Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wunsch, C. M., Lewis, J. P. Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells. J. Vis. Exp. (106), e53408, doi:10.3791/53408 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Anaerobik bakteriler çok böyle gut, ağız ve vajina gibi birçok insan nişler aerop çoğunluktadır. Ayrıca, anaerobik enfeksiyonlar sık ​​ve sık sık yerli kökenlidir. İnsan hücreleri istila bazı anaerobik patojenlerin yeteneğini onlara doğal bağışıklığı kaçmak için de konakçı hücre davranışını modüle edilmesi için bir tedbir alınması verir. Ancak, anaerobik bakteriler zorluklar oluşturabilecek olayların deneysel soruşturma sırasında canlı sağlanması olduğunu. Porphyromonas gingivalis, bir Gram-negatif anaerob, ökaryot fagositik olmayan hücrelere çeşitli işgal yeteneğine sahiptir. Bu makale başarıyla kültür ve P. yeteneğini değerlendirmek için nasıl özetliyor gingivalis, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) işgal etmek. İki protokolleri geliştirilmiştir: Bir başarı istila ve ev sahibi içinde hayatta ve diğer konakçı hücreleri ile etkileşim bakteri görselleştirmek için bakteriler ölçmek için kullanılır. Bu teknikler, bir ANAE kullanımını zorunlurobic P. tedarik bölmesi Optimal büyüme için bir anaerobik ortam ile gingivalis.

Birinci protokol büyük ölçüde bakterilerin konakçı hücrelerin istilası incelemek için kullanılır antibiyotik koruma deneyi, dayanmaktadır. Bununla birlikte, antibiyotik koruma deneyi sınırlıdır; Antibiyotik tedavisi ve konak hücre lizis aşağıdaki kültürlenebilen sadece hücre içi bakteriler ölçülür. Canlı ve ölü konakçı hücreler ile etkileşen tüm bakteri değerlendirmek için, konukçu-patojen etkileşimini incelemek için flüoresan mikroskopi kullanan bir protokol geliştirilmiştir. Bakteriler flüoresan olarak, 2 'ile 7'-bis- (2-karboksietil) olarak etiketlenmiştir -5- (and-6) -carboxyfluorescein asetoksimetil ester (BCECF-AM) ve anaerobik koşullar altında ökaryotik hücrelerin enfeksiyonu için kullanılır. % 0.2 Triton X-100 ile formaldehit ve geçirgenliği ile tespit eden konakçı hücreler, sırasıyla, hücre sito-iskeletini ve çekirdeği etiketlemek için TRITC falloidinle ve DAPI ile etiketlenmiştir. Çoklu imaFarklı odak noktaları (Z-yığın) alınan ges bakterilerin zamansal-mekansal görselleştirme için elde edilir. Bu çalışmada kullanılan yöntemleri, herhangi bir ekilebilir anaerob herhangi bir ökaryotik hücre tipine uygulanabilir.

Introduction

Anaerobik bakteriler insan vücudunun hemen hemen tüm yüzeyleri kolonize. Oksijen konsantrasyonu düşüktür bağırsak ve genitoüriner yolun florasında baskın olmasına rağmen, aynı zamanda cilt, ağız, burun, boğaz ve 1 yüksek seviyelerde bulunmaktadır. Anaerobik bakteriler endojen enfeksiyon ortak bir nedenidir ve sıklıkla hastalıklı sitelerden izole edilmiştir. Bununla birlikte, bunların üreyen doğa anaeroblar izole etmek ve kültür, zor olabilir. Anaerobik bakteri içeren çalışmalar kısıtlı şartlarda yapılmalıdır. Modern anaerobik-kültür teknikleri araştırmacılar, birçok anaerobik laboratuar suşları ve hatta klinik izolatları 2,3 incelemek için gerekli olan anaerobik ayarlarını taklit izin verir.

Patojenik anaerobik bakteriler içinde bulundukları konakçı hücreler ile dinamik bir ilişki ve ko-evrim geliştirdik. En anaeroblar infecti ulaşmadan önce bir vücut bağışıklığı tepkisi ile öldürülmeye duyarlılı seviyeleri. Ancak, bazı patojen bakteriler kaçmak ya da konak immün yanıtı yıkmak için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Bunlar, bağışıklık tanıma bağışıklık aracılarının nötralizasyon, hücre-aracılı bağışıklığın bir değişiklik, konakçı hücrelerin istilası ve 4 sinyal İmmün alterasyon kaçırma gibi mekanizmalarla bu amacı gerçekleştirmek. Porphyromonas gingivalis, hem oral hem de karışmış bir Gram-negatif anaerob ağız dışı hastalıklar, ev 5-7 patojen değişikliklerin neden olabilecek yüksek adapte bakteriyel patojenin bir örnektir.

Biyofilm plak cepler atmosferik oksijen 8 korunur anaerobik bakteri barındırabilir diş ve dişeti mukoza dokusunun arasında oluşan derin yarıklar oluşmuştur. Bunlar periodontal cepler gibi P. gibi çeşitli anaerobik patojenler, bir niş olarak hizmet gingivalis 9. P. gingivalis şeklini kapasitesine sahip bir kilit taşı patojendirPeriodontal hastalıkların 10 gelişmesini ve ilerlemesini teşvik şekillerde ağız mikrobiyal topluluk ing. Bu ana proteinlerin geniş bir spektrumuna karşı aktif olan ve ana savunma 11 kaçırma için mekanizmalar sağlar hastalık oluşturma faktörlerinin çok sayıda üretir. Aynı zamanda, in vitro ve in vivo 12-14 15 epitel, endotel, fibroblastik ve periodontal ligament hücreleri istila edebilir. Etkin bir şekilde, P. konakçı hücreleri işgal tarafından gingivalis konak bağışıklık kaçabilir. Konakçı hücrelerin etkili işgali sadece bakteri konak savunma kaçmasına izin değil, aynı zamanda gelecekte yeniden enfeksiyon için bir rezervuar olarak hizmet yanı sıra konakçı hücreyi değiştirir. Konakçı hücreler tarafından yapışması ve bakterinin içselleştirme yer alan moleküler mekanizmalar çalışmalar gereklidir. Birkaç laboratuvarlarda Araştırma P. içselleştirilmesi ile ilgili moleküler olayları anlamaya odaklanmıştır konakçı hücreler tarafından gingivalishem de bastırmak ve bağışıklık yanıtı kaçırmak ve düşman konak savunma mekanizmaları hayatta kalmak için kullanılan mekanizmalar olarak.

Tanımlanması ve konakçı hücreleri işgal edebilen patojenleri karakterize edebilen çok sayıda deneyler vardır. Oksijen yokluğunda hantal araçlara dayanan çalışmalar yapmak zor olduğundan Ancak, anaerobik patojenler ile in vitro çalışmalar ağırlıklı olarak araştırmacı birçok deneysel sorunlar oluşturmaktadır. Bu ökaryotik hücreler büyümeye oksijene ihtiyaç ve dolayısıyla doku kültürü inkübatörlerde ayrı hazırlanmış olmalıdır gerçeği ile birleşir. Bu tür engelleri önlemek için bir yolu atmosferik oksijenin altında çalışmalar yapmak olurdu, ama o anaerobik bakteri büyüme imkansız hale getirecektir. Başka bir yöntem, enfekte ve ana-hücre etkileşimini incelemek ısı ile öldürülmüş bakterilerin kullanmak olacaktır. Ancak, farklılıkların konak-patojen etkileflimlere alaka azaltmak ısı ile öldürülmüş ve canlı bakteri arasındaki mevcut16. Bu konak hücreleri ile etkileşim değişmeden ifade ile canlı bakteri incelemek için merkezi; P kültürlemek için, bu nedenle, yöntem anaerobik ortamda gingivalis verilmiştir. Aynı zamanda, iki basit düşük maliyetli protokoller P. yeteneğini değerlendirmek için gösterilmektedir gingivalis, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) tarafından içselleştirilebilir için. Birinci protokol popüler antibiyotik koruma deneyi dayanmaktadır. Deney basittir, ancak anaerobik mikroorganizmalar kullanılarak hususlar verilmiştir. İkinci protokol etkileşim görselleştirmek için bir floresan tarama mikroskobu kullanılmasını gerektirir ve P. içsel gingivalis. Her deney sınırlamaları ve anaerobik bakteri invazivliğini eğitimi için araştırmacı bir taslağını sunmak üzere ele alınacak avantajlara sahiptir. Geçerli el yazması P çalışmaları olsa da gingivalis ve HUVECler, bu protokoller ve diğer pek çok anaerobik bakteriler için kullanılabilirEv sahibi hücre tiplerine olarak gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıdaki protokoller anaerobik türler, P. tarafından işgali kültüre ve eğitim yöntemlerini anlatacağız gingivalis; Bununla birlikte, bu protokoller anaerobik patojenlerin bir dizi kullanılabilir. HUVECler kullanılsa da, bu protokol immün olmayan bağışıklık hem de ökaryotik hücreler için kullanılabilmektedir.

1. Anaerobik Odası Kullanımı ve Bakımı

Not: P. gingivalis ortam havasındaki karşılaşılan oksijen normal düzeylere duyarlı bir anaerob olduğunu. Kontrollü bir anaerobik ortam P. ekimi için hayati önem taşımaktadır gingivalis.

  1. Burada, karışık anaerobik gaz (% 80 N2,% 10 H2, 2 10% CO) bir vinil anaerobik odası içinde (Şekil 1A) 'de verilen bir yapay atmosferi korumak. Anaerobik odasına laboratuar ortamında öğeleri aktarmak için bir hava kilidi (Şekil 1B) kullanın. Hava kilidi elle tw faaliyetKarışık anaerobik gazın önce N 2 gazı ile buz temizleme.
  2. Istenmeyen hidrojen sülfid bakım gerektirmeyen çıkarılması için bir bir hidrojen sülfür arındırma kolonu (Şekil 1C) kullanın. Katalizör tarafından oluşturulan O H 2 kaldırmak ve kontaminasyon yayılmasını kolaylaştıran aerosoller önlemek için bölme içinde bir nem alıcı yerleştirin.
    Not: Hidrojen sülfür, birçok anaerobik bakteri doğal metabolik yan ürünü olduğunu ve birikim bakteriler için toksik ve elektronik zarar ve bir katalizör ömrünü azaltabilir.
  3. Hidrojen mevcudiyetinde (Şekil 1D) oksijeni ortadan kaldıran bir paladyum katalizörü vasıtasıyla odası atmosferinin sirküle edilmesi için bir fan kutusu kullanın.
    Not: Bir çevrimli atmosferik (HEPA) filtresi 0.22 um veya daha büyük bir boyutu ile havadaki kirletici kaldırır.
  4. Anaerobik içinde bulunan bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde kültür anaerobik bakterilerodası. Anaerobik odasının içine çalışırken standart aseptik teknikler kullanın.

figür 1
Şekil 1. Anaerobik vinil odası ve bileşenleri. (A) atmosferik oksijen tamamen kapatılmış bir vinil anaerobik odası bir anda (32 x 78 in) iki kişi için çalışma alanı sağlar. Bu (geri orta) 37 ° C'de ayarlanmış bir inkübatör içermektedir. (B) Bir hava kilidi anaerobik odasına laboratuar ortamında öğelerin aktarımı için kullanılır. Resimde otomatik olarak anaerobik ortam yaratmak için gerekli vakum ve temizleme işlemleri gerçekleştirmek için programlanabilir bir kontrolör ile çalıştırılan bir otomatik airlock olduğunu. (C) bir hidrojen sülfür arındırma Sütun istenmeyen hidrojen sülfitin bakım gerektirmeyen bir yüksek kapasiteli kaldırma sağlar. (D) İki katalizör fan kutularıhidrojen varlığında, oksijeni ayırmaktadır, paladyum katalizörü vasıtasıyla odası atmosferinin dolaşımını sağlamaya anaerobik odası boyunca yerleştirilir. Anaerobik odası üreticinin talimatlarına göre ayarlanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Anaerobik Bakterilerin 2. Hazırlık

Not: P. gingivalis aerotolerant ve havadar koşullarda saklanabilir ancak% 6 17,18 daha yüksek seviyelerde oksijen varlığında büyüme olmaz. Bir anaerobik odası P. uygun yetiştirilmesi için gerekli olan gingivalis ve diğer anaerobik türler (Şekil 1). Anaerobik odası kullanımı ile ilgili uygun eğitim ve öğretim microanaerobes 19 ile çalışmaya başlamadan önce gerekmektedir.

  1. Anaerobik iklimlendirme tüm sıvı ortamları ve plakaları dengelenmesiEn az 12 saat boyunca deney öncesinde iyonları artık oksijen çıkarmak için.
  2. P Transferi anaerobik odasına -80 ° C derin dondurucuda gelen gingivalis, çözülme edelim.
  3. Streak P. (TSA II% 5 koyun kanı ile) triptikaz soya kan agar plaklarına gingivalis. 4-7 gün için bir anaerobik kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de parafilm ve mağaza plakaları sarın.
  4. P aşılamak 3 ml beyin kalp infüzyon halinde gingivalis (BHI) et steril döngüleri kullanarak, hemin ve menadoin anaerobik ve titiz mikroorganizmaların izolasyonu ve kültürü için zenginleştirilmiş bir seçici olmayan sıvı ortam ile takviye edilmiştir.
    Not: Uzun süreli depolama için, -80 ° C derin dondurucuda gliserol veya DMSO (% 10-20 nihai konsantrasyon) ve yer ile BHI hazırlanan bakteri kültürleri karıştırın.
  5. P. bir başlangıç ​​kültürünü hazırlayın 1:10 seyreltme yapılmadan ve bakteri, orta log fazına kadar büyümeye izin vererek gingivalis.

Not: bac optik yoğunluğunuarteryal Süspansiyon belirlenir ve incelenecek her bir suş için bakteri konsantrasyonu ayarlanır. P. gingivalis, orta log fazında ve • 7 x 10 8 hücre / ml 0,7 tekabül OD 660 bir süspansiyon. Protokolde tarif edildiği büyüme koşulları yukarıdaki P. özgüdür gingivalis ve diğer bakteri türleri için adapte edilmesi gerekebilir.

3. Endotel Hücre Kültürü

Not: Alma üreticinin talimatlarına uygun olarak,% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de, vasküler endotelyal büyüme faktörleri (VEGF) ihtiva eden bazal ortam içinde primer HUVECler ve kültür toplanmış.

  1. 15 ml VEGF medyada 2.5 x 10 5 hücre / şişeye T-75 matara Tohum HUVECler.
    Not:% 4,0 tripan mavisi ile 1 seyreltme: 1 vasıtasıyla canlılığı kontrol edin. Binoküler ışık mikroskobu altında bakıldığında tripan mavisi koruyacaktır bir tehlikeye membran ile hücreler, intakt membranlı sağlıklı hücre, beyaz görünecektir. Counhücrelerin% 80'den fazla 20 yaşayabilir olduğundan emin olun, 100 hücre t.
  2. Hücreler ~% 80 confluency ulaşana kadar önceden ısıtılmış taze VEGF medya ile Ortam 2 günde değiştirin.
  3. Önceden ısıtılmış bir kez PBS ile yıkayın hücreleri. 2 ml tripsin nötrleştirme çözeltisi, ardından 5 dakika boyunca 2 ml tripsin-EDTA (% 0.25) ile inkübe edilerek T75 şişeden hücreler serbest bırakılması.
  4. Bir 50 ml konik bir tüp içinde süspansiyon haline getirilmiş edilmiş HuVEClerde toplayın. PBS ile T-75 şişeler herhangi bir ekstra hücreleri yıkayın ve 50 ml konik tüpler transfer.
  5. 10 dakika boyunca 200 x g'de santrifüje hücreleri.
  6. Süpernatantı 10 ml önceden ısıtılmış VEGF medya hücre pelet askıya.
  7. Hemasitometre veya benzer hücre sayım cihazı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
  8. (50.000 / oyuk) lamelleri ile 6-çukurlu bir tablaya (400,000 / çukur) veya 12-çukurlu plaka ya da eklemek hücre süspansiyonu miktarını hesaplayın. HUVECler ertesi gün deneme için hazır olacak.

4. Survival Testi Invasion / Etkileşim(Kaplama)

Not: Bu deney yaparken, / de 400,000 hücre 'de tohumlanmakta endotel hücrelerinin iki 6-oyuklu plakalar hazırlamak. Bir tabak bakteri bağlı ve ana hücreler tarafından değerlendirmek için kullanılacaktır. Diğer levha içi bakteriler için hesap verecek. Iki numune kopyaların bir deneyde ifa edilecek olan, 6-yuvalı plaka sağlar. Bu protokolün bir taslak hayatta kalma tahlil akış şeması (Şekil 2) bakınız.

  1. Onlar orta-log büyüme (OD 660 0.5-0.7) ulaşıncaya kadar (bölüm 1) yukarıda açıklandığı gibi anaerobik bakteri hazırlayın.
  2. Santrifüj bakteri 10 dakika için 5000 xg'de.
    Santrifüj dış anaerobik odası ise, sıkıca kapatılmış bir 15 ml tüp içinde bakteriyel numuneleri taşıyan oksijen sızmasını önlemek için parafilm kap sarma: edin.
  3. Topak haline P. yerleştirin gingivalis geri odasında, süpernatant atın. VEGF Beni resuspending önce tekrar PBS ile pelet bakteri yıkayındia. Tüm bakteri soyları, orta log fazında (~ 7 x 10 8 hücre / ml) karşılık gelen 0.7 OD 660 değerinde test için süspansiyonlar hazırlayın. Bakteriler şimdi enfeksiyon için hazır.
  4. Anaerobik odasına doku kültürü inkübatör HUVECler içeren transfer 6 oyuklu plakalar. Ortamı çıkarın ve anaerobik PBS ile üç kez yıkayın. Her bir oyuğa, anaerobik VEGF ortamının 2 ml ilave edilir ve enfeksiyon için sıcaklık dengelenmesi için 20 dakika boyunca anaerobik bir inkübatörde 37 ° C'de plakalar yerleştirin.
    Not: enfeksiyon için kullanılan olanları sağlamak için kan agar plaklarına Plaka bakteriler homojen ve enfeksiyon sırasında kontamine değildir.
  5. 100: enfeksiyon çokluğunda bakteri konakçı hücreleri (ana MOI bakteriler) Infect 1.
    Not: HUVEC hücre sayısı enfeksiyondan önce tek bir oyuk üzerinde tripan dışlama testi ile tespit edilir. Bakteriyel hücre sayısı (0,5 = 5 x 10 8 hücre / ml OD, gibi), optik yoğunluk ile belirlenmiştir. Bİçeriği: Bakteri konsantrasyonu HUVECler konsantrasyonuna 21 dayalı doğru İçişleri Bakanlığı ayarlanır.
  6. Anaerobik inkübatör içine enfekte HUVEC 6-çukurlu tabak yerleştirin ve bakteriler, 30 dakika boyunca, konak hücreleri ile etkileşim sağlar.
  7. BHI içinde saponin anaerobik odası içinde ve 0.2 um'lik bir filtreden filtre (ağ / hac% 1.0) hazırlayın.
  8. Hem takılı ve içselleştirilmiş bakteri Survival.
    1. Inkübatörden, aspirat ortam plakaları çıkarın anaerobik üç kez PBS ile yıkayın ve 2 ml (adım 4.8 de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır),% 1.0 saponin, süzüldü ekleyin. Ev sahibi hücre lizizine izin vermek için 15 dakika boyunca inkübe edin.
    2. Hücre kazıyıcı ile her iyi alt kazıyın. Beher kuyudan hücre karışımını toplamak ve 1 yapın: BHI 1 seyreltme.
    3. Numunenin seri dilüsyonları yapmaya devam edin. Bakteriyel türler ve konsantrasyona bağlı olarak, seri dilüsyonları ayarlayın. 1 ile başlayın: 100 veya 1: 1000 dilüsyonları.
    4. Kan agar plakaları üzerine istenen seyreltme 200 ul Plate. Bürünmüş37 ° C'de anaerobik kuluçka makinesinde parafilm ve yerine o plakalar.
    5. 37 ° C'de yedi günlük inkübasyondan sonra, plakalar çıkarın ve el koloniler saymak için bir ışık kutusu kullanılarak koloni oluşturan birimler (CFU) sayısı.
      Not: CFU numaralandırılan. CFU büyük miktarlar için, görüntü alınabilir ve bilgisayar programı CFU numaralandırılmasına kolaylaştırmak için kullanılabilir.
  9. Içselleştirilmiş bakteri Survival.
    1. Inkübatör plakaları çıkarın. Anaerobik PBS ile üç kez yıkanır ve takviye antibiyotik (gentamisin 300 ug / ml, metronidazole 400 ug / ml) ile 2 ml VEGF ortamı eklenir.
    2. 1 saat süreyle inkübe edin. Istenilen bakteri suşu öldürme% 100 etkilidir, böylece antibiyotik test etmek ve onlar konakçı hücreleri 22,23 nüfuz olmadığından emin olmak için emin olun.
    3. Aspire medya, süzülmüş% 1.0 saponin 2 ml ekleyin. Ev sahibi hücre lizizine izin vermek için 15 dakika boyunca inkübe edin.
    4. Her wel alt Pençehücre kazıyıcı ile l. Her kuyudan hücre karışımı toplayın ve 1 yapın: BHI 1 seyreltme.
    5. Örnek (: 100, 1: 1000, 1) seri dilüsyonları hazırlayın.
    6. Kan agar plakaları üzerine istenen seyreltme 200 ul Plate. Anaerobik inkübatör parafilm ve yerinde plakaları sarın.
    7. 37 ° C'de inkübasyondan yedi gün sonra plakaları kaldırmak ve CFU sayımı C.

Şekil 2,
Şekil 2. ökaryotik hücreler ile anaerobik bakteri hayatta kalmak için kullanılan bir protokol şematik. Toplam bakteri hayatta kalma ve içselleştirilmiş bakteri hayatta kalmak için her iki deneyleri aynı anda yapılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ana Ce içine Bakterilerin 5. içselleştirilmesills (Floresan Mikroskobu)

Not: P. gingivalis, 2 'ile 7'-bis- etiketlenmiştir (2-karboksietil) -5- (ve-6) -Carboxyfluorescein, asetoksimetil ester (BCECF-AM). BCECF-AM floresan olmayan bir zan-geçirgen bir boyadır; Hücre içi esterazların etkisi ile floresein BCECF olan dönüşüm hücre canlılığı gösterebilir. P. gingivalis BCECF-AM boyası ile etiketlenmiş ve sonra ökaryotik hücreleri enfekte etmek için kullanılır. Enfeksiyonu takiben, hücreler sabitlenir ve DAPI ve TRITC-falloidinle etiketli. Ökaryotik hücre çekirdeği leke kullanılan DAPI leke da değil metabolik cleave BCECF-AM can cansız bakterileri tanımlamak için bir karşı-önlem sağlar bakteriyel hücre çekirdeğine, etiketleyecektir. Konakçı hücreler TRITC-Phalloidin, kırmızı aktin boya ile vurgulanır.

  1. Otoklav lamelleri. Aseptik / gözenek 5 x 10 4 hücre endotelial hücreler, tohumlamadan önce 12 oyuklu plakalara lamelleri ekleyin. (Deneyden önce hazırlanan gün)
  2. Bölüm 1'de anlatıldığı gibi orta-log fazı büyüdü anaerobik bakteriler (= 0.5-0.7 OD 660) hazırlayın.
  3. Yıkama bakteri 5000 xg'de santrifüj ve 5-7 x 10 8 hücre / ml'de PBS içinde süspansiyon haline pelet ile anaerobik PBS ile 2x.
  4. 2 uM BCECF-AM bir son konsantrasyona kadar bakteriyel süspansiyon (5-7 x 10 8 hücre / ml) içinde 2 ml 0,2 mM BCECF-AM 20 ul ekle.
  5. Karanlıkta 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
  6. Anaerobik odasına doku kültürü inkübatör 18 mm (# 1.5 kalınlık) dairesel lamelleri numaralı seribaşı endotel hücreleri ile transfer plakaları. PBS ve anaerobik VEGF medya ile alışverişi ile yıkayın.
    Not: HUVECler ışık mikroskobu altında sağlıklı olduğundan emin olun. HUVECler% 80 birleşen, morfoloji üreticilerine karşılaştırılabilir olmalıdır ~ olmalıdır.
  7. Santrifüj etiketli bakteriler10 dakika için 5000 xg artık BCECF-AM boya kaldırmak için. 2 ml anaerobik VEGF medyada Askıya.
  8. 1 (bakteri: host) 100 MOI'da etiketlenmiş bakteri ile konak hücreleri enfekte.
  9. 30 dakika boyunca 37 ° C'de anaerobik odasında inkübe edilir.
  10. Ve PBS ile üç kez enfeksiyon yıkama hücreleri sonra 10 dakika boyunca taze hazırlanmış% 4.0 paraformaldehid düzeltmek.
    Not: hücrelerin sabitlenmesi sonra deney anaerobik ile odacığın dış tarafına yapılabilir.
  11. Yıkama PBS ile üç kez lamelleri.
  12. 10 dakika için% 0.2 Triton X-100, 1 ml ekleyin.
  13. Yıkama PBS ile üç kez lamelleri.
  14. 45 dakika boyunca lamelleri TRITC falloidinle (50 ug / ml) 50 ul ekle.
  15. Yıkama DAPI içeren yumuşak set montaj ortamı ile bir slayt 12 plaka ve yerden kaldırmak üç kez lamelleri. Oje ile kenarlarını kapatın.
    Not: Slaytlar karanlıkta birkaç ay saklanabilir. Foto-ağartma önlemek için hafif maruz kalmaktan kaçının.
  16. Görünüm slaytlarkonfokal mikroskop ile incelendi.
    1. Burada, (ters) bir AxioObserver etrafında düzenlenmiş bir 34 kanallı spektral sistemi (32 kanal dizi detektörü ve iki yan PMT dedektörleri, artı iletilen ışık dedektörü) bir motorlu XY sahnede stand kullanın. Mavi diyot (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), yeşil diyot (561 nm), kırmızı HeNe (633 nm) ve 440 nm darbeli lazer: Sistem beş lazerler vardır. (FRET-Flim için) 2 hibrid GaAsP dedektörleri ile bir Flüoresans Ömrü Görüntüleme sistemini donatın.
    2. 340-380 nm ve 540-560 nm, ve sırası ile 435-485 nm ve 570-590 nm'lik bir emisyon filtresi uyarım dalga boyları ile bir çift bant filtre kullanılarak bir kanalda DAPI ve TRITC floresans algılama. 440-500 nm eksitasyon dalga boyu ve 510-590 nm'lik bir emisyon filtresi olan bir filtre kullanılarak BCECF-AM floresans algılama.
      Not: Her bakteri suşu yapılmalıdır BCECF-AM için Kontrolleri canlı bakteri doğru etiketleme sağlamak için çalışılmaktadır. Öncelikle bu nonviab doğrulamakle bakteri DAPI-pozitif ve BCECF-negatiftir. İkincisi, canlı bakteri floresein BCECF içine BCECF-AM metabolize sağlamak. Bakteri veya BCECF-AM boyası değişken konsantrasyonları uygun etiketleme için test edilmesi gerekebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yukarıda özetlenen Protokoller P. arasındaki konak-patojen etkileşimi inceleyerek kullanılmıştır gingivalis ve endotel hücreleri. P. gingivalis W83 ve bir P. PG0228 bir silme taşıyan gingivalis V3150 çalışmada kullanılmıştır. PG0228 sonuçta P. etkileşimini etkileyebilir RNA ve protein seviyelerini değiştirebilir bir protein kodladığı tahmin edilmiştir Ev sahibi hücreleri ile gingivalis. P. PG0228 etkisini araştırmak gingivalis sitesindeki konakçı hücreler ile etkileşim yeteneği, HUVEC ile etkileşim parental ve mutant kabiliyeti karşılaştırıldı. Sağkalım protokolü (Şekil 2) Bu çalışmada uygulanmıştır. Her iki suş da bu şekilde benzer bir büyüme eğrileri ve enfeksiyondan önce karşılaşıldı hücre sayıları normalleşme için ciddi bir sorun sahip adım 2'de tarif edilen ve böylece, her iki soy logaritmik faza büyütülmüştür. Yedi günlük inkübasyondan sonra, CFU kan gözlendigar levhalar (Şekil 3). Çeşitli seyreltmeler 1:10 (Şekil 3A), 1: 100 (Şekil 3C) ve 1: 1000 (Şekil 3B), kan agar plakaları üzerine kaplanmıştır. Şekil 3A görüldüğü gibi kolonilerin sayısı değerlendirmek için çok yüksek; koloniler [TMTC] "saymak çok fazla" olarak birbirleriyle ve belirlenen gelen indiscernible idi. Şekil 3B'de seyreltme çok az koloni elde edildiği gibidir çok düşüktü. 1 dilüsyonları: kolonileri belirgin ve kolonilerin sayısı saymak yönetilebilir olduğu gibi 100 Şekil 3C gösterildiği, arzulanan bir durumdur. Benzer sonuçlar, mutant soy V3150 (Şekil 3D) için bulundu. Böylece CFU 1 seyreltme faktörü ile plakalardan sayıldı: 100.

CFU sayısı ve seyreltme faktörü kullanılarak, her bir suş için elde canlı bakteri tahmini sayısı hesaplanmıştır. Viabl sayısını bölünmesiişgal etkinliği olarak tanımlanan bir oranda bakteri sonuçları ilk sayısı ile geri kazanılmıştır e bakteri. Her iki soyda işgali verimliliği karşılaştırıldığında, yabani tip W83 PG0228 eksik suşlar iken (Şekil 4), yaşamda kalmada önemli bir azalma gösterdi, yüksek verimli HUVEC içinde kurtuldu.

Ayrıca kusur sağkalım ziyade bakteri azalmış içselleştirilmesi nedeniyle olduğunu doğrulamak için, mikroskopi analizi yapıldı. HUVECler P. ile enfekte gingivalis mikroskopta (Şekil 5) altında incelendi. Bu örnekte, tek bir HUVEC sunulmuştur. Içselleştirilmiş bakteri sayısını belirlemek için birden fazla görüntü içselleştirilmiş P. mekânsal-zamansal tanımlama için izin veren bir Z-yığını elde etmek için farklı odak mesafelerde alındı gingivalis. Ayrıca, en az 40 hücre / deney (her bir biyolojik deney için) analiz edilmiş ve her bir st için sıralanan içsel bakteri sayısı olmalıdıryağmur. Bir mikroskop altında bakıldığında içsel bakteri sayısı, her bir suş için aynı ise, o zaman her iki suş eşit HUVECler istila; Ancak, mutant V3150 antibiyotik koruma deneyinde görüldüğü gibi, konakçı hücre içinde iken hayatta yeteneği azalttı.

Şekil 3,
Bakteriyel sağkalım tahlilinden 3. Sonuçlar Şekil. Protokol hücre içi bakterilerin hayatta kalması için vahşi tip P. kabiliyetini değerlendirmek üzere kullanıldı gingivalis W83 ve PG0228 bir mutant V3150 eksik istila ve HUVEClerde içinde hayatta kalmak için. İçselleşmiş canlı bakteri HUVECs- P., inkübasyonu takiben CFU görselleştirme ile belirlenir Anaerobik koşullar altında yedi gün süreyle kan agar plakaları üzerine gingivalis karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Kan plakaları kontrastı artırır ve CFU kolay sayımı sağlayan ışık kutusu üzerine yerleştirilir. Çeşitli dilüsyonlar ex olduni inceledi. HUVECler P. ile enfekte gingivalis W83 seyreltme 1:10 (A), seyreltme 1: 1.000 (B) ve sulandırma 1: 100 (C). HUVECler P. ile enfekte gingivalis V3150 seyreltme 1:. 100 (D) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Ebeveyn ve mutant bakteri suşları arasında. HUVEC'lere bir hayatta kalma oranlarının karşılaştırılması Şekil 4. yabanıl tip P. ile enfekte edildi gingivalis W83 ve PG0228 eksikliği mutant V3150. Şekil 2'de gösterildiği gibi hayatta kalma için protokol takip edilmiştir. Deney üçlü olarak üç kez yapıldı ve standart sapmalar ortalama ± sunulmaktadır. Invasion verimliliği / başlangıç ​​bakteri hayatta temsil eder.Vahşi tip W83 suşu (P <0.05) ile karşılaştırıldığında * mutant suşu hayatta istatistiksel olarak anlamlı azalttı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
P. mikroskobik analizi Şekil 5. Örnek HUVECler. HUVEClerde tarafından içselleştirilmiş gingivalis BCECF-AM ile enfekte edildi P. etiketli 1 (S. gingivalis: HUVEC) 100 MOl'de 30 dakika boyunca gingivalis. Hücreler, paraformaldehid ile sabitlendi ve TRITC-falloidinle ve DAPI ile etiketlenmiştir. Görüntü çekirdeğinin (A) ve mavi, kırmızı ve lekeli F-aktine (B) tek bir HUVEC göstermektedir. Ok P gösterir gingivalis yeşil (C) etiketli. Bir birleştirilmiş image P. göstermek için üretilen HUVEC'lere (D) içine gingivalis işgali. Görüntüler tarama konfokal mikroskop kullanılarak üretildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıdaki yöntemler eukaryotik hücreleri ile anaerobik bakteri ilişkinin değerlendirilmesi için özel bir tahlilleri tasarlamak için de kullanılabilir. Ancak, başarılı deneyler gerçekleştirmek için bazı noktalar vardır. İlk çalışmada kullanılan mikrobiyal soylar bulunmaktadır.

Bu, benzer bir büyüme aşamalarında ve invazyon verim 13 etkileyebilir yukarıda herhangi bir fark benzer hücre konsantrasyonları elde hayatta kalma tahlilinde hem de iki suşların karşılaştırılması, hem de, mikroskopi analizi ile çok önemlidir. Büyüme eğrileri, iki bakteri suşları arasında farklılık olduğunda, ayarlamalar sonunda tutarlı konsantrasyonları 21 paylaşımı benzer büyüme modelleri elde etmek için yapılmalıdır. Ayrıca, bakterilerin hücre toplanmasını önlemek için eşit şekilde dağılmış olması gerekir. Bundan başka, etkili bir şekilde hücre dışı bakteriler bu ortadan antibiyotik seçmek çok önemlidir. Seçilen antibiyotik daha sonra konakçı hücreler, ilgili zararlı etkileri varsaAlternatif bir antibiyotik ya da litik enzimler 24,25 kullanılabilir. Son olarak, gerilme heterojen kabul edilmelidir; Bir tür konak hücreleri işgal tespit edilebilir, ancak, orada başka bir 26 soydan diğerine patojenik önemli bir fark olabilir, ve bu nedenle pilot çalışmada, her bir suş incelenmesi için gerçekleştirilmelidir.

İkinci kritik bir adım protokolleri tasarlarken (konakçı hücreyi enfekte kullanılan bakteri sayısı enfeksiyon çokluğu [İçişleri Bakanlığı]) optimal inkübasyon süresi ve bakteriyel inokulum kurmaktır. Kısa inkübasyon süreleri daha uzun zaman noktaları bakteriyel sağkalım yanı sıra hücre içi çoğaltma 27 belirlemek için gerekli olabilir iken bakteri yeteneği konak hücreler tarafından içselleştirilmesi için değerlendirecektir. Bakterilerin hücre içi sağkalım İçişleri Bakanlığı tarafından etkilenebilir kullanılan olarak, hücreye hasar hücre ölümü veya permeabiliz yol açacağını neden oldu emin olmak için birden fazla Mois sınamak için en iyisidired hücre içi bakterilerin antibiyotik öldürülmesi erişim membranlar. Isteniyor belirli soruyu cevaplamak için gerekli İçişleri Bakanlığı ve kuluçka süreleri kurduktan sonra, deney protokolüne göre çalıştırılır; Bununla birlikte, ökaryotik hücre bakteri liziz karışımı birkaç seri seyreltme yapılmalıdır. Optimal seyreltme faktörü gözlenen CFU dayalı belirlenecektir. 50-200 CFUs plakalar neden Sulandırma faktörleri yaşam etkinliğini değerlendirmek için en uygun bulunmaktadır. CFU sayısı çok yüksek ise, koloniler birbirinden ayırt edilemez ve bu kullanıcı her bir koloni sayısı zor bir hale gelir. CFU sayısı çok düşükse, küçük sapmalar suşları arasındaki kat değişim incelenmektedir abartmak yanı sıra çoğaltır arasında büyük standart sapma üretirler.

Üçüncü bir kritik nokta sağlıklı ve bakteriler ile etkileşim için hazır konak hücreleri hazırlamaktır. Yukarıdaki protokol konakçı hücreler ayrı ayrı standart aseptik tec kullanarak kültüre edilirhniques. Doku kültüründe antibiyotik ve antifungal kullanımı özellikle acemi hücre kültürü biyologlar için, tavsiye olabilir. Ancak, hayatta kalma deneyi gerçekleştirmeden önce, konakçı hücreler anaerobik odasına hücrelerin aktarımı için en az 12 saat boyunca antibiyotik içermeyen ortam içinde kültive edilmesi gerekir. Enfeksiyon sırasında anaerobik bakteriler üzerinde etkilemek değil gibi bir kez odasının içine medya anaerobik antibiyotik içermeyen medya ile değiştirilmesi gerekir. Sorunları plastik doku kültürü plakaları olan konakçı hücrelerin eki ile yok veya lamelleri Eğer, poli-L-lizin ya da jelatin gibi bir yapıştırıcı kaplamanın uygulanması tavsiye edilebilir. Ayrıca, doğal olarak üretilen bazal membran benzeri hücre dışı matriks (ECM) ile kaplama doku kültürü yemekleri teknikleri koşullar 28,29 gibi in vivo olarak daha fazla araştırmacı sağlayabilir. Konakçı hücreleri yok bakteriyel canlılığı değiştirmeden açılması konakçı hücrelerin yeteneğine dengeli bir deterjan gerektirir. Saponin k olmaz, ancakHasta bakteriler, bazı türlerinin gelişimini inhibe edebilir. P. saponin çalışmalarımız öncesinde etkisi gingivalis büyüme / sağkalım üzerinde bir etkiye sahip olmadığı doğrulanmıştır-konak analizi için kullanılacak zorlamaktadır. Bakteri saponin içeren deterjanlar, son derece önemli olan, tekrarlanan donma-erime döngüleri ya da damıtılmış su bakterilere az zararla konakçı hücreleri lize etmek için kullanılabilir.

Dördüncü kritik nokta mikroskopi deneyler yaparken hususlar alınacak kapsamaktadır. İlk mikroskopi protokolü için kullanılmak üzere bakteri etiketlemek için floresan boya kullanılmasıdır. Bakteriler için çok geçerli etiketleme yöntemleri birincil antikor ya da toksik etkileri ve böylece yüksek arka plan vererek çevreye boya liç kadar önemli sınırlamalar ile alışılmış bakteriyel boyalar gerektirir. BCECF-AM yaygın prokaryot ve ökaryot 30-32 hem de hücre içi pH'ın bir flüoresan göstergesi olarak kullanılan membran geçirgen boyadır. Bu önceki çalışmalarda 33-35 anaerobik bakterilerin bir dizi etiketleme etkili olduğu bulunmuştur. BCECF-AM sadece esterleşme yeteneğine canlı bakteri etiketleyecektir. Dönüşüm onun ana bileşikten çok daha yavaş hücre dışarı sızar bir floresan formda içi esterazlar sonuçları BCECF için. Birçok flüoresan boyalar ve 36 kullanılabilir boyama teknikleri vardır; Bununla birlikte, bu protokol hemen hemen herhangi bir mikroorganizma ile kullanılabilen basit bir sabitleme / boyama tekniği açıklar. Buna ek olarak, diğer boyalar (TRITC-falloidin ve DAPI) daha açık bir şekilde, konak hücreleri ile etkileşime sadece bakteriler için ökaryotik hücrelerin ve hesap sınırları ayırt etmek için kullanılır.

Floresan boyalar fotoğraf beyazlatma duyarlı ve floresan sinyal 37 zayıflamasına önleyebilir mevcut birkaç ticari antifades ve montaj ortamlar vardır. Medya a montaj sert kümesinin arasındaki seçimler de vardırnd olanları yumuşak ayarlayın. Sert-set olanlar önemli refrakter endeksindeki değişiklikleri yanı sıra çekme ve doku hasarına neden olabilir 38 iken yumuşak ayar medya lamel güvenli, oje gibi sızdırmazlık gerektirir. Sonra enfekte ökaryotik hücrelerin arasında gözlemlenen farklılıklar nedeniyle; değişebilir hücreleri ve bu nedenle birden fazla ökaryotik hücreler arasında içsel bakteri sayısı analizi için kullanılır. Çalışmalarda, en az kırk ökaryotik hücreler deney 33,34 başına sayılan bakteriler değerlendirilir ve içselleştirilmiş edilir. Son olarak, açık bir şekilde, tek hücreleri görselleştirmek için, enfeksiyon için kullanılan ökaryotik hücreler konflüansa büyütülmüştür olmamalıdır. Epitel hücreleri ile Prevotella intermedia enfeksiyonun Mikroskobik konakçı hücre membran belirli bölgeler için tercih gösterdi ve bakteri epitel hücrelerin birbirleri ile temas halinde olan ve hiçbir lamellipodia 39 sahip sitelerinin bağlı değildir.

Lmikroskopi taklit düşük verimlilik olabilir. Bu durumda, bakterilerin invaziv özelliği akış sitometrisi büyük ölçekli nicel veriler ayrıca 40 kullanılabilir. Bu yöntem, floresan etiketli bakteri kullanımı (mikroskopi için kullanılmak üzere bakteri için tarif edildiği gibi olduğu yapılabilir) içerir ve bazı araştırmacılar için cazip olabilecek bir anda birden fazla örneklerin incelenmesi sağlar.

Iki protokol modifikasyonlar bakteri konakçı hücre alımında görev alan yolları belirlemek için yapılabilir. Başarılı bakteriyel işgali beş aşamada gerçekleşir: (1) eki (2) giriş / içselleştirilmesi (3) kaçakçılığı (4) sebat ve (5) çıkış 41. Böylece giriş / içselleştirilmesi sırasında, bakteri konak üzerine kendisini bulur ve sinyal iletimini değiştirme yoluyla içselleştirilmesi için konak hücreye usurps. Seçici metabolik inhibitörler başarılı işgali hücre sinyal değişiklikleri belirlemek için konukçu hücrelere ilave edilebilir. İçinaktin polimerizasyonu inhibe örnek Latrunculin, P. içselleştirilmesi nasıl etkilediğini hücre iskeleti yeniden düzenleme incelemek için kullanılabilir gingivalis. Hücreye özel reseptörler ya da bazı genlerin aşağı vurma edebilen siRNA hedef antikorlar da bakteriyel içselleştirme katılan sinyal olaylarını konakçı hücre daha iyi anlaşılması için kullanılabilmektedir. Tüm metabolik inhibitörler dışındaki konakçı hücreler üzerinde minimal genel etkisi, sahip olmalıdır araştırılmaktadır birlikte, bakteriler üzerinde toksik bir etkiye sahip olmayan inhibitör tedaviler sağlamak için önemlidir.

Gelecekteki çalışmalar belki bu tekniklerin bazıları mükemmel durumda gibi in vivo bir daha elde etmek olmazdı. Mevcut yazıda, her iki bakteri veya konakçı hücreler sert ortamlara maruz kalır. Deneyin organizmanın hücre çizgisi ve hedefe bağlı olarak bazı araştırmacılar CO 2 inkübatör yukarıdaki protokol gerçekleştirmek tercih edebilirsiniz. Bununla birlikte, periodontal lezyons bakteri ev sahibi ile etkileşim içinde oksijensiz bir mikro yansıtmaktadır. Hücresel cevap varyasyonları anaerobik koşullar karşısında aerobik altında ağız bakterileri ile meydan incelenen bir çalışma olduğunu bildirdi örneğin düşük oksijen gerilimi (% 2 oksijen) bakteriler, Tannerella hor P. altında gingivalis, ve P. intermedia aerobik şartlarda 42 ile karşılaştırıldığında, IL-8 ve TNFa yüksek düzeylerde ortaya çıkardı. Anaerobik koşullar altında hayatta kalmak için ökaryotik hücrelerin yeteneği aynı zamanda insan mezenkimal kök hücrelerin, insan dental folikül kök hücreleri, GF'lerinin, dişeti kanseri hücreleri ve insan oral epitel hücreleri 43,44,45 kabiliyetini tetkik çalışmaları ile teyid edildi. WST-1 hücre proliferasyon deneyi kullanılarak çalışmalarımız HUVECler oksijensiz koşullar altında 48 saat boyunca hayatta olduğunu gösterdi. Karar P. için havasız odadan hücrelerin enfekte edilmesi için yapıldı gingivalis de duyarlıdıratmosferik oksijen seviyesi, HUVECler, anaerobik koşullar altında uzun zaman süreleri hayatta iken. Gelecekteki araştırmalar, diğer 46 bir (bir arter gibi) tek ve anaerobik koşullardan biri yüzeyine oksijen sağlayan mikro-akışkan hücre kültürü cihazların uygulanmasını araştıracağız. Bu şekilde koşulları bakteri ya da enfeksiyon üzerine ana makinesi için kurban olmayacaktır. Özet olarak, anaerobik bakteriler için konukçu-patojen etkileşimini incelemek için kullanılabilir birkaç basit protokolleri tanımlanmıştır. Bu protokoller, bakteriyel istilası 40, hem de bakteri 47 invaziv özelliği kazandıran bir proteini eksprese eden taşıyıcı invaziv olmayan bakteri teşvik bakteriyel internalins, protein etkisini değerlendirmek için kullanılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B Coy Laboratory Products Model 2000 incubator 
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood BBL 221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool LifeLine Technology FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit LifeLine Technology LL-0003
TrypKit LifeLine LL-0013
Saponin Riedel-de Haen 16109
Gentamicin Sulfate Salt Sigma-Aldrich G-1264
Metronidazole Sigma-Aldrich M-3761
BCECF-AM LifeTechnologies B1150
TRITC Phalloidin  Sigma-Aldrich P1951
18 mm Circular Coverslips Electron Microscopy Sciences 72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16, (4), S175-S180 (1993).
  2. Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. (2014).
  3. Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10, (1), 49-61 (1977).
  4. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, (3), 188-202 (2008).
  5. Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52, (1), 134-152 (1988).
  6. Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, (4), 1244-1263 (1998).
  7. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5, (1), 78-111 (1994).
  8. Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47, (1), 1-18 (1976).
  9. Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27, (9), 648-657 (2000).
  10. Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91, (9), 816-820 (2012).
  11. Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20, (1), 168-238 (1999).
  12. Lamont, R. J., Yilmaz, öZ. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30, (1), 61-69 (2002).
  13. Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63, (10), 3878-3885 (1995).
  14. Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1, (3), 215-223 (1999).
  15. Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10, (5), 298-305 (2004).
  16. Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11, (1), 129-163 (1993).
  17. Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19, (2), 88-94 (2004).
  18. Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
  19. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787 (2013).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. (2001).
  21. Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30, (6), 481-485 (1968).
  22. Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1, (6), 451-459 (1972).
  23. Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45, (4), 493-496 (1966).
  24. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52, (7), 1673-1679 (1973).
  25. Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66, (12), 5994-5998 (1998).
  26. Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15, (4), 215-225 (2008).
  27. Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3, (1), 49-53 (2000).
  28. Gospodarowicz, D. III C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65, (6), 1351-1364 (1980).
  29. DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5, (9), e13039 (2010).
  30. Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172, (2), 255-264 (1994).
  31. Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269, (47), 29509-29514 (1994).
  32. Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271, (2), 861-868 (1996).
  33. He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74, (7), 4214-4223 (2006).
  34. Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78, (2), 688-696 (2010).
  35. Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71, (3), 1170-1178 (2003).
  36. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
  37. Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13, (14), 6699-6709 (2011).
  38. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. (2010).
  39. Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24, (4), 304-309 (2009).
  40. Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82, (6), 2637-2648 (2014).
  41. Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
  42. Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37, (12), 1039-1048 (2010).
  43. Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9, (11), e110616 (2014).
  44. Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8, (11), e78226 (2013).
  45. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58, (1), 65-72 (2012).
  46. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
  47. Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78, (6), 2385-2396 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics