Protocol
すべての血液描画手順はライセンスと認定専門家によって行われるべきです。研究のためのヒト被験者の使用は、治験審査委員会またはその他の適切な権限の承認を必要とします。インフォームドコンセントに関する参加者の識別情報を保護する特別な予防措置が続いする必要があります。このプロトコルに記載されているすべての実験は、ヒトの血液および/または血液製剤及び適切な個人用保護具の取り扱いは常に着用する必要が伴います。廃棄物はバイオハザードと見なされ、規則に従って廃棄する必要があります。
1.静脈穿刺
- 患者/参加者を特定し、既存のレコードで確定します。詳細に研究を説明し、インフォームドコンセントを得ます。
- 平らな安定した面にマーキング管を個々の患者のために設定トレイを持っています。
- 手順を説明し、支持されたアームで快適に患者席を作ります。患者彼またはSHに知らせますeは小さなピンチを感じるだろうし、手順全体でまだ残っている必要があります。
- アダプタに針を取り付けます。
- 手を洗うと手袋を着用してください。
- 中心から外側同心円状に70％のイソプロピルアルコールで洗浄することにより、静脈穿刺のための肘前窩を準備します。 30秒間空気乾燥にサイトを許可します。
- 触診によって適切な静脈を識別します。
- （まだラジアルパルスを感じながら）それはあまりにもタイトではないことを確認して穿刺部位以上に止血帯3-4を適用します。
- 1滑らかな動きで皮膚に針15〜30度のベベルを挿入することにより、静脈穿刺を実行します。針を通して採血管を押して、全血の9ミリリットルを収集します。
- 止血帯を削除します。針からチューブを外します。
- 針を撤回し、針を除去する前に穿刺部位にガーゼ正方形を適用します。適切なバイオハザード容器に針を廃棄してください。
- 広報を維持するために患者を依頼穿刺部位でessure。
- チューブにラベルを付けます
- 出血が停止していることを確認するために穿刺部位を確認してください。
- 患者は大丈夫（痛み、腫れや光ふらつき）を感じていないかどうか尋ねる、ガーゼ正方形の上に接着剤包帯やテープで固定します
- 退院前に患者/参加ありがとうございました。
2. L-PRF準備
- すぐに赤張りの乾燥したガラス管の中に静脈採血後、遠心に配置します。
- 適切なカウンターバランスを配置した後、室温で12分間、400×gで遠心分離します。
- サイクルの終わりにチューブを外します。乏血小板血漿（PPP）、多血小板フィブリン（L-PRF）とRBCベース（ 図1）：三層に注目してください。
- ピペットを使用して、PPPを吸引します。ピンセットを使用すると、静かに、L-PRFを引き出し、滅菌、パンチングメタルメッシュに配置します。
- 外科用メスを使用して、慎重にバフを残すRBC層の大部分をこすりYコートそのまま。
- 穏やかに30秒間（無菌の金属板を用いて、およその重量225 g）のL-PRF塊を圧縮します。乏血小板血漿が絞り出されます。
- プレートを外し、ゆっくりとL-PRF膜を持ち上げます。 L-PRF膜は、実験12で使用するための準備ができています。
3.一軸引張試験
- 取り扱いを容易にするため、濾紙の上に置いて、L-PRF膜（N = 6）を、カスタムメイドの金属を使用して「ドッグボーン」にパンチ（7.5ミリメートルのゲージ長との狭いポイントで広い2.75ミリメートル）死にます。
- 3つのスポットで、各サンプルの厚さを測定し、平均値を取ります。
- 一軸試験システムのジョーグリップの中央にL-PRF膜を慎重に係合します。
- 注意深くL-PRF膜を露出させるためにファイラ紙支持体を引き裂きます。
- プログラム楽器可動ヘッドが一定の割合（10.0ミリメートル/分）で動作しているので、いつL-実験を開始PRFがまだ湿っています。
- 弾性率、破断エネルギー、および一軸テストシステムのソフトウエアから破断時のひずみを記録します。これらの値は自動的に計算されているとは、ユーザー定義の入力は必要ありません。 図3を参照してください。
4.縫合糸保持力
- 取り扱いを容易にするため、濾紙の上に置いて、L-PRF膜（n = 3）で、手術用メスを用いて、（X 25ミリメートル10ミリメートル）を測定長方形のサンプルに切断。
- 各サンプル（3の平均）の厚さを測定します。
- ステンレス製歯列矯正リガチャーワイヤー（直径220μm）を用いて、サンプルの中央にピンホールを作成します。
- ループを形成し、引張試験機にそれを修正するためにピンホールを介して結紮ワイヤを渡します。下顎のグリップ13にL-PRF膜の端を置きます。
- プログラム可動ヘッドが一定の速度（10 mm /分）と開始時に動作しているように、器具実験。
- 弾性率、破断エネルギー、および一軸テストシステムのソフトウエアから破断時のひずみを記録します。これらの値は自動的に計算されているとは、ユーザー定義の入力は必要ありません。 図3を参照してください。
5.形態学的検査
- 10ミリメートルの皮膚生検パンチを使用して、SEM観察用のL-PRFのサンプルを調製し、24ウェルプレートに配置します。
- PBSでサンプルを洗浄し、20分間（PBS中）、2.5％のグルタルアルデヒドで固定します。
- 5分ごとに（50％、70％、80％、90％及び100％）エタノールの濃度を増加させ、順次に浸漬することによって試験片を脱水します。
- 5分間、100％のHMDS（ヘキサメチルジシラザン）0.5mlで処理します。過剰のHMDS 14を除去するために 、O / Nを通気します。
- 両面テープを使用して、スタブのマウントサンプルは、70秒間白金コートスパッタやアクセルで動作する走査型電子顕微鏡で調べますerationの電圧20kV（または適切な設定）。
6. L-PRFのゲニピン架橋、トリプシン感受性およびニンヒドリンアッセイ
- ゲニピン架橋されたL-PRFを調製するために、PBSで膜を洗浄し、48時間（70％エタノール中）1％のゲニピン溶液4mlに浸します。過剰ゲニピン15、16を除去するために、実験前にPBSですすいでください。
- トリプシンによる分解に対する耐性により、L-PRFのゲニピン架橋の安定性を評価します。置き、L-PRF膜（n = 3）を0.01％トリプシン500μlの架橋のL-PRFゲニピンとトリプシンの日々の変化に伴って37℃で3日間インキュベートしました。
- 露出を酵素に先立って1日目にサンプルを秤量し、3日目に開始と終了の重量差は、酵素分解17を表しています 。
- ニンヒドリンアッセイにより、L-PRF（G-PRF）で処理ゲニピンで架橋の量を定量化します。まず標準CURVを準備電子グリシンを用いて、（1 MM-0.031 mM）の曲線は、遊離アミノ酸濃度（FAA）と吸光度との関係を確立します。
- 2％の1 mlの熱PRF試料（w / v）の100℃で15分間ニンヒドリン。
- ソリューションは、室温まで冷却し、50％エタノール1.5ミリリットルを追加することができます。
- 適切な分光光度計を用いて570 nmの吸光度を分析します。
- 15以下の式を使用して架橋の割合を決定します
7. MTS細胞増殖アッセイ
- 80％のコンフルエントな単層が得られるまで、T-75フラスコ中で最小必須培地 - アルファの変更（αMEM）にMC3T3（マウス頭蓋冠前骨芽細胞）を成長させます。
- 新鮮な、無菌のL-PRF膜を準備し（細胞培養フードの内側にL-PRFチューブを開く）と、新たな細胞培養皿上に膜を転送します。
- 吸引フラスコからメディアと、PBSで単層をリンス5ミリリットル0.05％トリプシンを追加し、5分間37 O Cのインキュベーター内でフラスコを置き、5用の400×gで遠心チューブと遠心分離機にフラスコの内容物をピペット分。
- 優しく、上清を除去し、細胞ペレットを破るためにチューブをタップして、新鮮なαMEMの4mlで再懸濁、血球計算板に細胞懸濁液（50μL）およびトリパンブルー（50μL）の混合物を分配し、数を数えます細胞
- 膜内に細胞を保持するために、L-PRF膜の上に置か10ミリメートルのガラスクローニングリング内の4×10 5個の細胞種（環は、24時間後に削除することができます）。
- 4日目に、10分間のPBS三度を有する構築物をすすぎます。
- 各ウェルに無血清培地の1ミリリットルと200μlのMTS試薬を加え、37℃で2時間インキュベートします。
- 490 nmで200μlのアリコートからの吸光度を測定します。
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Representative Results
（上部、中央および底部）層を、 図2に示されている別のセクションのL- PRFクロットの走査型電子顕微鏡画像。図から分かるように、頂部は無細胞で主にフィブリンネットワークの構成されています。中間層は、それらの活性化と脱顆粒の証拠と血小板と濃縮されています。下層は、白血球およびフィブリンマトリックス内に捕捉された赤血球の混合物を有しています。
一軸引張試験および縫合糸保持強度試験：機械的性質は、2つのモードで評価しました。結果は、L-PRFの粘弾性挙動を示しています。弾性率（0.47 MPa）と低い場合であっても、膜は厳しい（5 N・mmでの破断エネルギー）は、著しい変形（217％、 図3）を受けることができます。縫合糸保持試験からのデータは、膜の能力の指標は、組織に縫合するために、かなり厳しいAを示唆しND変形可能な材料（弾性率、0.2 MPaで、ひずみ140％とエネルギーは、ブレーク・3.2 N.mm）L-PRFで（ 図4）。
再生医療におけるフィブリン製品の制限の1つは、その短い生物学的生命です。内因性フィブリンから作られ、L-PRFは、酵素分解の影響を受けやすいと線維素溶解を受けます。 L-PRFの抵抗を評価するために、分解を媒介する酵素を、新鮮なL-PRFは、37 O℃でトリプシン処理（0.01％）にかけ、インキュベートしました。私たちは3日以内に、L-PRFの完全な分解を観察しました。 L-PRF膜のゲニピン架橋は、ほぼ60％（ 図5）による分解を減少させました。
細胞増殖を支持するL-PRF膜の能力は、架橋及び非架橋膜上で、マウス頭蓋冠骨芽細胞を培養することにより評価しました。ゲニピン架橋膜は、その構造を保持し、Cをサポートしながら、非架橋凝血塊は様々なレベルに劣化を受けましたエル成長（ 図6）。
L-PRFの生成を図1のステップ。（A）ガラス管中の全血を遠心分離した後、三層が表示されます。（B）は 、PPPをデカントした後、L-PRFは、滅菌ピンセットを用いて除去されています（C）赤血球ベースはメスを用いて掻き取り、穿孔金属トレイ（D）上に置かれています。穏やかな圧縮後、PPPが絞り出され、しっかりとL-PRF膜が形成されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図一軸引張試験モード（A）と、縫合糸保持強度（B）中のL-PRFの機械的負荷を次の3応力-ひずみ曲線 。各サンプルのローディングパターンは、異なる色で表現されます。一軸引張試験データ（A）は低い弾性率を示し、大きな弾性変形そして、迅速な障害。縫合糸（B）により膨満すると、L-PRFはタフである膜（曲線下面積）と同様に膨張性を表します。データの良好なクラスタリングは、サンプル間の最小の変化を示唆している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
縫合糸保持強度試験における実際の故障の図4写真。220ミクロンの厚さのステンレススチール結紮歯科矯正ワイヤーは、L-PRFの中央を通過し、引張試験機の上部ジョー部材に結び付けました。他方の端部は、下部グリップに取り付け、一定速度で延伸しました。 L-PRFの優れた弾力性を示唆し、膜や破れに対する抵抗性の伸びに注目してください。OM /ファイル/ ftp_upload / 53221 / 53221fig4large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
0.01％トリプシン中でのインキュベーションの後、L-PRF膜の分解図5。すべてのL-PRF膜は60％、より安定したゲニピン架橋L-PRFながら3日以内にトリプシンで完全に崩壊しました。これは、化学的架橋は、インビボで配置されたときL-PRF膜の寿命を改善するための実行可能な戦略であることができることを示しています。
細胞生存率に対するL-PRF架橋の図6.効果。未架橋のL-PRF（A）、ゲニピン架橋L-PRF（B）は、AのMC3T3細胞の4日間の培養の代表的な画像ND組織培養プラスチック（C）。架橋されていないL-PRF変数程度まで培養物中で分解し、プラスチックに似た細胞活性を示しました。ゲニピン架橋L-PRFは、その構造を維持し、強固な細胞の生存を支持しました。右側には3つの複製を持つ独立した実験からのデータ（+ SD）を定量化される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
自己血小板濃縮物が原因の増殖因子の存在量の18再生医療の分野において有望です。しかしながら、これらの製剤は、多くの場合、外科的操作が非常に困難に定義された構造を欠いていました。多くの場合、懸濁液およびゲルは、予測不可能な結果が得られ、送達部位に効果的に保持されません。 L-PRFは、血小板の進化に大きな進歩が、それは本質的に捕捉された血小板としっかりフィブリン膜であることを集中して表します。これらの固体膜は、優れたハンドリング特性を有し、かつ安全にオープン手術中に解剖学的に所望の位置に縫合することができます。しかし、その物理的および生物学的特性は、比較的知られていません。
以上の工程を厳密に（ 図1）に接着されたときにL-PRFは一貫形成します。良いL-PRF膜を生成する際の重要な検討事項の一つは、Tiで私は、採血し、遠心分離の間に遅延します。 L-PRF技術の成功は、完全に通常1分以内に、採血と遠心機19への即時転送の速度に依存します。血液採取が長く、均一されていない場合には、十分に構造化された（その特定のセルの内容と、マトリクス構造と成長因子の放出プロフィール）L-PRF塊を生成することは不可能です。不明なコンテンツとフィブリンの小さな非干渉性、もろい塊が代わりに形成されています。
これは、細胞と細胞外マトリックス（ECM）との相互作用がmechanobiological遊走、増殖および分化20,21を含む細胞の挙動のすべての面で重大な影響を有することが認められてきました。 L-PRF、血液凝固の固有のタイプは、特定の状況下で形成されたフィブリンの複合体、分枝状のネットワークで構成されています。治癒中に機能的な組織にひっくり返された暫定ECMとして、L-PRF機能。 Mが施されechanical力、成功した癒しの成果は、L-PRFの構造的完全性に依存しているので、それらの物理的性質を解明することが重要です。我々は、新鮮なL-PRFに（障害特性を識別するために）、一軸引張試験（固有の材料特性を識別するために）、および縫合保持試験を行いました。 PRPゲルまたは定義された構造を有していない凝固した血液とは異なり、L-PRFは、優れたハンドリング特性との密な結合組織に似ています。私たちは、L-PRF膜用0.470メガパスカル（SD = 0.107）の弾性率を報告し、失敗（215パーセントのひずみ）の前に2倍の最初の長さを伸ばします。破壊前に低い剛性（1-10 MPa）とし、（150％まで）高歪みを報告公表された文献22,23と、これらのデータが一致します。値の差は、上記の研究において、単一のフィブリン繊維のAFM分析の使用と比較して、フィブリンネットワークの使用に起因し得ます。
縫合糸保持強度は、外科的にあります移植材料の重要なパラメータとそれが移植片から縫合糸を引っ張ったり、移植片の壁が失敗させるのに必要な力として定義されています。我々の実験は、直横切っ手順（ANSI 24によって定義される）を使用しました。必要な力は3.23 N.mm（SD = 0.329）のL-PRFを通して結紮ワイヤを引っ張ります。全体的に、我々は、L-PRF負荷と緊張に限り二回ストレッチする能力をサポートすることができる、機械的にタフであることが判明し、非常によく、縫合糸を保持している（引き裂く前に大幅に変形します）。
安定性および生物学的環境におけるL-PRFの構造的完全性の欠如は、組織工学での使用における主な制限です。私たちは、化学的にゲニピンを使用して、L-PRFを架橋することによってこの問題に対処しようとしました。毒性と関連しているグルタルアルデヒドとは異なり、ゲニピンは低い細胞毒性を持つ天然に存在する生分解性分子です。ゲニピン処理後、膜は、トリプシンとスッポで有意に安定していました4日間にわたり細胞増殖をRTED。しかし、L-PRFの20％のみがゲニピンで架橋した（ニンヒドリンアッセイによって決定されます）。このデータは、化学的な架橋が実行可能な戦略であるが、他の選択肢を探求する必要があることを示唆しています。
自己血から予測可能な製剤、プロトコルの簡単さ、定義されたアーキテクチャ、印象的な機械的特性、活性化血小板からの成長因子の存在量：これらの知見に基づいて、L-PRFが一意の属性を持つ新規な生体材料であることが明らかです。血液は、抗凝固剤、外因性のトロンビンおよび塩化カルシウムに暴露なしで生理的条件下で凝固させました。これらの特徴のすべては、再生医療への応用のためのL-PRF有望なバイオマテリアルを作ります。
L-PRFのアプリケーションに対処するために臨床的問題の一つは、血小板および血液成分の品質が不均一です。現在では、非常に少ないが約理解されていますL-PRF血液凝固（ヘパリン、ワルファリンまたは血小板阻害剤）に影響薬の凝固障害や患者と患者から生成されます。これらの質問に対する回答は間違いなく癒しの我々の理解を向上させるだけでなく、オーダーメイド医療の分野を前進させるために貢献していきます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありませんし、この出版物に関連した興味のある既知の競合がないことを確認してください。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Needle 19G | BD | 305186 | |
| Needle Disposal Container | Fisherbrand | 14-827-122 | |
| Red-Topped Glass Collection Tube | BD | 8020129 | |
| Gauze Pads | Tyco | 5750 | |
| Bandage | Johnson & Johnson | 5005989 | |
| Surshield | Terumo | SV*S19BL | Safety winged infusion set |
| Blood Collection Assembly | BD | 303380 | |
| Tourniquets | BD | 367203 | |
| Brand Luer Adapter | Vacutainer | L42179 | |
| Intra-Spin System | Intra-Lock International | ISS110 | Centrifuge and Xpression L-PRF FabricationKit |
| Pipettes (Serological & Micro) | Corning | ||
| Scalpel | Exelint | 29552 | |
| MTS Bionix 200 | MTS Systems Corporation | Material testing systems | |
| MTS Test Works 4 | MTS Systems Corporation | ||
| Whatman Filter Paper | Whatman | 1004 070 | |
| SS Orthodontic ligature wire | Patterson Dental | 628-4228 | |
| 200 Proof Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Aldrich | 440191 | |
| Aluminium Mounting Stubs | Ted Pella | 16324 | |
| Double Sided Carbon Tape | PELCO Tabs | 16084-1 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL | LV 5610 | |
| Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
| Cell Culture Incubator | Thermo Fisher Scientific Inc | 51026282 | |
| Antibiotic-Antimicotic | Gibco | 15240-062 | |
| Genipin | Wako | 078-03021 | |
| Cell Culture Media | Gibco | 12000-022 | Minimum Essential Medium-Alpha |
| MTS Reagent | Promega | G1118 | |
| PMS Reagent | Sigma | P9625 | |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch Spectrophotometer | |
| 10mm Glass Cloning Rings | Corning | 3166-10 | |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| DPBS | Corning | 55-031-PB | |
| Ninhydrin 98% | Aldrich | 454044 | |
| 24 Well Plate | Corning | 3987 | |
| Biopsy Punch | Acu Punch | P1025 | |
| Digital Micrometer | Pittsburgh | 68305 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257 | |
| 12 Well Plate | Corning | 3336 | |
| 96 Well Plate | Corning | 3596 |
References
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