Измерение Вложений и интернализации вируса гриппа в клетках А549 методом проточной цитометрии

1Institute of Medical Virology, University of Zurich
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pohl, M. O., Stertz, S. Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (105), e53372, doi:10.3791/53372 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Вступление вируса гриппа А (ИФО) является многоступенчатый процесс, который начинается с связывание вируса с рецепторами на плазматической мембране клеток-мишеней 1. Рецептор IAV является сиаловой кислоты который присутствует на большом разнообразии гликопротеинов и гликолипидов. Гемагглютинина (HA), белок IAV который присутствует в вирусной оболочке связывается с сиаловой кислотой и тем самым опосредует прикрепление вирусных частиц в плазменной мембране клеток-мишеней 2. Вирус проникает в клетки через клатрин эндоцитоза, но и альтернативные пути доступа, такие, как макропиноцитозом, были описаны 3-6. Взаимодействие между НА и сиаловой кислоты оказывается достаточным для опосредования и, привязанность и запуска интернализации вирусных частиц 7. Тем не менее, альтернативные рецепторы входа были предложены и их роли в IAV вступления в настоящее время расследуются 1,8,9.

Дворняжкаrently, предпринимаются усилия для выявления факторов, принимающих, которые участвуют в жизненном цикле вируса с целью разработки крайне необходимых новых противовирусных лечения 10-12. Вирус запись будет благоприятным шагом для таргетинга рост ИФО для того, чтобы блокировать вирусную инфекцию при первой точки. Измерение различные этапы IAV вступления экспериментально сложным, как правило, большое количество вируса требуется, чтобы обнаружить входящий вирус. Кроме того, дальность обнаружения изменений в записи вируса только линейные связи с отсутствием репликации вируса. Это подчеркивает необходимость для анализов с высокой чувствительностью.

Анализ приведем позволяет обнаруживать прикрепленной вируса на клеточной поверхности, а также обнаружение вируса интернализованной по отношению к общему количеству вируса клеточно-ассоциированного. Использование биотинилированного вируса дикого типа обеспечивает удобное измерение с помощью окрашивания СТВ-Cy3 и считывания с помощью проточной цитометрии. Биотинилированный вирус холодной границу к ячейкес, чтобы вложение, но предотвратить интернализацию вирусных частиц. Клетки могут быть фиксированной, проницаемыми и окрашивали STV-Cy3 для измерения прикрепленный вирус. Сигнал от внеклеточных вирионов, прикрепленных может быть отменен, если блокирующий шаг применяется до фиксации, при котором клетки инкубируют с немеченого стрептавидина (СТВ). На следующем этапе, после прикрепления биотинилированного IAV, температура сдвигается до 37 ° С и интернализации вирусных частиц дают проходить. Интернализованная частицы защищены от связывания СТВ тем самым позволяя дискриминацию между вне- и внутриклеточных вирусов.

За экспериментальных условиях, четыре образца требуется: '0 мин': Первый образец, обозначенный "0 мин", состоит в измерении вирус холодной переплете на клеточной поверхности. '0 мин + СТВ ": Второй образец, обозначенный" 0 мин + СТВ ", дает интенсивность сигнала линии эксперимента. Прикрепленный вирус заблокировал остроумиеч СТВ и сигнала после окрашивания STV-Cy3 должны быть значительно ниже, по сравнению с "0" мин образца. '30 Мин ": Третий образец, '30 мин 'содержит прилагается и внутреннюю вирус из-за температурного сдвига до 37 ° С в течение 30 мин. '30 Мин + СТВ ": Четвертый образец, '30 мин + STV 'меры внутриклеточный фракция вирусов. Блокирующий шаг СТВ наносится после 30 мин инкубационного периода. В результате вирусные частицы на поверхности клетки связаны СТВ оставив только интернализированные вирусы для окрашивания СТВ-Cy3. Относительное количество интернализованной вируса может быть вычислена как отношение интернализованной вируса (измеренной в '30 мин + СТВ 'образца), деленное на общее количество вируса (описываемой '30' мин образца).

В качестве контроля мы предлагаем включить макет-инфицированные клетки. Сигнал после СТВ-Cy3 окрашивания макет-инфицированных клеток дает фонПолученный от протокола окрашивания. Контрольную для крепления IAV является предварительная обработка клеток с бактериальной нейраминидазы (НА). NA отщепляет сиаловой кислоты от гликопротеинов, сотовых удаляя рецепторы крепления с клеточной поверхности. Азид натрия (SA) является мощным ингибитором метаболических и, таким образом, блоки 13 эндоцитоза. Клетки, обработанные азида натрия должен быть положительным для вируса связывания, но отрицательным для интернализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание Перед запуском: капот использования ламинарного потока и соответствующего биоизоляции при работе с живым вирусом. Здесь мы опишем условия, подходящие для роста вируса гриппа штамма культуры A / WSN / 33. Множественность заражения (МВД) и инкубации раз могут варьироваться в зависимости от штамма вируса, используемого.

1. Получение биотинилированных A / WSN / 33 вируса

  1. Клетки в T175 см 2 с использованием колбу Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen / Strep) Семя Madin Darby собак-kindey (MDCK). Культуры клеток при 37 ° С до приблизительно 70% слияния будет достигнута.
  2. Перед инфекции, удалить среднего и промыть клетки с фосфатно-солевом буфере (PBS, pH7.0-7.3), добавив достаточно большой объем, чтобы покрыть клеточный монослой.
  3. Удалить PBS и инфицировать клетки с A / WSN / 33 с МВД 10 -4. Развести вирус в PBS с добавлением 0,02 мг Mg 2+, 0,01 мг Са 2+ </ SUP>, 0,3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 1% Pen / Strep (инфекционно-PBS). Используйте посевной 4 мл для T175 см 2 колбу.
  4. Инкубируйте клетки 1 часа при 37 ° С. Удалить инокулята аспирацией и пипеток 10 мл DMEM, дополненной 0,3% BSA, 20 мМ HEPES и 1% Pen / Strep в колбу.
  5. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение примерно 3 дней до цитопатического эффекта (CPE) не видна, а затем урожай супернатант. CPE может быть признан округление клеток с последующим отряда и смерти клеток 14.
  6. Спин супернатант при 450 х г в течение 5 мин, чтобы удалить клеточные остатки. Перевести супернатант в новую пробирку и сокола повторить этот шаг еще раз. Откажитесь от гранул.
  7. Передача супернатанты в Ультрацентрифуга труб и подложкой из супернатантов с помощью 5 мл 30% сахарозы в разбавленных NTE буфере (10 мМ Трис [рН 7,4], 100 ммоль NaCl, 1 мМ ЭДТА). Баланс трубы, прежде чем ультрацентрифугированием и залейте PBS для достижения конечного объема 30 мл. Спин supernaTants на 112,398 мкг (что соответствует 25000 оборотов в минуту для ротора SW28 с) в течение 90 мин в ультрацентрифуге.
  8. Осторожно снимите супернатант с помощью пипетки и замочить на ночь таблетку от вирусов при температуре 4 ° С в 250 мкл PBS. Ресуспендируют осадок с помощью пипетки вверх и вниз. Измерьте содержание белка очищенного вируса по Бредфорда 15.
  9. Использование комплекта биотинилирования генерировать биотинилированное A / WSN / 33. Следуйте инструкциям производителя.
  10. Вкратце, добавить соответствующее количество биотина к очищенного вируса и инкубируют в течение 2 ч на льду. Передача вируса ультрацентрифужную пробирку и заполнить трубку с PBS, чтобы достичь конечного объема 30 мл. Спин вирус на 112,389 мкг в течение 90 мин в ультрацентрифуге. Удалить супернатант с помощью пипетки и добавить 250 мкл PBS. Замочите гранул в течение ночи при 4 ° С. Аликвоты и хранить вирус биотинилированного хранили при -80 ° С, где она будет стабильной в течение по крайней мере 24 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть полезно для определения титра биотинилированной рвозмещение IAV стандартным методом бляшек. Тем не менее, следует отметить, что последующее протокол только измерить биотинилированных вирусные частицы. Оставшееся unbiotinylated частиц из-за неполного биотинилирования будет способствовать инфекционного титра по бляшек, но не измеряемого сигнала в привязанность / интернационализации анализа.

2. Определить необходимое количество Биотинилированный Касперского

Примечание: Перед присоединени / интернализации анализ проводят, важно, чтобы определить количество вируса биотинилированного необходимой для инфицирования все клетки образца.

  1. Культура и Trypsinize А549 в соответствии с инструкциями изготовителя. Граф клеток с использованием клеточной камеру. Пипеток 200000 А549 в FACS в шахтах трубы. Спин 3 мин при 450 х г. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS. Холодные клетки вниз на льду в течение 10 мин.
  2. Подготовка 5-кратным серийных разведений biotinylated вирус складе в инфекционно-PBS.
  3. Спин пробирки, содержащие клетки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок с 100 мкл вируссодержащей инфекции-PBS. Как макет управления использованием инфекцией PBS без биотинилированного вируса. Инкубируйте пробирки во льду в течение 1 часа.
  4. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS. Повторите этот шаг еще раз.
  5. Для фиксации, спиновые трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл 3,7% параформальдегида (PFA). Инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем повторите стирки шаг, описанный в 2.4).
  6. Для проницаемости, спиновые трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл PBS, содержащим 0,5% Тритон Х-100. Инкубировать в течение 6 мин при комнатной температуре. Затем повторите стирки шаг, описанный в 2.4).
  7. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют ПеллET 50 мкл в 2% BSA в PBS, разбавленном содержащий STV-Су3. (Пожалуйста, обратите внимание, что в соответствующей концентрации STV-Cy3 должны быть определены до начала эксперимента Начните с концентрацией 1:. 200 и тест-2-кратные разведения до 1:. 2400 В наших руках, разбавление 1: 1000 оказалось оптимальным.)
  8. Выдержите 1 час в темноте при комнатной температуре. Затем повторите этап промывки описано в 2.4, но ресуспендируют осадок в 200 мкл 2% БСА в PBS, разбавленного.
  9. Анализ образцов цитометрическим 16. Ворота на Су3-положительного населения. Выбрать самую низкую концентрацию биотинилированного вируса, в результате чего максимальное количество Cy-3-позитивных клеток в популяции А549.

3. Определите необходимое количество стрептавидином


Примечание: Эффективность блокировать сигнал, полученный из внеклеточного вируса определяет диапазон детекции этого анализа в. Таким образом, важно, чтобы отменить сигнал СТВ-Cy3 как можно больше. Чте необходимое количество СТВ необходимо зависит от количества биотинилированного вируса складе используется (определяется в разделе 2).

  1. Выполните шаги 2.1-2.4, но использовать концентрации вируса определяется в разделе 2.
  2. Подготовьте пять раз серийных разведений СТВ разводили в PBS, содержащий 2% BSA и 0,1% азида натрия.
  3. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мкл STV разбавления. В макете использования управления ФБР, содержащим 2% BSA и 0,1% азида натрия без СТВ. Инкубируйте пробирки в течение 30 мин на льду. Затем повторите шаг мыть описано в 2.4.
  4. Выполните шаги 2,5-2,9. Для анализа интернализации, выбирают наименьшую концентрацию СТВ в результате сильного блока Cy-3 сигнала (по сравнению с образцом, в котором нет СТВ не присутствовал). Для этого, процент Cy3-позитивных клеток или средней интенсивности флуоресценции сигнала Cy3 могут быть использованы. В идеале, сигнал Су3 из STV-обработанных образцов должно быть как можно ближе к сигналу от макета-инфицированныхклетки, как это возможно.

4. Приложение / Интернализации Анализ


ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все реагенты подготовить перед началом анализа. За три контрольных групп представлены в разделе результатов (макет инфицированных клеток, нейраминидазы предварительно обработанных клеток и азид натрия обработанных клеток) небольшими изменениями в протоколе не требуется.

  1. Подготовьте 16 в шахтах трубы друг, содержащие 200000 клеток А549. Рядом с экспериментальной установки, состоящей из 4 трубок, есть 3 условия управления, каждый из которых требует 4 трубы: макет-инфицированных клеток, нейраминидазы (NA) -pretreated клетки и азид-обработанных клетках натрия. Каждая группа состоит из 4 трубок помечены как '0 мин', '0 мин + СТВ », '30 минут', '30 минут '+ СТВ.
  2. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS.
  3. Побочные трубки при 4 ° C при 450 х г. Удалить супернатант и ресуспендируют ПеллET в 200 мкл DMEM, содержащей 0,3% BSA, 20 мМ HEPES и 1% пенициллина-стрептомицина (инкубационной среды). Инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С.
    Примечание: Для контроля нейраминидазы: Использование бактериальной нейраминидазы (например сиалидазы из Vibrio холеры) в концентрации 200 МЕ / мл, разбавленного в инкубационной среде для ресуспендирования клеток.
  4. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS. Повторите этот шаг еще раз, а затем прохладный трубы вниз на льду в течение 10 мин.
  5. Спин трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 100 мкл биотинилированных вирус (используйте концентрации вируса определяется в разделе 2, разведенного в PBS-инфекции). Инкубируют 1 час на льду. Затем повторите шаг мыть описано в 2.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для макета-инфицированных управления: Используйте инфекции-PBS без вируса. Для контроля азида натрия: Использование вируса, разбавленного в инфекционно-PBS с добавлением 0,1% азида натрия.
  6. Заработка образцов после поражения на льду:
    1. Для «0 мин» образцов, выполните шаг 2,5 и хранить образцы при температуре 4 ° С до тех пор, другие образцы не будут исправлены.
    2. Для '0 мин + STV' образцов, спиновых труб при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мкл СТВ (использовать концентрацию определяется в разделе 3), разбавленного в PBS, содержащий 2% BSA и 0,1% азид натрия (для предотвращения интернализации при обращении образец). Инкубируют 30 минут на льду. Следуйте шаг 2.4-2.5 и хранения образцов при 4 ° С.
    3. Для '30 'мин образцов, спиновых труб при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS, содержащим 2% BSA. Инкубируют 30 минут при 37 ° С. Следуйте шаг 2.4-2.5 и хранения образцов при 4 ° С.
      Примечание: Для контроля азида натрия: Применение PBS с добавлением 2% BSA и 0,1% азида натрия для 30 мин инкубации при 37 ° С.
    4. Для «30 мин + образцы СТВ "спина трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл PBS, содержащим 2% BSA. Инкубируют 30 минут при 37 ° С. Затем спиновые трубки при 4 ° С в течение 3 мин при 450 х г в. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мкл СТВ (использовать концентрацию определяется в разделе 3), разбавленного в PBS, содержащий 2% BSA и 0,1% азид натрия (для предотвращения интернализации при обращении образец). Инкубируют 30 минут на льду. Следуйте шаг 2.4-2.5 и хранения образцов при 4 ° С.
      Примечание: Для контроля азида натрия: Применение PBS с добавлением 2% BSA и 0,1% азида натрия для 30 мин инкубации при 37 ° С.
  7. Выполните шаги 2.6-2.8 и анализировать образцы с помощью проточной цитометрии. Определить процент Cy-3-положительных клеток в каждой пробе.
  8. Рассчитывают процент прикреплен вирус и относительное количество интернализованной вируса.
    1. Чтобы рассчитать количество присоединенных вируса, использовать процент Cy-3 positiве стробированные клеток или интенсивности флуоресценции среднее сигнала Cy3. Для сравнения, установить необработанных клеток на 100% (фиг.4В).
      Примечание: Процент прикрепленной вируса описывается "0" образец мин.
    2. Для расчета суммы интернализованной вируса, взять отношение "30 мин + STV" образца на "30 мин" образца (рис 5B).
      Примечание: Как уже упоминалось выше, процент положительных Cy3 закрытых ячеек или средней интенсивности флуоресценции сигнала Cy3 могут быть использованы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мультфильм описания четырех различных экспериментальных условиях показано на рисунке 1 Результаты типичного эксперимента представлены на рисунках 2 -. 5. В "0" образец мин, биотинилированный вирус холодной связаны с клетками-мишенями, которые могут быть визуализированы с помощью окрашивания СТВ-Cy3 (фиг.1 и 2). Когда блокирующий шаг (в "0 мин + STV" образца) применяется, вирус на поверхности клеток больше не может быть обнаружен с помощью окрашивания СТВ-Cy3. В результате интенсивность сигнала в "0 мин + СТВ" образца сильно уменьшается по сравнению с "0" образец мин (фиг.1 и 2). При повышении температуры до 37 ° С, придает вирус ресуспендировали в клетки ("30 мин" образцов). Интернализованная вирус не чувствителен к блокировке с немеченого СТВ, что приводит к менее резкому снижению интенсивности сигнала в & #8220; 30 мин + СТВ "образцы по отношению к" 30 мин "образца, в котором нет блокировки СТВ не была применена (1 и 2).

В качестве контроля мы использовали макет инфекции, лечение и лечение NA SA. Рисунок 3 показывает процент Су3-позитивных клеток для всех экспериментальных условиях, описанных в разделе 4. Мок-инфицированных клетки дают интенсивность фонового сигнала для эксперимента и выступать в качестве отрицательного контроля для Крепление вируса (фиг.4). Дополнительный контроль для крепления вирусов является лечение бактериально выразил NA. Н.А. удаляет сиаловой кислоты, рецептор для прикрепления IAV, из гликопротеинов на поверхности клеток и тем самым снижает связывание вируса с клетками-мишенями 17. Как показано на рисунке 4, обработка NA сильно отменяет крепление IAV примерно 90% по сравнению с необработанными клетками. Что касается интернализации, мы использовали в качестве контроля SA. SA TR eatment оперативно истощает уровни клеточных АТФ, тем самым ингибирующие энергоемких процессов, таких как эндоцитоза 13. Инкубации клеток с SA во время и после инфекции ингибирует интернализации вирусных частиц. Относительное количество интернализованной вируса (изображенной на рисунке 5) был увеличен с примерно 10% до 45% путем инкубации при 37 ° С в течение 30 мин в необработанных клетках. После обработки SA однако, процент относительного интернализованной вируса была около 15% для обоих, клетки инкубировали в течение 0 30 мин при 37 ° С. Это указывает на то, что на самом деле, С.А. уменьшает эффективную поглощение вирусных частиц в клетки.

фигура 1
Рисунок 1. Принцип анализа. Мультфильмов поясняющая принцип действия приложения / интернализации анализа.= "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Представитель результат для прикрепления IAV и интернализации. (А) гистограмму, показывающую интенсивность сигнала сигнала Cy3 для необработанных клеток. Показанный являются "0 мин", "0 мин + СТВ", "30 мин" и "30 мин + СТВ" образец. (Б) процент Су3-позитивных клеток от А. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель результат для крепления и интернализации, включая управления. Ронг> Процент Су3-положительных клетках А549 после указанной обработки. Показаны макет-инфицированных, лечения, Н.А. обращению и SA-обработанных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Ингибирование прикрепления вируса по нейраминидазы. (А) гистограмма интенсивности Cy3 сигнала "0 мин" образцов. Отображается являются необработанные клетки (в синем) и два контрольных образцов: макет инфицированных и NA-обработанные клетки (в красный и оранжевый, соответственно). (Б) процент Су3-позитивных клеток из А. показаны макеты, лечить и Н. обработке клеток от «0 мин» образца. Значение необработанных клетках был установлен на 100%.ком / файлы / ftp_upload / 53372 / 53372fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Подавление вируса интернализации азида натрия (SA). (А) Гистограмма показывает интенсивность сигнала Cy3 в "30 мин" и "30 мин + СТВ" образцы из необработанной (в красный и оранжевый, соответственно) и SA- лечение (в синих и зеленых, соответственно) клеток. (Б) процент относительной интернализованной вируса от необработанных и обработанных С.А. клеток после 0 и 30 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наш протокол описывает простой способ измерения вложение вирусов и интернализации с помощью проточной цитометрии. Это позволяет использование меченых вирус, который имитирует более близко вирусные инфекции по сравнению с использованием вирусоподобных частиц (VLP) дикого типа. В то время как наш протокол был оптимизирован для измерения привязанность и интернализации IAV он может быть легко адаптированы для других вирусов. Кроме того, как проточной цитометрии используется для считывания, со-окрашивание могут быть легко добавлены к протоколу, например, чтобы проверить уровни экспрессии следующие нокдауна или сверхэкспрессии белка, представляющего интерес. Таким образом, анализ позволяет модификаций протокола в зависимости от индивидуальных потребностей. Следует отметить, что этот анализ также может быть выполнена для ряда моментов времени для измерения вируса интернализации с течением времени и получить информацию кинетическую. Это может быть особенно важно, если по результатам анализа были быть адаптированы для другого вируса с неизвестными интернализации кинетики.

Хоуверсии, следует отметить, что окно обнаружения является относительно небольшим, как различия в приложении или интернализации происходят в линейном масштабе из-за отсутствия вирусной репликации. Для повышения доверия и снизить уровень шума, мы рекомендуем в том числе управления (например, элементы управления описано выше) и несколько повторов. В то время как результаты, показанные изображают типичного эксперимента, мы наблюдали хорошую согласованность между различными экспериментами: Например, для прикрепления, процент Cy-3-позитивных клеток составляла от 60-80%; для интернализированный вируса мы получили значения в диапазоне 40-60%.

Перед анализом начинается, важно, чтобы титровать рабочие концентрации используемых реагентов, таких как СТВ, СТВ-Cy3 и количества биотинилированного вируса. Пожалуйста, обратите внимание, что количество реагентов и времени инкубации может варьировать в зависимости от клеточной линии и штамма вируса, используемого. Чтобы максимизировать окно обнаружения, процент клеток положительными на вирус attachmenт должно быть как можно более высокой в ​​"0 мин и" 30 мин "образца (в зависимости от количества биотинилированного вируса, используемого) и как можно более низкой в" 0 мин + СТВ образца "(в зависимости от количества СТВ использовали ). Кроме того, может быть уменьшен шум, сохраняя клетки при 4 ° С во время центрифугирования и промыванием охлажденным льдом PBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом Швейцарского национального научного фонда (31003A_135278) к SST. СС является бенефициаром докторской гранта Фонда исследований AXA. Мы благодарим Патриция Нигг за помощь в оформлении рисунке 1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 41966-052
FBS Life Technologies 10270-106
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163
PBS Life Technologies 14190-169  
BSA VWR Calbiochem 126579
HEPES Life Technologies 15630-100
D-Sucrose Fluka 84100
TRIS Biosolve BV 20092391
EDTA Sigma-Aldrich 3680
EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit Fisher Scientific W9971E 
Bio Rad Protein Bio Assay Bio Rad 500-0006
deepwell tubes (1.2 ml microtubes) Milian 82 00 001
PFA  Lucerna chem  Electron microscopy sciences 15710
ultracentrifuge tubes Hemotec HmbH 253070
Triton X-100 Fluka 93420
STV-Cy3 Life Technologies 43-4315
STV Life Technologies 43-4302
sodium azide Fluka 71290
bacterial neuraminidase/sialidase Sigma-Aldrich N6514-1UN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
  2. Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
  3. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
  4. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
  5. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
  6. Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
  7. Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
  8. Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
  9. Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
  10. Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
  11. Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
  12. Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
  13. Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
  14. Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  16. Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. Humana Press. (2007).
  17. Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics