada em genipina tratada PRF-G (G-PRF) por ensaio de ninidrina. Primeiro prepare a curv padrãoe utilizando glicina (1 mM mM-0,031) curva para estabelecer a relação entre a concentração de amino ácido livre (FAA) e absorção.
    1. Calor PRF amostras com 1 mL de 2% (w / v) de ninidrina durante 15 min a 100 ° C.
    2. Deixar a solução arrefecer até à TA e adicionar 1,5 ml de etanol a 50%.
    3. Analisar a absorvância a 570 nm utilizando um espectrofotómetro adequado.
    4. Determinar percentagem de reticulação usando a fórmula que se segue 15

Equação 1

7. Ensaio de Proliferação de Células MTS

  1. Cresça MC3T3 (rato preosteoblasts calvárias) em Minimum Essential Medium modificação -alfa (aMEM) em frascos T-75 até uma monocamada confluente a 80% é obtido.
  2. Prepare fresca, estéril membrana L-PRF (abrir o tubo de L-PRF no interior da capa de cultura de células) e transferir a membrana em uma nova cultura de células prato.
  3. Meios aspirado a partir do balão e enxaguar a monocamada com PBS, adicionar 5 ml de tripsina a 0,05% e colocar o balão no 37 o C incubadora durante 5 min, pipetar o conteúdo do balão para um tubo de centrífuga e centrifugar a 400 xg durante 5 min.
  4. Decantar o sobrenadante, bata suavemente o tubo para quebrar o aglomerado de células e suspender novamente com 4 ml de MEM α fresco, dispensar uma mistura de suspensão de células (50 uL) e azul de tripano (50 ul) na hemocitómetro e contar o número de células
  5. Semente de 4x10 5 células de 10 mm anéis de clonagem de vidro colocados no topo de membranas de G-PRF para reter as células dentro das membranas (anéis pode ser removido após 24 h).
  6. No dia 4, lavar três vezes com PBS construções durante 10 min.
  7. Adicionar 1 ml de meio isento de soro e 200 ul de reagente MTS a cada poço e incubar durante 2 horas a 37 ° C.
  8. Medir a absorvância a partir de alíquotas de 200 ul a 490 nm.

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Representative Results

A imagem do microscópio electrónico de varrimento do coágulo L-PRF em diferentes secções (topo, meio e fundo) camada é ilustrado na Figura 2. Como pode ser observado, a porção de topo é composta predominantemente de rede de fibrina sem células. A camada do meio é enriquecido com plaquetas com evidência de activação e desgranulação sua. A camada inferior tem uma mistura de leucócitos e de células de sangue vermelhas aprisionadas dentro de uma matriz de fibrina.

As propriedades mecânicas foram avaliadas em dois modos: testes de tração uniaxial e teste de força de retenção de sutura. Os resultados demonstram o comportamento viscoelástico da L-PRF. Mesmo que o módulo de elasticidade é baixo (0,47 MPa), a membrana é difícil (a energia para quebrar, 5 N · mm) e é capaz de sofrer uma deformação significativa (217%, Figura 3). Dados de testes de retenção de fio de sutura, um indicador da capacidade da membrana para ser suturada para os tecidos, sugeriu um significativamente resistenteND material deformável (módulo-0,2 MPa, estirpe 140% e energia para quebrar-3,2 N.mm) em L-PRF (Figura 4).

Uma das limitações dos produtos de fibrina em medicina regenerativa é sua vida biológica curta. Feita a partir de fibrina endógena, L-PRF é susceptível a degradação enzimática e sofre fibrinólise. A fim de avaliar a resistência do G-PRF a degradação mediada por enzima, a L-PRF fresco foi sujeito a tratamento com tripsina (0,01%) e incubou-se a 37 o C. Observou-se uma completa degradação de L-PRF dentro de três dias. Genipina reticulação das membranas L-PRF diminuição da degradação por quase 60% ​​(Figura 5).

A capacidade do G-PRF membranas para suportar o crescimento celular foi avaliada através da cultura de osteoblastos de calvárias de ratinho em membranas reticuladas e não reticuladas. Coágulos não reticuladas foram submetidos a degradação a vários níveis, enquanto as membranas genipina reticulados mantiveram a sua estrutura e c suportadaell crescimento (Figura 6).

figura 1
Figura 1. Etapas na geração de L-PRF. (A) após centrifugação do sangue completo num tubo de vidro, de três camadas serão visíveis. (B) Depois de decantar o PPP, o G-PRF está a ser removido usando uma pinça estéril . (C) A base de células vermelhas do sangue está sendo raspado utilizando um bisturi e colocado em uma bandeja de metal perfurada (D). Após a compressão suave, o PPP é espremido para fora e uma membrana L-PRF empresa é formada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
SEM imagem de diferentes camadas de fresco PRF-L (A) representa a camada rica em fibrina;. (B) é uma zona de plaquetas enriquecidos com vários graus de activação; (C) é o revestimento de Buffy com numerosos leucócitos e (D) é a base de glóbulos vermelhos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Curvas de tensão-deformação seguintes carregamento mecânico de L-PRF no modo de ensaio de tracção uniaxial (A) e a força de retenção de sutura (B). O padrão de carga de cada uma das amostras é representado em cor diferente. Os dados de testes de tração uniaxial (A) indicam um módulo de baixo, uma grande deformação elástica e um fracasso rápido. Após a distensão por um sutura (B), G-PRF representa uma membrana que é dura (área sob a curva) bem como distensível. Bom agrupamento de dados sugere uma variação mínima entre as amostras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. fotografias de falha real em testes de força de retenção de sutura. A espessura de aço inoxidável fio ligadura ortodôntico 220 um foi passado através do meio de L-PRF e vinculados ao membro do maxilar superior da máquina de ensaio de tração. A outra extremidade foi ligada ao aperto inferior e esticada a uma taxa constante. Observe o alongamento da membrana e a sua resistência ao rasgo, o que sugere excelente resiliência de L-PRF.om / files / ftp_upload / 53221 / "target =" _ blank 53221fig4large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. A degradação de membranas de G-PRF após a incubação em 0,01% de tripsina. Todas as membranas L-PRF desintegrou completamente em tripsina no prazo de 3 dias, enquanto genipina reticulado L-PRF eram 60% mais estável. Isto mostra que a reticulação química pode ser uma estratégia viável para melhorar a longevidade das membranas L-PRF quando colocados in vivo.

Figura 6
Figura 6. Efeito da L-PRF reticulação sobre a viabilidade celular. Imagens representativas da cultura dia 4 de células MC3T3-G não reticulado sobre PRF (A), L-PRF (B) um reticulado-genipinaND cultura de tecido de plástico (C). Não Reticulado L-PRF degradada em cultura de extensão variável e mostrou a actividade das células semelhante ao plástico. Genipina reticulado L-PRF mantinham a sua estrutura e suportado sobrevivência celular robusta. Para a direita é dados quantificados (+ DP) de experimentos independentes com três repetições. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os concentrados de plaquetas autólogas são promissores no campo da medicina regenerativa 18 devido à abundância de factores de crescimento. No entanto, estas preparações não dispunham de uma estrutura definida que torna muito difícil a manipulação cirúrgica. Muitas vezes, as suspensões e géis não são retidos de forma eficaz no local de entrega, o que resulta em resultados imprevisíveis. PRF-L representa um grande avanço na evolução de concentrados de plaquetas na medida em que é, essencialmente, uma membrana de fibrina firme com plaquetas aprisionado. Estas membranas sólidas possuem excelentes características de condução, e pode ser suturado com segurança em um local anatomicamente desejado durante cirurgias abertas. No entanto, as suas propriedades físicas e biológicas são relativamente desconhecidos.

A L-PRF irá formar de forma consistente quando passos descritos acima sejam rigorosamente observadas (Figura 1). Uma das considerações importantes na geração de uma boa membrana G-PRF é o TIme atrasar entre coleta de sangue e centrifugação. O sucesso da técnica de G-PRF depende inteiramente da velocidade de recolha de sangue e transferência imediata para a centrífuga 19, normalmente no prazo de um minuto. É impossível gerar um coágulo de L-PRF bem estruturada (com o seu teor de células, a arquitectura de matriz e o factor de crescimento de libertação perfil específico), se a colheita de sangue é prolongada e não homogénea; uma pequena massa incoerente, friável de fibrina com conteúdo desconhecido é formado em vez disso.

Foi aceite que as interações entre células e mechanobiological matriz extracelular (MEC) tem uma influência fundamental em todos os aspectos do comportamento das células, incluindo migração, proliferação e diferenciação 20,21. L-PRF, um único tipo de coágulo de sangue, é formado sob as circunstâncias específicas e é composto de complexo de rede, ramificado de fibrina. Funções L-PRF como um ECM provisória que está virado para o tecido funcional durante a cicatrização. Ser submetido a mforças echanical, os resultados de cura bem sucedidos são dependentes da integridade estrutural de L-PRF e, portanto, elucidar as suas propriedades físicas é importante. Nós realizamos testes de tração uniaxial (para identificar as propriedades materiais intrínsecas) e testes de retenção de sutura (para identificar as características de falha) em fresco L-PRF. Ao contrário de gel PRP ou sangue coagulado que não tem um estruturas definidas, L-PRF se assemelha ao tecido conjuntivo denso com características de manipulação superiores. Nós relatamos um módulo de elasticidade de 0.470 MPa (DP = 0,107) para as membranas L-PRF e esticar duas vezes o seu comprimento inicial antes da falha (estirpe de 215%). Estes dados correspondem com a literatura 22,23 que relataram baixa rigidez (1-10 MPa) e alta tensão (até 150%) antes de quebrar. A diferença nos valores pode ser devido à utilização da rede de fibrina em comparação com a utilização de análise de AFM de fibra única de fibrina nos estudos acima mencionados.

Força de retenção de um fio de sutura é cirurgicamenteparâmetro importante de materiais de enxerto e é definida como a força necessária para puxar um sutura do enxerto, ou causar a parede do enxerto a falhar. Nossos experimentos usado direto em todo procedimento (como definido pela ANSI 24). A força necessária para a puxar o fio ligadura através da L-PRF de 3,23 N.mm (DP = 0,329). No geral, encontramos o L-PRF para ser resistente mecanicamente, capaz de suportar cargas e a capacidade de esticar o dobro da tensão e mantém suturas muito bem (deforma significativamente antes de rasgar).

A falta de estabilidade e integridade estrutural de L-PRF em ambientes biológicos é uma limitação importante na sua utilização em engenharia de tecidos. Procurou-se abordar esta questão por reticulação química L-PRF usando genipina. Ao contrário de gluteraldeído a qual está associada com a toxicidade, genipina biodegradável é uma molécula que ocorre naturalmente com baixa citotoxicidade. Após o tratamento genipina, as membranas foram significativamente estável em tripsina e supported proliferação de células ao longo de 4 dias. No entanto, apenas 20% de L-PRF foi reticulado com genipina (determinado pelo ensaio de ninidrina). Estes dados sugerem que, enquanto reticulação química é uma estratégia viável, outras alternativas precisam ser exploradas.

Com base nestes resultados, é evidente que a L-PRF é um romance biomaterial com atributos únicos: preparação previsível de sangue autólogo, a simplicidade do protocolo, arquitetura definida, impressionantes propriedades mecânicas e abundância de fatores de crescimento de plaquetas ativadas. O sangue é deixada a coagular sob condições fisiológicas sem exposição a anti-coagulantes, a trombina exógena e cloreto de cálcio. Todas essas características fazem do L-PRF prometendo biomaterial para aplicações em medicina regenerativa.

Um dos problemas clínicos para tratar na aplicação de L-PRF é a heterogeneidade na qualidade de componentes do sangue e as plaquetas. No momento, muito pouco se sabe sobreL-PRF gerada a partir de pacientes com distúrbios de coagulação ou pacientes em uso de medicações que afetam a coagulação do sangue (heparina, varfarina ou inibidores de plaquetas). As respostas a estas perguntas, sem dúvida, melhorar a nossa compreensão de cura, bem como contribuir para avançar no campo da medicina personalizada.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar e confirmar que não há conflitos de interesse associados conhecidos com esta publicação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Needle 19G BD 305186
Needle Disposal Container Fisherbrand 14-827-122
Red-Topped Glass Collection Tube BD 8020129
Gauze Pads Tyco 5750
Bandage Johnson & Johnson 5005989
Surshield Terumo SV*S19BL Safety winged infusion set
Blood Collection Assembly BD 303380
Tourniquets BD 367203
Brand Luer Adapter Vacutainer L42179
Intra-Spin System  Intra-Lock International ISS110 Centrifuge and Xpression L-PRF FabricationKit 
Pipettes (Serological & Micro) Corning
Scalpel Exelint 29552
MTS Bionix 200 MTS Systems Corporation Material testing systems
MTS Test Works 4 MTS Systems Corporation
Whatman Filter Paper Whatman 1004 070
SS Orthodontic ligature wire Patterson Dental 628-4228
200 Proof Ethanol Koptec V1001
Hexamethyldisilazane (HMDS) Aldrich 440191
Aluminium Mounting Stubs Ted Pella 16324
Double Sided Carbon Tape PELCO Tabs 16084-1
Scanning Electron Microscope JEOL LV 5610
Trypsin HyClone SH30042.01
Cell Culture Incubator Thermo Fisher Scientific Inc 51026282
Antibiotic-Antimicotic Gibco 15240-062
Genipin Wako 078-03021
Cell Culture Media Gibco 12000-022 Minimum Essential Medium-Alpha
MTS Reagent Promega G1118
PMS Reagent Sigma P9625
Spectrophotometer BioTek Epoch Spectrophotometer
10mm Glass Cloning Rings Corning 3166-10
T-75 Flask Corning 430641
DPBS Corning 55-031-PB
Ninhydrin 98% Aldrich 454044
24 Well Plate Corning 3987
Biopsy Punch Acu Punch P1025
Digital Micrometer Pittsburgh 68305
Glutaraldehyde Sigma G6257
12 Well Plate Corning 3336
96 Well Plate Corning 3596

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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