Mätning och analys av extracellulärt Acid Production att bestämma glykolytisk Rate

Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J. Vis. Exp. (106), e53464, doi:10.3791/53464 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Det övergripande målet med denna metod är att noggrant mäta den glykolytiska takten celler med hjälp av extracellulära flödesanalys. Kvantitativ mätning av glykolytiska takt med hjälp av extracellulära försurning är den önskade slutpunkten för många experiment. Dock är den totala satsen för extracellulärt försurning summan av två komponenter: andnings försurning, i form av CO2 (som återfuktar till H 2 CO 3 dissocierar sedan till HCO3 - + H +), och glykolytiska försurning i form av laktat - + H ^.

Bidragen från CO2 till total extracellulära försurning har tills nyligen betraktats försumbar i mätningen plattform som används här, XF24 analysatorn 7. Det är dock tydligt i flera andra system som CO 2 kan vara en viktig bidragande orsak till extracellulära försurning 4-5. Flera papper erkänna detta conbidrag, men inte försöka direkt kvantifiering av CO2-härledda syra 3,8,9. Vi har nyligen visat kvantitativt som CO 2 produktion är en betydande källa till extracellulära försurning i detta system 6. Dessutom, även om det finns flera metaboliska vägar som genererar CO2 från glukos katabolism, som genomförs av matris dehydrogenaser i citronsyracykeln är överväldigande bidragsgivare och alla andra källor genererar mängder av CO2 som är inom experimentellt fel 6.

Utan att korrigera för CO2 produktion är extracellulärt försurning därför en tvetydig indikator för glykolytiska takt och kan inte användas kvantitativt. Vår tidigare publikation belyser flera fall där andnings CO2 omfattar huvuddelen av den totala försurningssignalen, även i celler i allmänhet tros i första hand använda glykolys 6. Dessutomandnings CO2 bidrag till den totala försurning varierar kraftigt under loppet av gemensamma metaboliska profilering experiment visar att korrekt jämförelse av den glykolytiska takt under olika delar av ett experiment kräver korrigering för CO2.

För att mäta den glykolytiska takten av celler som använder hastigheten av extracellulär försurning, är det nödvändigt att omvandla pH-förändringar till förändringar i den totala H * som alstras, och att subtrahera den extracellulära försurning som orsakas av CO 2 frigörs under drift av citronsyracykeln. Här beskriver vi en enkel metod för mätning av extracellulär protonproduktionshastigheten (från extracellulära förändringar i pH och den kalibrerade buffrande effekten hos analysmediet) och CO 2 produktion (från extracellulära förändringar i O 2-koncentration), och visar hur man kan beräkna glykolytisk hastighet med användning av dessa mätningar.

Denna metod styrka ENS nyttan av extracellulära försurning mätning genom att använda det till ordentligt beräkna glykolytiska takt som definieras av laktat produktion. Utan korrigering för andnings CO2 (eller direkt mätning av laktat), är det omöjligt att avgöra om och i vilken utsträckning den totala försurningstakten avspeglar glykolytiska takt, confounding tolkningen av experiment som använder total extracellulära försurning som ett direkt mått på laktat produktion.

BERÄKNINGAR

CO 2 och laktat är inom experimentellt fel, de enda två bidragsgivarna till extracellulär syraproduktion, baserat på experiment med myoblastceller 6. Därför kan definieras graden av totala extracellulära försurning (PPR, protonproduktionstakten) som:

PPR tot = PPR resp + PPR Glyc Ekvation 1

. _content "> där tot = totalt, resp = luftvägarna, Glyc = glykolytiska glykolytiska PPR är alltså:

PPR Glyc = PPR tot - PPR resp Ekvation 2

Här,

PPR tot = ECAR tot / BP Ekvation 3

där ECAR = extracellulär försurning hastighet (km / h / min), och BP = buffrande effekt (mph / pmol H ^ i 7 | il), medan

PPR resp = (10 pH-pK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) Ekvation 4

där K 1 = kombinerad jämviktskonstanten av CO2 hydrering och dissociation till HCO3 - + H +; max H ^ / O 2 = ee CO2 härledda försurning för en viss metabolisk omvandling såsom fullständig oxidation av glukos-6; OCR = syreförbrukningen (pmol O 2 / min), och OCR rot / myx = icke-mitokondriella OCR.

Ekvation 4 isolat mitokondriell OCR genom att subtrahera icke-mitokondriska OCR (definierat som OCR som är resistent mot den mitokondriella andningsgifter rotenon och myxothiazol) och svarar för den maximala H + genereras per O 2 konsumeras för varje substrat (max H ^ / O 2 ) (se 6), samt andelen av CO2 vilket ger upphov till H + vid den experimentella temperatur och pH (10 pH-pK 1 / (1 ​​+ 10 pH-pK 1). För fullständig oxidering av glukos, mitokondriell Syre Konsumtion Rate (OCR) är exakt lika med hastigheten för CO 2 produktionen. I det slutna analysvolymen av extracellulärt flödesmätning, CO2 producerard genom respiration förblir instängd i analysmediet. Det mesta av den instängda CO 2 hydratiseras till H 2 CO 3, som sedan dissocierar till HCO 3 - + H ^. En liten del förblir upplöst men inte hydratiseras, och en annan liten fraktion är hydratiserad men inte dissocieras, såsom dikteras termodynamiskt genom den kombinerade jämviktskonstanten CO 2 hydratisering och dissociation till HCO 3 - + H ^ vid experimentell temperatur (37 ° C) och pH-värdet (~ 7,4).

Således, hela ekvationen för beräkning av PPR g genom att subtrahera PPR resp från PPR tot är:

PPR Glyc = ECAR tot / BP - (10 pH-pK 1 / (1 ​​+ 10 pH-PK 1)) (max H + / O 2) (OCR tot - OCR rot / myx) Ekvation 5

jagn på detta sätt, andelen andning och glykolys, samt tillhörande ATP produktionstakt kan bestämmas kvantitativt från enkla mätningar (syreförbrukning, extracellulära försurning, buffertkapacitet) och import eller beräkning av andra nödvändiga värden (H + / O 2 , P / O, och jämviktskonstanten K 1) 6. Experimentet som beskrivs här expanderar på standardtekniker för att använda de extracellulära Flux Analyzer som Seahorse XF24 10,11; för andra extracellulära flux mätningsformat (t.ex. XF e 96, eller XFP), bör alla volymer nedan skalas på lämpligt sätt.

Den buffrande effekten hos analysmediet kan mätas genom konstruktion av en standardkurva, antingen direkt i den extracellulära flödes plattform eller separat användning av en kalibrerad pH-sond. Här är tre alternativ för att mäta buffring av den extracellulära flödesanalysmediet ges, bland annat med hjälp av alla injectipå hamnar i den extracellulära flödes analysator med cellfria provbrunnar, eller med endast den sista injektionen hamn i cellinnehållande brunnar (avsnitt 1) ​​eller genom att använda en extern pH-mätning (avsnitt 2). Se bifogad kalkylblad för hela beräkningar av exempeldata.

För att mäta buffert makten med hjälp av pH-detekteringsförmåga av den extracellulära flödesinstrumentet, är det säkrast att använda cellfria brunnar för att minimera signalvariation. Men inom felet finns ingen statistisk skillnad mellan cellfria och cellinnehållande brunnar när du utför denna mätning (data visas ej). OBS: variationen beskrivs i steg 1,7 uppbär fördelen för redovisning av eventuella ändringar av buffring som följer av tillsatta föreningar eller genom närvaron av celler, med nackdelen av bullrigare signalen. Såsom konstaterats ovan har inga signifikanta skillnader hittades i den beräknade buffertstyrka mellan den cellfria utformning som visas i tabell 1 ochefterexperimentdesign i tabell 2 under de experimentella betingelser som beskrivs här.

Dessutom över små APH intervall (<0,4 enheter; experimentellt bäst begränsas till 0,2 enheter), den linjära lutningen erhölls genom avsättning Δ mph / pmol H ^ adekvat approximerar logaritmiskt förhållande mellan ApH och [H *]. Lutningen på denna standardkurva representerar därför buffert kraften i analysmediet som testas i pH / nmol H + i 7 il eller mph / pmol H + i 7 ul. Vi rekommenderar att öka medeleffekt buffring eller minska celltäthet för prover som överskrider en enhet förändring 0,2 pH under mättiden. Mättiden kan också minskas, men detta kan förkorta steady state försurningshastighet och införa fel i beräkningen av hastigheten.

Protocol

1. Att mäta buffring Power i ett extracellulära Flux Instrument: två varianter

OBS: beräkningarna och metoder som beskrivs här har utvecklats med hjälp av en Extracellulärt Flux Analyzer. För andra instrument måste mätvolymen skalas på lämpligt sätt.

  1. Förbered 0,1 M standard HCI i vatten med HCI koncentrat (se Material och utrustning) enligt tillverkarens instruktioner.
    Obs: Ett beräkningsexempel för framställning av HCl injektioner för användning i alla fyra injektions portar visas i tabell 1:

Bord 1
Tabell 1. varandra följande HCl injektioner i ett extracellulärt flödesanalysbrunn.

  1. Förbered spädningar av HCl-standard i det medium som skall analyseras såsom i tabell 1 för antalet tekniska replikat vara carrerat i en platta, plus en för att möjliggöra pipettering fel, t.ex. för fyra tekniska replikat av port A injektion, förbereda ett lager av (1,1 pl x 5) 0,1 M HCl i (48,9 pl x 5) analysmedium.
  2. Fördela 50 pl i varje hamn A mätsonden patronen. Upprepa denna procedur för övriga hamnar B, C och D.
  3. Kör ett extracellulärt flödesanalys 10 med en standardkalibreringscykel, följt av två cykler av [2 min mix, 1 min vänta, och 5 min mätning] för vart och ett av de fyra tillägg hamn (se figur 2).
    1. Programmera experimentet ovan i instrumentets programvara enligt mjukvaruinstruktioner. Ladda förberedda kassetten i maskinen och utför kalibreringen enligt mjukvaruinstruktioner.
    2. När du uppmanas av programmet tar du bort kalibreringsinnehållande plattan och sätt plattan innehåller analysmediet i varje brunn i instrumentet; fortsätt programmet.
  4. U sjunga i genomsnitt 8-10 datapunkter som erhållits vid steady state (typiskt de senaste 8-10 poäng) från före och efter varje hamn dessutom beräkna (kumulativ) skillnad i pH (ApH) som orsakas av varje injektion av standardsyra.
  5. Rita ApH mot nmol H + som finns i 7 il volym fångas av mätsonden. Den linjära lutningen är bufferteffekt (BP) i mph / pmol H +.
  6. Som ett alternativ till steg 1,2-1,3, utföra APH mätningar efter en analys i vilken Ports A, B och C används för att genomföra ett experiment, följt av en HCl injektion i Port D. Liksom i tabell 2, fyra tekniska replikat är används för att generera varje punkt av en 5-punkts standardkurva i de 20 experimentella brunnarna (exklusive de fyra bakgrundstemperaturen korrektions brunnar) i den extracellulära flödesanalysplattan.

53464table2.jpg "/>
Tabell 2. Single HCI injektion i ett extracellulärt flödesanalysbrunn.

2. Mätning buffring ström Genom att använda en extern pH-mätare

NOTERA: För att mäta det buffrande kraften i ett medium med användning av en extern pH-sond, kalibrera sonden vid 37 ° C och bibehålla denna temperatur under alla reagenser under experimentet.

  1. Bered 0,1 M-standarden HCl i vatten med användning av HCl-koncentrat enligt tillverkarens instruktioner.
  2. Varm pH-sond, pH-standarder, analysmediet, vars buffrande strömmen skall mätas, och 0,1 M HCl till 37 ° C i ett vattenbad.
  3. Kalibrera pH-sond vid 37 ° C enligt tillverkarens instruktioner. Upprätthålla alla reagenser vid 37 ° C under hela analysen genom användning av en värmeplatta eller vattenbad.
  4. Alikvot 10 ml av analysmediet till en liten bägare eller koniska rör. Övervaka pH kontinuerligt med hjälp av en nedsänkt pH-sond.
  5. Lägg 0,1 M HCl till den somsäga medium i 10-20 | il alikvoter.
    1. Se till att blanda med hjälp av en omrörare eller genom att manuellt snurra behållaren efter varje syraadditions.
    2. Det tar några sekunder för pH-mätning för att stabilisera och sedan spela in pH-värdet efter varje tillsats.
    3. Såsom visas i tabell 3, gör ett tillräckligt antal tillsatser för att säkerställa korrekt lutningsberäknings och för att täcka det pH-område förväntas under experimentet.

Tabell 3
Tabell 3. Mätning buffert strömmen med en pH-mätare. Data representerar ett typiskt experiment med sex 20 ul tillsatser av 0,1 M HCI.

  1. Plot ApH mot nmol H * tillsatt per 7 pl, vilket ger en linjär lutning som representerar buffrande effekten (Figur 1).


Figur 1. Fastställande buffrande effekt. HCI standardkurva mättes såsom i tabell 1, tabell 2 eller (här) som i tabell 3. Lutningen på den linjära kurvan passformen ger den buffrande effekten (pH / nmol H ^ i 7 | il). Varje punkt representerar medelvärde ± SEM av n = 9 tekniska replikat.

  1. När buffert makten är känd genom metod 1 eller 2 ovan, omvandla ECAR signalen (mph / min) till PPR (pmol H + / min / g protein) genom att dividera ECAR genom att buffra effekt (BP) (mph / pmol H +) och skalning till innehållet i varje brunn protein:
    PPR tot (pmol H + / min / g protein) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol H + i 7 pl) / protein per brunn (ig) Ekvation 6
  2. Alternativt kan du använda samma experiment i metods 1 eller 2 för att beräkna buffertförmåga (BC) värde som används av instrumentets programvara för att automatiskt beräkna PPR under datainsamlingen.
    OBS: användarmanualen 12 (sidan 107) ger detaljerad information om beräkning och användning av buffertkapacitet, där BC beskrivs som
    BC (mol / l) = mol H + / (ApH x buffertvolym (L)) ekvation 7
    OBS: buffringskapacitet enligt ekvation 7 kan beräknas på de instrument eller extern pH-probanalyser beskrivna ovan. Omvandling mellan buffrande effekt och buffertkapacitet är lätt gjort (se bifogad kalkylblad):
    BC = 1 x 10 -9 / BP ((mph / pmol H + i 7 pl) / 7 ul) Ekvation 8
    OBS: Om det är känt innan analysen utförs, kan buffertkapacitet skrivas in direkt i instrumentets programvara under experimentuppställning.
  3. Tillämpa detta förfarande och beräkningar som används ovan för att de flesta konventionella buffertsystem, såsom beskrivits i föregående publicering 6.
    OBS: Tabell 4 listar det buffrande effekt och buffertkapacitet av flera konventionella medier.

Tabell 4
Tabell 4. Buffert makt och buffertkapacitet av utvalda medier.

3. Utföra en Extracellulärt Flux analys Använda C2C12 myoblastceller

OBS: I steg 3.4.3, fanns det inga observerade skillnader i CO2 härledda syraproduktion beroende av närvaron av karbanhydras i C2C12 kultur, vilket tyder på att dess närvaro inte krävs för full konvertering av CO2 till HCO3 - + H +. Men empiriskt testa detta i olika experimentella system rekommenderas före aboutitting kolsyreanhydras.

  1. Kultur mus C2C12 myoblaster 13 vid 37 ° C i 95% luft / 5% CO2 i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 11,1 mM glukos, 2 mM glutamin, 10% volym / volym fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin.
  2. 24 h före analysen, plåt / fröceller i 100 | il av samma odlingsmedium vid 20.000 celler / brunn i en 24-brunnars polystyren extracellulär flödesanalysplatta (se Material och Metoder) utan ytterligare beläggning.
  3. Späd oligomycin, FCCP och rotenon plus myxothiazol, och HCI (tillval) till 10x slutkoncentration i Krebs Ringer fosfat HEPES (KRPH) analysmedium (2 mM HEPES, 136 mM NaCl, 2 mM NaH 2 PO 4, 3,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2, 0,1% vikt / vol fettsyrafritt bovint serumalbumin, pH 7,4 vid 37 ° C).
  4. Cellberedning
    1. 30 minuter före analysen, tvätta vidhäftande celler tre gånger genom att aspirera till GEntly avlägsna mediet från brunnen och därefter långsamt tillsätta 500 | il KRPH.
    2. Inkubera cellerna efter det tredje tvättsteget vid 37 ° C under luft (ej enligt 5% CO2, vilket kommer att förändra pH för denna bikarbonat fritt medium).
    3. Vid analysstart, byt KRPH i brunnar med 500 l färska KRPH innehållande 500 U / ml karbanhydras och antingen glukos (10 mM) eller endast medium, utan extra substrat.
  5. Fylla på sensorhuvudet
    1. Pipettera 50 | il alikvoter av varje 10x föreningen framställd i Steg 3,3 till patron hamnar i en extracellulär flödessensorhuvudet enligt följande (slutkoncentrationer i analysbrunn given): Port A: 2 | ig / ml oligomycin, Port B: 0,5 pM FCCP, Port C : 1 pM rotenon, 1 pM myxothiazol, Port D: HCI (om att utföra en in-analys syra kalibrering såsom beskrivits ovan och i tabell 2).
      OBS: för att hela andningskedjan inhibition som beskrivs här, 1 iM minaxothiazol kan användas utbytbart med ett iM antimycin A.
  6. Extracellulär flödesanalys:
    1. Gör en vanlig extracellulärt flöde analys för att bestämma andningskontroll som beskrivs i 10.

OBS: För varje segment av experimentet, fastställa vilken blandning, vänta, och mättider önskas, såväl som antalet cykler per segment.

OBS: Data i tabell 5 samlades under två analys cykler av 2 min mix, 1 min vänta, och 5 min åtgärd för varje segment, med tre analyscykler som inträffar efter Port D tillsats av olika mängder av HCI (för kalibrering av buffring effekt som i tabell 2).

Tabell 5
Tabell 5. Extracellulär flödesanalyskonfiguration.

4. Measuring slutpunkten laktatkoncentration

NOTERA: För att validera den indirekta analysen beskriven här i någon annat system, slutpunkt laktat koncentrationen i slutet av en extracellulär flödesexperiment kan bestämmas direkt i en konventionell 96-brunnar genom att mäta initialhastigheten (över 2 min) av minskning av NAD + → NADH katalyseras av laktatdehydrogenas, beskrivs i detalj i vår tidigare publikation 6. För de data som presenteras i Representativa resultat, slutpunkten laktatkoncentrationen i glukos-innehållande analysbrunnar var ~ 40 iM.

  1. Bered 2x hydrazin-medium: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM hydrazin, pH 9,8 vid 22 ° C). Omedelbart före analys start lägg NAD ^ till 4 mM och laktatdehydrogenas (LDH) till 40 U / ml. Slutlig analysmedium komposition (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM hydrazin, 2 mM NAD +, 20 E / ml LDH.
  2. Omedelbart efter den extracellulära flödesanalysen, ta bort 100il av analysmediet från varje brunn av den extracellulära flödesanalysplattan och överför till en brunn i en ogenomskinlig (svart) 96-brunnar.
  3. Till varje provbrunn, tillsätt 100 pl 2x hydrazin medium.
  4. Omedelbart ladda plattan i en mikroplattläsare och börja övervaka NADH fluorescens vid 340 nm excitation / 460 nm emission.
  5. Anteckna den initiala hastigheten för cirka två minuter.
  6. Kör ett liknande experiment för att konstruera en standardkurva genom att plotta utgångshastigheten mot laktatkoncentrationen av tillsatt laktatkoncentrationer från 0 till 50 | iM.
  7. Beräkna laktatkoncentrationen i varje försöks brunn med hjälp av standardkurvan.

5. Mätning Proteininnehåll

  1. Avlägsna återstående analysmediet från varje brunn i analysplattan.
  2. Tvätta brunnarna tre gånger med 250 ul BSA-fri KRPH, var noga med att minimera lossnar celler från botten väl ytan.
  3. Lägg 25 ul RIPA lysmedium (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% vol / vol Triton X-100, 0,5% vikt / volym natriumdeoxikolat, 0,1% volym / volym SDS, pH 7,4 vid 22 ° C) till varje brunn i analysplattan.
  4. Inkubera plattan på is under 30 minuter.
  5. Skaka plattan på en tallrik shaker vid 1200 rpm under 5 minuter.
  6. Mät proteinkoncentration genom standardmetoder, t ex genom BCA-analys, vilket säkerställer att lysbufferten kompositionen är förenligt med den mätmetod. Proteinhalten i experimentet i figur 2 var ~ 4 ^ g / brunn.

Representative Results

Figur 2 visar rådata för ett typiskt experiment. De sista 10 mätpunkter från punkt-till-punkt-inspelning av både OCR och pH (skuggad vertikala staplar) användes för beräkningarna. Inledande oro för att det genomsnittliga värdet (mittpunkten mätning) för varje försök cykel inte skulle ge tillräcklig upplösning av ränta för en exakt beräkning, särskilt som det verkade vara en liten fördröjning mellan hamn addition och steady state försurnings fall inte bars ut, eftersom det inte verkar bidra väsentligt till räknefel (ej visad). Alternativt, om rätt buffertkapacitet anges under experimentuppställning, PPR kan läsas direkt från datainsamling instrumentavläsning genom att visa PPR produktionen i instrumentets programvara eller PC-kompatibelt format finns som en av inställningarna för utdata.

ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg "/>
Figur 2. Representativa extracellulära flödes spår av O 2 och H +. OCR och pH-spår för exemplet experimentet i tabell 5, innehållande 10 mM glukos vid analysstart. Port D hade olika HCl-koncentrationer för kalibrering av buffrande effekt (ej visad i dessa genomsnitt spår). Data från föregående publicering 6. Varje punkt representerar medelvärde ± SEM av n = 8 biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Analys av representativa resultat Data

Använda kalkylbladet visas i tabell 6 och tillhandahålls som en bifogad fil, kan datavärden från enskilda brunnar föras in i kolumnerna som visas med gula rubriker. Alla sex kolumner till höger beräknas från dessa poster. Exemplet i tabell 6 visar beräkningar av PPR resp och PPR Glyc använder ECAR och OCR uppgifter från enskilda brunnar för de inhemska förhållanden med eller utan tillsatt glukos, före Port A tillsats av oligomycin. Tekniska replikat på varje biologiskt preparat normalt i genomsnitt att ge enskilda värden för utgångarna under de senaste fyra kolumnerna, då data från olika biologiska preparat medelvärdes med lämplig spridning av statistik fel i BP och dessa fyra värden.

Tabell 6
Tabell 6. Beräkning av andnings- och glykolytiska försurning. Kolumnerna med rubriken i gult indikerar värden som förs in i beräkningen (t.ex. BP, max H + / O 2), eller från uppgiftsinsamling (t.ex. ECAR tot, OCR). ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna tabell |. Klicka här för att ladda ner tabellen som Excel-ark .

Bidrag från glykolys och andning till PPR efter korrigering

Figur 3 visar den grafiska utmatning av data har beräknats enligt tabell 6 för inhemska andelen glykolytisk och andnings försurning, priser efter oligomycinkänslig tillägg (Port A), och priser efter FCCP tillsats (Port B). Dessa data visar tydligt hur proportionerna av andnings- och glykolytiska försurning förändring med val av substrat (glukos jämfört med kontroll (CTL) med ingen tillsatt) och med mitokondrie status (native funktion vs. farmakologiskt förändrad funktion).

"> Figur 3
Figur 3. Proton produktionshastigheten (PPR) från glykolytiska och respiratoriska källor. PPR från andning (öppna partier) och glykolys (fyllda portioner) av C2C12-celler beräknas enligt ekvation 5 med tillsatt glukos (tre vänster staplar) eller utan tillsatt glukos (tre rätt staplar). Data från sex. Alla data representerar medelvärde ± SEM av n = 8 biologiska replikat.

Discussion

Extracellulär försurning är en lätt att mäta indikation på cellulär ämnesomsättning. För att korrekt bestämma hastigheten för cellulär glykolys (såsom definieras av laktatproduktion) är det viktigt att veta den buffrande effekten hos analysmediet, och för att omvandla de extracellulära flödes mätningar av syreförbrukning och surgöring till protonproduktionshastigheter. Genom att utföra denna beräkning, kan surgöringen erhållna bland CO 2 släpptes i citronsyracykeln subtraheras, lämnar försurning som är resultatet av laktatproduktion.

De många olika sätt som anges här för att mäta buffert kraft för denna korrigering har olika fördelar och nackdelar. Utvändiga mått med hjälp av en pH-sond är mycket noggrann och reproducerbar, men kanske därför inte speglar små skillnader i pH detektering infördes av fluoroforer som ingår i analysplattan, tillsättning av föreningar under analysen, eller närvaron av than cellerna själva. In-plattan pH-mätningar itu med dessa frågor, men också införa olika grader av experimentell buller.

CO 2 korrigering ECAR möjliggör för första gången en entydig och kvantitativ beräkning av glykolytiska takt, och avslöjar variation i luftvägarna och glykolytiska bidrag till den totala ECAR under ett experiment. Använda ekvation 5 och mätningar av OCR, ECAR, och buffrande effekt, kan glykolytisk hastighet beräknas med hjälp av enkla kalkyl tillhandahålls (tabell 6). Denna ränta kan verifieras genom post-hoc laktat mätning om så önskas 6. I celler där pentosfosfatvägen är högaktiv kan användningen av pathway inhibitorer såsom 6-aminonicotinamide vara användbara för att isolera glykolytiska takt. Beräkning av bidragen från både CO2 - och laktat härrörande H + från den totala uppmätta Extra Cellular Försurning frekvens och syre Consumption Rate är ett ovärderligt verktyg för att använda extracellulära flödes data för att göra kraftfulla och kvantitativa uttalanden om metabolisk aktivitet.

Med användning av de förfaranden som beskrivs här, inklusive olika modifikationer för mätning buffrande effekt, och optimera den extracellulära flödes experimentet för cellerna är föremål för undersökning och data som önskas, kan hastigheten för glykolys i intakta celler kvantifieras under ett brett område av experimentella betingelser. Denna metod är begränsad till celler som kan växa i vidhäftande kultur på (eller celler eller organeller som kan följas) en polystyrenyta. Det är mest tillförlitliga när odlade celler är homogen och sammanflytande, fast användbara data kan fortfarande erhållas över ett område av dessa tillstånd. Beräkningarna kräver vissa kunskaper i metabolismen av cellerna, som max H + / O 2 varierar från 0,65 till 1,0 för full oxidation av olika substrat och mer för partiell oxidation 6, men om cellerna är kNown att oxidera glukos, kan antas ett värde på 1,0.

Även relevant för alla metaboliska karakterisering, kan denna metod vara särskilt användbart när det används i system där en förskjutning mellan andnings- och glykolytiska metabolismen att upprätthålla cellulär ATP-utbudet är en kritisk fenotyp, inbegripet karakterisering av stamceller och tumörhärrörande cancerceller. Förstå metabol kontroll förändringar i dessa och andra sammanhang kommer att möjliggöra en högre grad av förfining och noggrannhet i experimentell design och analys av dessa celltyper.

Disclosures

Dr. Shona Mookerjee förklarar att hon inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. Dr Martin Brand har konsulteras för Seahorse Biosciences, som producerar instrument och reagenser som används i denna artikel. Open Access avgifter för denna artikel betalades av Seahorse Biosciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pherastar FS BMG n/a microplate reader
Seahorse XF-24 Seahorse Bioscience n/a extracellular flux instrument
Seahorse XF assay plate Seahorse Bioscience V7-PS consumable
XF Calibrant Seahorse Bioscience 100840-000 solution
HCl standard Sigma 38280 chemical
oligomycin Sigma O4876 chemical
FCCP Sigma C2920 chemical
Rotenone Sigma R8875 chemical
Myxothiazol Sigma T5580 chemical
DMEM Corning 10-013-CV medium component
FBS Corning 35-010-CV medium component
penicillin/streptomycin Corning 30-002-CI medium component
carbonic anhydrase Sigma C2624 chemical
96-well assay plate Corning CLS3991 consumable
NAD+ Sigma N7004 chemical
LDH Sigma L1254 chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, (2), 297-312 (2011).
  2. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Anal. Chem. 81, (16), 6868-6878 (2009).
  3. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).
  4. Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption. Mol. Biol. Rep. 29, (1-2), 83-87 (2002).
  5. Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism. Clin. Cancer Res. 8, (4), 1284-1291 (2002).
  6. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).
  7. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am. J. Physiol. 292, (1), C125-C136 (2006).
  8. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. J. Bioenerg. Biomembr. 44, (4), 421-437 (2012).
  9. Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).
  10. Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J. Vis. Exp. (46), 2511 (2010).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6, (7), e21746 (2011).
  12. Seahorse Biosciences. F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual. 1.7, (2010).
  13. Blau, H., Chiu, C., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons. Cell. 32, 1171-1180 (1983).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics