Einfache und genaue Mechanotherapie Profilierung Micropost Arrays

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Bioengineering

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Goedecke, N., Bollhalder, M., Bernet, R., Silvan, U., Snedeker, J. Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays. J. Vis. Exp. (105), e53350, doi:10.3791/53350 (2015).

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Abstract

Introduction

Mechano empfindlichen zellbasierte Assays ermöglichen die Untersuchung von adhärenten Zellen, mit einer breiten Palette von Anwendungen, die die zentrale Rolle, die Mechanik in der Zellbiologie spielen reflektieren. Diese Anwendungen konzentrieren sich oft auf die zugrunde liegenden Mechanismen, die subzelluläre Prozesse oder Ganzzellverhalten zu fahren. Einerseits können externe Umweltfaktoren, wie die extrazelluläre Matrixzusammensetzung oder Matrixsteifigkeit dramatischen Einfluss auf die mechanischen und biologischen Antwort der Zelle. 1 Das gleiche kann nach der Verwendung von vielen Klassen von pharmazeutisch wirksamen Verbindungen beobachtet werden, deren Wirkungen sind häufig unter Verwendung von Zellkulturmodellen charakterisiert. 2 auf der anderen Seite genotypischen Eigenschaften, wie sie durch spontane oder experimentell induzierter Genmutationen verursacht werden, können starke Änderungen Zellphänotypen, die mit Veränderungen im Zytoskelett Struktur und Funktion zugeordnet sind induzieren. 3 Diese Beispiele sind nur ein paar der vielen möglichenThemen, für die mechanische Phänotypisierung der Zellen von Bedeutung ist, und alle diese sind zweckmäßigerweise mit micropost Arrays untersucht.

Zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels, haben rund 200 Artikeln veröffentlicht worden beschreiben zell micropost Interaktion. Diese Arbeiten diskutieren theoretische Aspekte der micropost Ablenkung Grundlagen sowie praktische Hinweise zu deren Herstellung. Der erste Artikel der Wechselwirkung von Zellen und flexible micropost Arrays beschreibt, wurde von Tan und Kollegen im Jahr 2003 4 veröffentlicht Im Gegensatz zu klassischen Traktionskraft-Mikroskopie (TFM), wo kontinuierliche weichen Substraten verwendet werden, um Nanonewton-Wägezelle Kontraktilität, Tan et al schätzen. ein Verfahren beschrieben, unter Verwendung von mehreren eng beabstandeten vertikalen Balken aus Silikonelastomer hergestellt. Die Hauptvorteile dieser Technik ergeben sich aus zwei Hauptfunktionen. Erstens, um die Zell-Substrat scheinbare Steifigkeit zu ändern braucht man nur die micropost Abmessungen verändern, währendDie Substratzusammensetzung ansonsten konstanten und wodurch Unterschiede in der Oberflächentopologie und Chemie. Zweite microposts handeln wie einzelne Federn, die diskret mit Kraft und räumlichen Auflösungen in der Größenordnung von einzelnen fokalen Adhäsionen untersucht werden kann und die analytischen Herausforderungen, die inhärent analoge Analyse durch Standard-TFM sind zu reduzieren.

Heute ist die Palette von Anwendungen für micropost Arrays stark gerade die Abbildung der Kräfte für ein paar Einzelzellen überschreitet. So berichtet Akiyama die Verwendung eines isolierten Rückengefäß Gewebe von einem Falter Raupe als Aktuator für eine micropost Array, um ein Insekt mit Muskelkraft betriebene autonome Mikroroboter zu entwickeln. 5

Allerdings haben die meisten Veröffentlichungen zur microposts auf Studien von Erkrankungen wie Infektionen oder Krebs. Zum Beispiel haben micropost Arrays verwendet, um die Krafterzeugung von gebündelten Typ IV-Pili von Neisseria gonorrh studierenOEA Kolonien, die mit Signalkaskaden Verbesserung Infektion assoziiert ist. 6 Andere haben microposts verwendet, um Brustkrebszellen mit pharmazeutischen Verbindungen zur Förderung der Zytoskelett behandelt zu studieren. 7

Ablenkung eines micropost wird oft mit klassischen Balkentheorie beschrieben, für einen Freischwinger mit einem Ausgabeaufschlag unter der Annahme der Zelle misst nur auf die Spitze der micropost. Hier wird die aufgebrachte Kraft F, die eine Durchbiegung δ verursacht, hängt von der micropost des "Biegesteifigkeit" k und wird berechnet durch:

Gleichung 1 (1)

mit E, I, und L der Elastizitätsmodul, Flächenträgheitsmoment und Strahllänge auf. Allerdings ergibt sich aus dieser Gleichung geben nur einen allgemeinen Angleichung der Kräfte am Werk, da Strahl Scher- und Biege sowie Substrat Verziehen nicht in ac getroffenGraf. In Anbetracht, dass microposts werden typischerweise aus weichen Materialien wie Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt -basierte Silikonkautschuk müssen diese Faktoren einbezogen werden. . Schoen et al gezeigt, daß es eine solche Korrekturfaktor auf der Basis des Seitenverhältnisses des micropost (L / D) und der entsprechenden Polymer Poissonzahl v 8 Es wird durch gegeben.:

Gleichung 2 (2)

Mit T-Neigung (v) ein Neigungskoeffizienten, die Anpassungsparameter a = 1,3, wie in dem gleichen Artikel gefunden werden enthält:

Gleichung 3 (3)

Das bedeutet, dass ein micropost korrigiert Steifigkeit k corr ist das Produkt aus dem reinen Biegesteifigkeit k = k Kurve und der Korrekturfaktor Korrgegeben durch:

Gleichung 4 (4)

Daher sollten Zellkraftberechnungen unter Verwendung des verfeinerten Variante der Gleichung (1) gerade lesen werden:

Gleichung 5 (5)

Die Auswirkungen der Korrektur offensichtlicher, sobald typische Werte für micropost Abmessungen eingesetzt werden. Zum Beispiel ein 15-Mikron lang micropost mit einem kreisförmigen Querschnitt und einem Durchmesser von 5 um aus PDMS-basierten Silikonkautschuk führt zu einem Korrekturfaktor von 0,77 und somit eine korrigierte Berechnung würde der ausgeübten Kräfte Zelle um 23% zu überschätzen. Dies wird umso schwerer für microposts mit kleineren Seitenverhältnisse.

Traditionell wurde micropost Bildanalyse auch auf idealisierten Strahlbiegetheorie basiert. Im Jahr 2005 die Gruppe, die die Verwendung von MICR-Pionieropost Arrays veröffentlichte eine Bildanalyse-Software für micropost Analyse geeignet 9 Die Software benötigt eine Software-Lizenz und der Benutzer muss drei Bilder für jede Position zu nehmen. jeweils einer aus oberen und unteren Ebenen der micropost im Sendemodus und ein anderer in der Fluoreszenzmodus mit dem gefärbten Zelle. Nach einem Vergleich der oberen und unteren Positionen für jede micropost die Software bestimmt einen Kraftvektor Feld und berechnet damit verbundenen Parameter wie Kraft pro Beitrag. Andere Softwarepakete bestehen und deren Analyse Prinzipien werden kurz in die entsprechenden Artikel, die sie beschreiben, erwähnt, aber diese Analysesoftwarepakete sind in der Regel nicht öffentlich verfügbar. 10,11

Die micropost Anordnungen zum Abbilden von Zellkräften konstruiert werden kann als welche entweder in einer orthogonalen micropost Layout oder einem hexagonalen ein, von denen die letztere den Vorteil haben äquidistanten Abstände zwischen allen benachbarten microposts klassifiziert werden. Typische microposts have einen runden Querschnitt und ihre Abmessungen im Bereich von 1,0 um bis 10 um im Durchmesser und 2 bis 50 um in der Länge. 4 jedoch microposts mit elliptischen oder quadratischen Querschnitt haben ebenfalls berichtet. 12,13

Die Verwendung von PDMS-basierten Silikon-Mischungen als micropost Material ermöglicht zum Addieren Nanopartikel in der Mischung. Zum Beispiel das Hinzufügen Cobaltnanostäbe ermöglicht eine magnetische Aktivierung des micropost und somit gibt einen weiteren Freiheitsgrad, um mögliche experimentelle Designs. 14 Die meisten Gruppen auf flachen starren Substraten wie Deckglas oder in einer Petri-Schale produzieren ihre micropost Arrays. Allerdings Mann und Mitarbeiter berichteten kürzlich über eine micropost Array auf einem dehnbaren Membran gebildet. 15. Dies ermöglicht die Anwendung von Zelldehnungskräfte an anhaftenden Zellen während des Studiums lebenden Zellen subzellulären dynamischen Reaktionen in Bezug auf Zellkontraktilität.

Die breite Anwendung und die meisten Established Verfahren zur Herstellung micropost Arrays auf Weich-Lithographie, wie in den Protokollen der aufschluss Sniadecki und Kollegen. 16-18 Kurz Standardreinraumprozesse beschrieben werden, verwendet werden, um die Mikrostrukturen auf einem Siliziumwafer unter Verwendung von Fotolack SU8 Ganzes erzielt. Dies wird durch ein Kopierverfahren, bei dem der Silikonkautschuk über die Strukturen ihre Übertragung in Formen gegossen, gefolgt. In einem zweiten Schritt diese Formen werden verwendet, um die anfängliche Mikrostruktur unter Verwendung von Silikonkautschuk auf einem gewählten Substrat replizieren. Doch trotz der großen und wachsenden Zahl von Publikationen, um ihre Anwendung beziehen, zur Schaffung einer Herstellungsprozess für microposts nimmt sehr viel Zeit sogar für Mikrotechnik-Experten; es gibt viele Prozessschritte, die Optimierung und Anpassung an die spezifischen Testumgebung und micropost Layout benötigen, um ein akzeptables Qualitätsniveau zu liefern.

Kommerzielle micropost Arrays sind jetzt in einer ready-t verfügbaro-Nutzung ("off-the-shelf") Format mit einer gleichbleibend hohe Qualität. Als solche sind sie eine Alternative zu dem Vor-Ort-Erzeugung erforderlichen komplizierten und langwierigen Herstellungsprozess. In dieser Arbeit wurde ein im Handel erhältlicher micropost Array zur Abbildung zellulärer Kräfte mit einem einzigen Bild Hellfeldmikroskopie verwendet. Noch wichtiger ist in diesem Artikel beschrieben und dokumentiert eine voll funktionsfähige Open Source-Software mit dem Namen MechProfiler, die zum Download als Begleitmaterial zu diesem Manuskript zur Verfügung steht. Eine aktiv gepflegte Version der Software finden Sie auch bei http://www.orthobiomech.ethz.ch gefunden werden.

Die Kombination aus einem "off-the-shelf" Assay und einem kompatiblen Open-Source-Analyse-Software deutlich senkt die Eintrittshürde, um genaue TFM Experimenten zu erreichen. Forscher ohne Zugang zu entweder Reinraumanlagen oder Software-Entwicklungskompetenz können zelluläre Kräfte erfolgreich zu analysieren. Es einem Benutzer ermöglicht, auf den mechanos konzentrierenensitivity Assay Ausgangs anstatt die Technologie selbst, und macht Zugkraftmessungen zur Verfügung, um eine breitere Gemeinschaft. Darüber hinaus ist dies ein wichtiger Schritt, um den Weg zur vollautomatischen Überprüfungen micropost Arrays zu ebnen.

Die MechProfiler Analyse-Software verarbeitet Bilder in Dateiformat TIFF, PNG, BMP und JPG. Bilder können unter Verwendung von Fluoreszenz, Phasenkontrast und Hellfeld-Lichtmikroskopie genommen werden. Die Standalone-Programm läuft zusammen mit dem freien Matlab Compiler Runtime (verfügbar unter: Abbildung 12) und die zugrunde liegenden Algorithmen erlauben schlanke Bildverarbeitung, die dem Benutzer ermöglicht, Bilder mit einzelnen oder mehreren Zellen in etwa 1 min zu verarbeiten. Ferner können diese Zellen entweder lebenden oder "fixiert".

Die MechProfiler Software kann die Datenanalyse Durchsatz stark zu erhöhen, indem sie sich auf die Reproduzierbarkeit der Qualität kommerzieller micropost Anordnungen, genauer gesagt, die Standard & #8220; nicht abgelenkten "Position jeder Eintrag in der Anordnung gegen ein ideales Raster ausgegangen werden (für das Gitter in der für diese Studie verwendeten Arrays Fertigungsabweichungen betrugen weniger als 100 nm).

Kurz öffnet man eine Auswahl von Bilddateien für die Analyse, schneidet sie in den Bereich von Interesse definiert, die Beiträge von Zellen bedeckt oder die verworfen werden müssen, bestimmt die Postpositionen, berechnet die Durchbiegungen / Kräfte gegen idealen Rasters und schließlich speichert alle zellspezifischen Daten mit der Möglichkeit für den Export, darunter zu einem Standard-Office-Tabellenkalkulation.

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Protocol

1. Kultivieren von Zellen auf Micropost Arrays

Hinweis: Alle Schritte müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt, um die Sterilität zu gewährleisten. Die hier angegebenen Volumina sind für T25 Zellkulturflaschen. Das Zellkulturmedium Rezept und Zellaussaatdichte für Knochenkrebszelllinien HuO9 und M132 optimiert.

  1. Bereiten Sie eine Zellkultur für die Aussaat auf eine micropost Array.
    1. Untersuchen Sie den Zellkulturqualität, indem die Kulturflasche auf einem Standard-Lichtmikroskop. Sicherzustellen, dass die Zellen eine typische Wachstum und Morphologie durch Schätzen, wie viel von der Kulturflasche Boden bedeckt. Eine Abdeckung von 70% -80% entspricht einer gesunden Wachstumsrate. Achten Sie auf die Höhe der schwimmenden Zellen, wie sie abgestorbene Zellen und / oder einen überwucherten Kultur zu repräsentieren.
    2. Trypsinize Zellen durch Entfernen Medium und Waschen mit 4 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -Puffer. Hinzuzufügen 0,8 ml 1x Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Inkubation bei RT, bis die Zells dislodge, die etwa 2-4 min dauert. Überprüfen Sie den Prozess mit dem Mikroskop und gelegentlich die Flasche klopfen sanft um das Verdrängen zu unterstützen.
    3. 5 ml Zellkulturmedium (Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptavidin (Pen / Strep)), um die Reaktion zu stoppen und zu waschen Restzellen, die still sitzen auf der Unterseite des Kolbens ist. Anschließend pipettiert diese Suspension nach oben und unten mehrere Male, um eine homogene Mischung zu erhalten. Sicherstellen, dass alle Lösungen in der ursprünglichen Wachstumsbereich der Flasche pipettieren, um eine effektive Verdrängen zu gewinnen.
    4. Übertragen Sie die Zellsuspension in in ein 15 ml Röhrchen und zentrifugieren Sie es mit einem Tischzentrifuge bei 0,5 × g für 3 min.
    5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellpellet in 5 ml Medium durch Auf- und Abpipettieren 5 mal. Achten Sie darauf, um die Erzeugung von Luftblasen zu vermeiden, während dies zu tun.
    6. Bestimmen Sie die Zelldichte mit Hilfe eines Zellzählung Kammer und eine Licht microscope. Überprüfen Sie die Zellsuspension in Zellzählung Kammer für Zellaggregate und sorgen nur Einzelzellen für die nachfolgende Experiment haben. Pipette wieder nach oben und unten mehrere Male, wenn die Zellen dazu neigen, Aggregate, sie zu trennen bilden.
    7. Verdünnen der Zellsuspension mit ausreichender Medium, um ein Zelllösung von 25.000 Zellen / ml zu erhalten. Gut mischen durch Invertieren des geschlossenen Rohr mehrmals.
  2. Bereiten Sie eine micropost Array für Zellaussaat.
    Kritische Anmerkung: auf die micropost Array Sie pipettieren nicht direkt, da dies möglicherweise die microposts schaden, vor allem, wenn unerwünschte Luftblasen eingebracht werden. Darüber hinaus stellen Sie sicher, dass die micropost Array trocknet nie aus, wie auftretende Kapillarkräfte zu Kollabieren der microposts führen.
    1. Legen Sie das Glassubstrat mit dem micropost Array Seite nach oben in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte mit Hilfe einer Pinzette und nass ist es durch Zugabe von 1 ml Ethanol (99%). Inkubieren bei Raumtemperatur für 20-30 sec.
    2. Verdünnen Sie das Ethanolstufenweise durch Zugabe von ungefähr 1 ml sterilem entionisiertem Wasser (DI-Wasser) an der Bettseite und Absaugen ungefähr 1 ml unter Verwendung einer Transferpipette oder Absaugvorrichtung. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens 3 mal.
    3. Ersetzen den DI-Wasser mit PBS-Puffer auf die gleiche Weise durch Zugabe und Absaugen von ungefähr 1 ml. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal.
    4. Ersetzen Sie den PBS-Puffer mit mittlerer durch Zugabe und Absaugen etwa 1 ml Medium. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal.
  3. Pipette 1 ml Zelllösung (25.000 Zellen) auf der jeweils vorbereitet micropost Array. Schließen Multiwellplatte und überträgt es auf einen Inkubator (CO 2 5%, 37 ° C). Lassen Sie die Zellen anhaften und wachsen auf der Oberseite des microposts für 6 -7 Std.
  4. Untersuchen Sie den Klebeprozess gelegentlich unter Verwendung eines Licht ein Mikroskop. Überprüfen Sie, dass die meisten der Zellen erscheinen ausge über mehrere microposts verbreiten.

2. Fixing & Färben von Zellen

Hinweis: Alle Schritte undVolumina hier angegebenen sind für eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte. Es empfiehlt sich, zu einem Zeitpunkt, um ein Austrocknen der Vertiefungen nach dem Ansaugen einer Flüssigkeit, die in einem Kollabieren der microposts führt vermeiden verarbeiten nicht mehr als vier der zwölf Vertiefungen.

  1. Aspirat Medium aus dem Bohrloch und waschen Zellen 2x mit 1 ml PBS-Puffer. Achten Sie darauf, um eine sanfte Kraft aufzubringen, während dem Waschen mit PBS, um Zelltrümmer, die auf dem micropost Array während der Inkubation angesammelt entfernen und toten Zellen zu lösen.
  2. Befestigen Sie die Zellen mit 0,5 ml 3,7% gepufferte Formaldehydlösung für 5 min.
  3. Ersetzen Sie die Formaldehyd-Lösung durch Waschen der micropost Array 2x mit 1 ml sterilem DI-Wasser.
  4. Färben die Zellen mit Farbstoff (0,05% Coomassie Brilliant Blue in 50% Wasser, 40% Ethanol und 10% Essigsäure) für ca. 90 sec. Waschen Sie überschüssige Färbelösung off 2x mit 1 ml sterilem DI-Wasser. 1 ml VE-Wasser auf Array micropost.
  5. Überprüfen Färbungsergebnis mit einem Lichtmikroskop. Wiederholen tHE-Färbung Schritt, wenn Zellkörper ist zu schwach, um sichtbar gemacht werden.
  6. Shop micropost Arrays mit den gefärbten Zellen auf der Oberseite in einem Kühlschrank bei 4 ° C. Stellen Sie sicher, sie unter Wasser zu allen Zeiten zu halten.

3. Cell Imaging

Hinweis: Schritt 4 gilt nur für Mikroskope, ohne unendlich korrigierte Optik.

  1. 2 ml VE-Wasser in eine Petrischale mit einer dünnen Glasboden für hochauflösende Bildgebung.
  2. Bringen micropost Array mit einer Pinzette in den bildgebenden Schale mit dem microposts nach oben zeigt.
  3. Legen Sie die Imaging-Petrischale auf einem beweglichen Tisch eines Lichtmikroskops.
  4. Drehen des Kompensationsrings des Objektivs zur Bilderzeugung verwendet, bis die Anzahl auf der Skala stellt die Gesamtdicke aller Materialien entlang des optischen Pfades für die Fehlanpassung der Brechungsindizes des Glassubstrats, das Siliconelastomer und der Flüssigkeit auf der Oberseite zu kompensieren. Dies sollte zu einem hellen Erscheinungsbild der microposts führenKerne.
  5. Schließen Sie die Blende auf der Beleuchtungsseite nach unten auf 50% und keine Phasenkontrastringe zu entfernen aus dem Strahlengang ermöglicht eine gewöhnliche Hellfeld-Modus.
  6. Richten Sie die micropost Array, das die microposts bilden eine horizontale Linie über das Beobachtungsfeld. Definieren Sie einen Startpunkt (zB links oben) und bewegen Sie die Petrischale schrittweise über die Bühne Scannen des micropost Array während der Einnahme von zahlreichen Bildern.
  7. Nehmen Sie alle Bilder mit der höchsten Auflösungseinstellung für die Kamera mit einem 20X oder 40X-Objektiv. Ziel ist es, eine einzelne Zelle in der Mitte des Bildes haben.
  8. Kehren entlang der z-Achse durch das Substrat, bis die micropost Spitzen scharf sind. Verwenden Sie die Feinabstimmung Fokusrad des Mikroskops und drehen Sie ihn in Richtung Konzentration auf die micropost unten für ca. 2-3 & mgr; m.
  9. Stellen Sie die Standard-Bildgebungsverfahren, indem sie Testbildreihe aus einem Feldabschnitt fegt durch die Bildaufnahmeparameter ein zu einer Zeit (zB Belichtungszeit,Blendeneinstellung, Lampeneinstellungen usw.). Analysieren Sie Bilder mit MechProfiler und bestimmen einen geeigneten Parametersatz für eine schnelle und zuverlässige Analyse.

4. Bildanalyse mit Open Source Software "MechProfiler"

Hinweis: Alle Software-Funktionen können Sie mit einem Zeigegerät mit der linken Maustaste aktiviert werden. Allerdings wird ein ausgebildeter Bediener die dokumentierten Tastenkombinationen entwickelt, um auf der linken Hälfte der Tastatur, um eine effiziente zweihändige Bildverarbeitung zu ermöglichen verwenden.

  1. Starten Sie Bildanalyse-Software MechProfiler und öffnen Sie eine Reihe von Bildern, die durch Klicken auf "Öffnen", analysiert werden müssen.
  2. Setzen Sie alle Parameter in den "Settings" Abschnitt von dem Software-Entwickler gegeben. Bestimmen Sie die Parameter, die benutzerdefinierte konfiguriert werden müssen (dh Kontur Schwelle und Minimalabstand) nach den im Einzelnen von der Software Handbuch beschriebenen Pflegehinweise.
  3. Bild zu analysierens one-by-one durch Zuschneiden sie an den Bereich von Interesse unter Verwendung "Crop" (klicken und ziehen Sie mit gedrückter Maustaste nach unten). Klicken Sie doppelt in der gezeichneten Rechtecks, um diese Aktion zu beenden.
  4. Markieren jedes sichtbare Zellkontur one-by-one, indem Sie auf "Draw Zell Konturen" und verwenden Sie das Fadenkreuz zum Zeichnen einschließlich aller microposts die Zelle zugeordnet ist.
  5. Entsorgen Sie alle unerwünschten microposts indem Sie auf "Verwerfen Beiträge" und verwenden Sie das Fadenkreuz zum Zeichnen. Schließen Sie alle microposts, die in eine Zelle außerhalb des Bildausschnitts gehören, oder dass sich aus einem anderen Grund, aber nicht von der Zelle von Interesse abgelenkt wird.
  6. Starten Sie die Software-Unterprogramm "finden Zentroide" per Mausklick. Stellen Sie die Filtereinstellung direkt neben dem "Suchen Zentroide" drücken, bis alle microposts registriert sind, die mit einem roten Kreuz in der Mitte zu sehen ist. Wenn die Filtereinstellung zu niedrig ist microposts werden ignoriert, wenn sie zu hoch multiple Positionen werden für eine einzelne micropost markiert werden. Halten Sie die Filtereinstellung während einer Analysesitzung konstant.
  7. Verwenden Sie die manuelle Bearbeitungsfunktion "Manual Edit" für die Flächenschwerpunkte mit mehreren oder verpasste micropost Positionen. Benutzen Sie die Maus, um das Fadenkreuz micropost in Frage durch Klicken und Ziehen sie über auswählen. Doppelklicken Sie innerhalb des Rechtecks ​​und legen Sie die fehlenden roten Marker in der vergrößerten Bildausschnitt, der automatisch schließt. Entsorgen eines solchen micropost wenn sie außerhalb der Zelle gezogen Kontur ist (siehe Schritt 4.5), bevor Sie fortfahren.
  8. Finden Sie die ideale micropost Gitter durch die Aktivierung der Funktion "Grid" mit einem Mausklick. Achten Sie darauf, die Position entspricht der wahren micropost Kopf, durch einen blauen Ring dargestellt ist, im Inneren der Zelle gezogen Umriss.
  9. Korrigieren Sie alle fehl am Platz Gittermacher innerhalb der Zelle Bereich, in dem über die entsprechende Funktion "Manuel Edit" mit einem Mausklick erforderlich. Verwenden Sie das Fadenkreuz, um die micropost in qu wählenestion durch Klicken und Ziehen sie über. Doppelklicken Sie in der erscheinenden Rechtecks ​​und legen Sie die fehlenden blauen Marker in der vergrößerten Bildausschnitt, der automatisch schließt.
  10. Über die Schaltfläche "berechnen Biegungen" per Mausklick, um ein Histogramm der berechneten Ablenkungswerte auf der Basis der Differenz zwischen der Position eines micropost innerhalb des Bildausschnitts und der erzeugten idealen Raster zu erhalten.
  11. Speichern Sie die vollständige Analyse einschließlich der Wertetabellen durch einen Mausklick auf "Speichern".
  12. Fahren Sie mit der Bildanalyse, entweder, indem Sie auf "Ansicht zurücksetzen" und zu analysieren, einen anderen Bildausschnitt oder Mausklick auf "nächstes Bild", das bequem mit der rechten Tastatur Cursor-Taste durchgeführt werden.

5. Datenanalyse - Mechanoprofiling

  1. Öffnen Sie die Datei "results.xls" mit einem Büro Tabellenkalkulationsprogramm aus dem Ordner mit den analysierten Bilder. Sie enthält die Daten all berechneten Werte einschließlich aller micropost Biegungen und Standard-Derivat Maßnahmen wie Arbeit (dh Substratverformungsenergie) von der Zelle analysiert.

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Representative Results

Der Hauptvorteil der beschriebenen Technik liegt in seiner Einfachheit und das Potenzial für eine schnelle und effektive Integration in die Routinelaborarbeiten. Die Kombination von hochwertigen kommerziellen Sensoranordnungen gepaart mit Open-Source-Software bietet Informationen über mechanisch-Empfindlichkeit, die sonst benötigt würde den Zugang zu Reinraumausstattung und vertiefte Kenntnisse der Bildanalyse und Softwareentwicklung. 1 veranschaulicht den Workflow des vorgestellten Verfahrens. Es beginnt mit der Vorbereitung und der Aussaat von Zellen auf der micropost Array. Nach der Fixierung und Färbung der Zellen die micropost Arrays bereit sind, für die Bildgebung. Der zentrale Teil der Technik ist die Bildanalyse unter Verwendung des MechProfiler Software. Ein Benutzer kann Bilder direkt nach der Eingabe aller relevanten Parameter in den "Einstellungen" des GUI starten analyszng. Der entsprechende Pixelgröße ist die Länge, die durch ein einzelnes Pixel dargestellt wird, und hängt von der Umgebung des Benutzers. Es brauchtgetrennt für jeden verwendeten Vergrößerung durch Aufnehmen von Bildern von Objekten mit bekannter Größe hergestellt werden. Ein Beispiel ist in der Zusatz Figur 9 angegeben.

Die Bildqualität ist ein wichtiger Faktor, da es stark den Analyseprozess beeinflusst. Um die höchste Qualität sollte man sicherstellen, dass eine stabile und routinemäßig gewartet Imaging-Plattform haben wie in Abbildung 2 gezeigt, insbesondere zu erreichen, ist die Ausrichtung der Lichtquelle wichtig, da Fehlausrichtung unerwünschte Schatten, die problematisch sein kann, wenn die Analyse der Ursache Bilder. Weiterhin Anordnen des Lichtmikroskops oben auf einem Antischwingungstisch oder Platte ist vorteilhaft in den meisten Labors wie es gibt zusätzliche Stabilität während der Bildgebung.

Die Vorteile der Verwendung einer dünnen Glasboden Petrischale für die Bildgebung umfassen höhere effektive numerische Apertur Werte, die hellere Bilder mit erhöhter Auflösung übersetzt.

Wenn taking die Bilder in Hellfeld-Modus mit 50% geschlossenen Blende wird empfohlen, wegen der Umfänge als knackigen dunklen Ring erscheinen, wie die Konzentration auf die microposts Spitzen erleichtert. Darüber hinaus, falls die gebrauchte Ziel hat einen Ausgleichsring, ist es wichtig, sie richtig eingestellt, um genaue Ablesungen Kraft zu erreichen. Die Wirkung dieser Funktion kann durch Vergleichen 3A und 3B gesehen werden. Bilder, die schnell analysiert werden können, werden durch Kombinieren der richtigen Einstellung der Kompensationsring eine optimale Beleuchtung, wie in 3C gezeigt, erreicht werden. Starken Kontrast zwischen einem micropost und seine Umgebung reduziert die Analysezeit, wie es beschleunigt den Suchalgorithmus. Benutzer werden feststellen, dass nur eine minimale Erfahrung ist erforderlich, um Bilder, die mit Leichtigkeit analysiert werden können, zu erreichen.

Wichtig ist, dass die Protokolle über eine kritische überwinden und gemeinsame Hindernis für die rasche und wirksame Integration der micropost Arrays in den RoutineLaborarbeit. Dieses Hindernis ergibt sich aus der Notwendigkeit, die Anordnung Qualitätskontrolle - eine Forderung, die erreichbar ist, nur durch eine genaue und detaillierte experimentelle Charakterisierung Sensor Reproduzierbarkeit, Sensitivität und Genauigkeit. Jedoch durch Drehen zu kommerziell erhältlichen micropost Arrays Dieser beträchtliche Hürde vollständig vermieden. 4A und 4B veranschaulichen die Genauigkeit eines solchen micropost Array. Die Abweichung der microposts Position ist gut unter 200 nm und als solche vergleichbar mit einer "Pixelfehler", die die Kamera / Objektivkombination, die in einer Pixelgröße von 82 nm für das verwendete Setup geführt begleitet. Die Auswertung der Bilder mit Zellen Ablenken der microposts zeigt, dass die Werte für eine Zelle auferlegten Biegung wesentlich höher sind als 200 nm (wie in 4C und 4D gezeigt), die zu einem komfortablen Störabstand.

Abbildung 5 illustrates die verschiedenen Arten von Spielen für microposts innerhalb eines Bildes in Abhängigkeit, ob es abgelenkt wird, oder nicht. Wie oben nicht abgelenkten microposts erwähnt haben eine helle kreisförmige Aussehen mit einem dunklen Ring um sie herum. Ihre Position kann unter Verwendung einer Hough-Transformation, die ein Merkmal Extraktionstechnik zur digitalen Bildanalyse bestimmt werden.

Darüber hinaus zeigt es, dass abgelenkte microposts auf einem inversen Mikroskop zeigen zwei gegenüberliegende dunkle Halbmondformen (siehe 5A). In einem aufrechten Mikroskop der Rand des micropost Spitze und einem dunklen Halbmondform richtig sind sichtbar, während die zweite eine schwer zu erkennen wird. Diese Eigenschaften sind die Basis für die Berechnung der Positionen der Hellfeld-Mikroskop Bilder von den Tipps von umgelenkt microposts, die für dieses Protokoll entwickelt wurde, und erhielt den Namen "Kontur anfahren".

5B ist ein Beispiel für eine HuO9 KnochenkrebsZell am microposts auf einem inversen Mikroskop (oben) abgebildet. Die analysierte Version des Bildes zeigt die Ergebnisse aus der angewandten Kontur Ansatz (unten). 5C wurde mit der gleichen micropost Array mit einem aufrechten Mikroskop (oben) übernommen. Wieder die analysierte Version zeigt die Ergebnisse unter Verwendung der Kontur Ansatz.

Jeder Bildanalyse-Sitzung startet von einem Benutzer Überprüfung der Parameter im Abschnitt "Einstellungen" des MechProfiler. Einige werden von der micropost Hersteller wie micropost Array-Dimensionen und Federkonstante angegeben. Andere werden durch den Benutzer, wie beispielsweise die Werte für die Kontur Schwelle und einer minimalen Auslenkung Schwelle nach den Verfahren in der Software-Handbuch beschrieben definiert. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Werte sollte sorgfältig ausgewählt werden und muss in einem zusammenhängenden Satz von Bildern für alle Bilder konstant sein, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Während die Vorverarbeitungsschritte für die Bild analysis, wie Zuschneiden, sind selbsterklärend die grundlegenden Strategien für die Softwarefunktionen wie "Finding Zentroide", "Gene Grid" und die "Kontur anfahren" benötigen nähere Erläuterungen.

Algorithmische Erkennung von Standard micropost Position (wie vom Hersteller geliefert) beginnt, indem Sie die "Suche nach Schwerpunkten" Software-Funktion. Der Algorithmus beginnt in der linken oberen Ecke des Bildes auf der Suche nach dem ersten micropost. Anschließend wurden alle anderen microposts werden basierend auf den Koordinaten dieses ersten micropost sowie der Werte für die Gitter und micropost Größe der vom Hersteller entsprechend dem hexagonalen Geometrie gegeben gefunden. Der Schwerpunkt für jede gefundene micropost wird unter Verwendung einer Hough-Transformation berechnet. Der Filterschieber neben der Schaltfläche des GUI ermöglicht die Einstellung der Empfindlichkeit dieser Transformation. Alle gefundenen microposts sind mit einem roten Kreuz markiert und ihre Positionen bekannt für subsequent Prozesse.

Als nächstes führt die Funktion "Grid" zu den Koordinaten aller microposts Spitzen. Sie sind das Ergebnis von einem mehrstufigen Prozess. Zuerst wird eine Optimierungsfunktion gelöst ist auch die Ausgangspositionen aus dem Stand ausgeführt "Suchen Schwerpunkte" Algorithmus, um die ideale Raster zu etablieren. Zweite die Positionen der microposts innerhalb der Zellfläche berechnet. Microposts mit weniger Durchbiegung als in der Einstellung Parameter "Mindestbiegung threshold" in bezug auf das ideale Raster definiert sind mit einem Hugh Transformation verarbeitet. Alle anderen micropost Spitzenpositionen unter Verwendung der oben beschriebenen Kontur Ansatz zur abgelenkt microposts berechnet werden. Hier startet die Software die Suche von der ersten Schwerpunkts weg von der Zellmitte für eine kreisförmige Kante (hell nach dunkel) in einem Winkel von 15 ° (siehe 5A). Sobald dieser Kante ist ein Kreis mit dem angegebenen micropost Durchmesser gefunden angebracht zu tHut Rand mit der Kontur Schwellwert von den Einstellungen im GUI. Dieser Parameter bestimmt, welche Pixel-Grauwert für den Anpassungsprozess verwendet. Je höher dieser Wert ist, desto mehr die Pass lehnt sich in Richtung der helleren micropost Zentrum desto geringer, je mehr sie den Kreis der dunkleren micropost skizzieren passt schätzen. Einmal gewählt, dass Wert konstant bleiben für alle Bildanalysen innerhalb einer bestimmten Studie Zugabe künstlicher Auslenkung oder ruft Auslenkungen zu konservativ, um zu vermeiden.

Zum Beispiel zeigt 6 die Bedeutung der Entscheidung für eine geeignete Kontur Schwellenwert. Die Software ermöglicht dem Benutzer, für einen weiten Bereich (0,1 bis 0,9) wählen, um alle physikalisch möglichen Beleuchtungssituationen zu umfassen. Die Übersetzung der optischen Informationen in Biegung Abstände für beide Extreme und einer eher praktischen Wert in der Mitte gegeben sind in 6B angegeben. Allerdings trainiert Users oft converge sehr ähnliche Kontur Schwellenwerte, die zu vergleichbaren Ergebnissen wie in 6C zu sehen ist. Darüber hinaus mit Hilfe standardisierter Verfahren für die Zellfärbung und Imaging minimiert das Risiko von ungültigen Kontur Schwellenwerten, die sollte in der Regel innerhalb von Konstante für zusammenhängende Sätze von Bildern zu bleiben.

Um die Robustheit des Verfahrens zu demonstrieren eine Auswahl der mechanisch-Profiling-Ergebnisse werden in Abbildung 7 zusammengefasst. In 7A zwei Ergebnisse aus dem Knochenkrebszellen HuO9 und zwei aus M132 verglichen. Alle vier Felder aus derselben Produktionscharge und damit identische mechanische Eigenschaften auf. Die Analyse wurde mit einem festen Satz von Parametern für eine minimale Durchbiegung (0,25 um) und für die Konturgrenze (0,125) durchgeführt. Darüber hinaus wurden zwei identische Sätze von Bildern aus SaOS 2 Knochenkrebs, zwei Analysten, ohne weitere Informationen zu Parametereinstellungen (siehe Abbildung 7 angegebenB). Der Einfluss der Färbung auf der Analyse wurde bestimmt, indem Bilder der Knochenkrebszellen mit Coomassie-Blau angefärbt R. Anschließend wird der Farbstoff entfernt wurde getestet. Nach der erneuten Färbung mit Coomassie Blue G einen zweiten Satz von Bildern aufgenommen wurde. 7C stellt die Ergebnisse von beiden Reihen, die durch den gleichen Benutzer mit identischen Werten für die minimale Auslenkung (0,25 & mgr; m) untersucht wurden und die Kontur Schwelle (0,25) .

Ein typisches Beispiel angewendet mechano-Profilierung in 8A, wobei die kompilierten Daten für die Knochenkrebszelllinien HuO9 und M132 nach der Analyse von 151-Zellen aus jeder der vier Arrays gebündelt vorgelegt vorgelegt. In dieser Übersicht alle Indikatorwerte sind höher für HuO9 als für M132 bereits darauf hinweist, dass HuO9 Zellen gelten mehr Kraft als M132. Die Daten aus der Bildanalyse eine große Menge an zusätzlicher Einzelzellen-Information, die abgebaut kann phen besseren Verständnis werden jedoch enthältotypic Zelllinie Verhalten und Zell-zu-Zell-Variabilität innerhalb einer gegebenen Linie. Mit der Vorlage der Ergebnisse für die Kraft pro micropost in einer Box Grundstück findet man, dass trotz ähnlicher Minima und Maxima, Datenwerte werden anders verteilt und in der Tat die niedrige metastatische Zelllinie HuO9 Zellen neigen dazu, mehr Kraft als die hochmetastatisch M132 Linie gelten (siehe Abbildung 8B). Weiterhin kann durch Kategorisieren der Kraftwerte in Bezug auf den Zellenbereich findet man, dass die mittlere Kraft pro Zelle ist nicht nur für HuO9 Zellen erhöht, verglichen mit M132, sondern auch, daß die durchschnittliche Kraft pro micropost ansteigt, wenn die Zellen aus, bis durchschnittliche Kraft pro Postlauf ein stabiler Wert (wie in 8C zu sehen). Außerdem für Zellen für sieben microposts die Werte nahezu identisch sind, was wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass sie angezeigt werden typischerweise in hexagonaler Form mit einem zentralen, nicht abgelenkten micropost unabhängig von der Zelllinie. Abgesehen von der differenzen der Kontraktilität, können morphologische Unterschiede mit interessanten Ergebnis quantifiziert werden. Zum Beispiel im Gegensatz zu den stark metastasierende M132-Zellen gab es sehr wenige HuO9 Zellen, die nur drei microposts bedeckt. Andere morphologische Vergleiche zwischen den Zelllinien hergestellt werden, einschließlich der Verteilung der Zellenfläche durch die Anzahl der microposts bedeckt dargestellt. 8D veranschaulicht, daß die beiden Zelllinien unterscheiden sich auch in dynamischen Ausbreitungsverhalten beim Aufwachsen auf der Oberseite microposts. Kurz gesagt, die mechanoprofile für die elterliche Zelllinie HuO9 zeigt, dass sie in der Regel decken mehr Bereich und gelten etwas mehr Kraft auf microposts während die metastatischen Zelllinie M132, eine aggressive Zelle, die aus HuO9 stammt bezeichnend deckt weniger microposts und wendet weniger Kraft pro micropost . Diese Ergebnisse zeigen das Potenzial einer TFM basierten Ansatz für diskriminierende Anwendungen.

Abbildung 1. Versuchsablauf. (A) Die gesamte Prozedur enthält fünf aufeinander folgenden wichtigen Schritte von der Aussaat Zellen auf einem micropost Array auf ihre mechanischen Eigenschaften Profiling. (B) Die Bildanalyse wird mit der beschriebenen MechProfiler Software durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Figur 2. Der Bilddarstellungsaufbau. Ein Standard-Umkehrmikroskop wird zur Abbildung der Zellen auf den micropost Arrays verwendet. Das Setup enthält auch eine Mikroskopkamera und ihre Steuerung, die auch Datenspeicherfunktionen bieten kann. Der große Bildschirm dargestellt ist nicht unbedingt erforderlich, aber dennoch ist bequem für erweiterte BildgebungSitzungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Leitlinie für die micropost Bildgebung. (A) Bild von gefärbten Zellen auf einem micropost Array mit einer 40X-Objektiv in Hellfeld-Modus aufgenommen. Nicht abgelenkten microposts erscheinen als dunkle Ringe, wenn abgebildet. Abgelenkten Beiträge übernehmen eine elliptische Form sowohl mit dunkler und heller Unterregionen. Gefärbten Zellen, die microposts decken macht sie noch dunkler zu dem Punkt, dass es keinen Gegensatz zwischen micropost und Zell angezeigt. (B) identische Bilder nach der Einstellung des Objektivs Ausgleichsring und Re-Fokussierung gemacht. Hier die Kerne der microposts sich wesentlich heller und geben mehr Kontrast. (C) Das gleiche Position nach adjus wieder abgebildetting alle Beleuchtungsparameter mit der Kamerasteuerung. Die frei stehende microposts erscheinen als helle Kreise mit einem dunklen Ring. Abgelenkten microposts zeigen eine deutliche Halbmond "Schatten" auf der ganzen Buchtkern entlang der Ziehachse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.>

Figur 4
Abbildung 4. MechProfiler Screenshots analysiert microposts. (A) Ein typisches Beispiel für ein leeres micropost Array kann in diesem Screenshot zu sehen. Die microposts in einem konstanten hexagonalen Muster angeordnet sind. (B) Das Histogramm mit den Ablenkungswerte für diese microposts zeigt, dass alle Werte unterhalb 200 nm. (C) Ein typisches Beispiel für eine HuO9 Knochenkrebs Zellbelagund Ziehen auf mehreren microposts. Es kann gesehen werden, dass die Menge des Ziehens ist heterogen. (D) Das Histogramm mit den Ablenkungswerte für die HuO9 Zelle zeigt das breite Spektrum der Ablenkungen, die aus den Zellen "Interaktion mit dem micropost Substrat entsteht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 5
Abbildung 5. Micropost Auftritte in Hellfeldbeleuchtung und die Strategien für die Berechnung ihrer Position innerhalb eines Bildes. (A) nicht abgelenkten microposts erscheint als heller Kreisfläche mit einem dunklen Außenring. Der Schwerpunkt wird durch eine Hough-Transformation berechnet. Abgelenkt microposts zeigen dunkle Halbmondformen. Je nach Mikroskopaufbau, wenn die microposts Gesicht der ligh t Quelle (zB inverse Mikroskop) gibt es zwei gut sichtbare Halbmondformen. Wenn die microposts stehen vor der Linse (zB aufrechten Mikroskop) ist nur eine halbmond gut sichtbar, sondern auch der Rand der Spitze. In beiden Fällen sollten die Kontur Ansatz verwendet, um die micropost Spitze zu berechnen. (B) Ein Originalbild (oben) mit einem inversen Mikroskop von einem HuO9 Knochenkrebs Zelle und ihrer analysiert Version (unten) mit der Kontur anfahren. (C) Originalbild aus der gleichen micropost Array (oben) mit einem aufrechten Mikroskop und die analysierte Version, erneut die Anwendung der Kontur Ansatz (unten), aber mit einer viel geringeren Kontur Schwellwert besser geeignet für den Aufruf der dunklen ringförmigen Rand. Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6. Die Kontur anfahren und der Auswahl der geeigneten Schwellenwert. (A) Die drei Screenshots zeigen die gleichen analysiert microposts mit drei verschiedenen Kontur Schwellenwerte. Ist der Wert eingestellt ist entweder zu niedrig (links) oder zu hoch (rechts) über die Software passt den blauen Ring, der die micropost Kopf falsch darstellt. Sie unterschätzt oder überschwingt die reale Position des micropost Kopf. A richtig gewählt Schwellenwert ermöglicht die Software, dass die blauen Ring auf die halbmondförmige dunkle Bereich innerhalb der micropost, die durch Ablenkung bildet passen. (B) Das Diagramm zeigt die durchschnittliche Ausmaß der Auslenkung abhängig von der gewählten Kontur Schwellenwert für die in oben gezeigt microposts. Es zeigt auch, dass die Werte für die microposts außerhalb der Zelle Umrisse nicht beeinträchtigt, da die Kontur Pass dort nicht angewandt. (C) Das Diagramm veranschaulicht, dass die Wahlein Schwellenwert innerhalb einer moderaten Intervall minimalisiert das Risiko einer Über- oder Unterschätzung der micropost Biegungen. Die Differenz zwischen den von verschiedenen geschulte Benutzer gewählten Werte in der Regel weniger als 0,05, die in akzeptable Unterschiede in der durchschnittlichen Ablenkungswerte führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 7
Abbildung 7. Robustheitstest für mechanisch-Profil Ergebnisse aus verschiedenen Knochen-Krebszelllinien; Die Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung (A) Mechano-Profiling-Ergebnisse aus vier identischen micropost Arrays nach dem Aussäen HuO9 Zellen auf Array 1 und M132 auf Array. 3 - vier Tage später Aussaat HuO9 auf Array 2 und M132 auf Array 4. (B) Vergleich der Ergebnisse von mEchano-Profiling basierend auf identische Sätze von Bildern nach der Analyse von zwei unabhängigen Analysten. (C) Vergleich der Bildanalyseergebnisse von zwei verschiedenen Bildserien nach Färbung mit Coomassie-Blau R und die zweite nach der vollständigen Entfernung des Farbstoffs und Re-Färbung mit Coomassie-Blau G. erste genommen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .>

Abbildung 8
Abbildung 8. Mechano-Profiling von Knochenkrebszelllinien. (A) Der Vergleich zwischen den beiden Knochenkrebszelllinien HuO9 (niedriges metastatisches Potential) und M132 (hochmetastatisch) Grafik zeigt, dass alle Indikatorwerte höher für die HuO9 Zelllinie (sind insgesamt N = 302; zwei unabhängigen Versuchsreihen, Fehlerbalken = Standardabweichung). (B trong>) Die Box-Plot zeigt, dass die aufgebrachten Kräfte pro micropost im unteren Nanonewtonbereich. Allerdings HuO9 Zellen ziehen über M132-Zellen (Whiskers stellen den Daten Minimum und Maximum). (C) Ein ähnliches Ergebnis kann durch Vergleichen Zellen, die die gleiche Anzahl von microposts Bedeckung gesehen werden. HuO9 Zelle anwenden mehr Kraft als M132-Zellen. Die Anzahl der Zellen, die drei HuO9 microposts nicht repräsentativ ist und nur der Vollständigkeit (Fehlerbalken = Standardabweichung) enthalten. (D) Die verschiedenen Distributionen über die Zahl der überdachten microposts zeigen, dass jedes Knochenkrebs-Zelllinie hat ihre eigenen charakteristischen Verbreitung bei der Interaktion mit micropost Arrays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Ergänzende Abbildung 9. Die Pixelgröße für ein Mikroskop-Setup wird in der Regel mit einem speziellen Mikroskop-Objektträger mit einer Maßstabsleiste darauf bestimmt wird; alternativ kann die micropost Array-Layout, die vom Hersteller angegebenen verwendet werden. Zum Beispiel 15 Einheiten mit 13 Mikrometer (195 & mgr; m Gesamtlänge), geteilt durch 2.375 Pixel (mit einem Bildverarbeitungswerkzeug etabliert) führt zu 0,082 & mgr; m / pxl. Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergänzende 10
Ergänzende Abbildung 10. Vergleich der Bilder einer HuO9 Knochenkrebszellen von der gleichen Position mit Hilfe von zwei Beleuchtungstechniken auf einem inversen Mikroskop aufgenommen; DIO befleckt microposts sind grün fluoreszierende. (A Hellfeld-Modus. (B) analysierte ich Magier nach dem Umschalten auf den grünen Fluoreszenzkanal entnommen ohne Nachfokussieren.   (C) der zweiten Fluoreszenzbild nach der Korrektur der Fokussierung auf die sehr micropost Tipps. (D) Überlagerung der beiden Beleuchtungskanäle lediglich zu Erläuterungszwecken.   (E) für Mechanotherapie Profilierungs Indikatoren ergibt sich aus den drei Bildern. Trotz Korrektur der Schwerpunkt der Vollausschlag nicht aus den Fluoreszenzbildern abgeschätzt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergänzende 11
Ergänzende FiAbbildung 11. Bildsequenz von der gleichen Position von fluoreszenzBunt microposts mit Dil auf einem aufrechten Mikroskop Hellfeldbild (A). es gibt drei microposts einander an der Spitze zu berühren. (B) Gleiche Position nach dem Umschalten auf die Leuchtstoffkanal leicht über dem microposts Köpfe. (C) Das Absenken der Brennebene auf der äußersten Spitze der microposts. (DE) aufeinander folgenden Bildern nach einer weiteren Senkung der Fokusebene schrittweise in Richtung der unteren microposts '. (F) Bild der microposts nach dem Absenken der Brennebene innerhalb des Siliconelastomer-Substrat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergänzende 12 Ergänzende Abbildung 12 Screenshot des MechProfiler GUI. Typische Analyseergebnis von Profiling eine HuO9 Knochenkrebszelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Diese Arbeit zielt darauf ab, den Bereich der Traktionskraftmikroskopie durch im wesentlichen Senkung technischen und praktischen Markteintrittsschranken voraus. Diese Barrieren kommen von zwei Seiten. In erster Linie sind die zahlreichen nicht-triviale technische Herausforderungen, die überwunden werden müssen reproduzierbar herzustellen und experimentell zu beauftragen eine micropost Array werden. Zweitens ist die in ähnlicher Weise nicht-triviale Bedarf an einer zuverlässigen halbautomatische Analyse von Einzelzellen-Kräfte - unter Berücksichtigung, dass ein typisches Experiment kann die Analyse von Hunderten oder sogar Tausenden von Zellen erforderlich. Die oben beschriebenen Techniken wurden entwickelt, basierend micropost Traktionskraftmikroskopie zugänglich innerhalb der Zellbiologie Labors, die keinen Wohnsitz Engineering-Kompetenz zu machen. Die in diesem Artikel vorgestellten Sensoren und Analysetechniken ermöglichen sollten Nicht-Experten, um leicht und genau zu analysieren, die von Einzelzellen ausgeübten Kräfte.

Abgesehen von Zugang zu einem Zellbiologie lab mit mindestens einer Mitte-Grade-Hellfeld-Mikroskop, die beschriebenen Verfahren erfordern einige zusätzliche technische Elemente. Hier die meisten Benutzer gültig Traktionskraftmikroskopie-Experimente mit noch wenig Erfahrung durchführen können, trotz der Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit der Technik. Dennoch gibt es drei kritische Aspekte im dargestellten Protokoll, berücksichtigt werden müssen. Zunächst ist es notwendig, sicherzustellen, dass die micropost Arrays immer mit Flüssigkeit bedeckt, um, daß ihr Zusammenbruch aufgrund von Kapillarkräften zu vermeiden. Zweitens muss man Abbildungsparameter für erworbene micropost Bilder, die am besten, indem Reihe von Bildern des gleichen Feldposition, während unterschiedlicher Belichtungszeit, Blende Blende und Kompensationsring Stellung gemacht wird zu optimieren. Es ist wichtig, die richtige Brennebene für die micropost Spitze zu finden, und dieser Aspekt dauert einige Erfahrung angesichts der geringen räumliche Tiefe der Sensoranordnungen. Drittens muss man die offen zugänglich Bildanalyse-Software MechProfiler discusse downloadenhier D, für die ein detailliertes Handbuch und Trainingsbeispiele sind auf der Downloadsite. Nach einiger Erfahrung mit der Software von Beispielen mit dem Handbuch zu analysieren, sollte der Benutzer machen Sie Testbilder auf dem Imaging-Setup verwendet werden soll, um so geeignete Mikroskopeinstellungen konfigurieren. Basierend auf den erhaltenen Bildern sollte die Kontur Schwellenwert ähnlich optimiert werden. Ein einzelnes Bild micropost können von einem geschulten Benutzer innerhalb einer Minute mit dem Open-Source-MechProfiler Software unabhängig davon, ob es eine oder mehrere Zellen enthält, analysiert werden, so dass die Erzeugung von statistisch relevante Ergebnisse (Analyse von mehreren hundert Zellen) innerhalb weniger Stunden .

Ein weiterer Aspekt, eine Abstimmungs erfordert die Optimierung eines angelegten Zell Färbeverfahren. Wenn Zellen übermäßig gefärbt, kann die Software nicht den richtigen Positionen micropost registrieren. Auf der anderen Seite, wenn die Färbung zu schwach ist, ist es mehr Aufwand durch den Benutzer zu erfassen, einen erfordert"True" Zellkontur als dünne Zell Vorsprünge können verpasst werden.

, Durch Anlegen einer festen Protokoll der Zellfärbung und Array-Bildgebungsverfahren der Bereich für diesen Fehler wird jedoch annehmbar niedrige. Während dieser Arbeit wurden verschiedene Zell Färbeverfahren getestet, basierend auf verschiedenen Konzentrationen an Kristallviolett, die Anwesenheit von Tensiden wie Tween 20 oder Triton-X, oder eine Kombination von Farbstoffen, die durch Zugabe von Eosin. Dennoch ist die Intensität der Färbung sowie dessen Stabilität wesentlich von Experiment variiert, zu experimentieren. Nur der Einsatz von Brilliant Blue G wie oben beschrieben, zeigten eine akzeptable Zellfärbung Robustheit kombiniert mit genügend Intensität, um immer noch die dünnen Zell Umriss, aber ohne mit dem entwickelten Kontur anfahren.

In der Regel gibt es Optionen, um die vorgestellte Technik ändern. Zum Beispiel durch die Kombination der Hellfeld-Techniken hier mit Fluoreszenz-Mikroskopie Färbung Organellen vorgestelltwie der Kern oder die Aktin-Filament-Netzwerk, das zusätzliche Informationen über die zugrunde liegenden Zellprozesse im Zusammenhang mit der Zellmechanik bieten kann. Außerdem wurde unter Verwendung langkettige Dialkyl carboxycyanines (DiI und DiO) die microposts fluoreszierend. 14. Allerdings ist es wichtig, jede Abweichung von der vorgestellte Technik steuern. Die ergänzenden den 10 und 11 veranschaulichen mögliche Fallstricke. Bilder einer Coomassie-Blau-G gefärbt NIH 3T3-Fibroblasten-Zell im grünen Fluoreszenzkanal (10B und 10C) mit dem inversen Mikroskop genommen eine Erläuterung der wichtigsten micropost Körper aber nicht ihre Tipps, was zu einer fehlerhaften Positionsanalyse (10E). Trotz der besten Bemühung, nach dem Umschalten von Hellfeld (10A), die micropost Spitzen nicht abgebildet werden, die aufgrund der Absorption des Fluoreszenzsignals von der Zelle Fleck sein könnte auszurichten. Dies steht im Gegensatz zu images mit der gelben Fluoreszenzkanal eines aufrechten Mikroskops (11B-11F) aufgenommen, bei denen mehrere scharfe Bilder zu erhalten, kann entlang der z-Achse. Hier muss der Benutzer sicherstellen, daß das Bild mit der Bildebene an der Spitze (11C) irgendwo näher am micropost Sumpf entnommen und nicht zu vermeiden, fordern fehlerhafte Ablenkungswerte.

Es sei darauf hingewiesen, dass es auch technische Beschränkungen für micropost Assays werden. Zum Beispiel ist die Genauigkeit eines detektierten Auslenkung abhängig von der Qualität der optischen Einrichtung. Mikroskope sind oft für Fluoreszenz-Bildgebung, wobei die Lichtempfindlichkeit der angeschlossenen Kamera hat eine höhere Priorität als eine große Anzahl von Pixeln. Natürlich führt dies zu Bildern mit einer größeren Pixelgröße. Weiterhin sollte beachtet werden, dass Hellfeld-Bilder können nicht erkennen, ob Zellprotrusionen die Substratunterseite erreicht werden. Allerdings waren die kommerziellen micropost Arrays mit Hilfe der konfokalen getestetMikroskopie. Es wurde festgestellt, dass Zellen scheinen die binären Beschichtung, die nur auf die Adhäsion fördert micropost Spitzen und nicht für den Rest der micropost Anordnung annehmen. Ein weiterer Faktor ergibt sich aus der Positionsfehler der micropost Array, das gezeigt wurde, dass 0,2 & mgr; m sein. Gemeinsam mit dem vorgegebenen Federkonstante von 2,8 nN / & mgr; m führt dies zu einem Fehler im Kraft Auslesen von 0,6 nN. Ein weiteres Hindernis für micropost Assays beruht auf der Tatsache, daß die aufgebrachten Kräfte von microposts durch mehrere Zellen geteilt nicht bestimmt werden kann. Daher können nur isolierte Einzelzellen untersucht werden. Eine spezifische Beschränkung für die vorgestellt Protokoll ergibt sich aus der korrekten Anwendung der sensible Kontur Ansatz, der ein gewisses Maß an Ausbildung für den Benutzer, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten erfordert. Ferner für eine schnellere Analyse der Benutzer Bilder aufzunehmen, wobei das micropost Array ausgerichtet ist eine horizontale oder eine vertikale Linie entlang der Kante des Beobachtungsfeldes zu bilden. Despite die Tatsache, dass die Software-Algorithmus zur Bestimmung microposts innerhalb einer hexagonalen Gittergeometrie wird nicht um einen Drehwinkel begrenzt die Abbildung microposts mehr als 5 ° außeraxial machen es schwierig, zu einem Bildabschnitt zu beschneiden, ohne mit inkompletten microposts, was dann zu einem Versagen der Funktion "Grid". In einem solchen Fall kann der Benutzer die integrierte Drehfunktion vor dem Start des micropost Positionen analysieren zu verwenden.

Das beschriebene Verfahren wurde hauptsächlich angewendet, um zwei Knochenkrebszelllinien, eine elterliche Zelllinie mit dem Namen HuO9, und eine abgeleitete hochmetastatisch Linie laut M132 charakterisieren. In diesem Zusammenhang wurden mehr als sechshundert Einzelzellen-Bilder in Hellfeld-Modus aufgenommen und mit Hilfe der MechProfiler Software analysiert. Die anschließende Data Mining ergab, dass der Elternzelllinie HuO9 übt etwas mehr Kraft, und in der Regel deckt mehr microposts pro Zelle als Zellen aus dem metastatischen Zelllinie M132. Jedoch sind die Zellenwurden in verschiedenen Stadien des Zellzyklus zum Zeitpunkt der Fixierung, die geeignet sind, den breiten Bereich der Ergebnisse trugen synchronisiert und daher. Indem sie Live Cell Bilder über Zeiträume von bis zu 24 Stunden wurde festgestellt, dass nach dem Verteilen viele Zellen bleiben auf ihre Ausgangsposition, während andere zu migrieren, Verbreitung, trennen und wandern wieder mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten (siehe Zusatz Videos). Dies zeigt an, dass das mechanische Profil einer Zelle oft nicht konstant und kann stark in einer Zellpopulation oder sogar innerhalb einer einzigen Zelle in Abhängigkeit von der aktuellen Aktivität variieren. Ein weiterer Faktor könnte sein, dass auf einem micropost Array eine Zelle gezwungen, diskrete Migrationsschritte, um einen anderen micropost, die im Gegensatz zu klassischen TFM, wo Zellen haften an flachen Oberflächen und kann mit Minuten-Schritten zu migrieren ist zu erreichen durchzuführen. , Um diese kleinen Schritte analysieren, ist es jedoch erforderlich, um Fluoreszenzbilder von focal adhesion Punkte zu nehmen, die den Zugang zu sehr fortgeschrittenen m erforderticroscopes und sehr aufwendige Bildanalyse-Software. Nichtsdestotrotz ist die Verteilung der mechanischen Profile innerhalb größeren Populationen oft noch ein bestimmendes Merkmal einer Zelllinie. Somit ist ein Verfahren mit hohem Durchsatz, die Charakterisierung ermöglicht einer großen Anzahl von Zellen erforderlich. Das Handbuch Abbildungsverfahren und Open-Access-Software hier präsentierten birgt ein großes Potenzial für die Skalierung zur vollautomatischen Mikroskopsysteme.

Zusammenfassend ein robuster Traktionskraftmikroskopie Ansatz vorgestellt, in einem Standard-Zelle Biologie-Labor ohne weiteres annehmbar ist. Der gesamte Workflow von der Zellaussaat zur Bildanalyse ist einfach und effektiv. Während die hier beschriebenen Protokolle sind voll funktionsfähig sind Verbesserungen im Gange, um die Analysealgorithmen anpassen, um in der Lage, auch hand micropost Arrays mit orthogonalen Layouts und der Entwicklung von Verfahren, die die Analyse von Bildsequenzen aus lebenden Zellen zu vereinfachen. In Zusammenhang mit den Ergebnissen für Knochenkrebszelle lines, die hier beschriebenen Ansätze können zu Rasterzellen aus klinischen Biopsien verwendet, um zu beurteilen, ob solche Tests können prognostischen Wert zu halten, so dass Ärzte, um die metastatischen Potential der Biopsie Zellen aus dem Knochenkrebspatienten vorherzusagen. Ein solcher Assay würde die therapeutische Strategien zu beeinflussen. Andere mögliche Anwendungen beziehen sich auf Tests pharmazeutisch aktiven Verbindungen auf mechanisch aktive Zellen, wie Zellen der glatten Muskulatur oder Herzmuskelzellen, die möglicherweise in Gründung Wirksamkeit oder Toxizität eines Arzneimittels zu unterstützen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T25 cell culture flasks Nunc 156367
1x PBS-buffer Sigma D8537
0.5% Trypsin-EDTA Life Technologies 15400054
Medium DMEM/F12 Sigma D8437
FBS South America Life Technologies 10270106
Penicillin-Streptomycin 100x Sigma P4333
15 ml centrifuge vials Sarstedt 62.554.502 
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin MicroDuits MPA-col1/FN Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A. Merck 100.983
12-well plate Nunc 150628
Formalin solution, neutral buffered 10% Sigma HT5011
Brilliant Blue G-250 Sigma 27815 Coomassie blue
Methanol ACS p.A. Merck 1.06009
Acetic acid Sigma 695092
Glass bottom dish WillCo Wells BV GWSb-3522 35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse Nikon n/a Inverted microscope
D3-L3 Nikon n/a Camera controler
DS Fi2 Nikon Camera

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References

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