Tomografia Computerizzata e Optical Imaging di osteogenesi-angiogenesi Accoppiamento per valutare l'integrazione di craniche Bone Autoinnesti e Alloinnesti

1Skeletal Biotech Laboratory, The Hebrew University–Hadassah Faculty of Dental Medicine, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 4Biomedical Imaging Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center
Published 12/22/2015
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Bioengineering

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Summary

L'impianto di innesti ossei autologhi e allogenici costituiscono accettato approcci per trattare la perdita di massa ossea cranio-facciale. Eppure l'effetto della composizione trapianto sull'interazione tra neovascolarizzazione, la differenziazione cellulare e la formazione delle ossa non è chiaro. Vi presentiamo un protocollo di imaging multimodale mira a chiarire l'interdipendenza angiogenesi-osteogenesi in prossimità dell'innesto.

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Cohn Yakubovich, D., Tawackoli, W., Sheyn, D., Kallai, I., Da, X., Pelled, G., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. J. Vis. Exp. (106), e53459, doi:10.3791/53459 (2015).

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Abstract

Un importante parametro determinante il successo di una procedura di innesto osseo-è vascolarizzazione della zona circostante l'innesto. Abbiamo ipotizzato che l'impianto di un osso autologo indurrebbe una maggiore rigenerazione ossea da una ricca formazione dei vasi sanguigni. Per studiare l'effetto del trapianto sulla neovascolarizzazione presso il sito del difetto, abbiamo sviluppato una tomografia (μCT) approccio micro-computerizzata per caratterizzare nuova formazione dei vasi sanguigni, che coinvolge la perfusione sistemica dell'animale con un mezzo di contrasto polimerizzazione. Questo metodo consente un'analisi dettagliata vascolare di un organo nella sua interezza. Inoltre, perfusione sanguigna è stata valutata utilizzando imaging di fluorescenza (FLI) di un agente fluorescente ematica. Formazione ossea è stata quantificata da FLI utilizzando una sonda di idrossiapatite mirato e analisi μCT. Reclutamento di cellule staminali è stato monitorato da bioluminescenza (BLI) di topi transgenici che esprimono luciferasi sotto il controllo del promotore osteocalcina.Qui si descrive e dimostrare preparazione del trapianto allogenico, chirurgia difetti cranica, μCT protocolli di scansione per lo studio e l'analisi neovascolarizzazione formazione ossea (tra cui la perfusione in vivo di mezzo di contrasto), e il protocollo per l'analisi dei dati.

L'analisi ad alta risoluzione 3D della vascolarizzazione dimostrata significativamente maggiore angiogenesi in animali con autoinnesti impiantati, soprattutto per quanto riguarda la formazione di arteriole. Di conseguenza, la perfusione sanguigna è risultata significativamente più alta nel gruppo autologo dal 7 ° giorno dopo l'intervento chirurgico. Abbiamo osservato mineralizzazione ossea superiore e una maggiore formazione ossea misurata negli animali che hanno ricevuto autoinnesti. Autotrapianto impianto residente indotto il reclutamento di cellule staminali per la sutura osso trapianto-ospite, dove le cellule differenziate in cellule che formano l'osso tra il 7 ° e 10 ° giorno post-operatorio. Questa scoperta significa che la formazione ossea maggiore può essere attribuito al'alimentazione vascolare aumentata che caratterizza l'impianto autologo. I metodi descritti possono servire come strumento ottimale per studiare la rigenerazione ossea in termini di formazione ossea strettamente delimitata e neovascolarizzazione.

Introduction

Perdita ossea craniofacciale causa di un trauma, la resezione del tumore, craniotomia decompressiva, e difetto congenito guarisce raramente da sola e presenta una chiara necessità clinica insoddisfatta. Innesti ossei autologhi e innesti ossei allogenici sono ampiamente utilizzati per trattare queste condizioni 1.

E 'ampiamente accettato che l'osteogenesi è strettamente accoppiato con angiogenesi 2,3. Pertanto, lo studio completo di una terapia proposto per la rigenerazione ossea dovrebbe includere un'indagine completa dell'albero vascolare formazione durante l'intero sito del difetto. Ci sono diversi metodi disponibili per caratterizzare vascolarizzazione in modelli di ricerca. L'albero vascolare può essere indagata mediante analisi istologica. Poiché istologia deduce sezionamento tessuto, vi è un'alta probabilità che l'immagine risultante sarà distorta. Per affrontare questo problema, la microscopia intravitale può essere eseguita per i vasi sanguigni intatti immagine 4; Tuttavia, questo metodo èlimitato a imaging solo piano. μCT scansione di campioni ottenuti da un animale perfuso con agente di contrasto permette imaging 3D della rete vascolare che alimenta il sito di rigenerazione 5. Questo approccio consente una dimostrazione estremamente dettagliata di vascolare di un organo nel suo complesso, nonché una meticolosa analisi della distribuzione dei vasi sanguigni. Inoltre, μCT consente differenziazione tra vari diametri dei vasi sanguigni, che caratterizzano i diversi sottotipi di vasi sanguigni.

Abbiamo ipotizzato che l'impianto di un innesto autologo cranica indurrà maggiore neovascolarizzazione di impianto di un allotrapianto, e questa maggiore neovascolarizzazione porterà, a sua volta, ad una maggiore osso formation.To perseguire questa ipotesi abbiamo utilizzato una varietà di tecniche. Abbiamo studiato i modelli di dell'albero vascolare di nuova formazione per l'esecuzione di un'analisi basata su μCT. Abbiamo misurato perfusione sanguigna utilizzando una sonda fluorescente sangue piscina. Successivamente, abbiamo asinised mineralizzazione del tessuto osseo da FLI di una sonda idrossiapatite-diretto e analisi μCT. Infine, abbiamo monitorato il reclutamento delle cellule staminali e la differenziazione, l'esecuzione di BLI in topi transgenici in cui luciferasi è espressa nelle cellule di osteocalcina-positivo.

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Protocol

Il protocollo segue le linee guida della cura degli animali istituzionale e uso comitato (IACUC) della Hebrew University di Gerusalemme, Israele (Richiesta n MD-12-13524-4), un impianto AAALAC approvata, e il Cedars-Sinai Medical Center IACUC (Richiesta n ° 3770). Gli animali sono stati trattati con la massima aderenza alle linee guida NIH.

1. Preparazione di Bone Alloinnesti

  1. Euthanize 7- a 8 settimane di età topi Balb / C, o qualsiasi ceppo diverso dal ricevente, utilizzando il metodo standard di CO 2 inalazione o iniezione intraperitoneale di 50 microlitri fenobarbital (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Confermare l'assenza di un battito cardiaco ed eseguire dislocazione cervicale. In alternativa, raccogliere le allotrapianti da carcasse che sono stati tenuti in -20 ° C e scongelati prima del raccolto.
  2. Radere la regione cranica con un tagliatore di capelli, applicandolo contro la direzione della crescita dei capelli. Disinfettare la testa della carcassa mediante l'applicazione di 70% isopropanol. Tagliare la pelle del cuoio capelluto con un bisturi n ° 11 e rimuovere il periostio.
  3. Utilizzando un trapano dentistico e una da 4,5 mm di diametro interno-trapano, staccare un frammento circolare di calvaria. Trasferire il frammento osseo di un piatto di plastica da 100 mm contenente soluzione fisiologica sterile. A questo punto, osservare sangue e tessuti molli attaccato al frammento osseo (Figura 1A). Ottenere frammenti ossei in questo modo da 22 donatori.
  4. Tenere frammento un osso alla volta utilizzando pinzette ricurve. Tampone a fondo utilizzando cotone punta dell'applicatore e rimuovere qualsiasi tessuto cerebrale, dei tessuti molli, e il sangue (Figura 1B). Tagliare delicatamente eventuali frammenti ossei che rimangono attaccati al trapianto con le forbici sottili in modo che il trapianto avrà una forma arrotondata perfetta.
  5. Immergere ogni innesto volta in una provetta da 15 ml contenente 70% di etanolo e due volte in 15 ml provette contenenti PBS per lavare l'etanolo.
  6. Congelare i trapianti in una -80 ° C in frigorifero cryotubes per aalmeno 1 settimana. A questo punto, assicurarsi che le allotrapianti appaiono trasparente (Figura 1C).

Chirurgia 2. cranica Difetto

  1. Per i destinatari di utilizzare i topi transgenici che esprimono luciferasi sotto il controllo del promotore osteocalcina 6.
  2. Sterilizzare le punte degli strumenti chirurgici utilizzando un riscaldatore perle di vetro per 30 sec. Trasferire gli strumenti per un vaso contenente il 70% di isopropanolo per mantenere condizioni sterili. Utilizzare guanti sterili.
  3. Anestetizzare un 7- a 8 settimane di età topo femmina mediante iniezione intraperitoneale di una miscela ketamine- medetomidina (75 mg / kg e 1 mg / kg, rispettivamente). Pinch l'arto animale per assicurarsi che sia profondamente anestetizzato. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
  4. Radere la regione cranica con un tagliatore di capelli applicando contro la direzione della crescita dei capelli. Applicare la crema-la rimozione dei capelli per eliminare eventuali residui di pelliccia e pulirla after non più di 2 minuti con garza asciutta seguite da garza imbevuta di soluzione salina. Si deve prestare attenzione per evitare di ottenere negli occhi. In alternativa, l'unguento veterinario occhio può essere applicato prima della depilazione come un ulteriore livello di protezione per gli occhi. È indispensabile che tutte le tracce del crema depilatoria essere rimosse per evitare possibili irritazioni da eccessiva esposizione all'agente chimico. Disinfettare il cuoio capelluto mediante l'applicazione di 5% di clorexidina (Figura 1D).
  5. Un'iniezione sottocutanea di 5 mg / kg carprofen diluito in 200 microlitri di soluzione salina. Applicare veterinario occhio unguento per prevenire la secchezza e mantenere l'animale su un pad termico in ogni momento. Posizionare l'animale sotto il binocolo operativi.
  6. Fare un 1 cm di lunghezza taglio ovale in pelle cuoio con le forbici sottili e pinzette (Figura 1E). Tenere il periostio con una pinzetta curve e tagliare con le forbici sottili.
  7. Praticare la cranica difetto 2 millimetri anteriore alla sutura lambdoidea utilizzando un trapano dentistico unnd un trapano esterna diametro di 5 mm (Figura 1F e G). Per evitare la penetrazione della dura madre, praticare tre quarti della strada nell'osso e staccare il frammento osseo con una spatola.
  8. Per impiantare un autotrapianto, recuperare il frammento osseo e lavarlo in un piatto di plastica 10 millimetri contenente 10 ml di soluzione salina sterile per rimuovere i detriti. Non rimuovere i tessuti molli. Per impiantare un allotrapianto, disgelo in anticipo un allotrapianto e normalizzare a RT, e poi lavare.
  9. Posizionare l'innesto osseo nel difetto con una pinzetta curva in modo da non toccare i margini difetto (Figura 1H). Incollare l'innesto con l'osso ospite usando il gel di fibrina (5 ml di 46 mg / ml di fibrinogeno mescolati con 5 ml di 25 U / ml trombina).
  10. Suturare la pelle con 4-0 Vicryl sutura (Figura 1I). Applicare iodopovidone al taglio chirurgico. Si deve prestare attenzione per evitare la contaminazione della sutura da pelliccia. Mark l'orecchio del mouse e iniettare 0,25 mg / kg Antisedan to invertire l'effetto anestetico di medetomidina.
  11. Se l'animale non svegliarsi 10 minuti, assicurarsi che si trova su un tappetino riscaldato. Iniettare 200 ml soluzione fisiologica sterile, e, se necessario iniettare 0,1 mg / kg Antisedan. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
  12. Tenere gli animali in gabbia separati per una settimana per impedire loro di aprire i punti di sutura. Posizionare il mouse Chow immersi in acqua in una capsula di Petri sul pavimento della gabbia per alcuni giorni post-op. Iniettare per via sottocutanea 200 ml di 1 mg / ml di soluzione Carprofen diluita in soluzione fisiologica sterile una volta al giorno per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per il trattamento del dolore post-operatorio.

Figura 1
Figura 1. cranica Alloinnesto Preparazione e cranica Difetto Chirurgia. Il frammento di osso è isolato dalla regione cranica (A). Tessuti molli, Midollo osseo e sangue sono tamponate (B), e l'innesto è sciacquato in etanolo al 70% seguito da due lavaggi in tampone fosfato salino (C, AG = allotrapianto). Il mouse destinatario è preparata per la chirurgia dalla rasatura e disinfezione della cute nella regione cranica (D). Un taglio ovale è creata nella pelle cuoio, e il periostio viene rimosso (E). Successivamente, il difetto cranica è forato utilizzando un trapano 5 mm di diametro (F). Il frammento osseo viene rimosso con una spatola a forma di cucchiaio, lasciando il seno sagittale superiore intatto (G). L'alloinnesto viene quindi posto nel difetto e bloccato usando gel di fibrina (H). Infine, la pelle viene suturata (I). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Micro-Tomografia Computerizzata per la caratterizzazione diVascular Albero

  1. Preparare soluzione salina eparinizzata. Peso 2.000 eparina sodica U e metterlo in tubo da 50 ml di plastica. Aggiungere 20 ml di soluzione fisiologica e agitare bene il tubo. Riempire una siringa da 20 ml Luer lock con 15 ml di soluzione fisiologica eparinizzata riscaldato e collegare la siringa a un set vena del cuoio capelluto 23-G. Fissare la siringa di una pompa a siringa, e impostarlo a pompare 10 ml a 1 ml / min.
  2. Sedate un mouse con una iniezione intraperitoneale di fenobarbital 50μl (65 mg / ml .; 100 mg / kg). Pinch arto dell'animale per assicurarsi che sia profondamente sedato. Fissare il mouse sul dorso di una scheda di fissazione avvolto con un rivestimento di superficie assorbente (Figura 2A). Posizionare il mouse fissato in una cappa aspirante per evitare l'esposizione del personale a fumi.
  3. Tagliare la pelle dall'addome al collo con le forbici sottili e pinzette (Figura 2b). Tagliare la parete addominale fino al processo xifoideo (Figura 2C). Tagliare la gabbia toracica lungo la sua faccia laterale. Evitare lesioni ai polmoni und cuore, e assicurarsi che il cuore è completamente esposto. Utilizzare un emostatico per ritrarre sterno (Figura 2D).
  4. Inserire l'ago a farfalla di 3 mm nel ventricolo sinistro (Figura 2E). Incollare l'ago della parete cardiaca e toracica utilizzando 3 secondi colla (Figura 2F).
  5. Attivare immediatamente la pompa. Dopo un minuto, sezionare la vena cava inferiore per depressurizzare il sistema vascolare (figura 2G). Inclinare la scheda in modo che i liquidi fluiranno lontano dalla testa. Perfusione successo si tradurrà in compensazione i vasi fegato e del sangue.
  6. Quando la perfusione soluzione fisiologica eparinizzata è completata, profumato 10 ml di formaldeide al 4%. Evitare la penetrazione di bolle d'aria nel sistema vascolare ed evitare l'esposizione a fumi di formaldeide. Perfusione formaldeide successo comporterà irrigidimento della coda. Lavare la formaldeide con 10 ml di soluzione fisiologica eparinizzate.
  7. Preparare il mezzo di contrasto radio-opaco secondo manufattoistruzioni urer. Tipicamente, richiederà miscelazione del composto, diluente, e un agente indurente. Utilizzare pipette sierologiche e miscelare la soluzione in un tubo di plastica da 15 ml.
  8. Profumato l'animale con la miscela di contrasto ad una velocità di 1 ml / min. Osservare i vasi sanguigni coronarici, intestinali ed epatici e assicurarsi che ingialliscono dopo perfusione di 2 - 3 ml, indicando perfusione di successo (Figura 2H). Al termine della perfusione, tagliare tubi del ago a farfalla, ottenere la carcassa solo e avvolgerlo in carta igienica per evitare perdite della soluzione alla regione cranica. Consenti polimerizzazione in 4 ° CO / N.
  9. Sezionare la regione cranica (figura 2I); Prima di utilizzare un bisturi per tagliare la pelle laterali possibile, evitando di danneggiare la regione craniale di interesse. Individuare l'innesto osseo e quindi utilizzare le forbici sottili per tagliare l'osso cranico 10 mm dal trapianto.
  10. Eseguire la scansione del CALV isolatocampione di midollo arial utilizzando uno scanner μCT; set campo visivo di 20,5 millimetri, l'energia dei raggi X di 55 kVp, intensità di 145 μA, con 1.000 proiezioni a 360 ° e l'integrazione di tempo di 200 msec. Regolare i parametri μCT 7 all'Immagine altri modelli di difetto osseo.
  11. Osservare le fette 2D ricostruiti che sono stati generati dal software μCT. Assicurarsi di eseguire la scansione la regione di interesse è appropriato e quindi individuare il difetto cranica. Valutare la qualità della perfusione. Dopo l'identificazione di successo dei vasi sanguigni (Figura 2J), proseguire e disincrostare il campione utilizzando il 6% di acido tricloroacetico (TCA) diluito in doppia Acqua distillata (DDW).
  12. Eseguire nuovamente la scansione del campione utilizzando i parametri di cui alla sezione 3.10. Individuare la sutura lambdoidea nelle fette 2D ricostruiti. Definire un volume cilindrico di interesse (VOI) in altezza di 2 mm e diametro 8 mm, che è tangente alla sutura - questo è il sito anatomico di difetto.
  13. Segmento °tessuto e osso da tessuti molli mediante una procedura soglia globale; impostare la soglia inferiore a 130, e applicare un filtro gaussiano vincolata 3D (sigma [σ] = 2.0 e supporto = 2) per eliminare in parte il rumore nei volumi. Generare una ricostruzione in 3D e assicurarsi che la VOI è posizionato correttamente (Figura 2K).
  14. Generare una mappa di spessore utilizzando il software IPL e la funzione "dt_object_param" (Figura 2L).
    NOTA: Questa funzione descrive il volume del serbatoio per ogni diametro del vaso.

Figura 2
Figura 2. perfusione utilizzando un agente radiopaco con approccio cardiaca. Il mouse è applicata al bordo di fissaggio (A), e la pelle è tagliata lungo l'addome fino al collo (B). La parete addominale viene tagliato lungo la linea mediana fino alla proce xifoidess (C), e la gabbia toracica è tagliato lateralmente (D). Un ago a farfalla è inserita nel ventricolo sinistro, evitando l'inserimento nel ventricolo destro, che è notevolmente più scuro (E, il ventricolo destro è indicata dalla linea tratteggiata bianca), e l'ago è fissato alla parete del cuore e del torace (F) . Soluzione salina eparinizzata (2-3 ml) viene pompata nel cuore, e la vena cava inferiore è sezionato (G, freccia bianca indica la vena cava inferiore). Formaldeide (4%) è perfuso e lavato fuori; questo è seguito da una perfusione di agente giallo tinto contrasto radio-opaco. Perfusione successo sarà evidente dai liquidazione dei vasi sanguigni, che cambiano colore al giallo (H). Dopo la polimerizzazione, la regione cranica è isolata (I, AG = trapianto allogenico) e ripreso con uno scanner μCT per confermare la corretta perfusione (J, volume di interesse è contrassegnata con colore arancione). Ilcampione è decalcificata e nuova scansione (K), seguita da generazione di una mappa dello spessore di colore (L). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

4. imaging di fluorescenza di Bone mineralizzazione e del Sangue di perfusione

  1. Ricostituire sonde ad una concentrazione di 2 nmol / 100 ml PBS in una provetta da 1,5 ml (utilizzare una sonda fluorescente bisfosfonato coniugato per monitorare mineralizzazione dell'osso e un agente fluorescente ematica per misurare la perfusione di sangue). Pipetta delicatamente più volte per garantire la dissoluzione omogenea della sonda.
  2. 24 ore prima della sessione di imaging designato prendere un'immagine di tempo zero; anestetizzare 3 topi utilizzando 2 L / min inalazione di 100% del medico-grado ossigeno integrato con il 3% isoflurano in una camera di induzione. Dopo l'anestesia corretta è stata stabilita, abbassare la concentrazione isoflurano all'1,5% - 2%.
  3. Applicare veterinario occhio unguento per prevenire la secchezza e assicurarsi pad termico sia acceso in ogni momento. Pinch l'arto animale per assicurarsi che sia profondamente anestetizzato. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
  4. Radere la regione cranica con un tagliatore di capelli applicando contro la direzione della crescita dei capelli. Rimuovere i resti di pelliccia con crema di depilazione. Qualsiasi residuo pelliccia interferirà con imaging ottico. Rimuovere suture con le forbici sottili e pinzette.
  5. Inserire tre animali sul palco IVIS riscaldato a 37 ° C per ogni sessione di imaging. Impostare il tempo di esposizione per l'auto, campo Vista C, e regolare i filtri. Ad esempio, per una sonda fluorescente bisfosfonato coniugato caratterizzato con eccitazione massima in lunghezza d'onda di 680 nm, utilizzare un filtro di eccitazione di 675 nm ed un filtro di emissione di Cy5.5 . Analogamente, quando si utilizza un agente fluorescente ematica di picco con eccitazione a 750 nm lunghezza d'onda di luceutilizzare un filtro di eccitazione di 710 nm ed un filtro di emissione di 780 nm.
  6. Immagine topi attraverso Vivere software immagine premendo il pulsante "Acquire". Assicurarsi che la regione cranica è completamente visibile (Figura 3B) Per una guida completa consulenza Lim et al 2009 8.
  7. Lasciare i topi per risvegliano l'inalazione di ossigeno al 100%.
  8. Iniettare la sonda fluorescente 2-nmol tramite una iniezione endovenosa di coda. Alla sessione di imaging designato, eseguire l'imaging come descritto sopra.

5. Micro-Tomografia Computerizzata per rigenerazione ossea

  1. Per la quantificazione della formazione ossea, anestetizzare il mouse per inalazione del 3% isoflurano, come illustrato nel passo 4.2 - 4.3. Trasferire il mouse per il piatto dello scanner μCT, e inserirlo nello scanner.
  2. Set tubo a raggi X potenziale energetico dello scanner μCT a 55 kVp e l'intensità di 145 μA risoluzione media. Utilizzando un campo visivo di 20,5 mm, eseguireun esploratore (single x-ray) scansione e definire una regione di interesse si estende dagli occhi del topo alla parte posteriore del cranio. Eseguire una TAC, utilizzando 1.000 proiezioni a 360 ° tempo e l'integrazione di 200 msec.
  3. Ricostruire le fette 2D con una risoluzione spaziale di 20 micron nominale. Allineare i margini difetto ad una posizione standard utilizzando il software μCT 9.
  4. Simile al punto 3.20, definire un volume cilindrico di interessi e di applicare il filtro Controllo vincolata 3D (σ = 0.8 e supporto = 1) per sopprimere parzialmente rumore nei volumi. Segmento del tessuto osseo da tessuti molli utilizzando una procedura thresholding globale.
  5. Determinare il volume di tessuto osseo mineralizzato nel volume di interesse.

6. bioluminescenza Imaging di reclutamento delle cellule staminali e la differenziazione

  1. Preparare il mouse per l'imaging come illustrato nelle sezioni 4,2-4,4 e risvegliare i topi per inalazione di ossigeno al 100%.
  2. Somministrare 126 mg / kg coleottero luciferina per ogni mouse tramite iniezione intraperitoneale, e rispedire l'animale verso la camera di induzione. Dopo 2 minuti, anestetizzare l'animale utilizzando 3% isoflurano. Posizionare i topi sulla IVIS riscaldati palco.
  3. Via Vivere software immagine, impostare il tempo di esposizione su "auto", e il campo di vista a C. Immagine topi 5 minuti dopo la somministrazione luciferina. Immagine gli animali come raffigurato al punto 4.6, usando la modalità "bioluminescenza" Definire le regioni di interesse in quanto espressione del transgene varia tra i topi. Normalizzare il segnale cranica alla coda.

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Representative Results

Neovascolarizzazione è stata valutata mediante μCT analisi volumetrica e da FLI utilizzando un agente ematica fluorescente per quantificare perfusione sanguigna. Sette giorni dopo l'intervento chirurgico, la scansione μCT dimostrato un volume significativamente più alto dei vasi sanguigni di piccole e medie diametro nei topi che avevano ricevuto autoinnesti che nei topi che avevano ricevuto alloinnesti raccolti da C57BL / 6 (figura 3A). È interessante notare che nel gruppo autograft dell'albero vascolare neoformato apparso per raggiungere l'intera area difetti, mentre nel gruppo allotrapianto vasi sanguigni sembravano penetrare nel sito del difetto dai bordi esterni ed estese verso l'interno per solo in misura limitata. Il FLI ha sostenuto questa osservazione, mostrando significativamente più alta perfusione sanguigna in animali autoinnesto trattati (Figura 3B). Con il 14 ° giorno, nel gruppo allotrapianto dell'albero vascolare raggiunto tutti la vicinanza del trapianto, ma volume del serbatoio è risultata significativamente inferiore a confrontoal gruppo autologo nella maggior parte dei diametri dei vasi che abbiamo esaminato (Figura 3C). Nota: le differenze di volume del vaso erano più importanti quando sono stati confrontati navi con 0.08- a 0,1 mm di diametro. Ventotto giorni dopo l'intervento il volume vascolare è tornato al basale (Figura 3D).

Sette giorni dopo l'intervento chirurgico, FLI eseguita utilizzando la sonda idrossiapatite diretto dimostrato significativamente maggiore mineralizzazione ossea nel gruppo autologo (figura 4A). A quel tempo, osso era formata durante la prossimità dell'innesto negli animali autoinnesto-impiantato. Al contrario, osso nei topi trapianto allogenico-impiantati era formata solo ai margini difetti ed è stato caratterizzato da una forma ad anello. Volumi di formazione ossea sono stati quantificati 56 giorni dopo l'intervento, al punto finale del processo di rigenerazione, effettuando μCT analisi (Figura 4B). Volume osseo era significativamente più alta (Figura 4C) e l'innesto Thickness significativamente maggiore negli animali che hanno ricevuto autoinnesti (Figura 4D). BLI è stato utilizzato in topi transgenici osteocalcina-luciferasi per monitorare il reclutamento delle cellule staminali e la differenziazione verso il lignaggio osteoblastica (figura 4E). Nei topi impiantati con alloinnesti, il segnale BLI picco 4 - 7 giorni dopo l'intervento, quando il segnale misurato ai calvaria era 15 volte superiore a quella misurata in coda. Nei topi autoinnesto-impiantati, il segnale BLI picco un po 'più tardi, 7 - 10 giorni dopo l'intervento, e era significativamente più alta, raggiungendo un 2 volte più alti cranica-to-tail rapporto (Figura 4F).

Figura 3
Figura 3. difetti Autograft impianto Agevola Angiogenesi. Cranica sono stati creati nei topi. La metà degli animali ha ricevuto allotrapianti e l'altra metà ha ricevuto autografts. Iltopi sono stati perfusi con un agente di contrasto polimerizzante 7 giorni dopo l'intervento. La regione cranica era isolato, ed i campioni erano decalcificata e ripreso utilizzando uno scanner μCT. Uno spessore mappa volumetrica è stata generata utilizzando il software IPL (A, n = 3, barre rappresentano ± SE, e asterischi indicano il valore P <0,05). I topi sono stati iniettati con una sonda ematica fluorescente 6 giorni dopo l'intervento. 24 ore più tardi gli animali sono stati sottoposti a FLI e è stata effettuata un'analisi quantitativa (B, n = 5, barre rappresentano ± SE, e asterischi indicano il valore P <0,05). È stata effettuata un'analisi vascolare-based μCT 14 (C) e 28 (D) giorni dopo l'intervento chirurgico (C e D: n = 3, barre rappresentano ± SE, e asterischi indicano il valore P <0,05). Cliccate qui per vedere una più grande version di questa figura.

Figura 4
Figura 4. L'impianto di un Autograft Promuove More Than Osteogenesi impianto di un allotrapianto. I topi hanno ricevuto impianti di autoinnesti cranica o trapianti. I topi sono stati poi iniettati con una sonda idrossiapatite di mira da iniezione IV 6 giorni dopo l'intervento chirurgico. 24 ore più tardi FLI e analisi qualitativa sono state eseguite (A, n = 5, barre rappresentano ± SE e asterischi indicano valore di P <0,05). In vivo μCT analisi è stata eseguita 56 giorni dopo l'intervento chirurgico, e un volume cilindrico di interesse segnati arancione è stata definita (B). Volume osseo (C) e spessore dell'innesto (D) sono stati quantificati (n = 8, barre rappresentano ± SE, e asterischi indicano il valore p <0,05) topi .Transgenic esprimono luciferasi driven dal promotore osteocalcina sono stati dati o trapianti autologhi. BLI è stata eseguita 10 giorni dopo l'intervento (E) così come a ulteriori punti temporali designati. Il segnale misurata in corrispondenza della regione cranica è stata normalizzata, perché il livello di espressione varia tra i topi (F, n = 8, barre rappresentano ± SE, e asterischi indicano il valore P <0,05). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Lo scopo degli approcci di imaging multimodali qui descritte è quello di consentire un'indagine meticolosa dell'asse angiogenesi-osteogenesi nel contesto cranica innesto osseo. Neovascolarizzazione è stato ripreso con un protocollo μCT, che ha permesso un accurato ad alta risoluzione dimostrazione 3D dell'albero vascolare che alimenta il vizio cranica. dati μCT possono essere facilmente analizzati utilizzando strumenti avanzati quali il software IPL. Ad esempio, l'analisi spessore mostrata in Figura 3C rivelato che le principali differenze tra autologo craniale e allogenico sono in vasi da 0.1 al 0.08 mm di diametro, che caratterizza arteriole sangue 10. Questo risultato è coerente con gli studi condotti nel modello di osso lungo 11. Va notato che i vasi stretti rilevabili di 0,02 millimetri di diametro non sono pienamente casted causa della viscosità dell'agente radio-opaco. Lo svantaggio principale di questo metodo è il fatto che essa comportaeutanasia dell'animale, e pertanto l'imaging longitudinale è impossibile. Diverse sonde radio-opachi sono disponibili per in vivo vascolare μCT immagini; Tuttavia, essi non sono radiopachi come sonda di polimerizzazione densa, e la risoluzione dell'immagine non soddisfa quello previsto dal metodo ex vivo raffigurato qui 12. risoluzione μCT è limitata e non sarà utile per studiare capillari sanguigni, per esempio. Oltre a questo, aiutato da una mano abile questo metodo offre una tecnica riproducibile per studiare vascolarizzazione dell'osso in dettaglio.

Un passo fondamentale nei protocolli raffigurati è la determinazione della posizione vizio (passo 2,7). Lesioni alla sutura lambdoidea porterà a una forte emorragia. Durante la foratura il difetto cranica, si deve prestare attenzione a non disturbare la dura madre subalterno e il seno sagittale superiore. Infine, l'inserimento dell'ago a farfalla nel ventricolo sinistro è una procedura delicata (passo 3.4). Se l'ago è insertoed nel ventricolo destro, il mezzo di contrasto si perfusione polmoni e passare alle vene, portando a scarsa perfusione del calvaria. Se l'ago viene inserito troppo in profondità, sarà perforare la parete cardiaca posteriore; e se l'ago non è inserito a sufficienza, si può facilmente strapparsi dal cuore. Non tentare di ri-regolare la posizione dell'ago come si può interferire con la perfusione. Il metodo può essere modificato mediante un insieme di sonde fluorescenti disponibili; Integrina-α 3 β v sonda -targeted può essere utilizzato per enfatizzare i vasi sanguigni di nuova formazione, mentre la sonda catepsina K-targeting possono essere utilizzate per quantificare l'attività degli osteoclasti.

In accordo con la nostra ipotesi, abbiamo osservato che autoinnesti cranica hanno un potenziale osteogenico superiore a trapianti. Questo è vero per ossa lunghe e 13 e può essere attribuito a diversi fattori. In primo luogo, l'autotrapianto contiene cellule che formano l'osso, che producono matrice ossea in tutto il trapiantodi superficie, come evidenziato sulla mineralizzazione diretto FLI (Figura 4A); considerando alloinnesti indurre la formazione di osso scarse solo ai margini di errori. In secondo luogo, BLI di topi osteocalcina-luc ha rivelato una maggiore attività osteogenica nel gruppo autologo, che può essere spiegato dalla presenza di fattori di crescita che vengono rimossi nel processo di preparazione allotrapianto (figura 4F). È interessante notare che la mineralizzazione delle ossa era significativamente più alto al Days 6 e 7, quando la sonda idrossiapatite mirati è stato somministrato, e la differenziazione cellulare rappresentato da attività BLI era evidente più tardi, tra il 7 ° giorno e il giorno 10. Possiamo dedurre da questo che la più ampia mineralizzazione ossea può essere almeno in parte spiegato con il sistema vascolare favorevole che caratterizza autologo innesto osseo.

I nostri risultati indicano che l'autotrapianto ha la capacità osteogenica superiore; tuttavia, si deve prendere in considerazione che l'innesto osseo autogeno ha diversi drawbacks. Bone raccolta è limitata in termini di volume e comporta morbidità al sito donatore 14-16. Inoltre, l'incidenza di riassorbimento osseo autologo non è trascurabile 17-19. Allotrapianti sono altamente disponibili e presentare una soluzione off-the-shelf per il clinico. Diversi lavori hanno dimostrato come l'osteo-integrazione di allotrapianti cranici può essere rafforzata con mezzi diversi, che vanno dal rivestimento della allotrapianto con BMP2-codifica adeno-associato virus 20,21 alle terapie adiuvanti come la terapia intermittente paratiroideo 22. Alla fine, una volta che la capacità del allotrapianto di fondersi con l'osso si perfeziona, eterologo diventerà il materiale di innesto preferito.

Alla luce di questi risultati, un particolare interesse risiede nella questione come modulare neovascolarizzazione nel sito di rigenerazione ossea. Approccio diretto di VEGF-espressione è stata trovata inefficiente, come i vasi sanguigni che formano sono che perde e non formano una functionale netto 23,24. È interessante notare, si è riscontrato che il segnale BMP trasduzione porta alla formazione mirata di vasi sanguigni 25,26. Inoltre, gli agenti farmaceutici 11 e terapia cellulare 27 hanno dimostrato di alterare i modelli angiogenesi a trapianto di osso di prossimità; entrambi gli approcci attuali strategie promettenti per migliorare cranico difetto osseo guarigione.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/C  Mice Harlan laboratories 57
FVB/n Mice Harlan laboratories 862
Phenobarbital West waro NDC 0641-0477-25
Rodent hair clipper Wahl animal 8786-451A
Scalpel 11 Miltex 27111504
Dental micro motor marathon III
5 mm trephine Fine Science tools 18004-50
Hair removing cream Veet
KetaVed (Ketamine) Vedco NDC 50989-996-06
Domitor Zoetis NADA 141-267
carprofen Norbrook 02000/4229
Eye ointment Puralube NDC 17033-211-38
Operating binocular Kent scientific KSCXTS-1121
Fine scissors  Fine Science tools 14060-11
Curve tweezers Fine Science tools 11274-20
Spoon shaped spatula Fine Science tools 10090-13
Tisseel Fibin gel kit  Baxter 718971
needle holder Fine Science tools 12060-01
vicryl suture 4-0 Ethicon J392H
Antisedan Zoetis NADA#141033
Heparin Sigma H3393
20 ml luerlock  BD 302830
23G scalp vein set (butterfly needle) BD 367342
Hemostat Fine Science tools 13008-12
Syringe pump Harvard apparatus PHD 2000
3-sec gel glue  Scotch
rodent dissection board Leica 38DI02313
Microfil MV-122 flow-tech MV-122
μCT40 scanner Scanco μCT40
TCA6% Sigma T6399
Osteosense 680 PerkinElmar NEV10020EX
Angiosense750 PerkinElmar NEV10011
Oxigen 100% medical grade
isoflurane (furane) Baxter 1001936040
IVIS kinetics Xenogen
Beetle luciferin Promega E160A

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References

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