Duplo Emulsion Geração de utilizar um dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-Axial Flow Foco

Bioengineering

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Cole, R. H., Tran, T. M., Abate, A. R. Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device. J. Vis. Exp. (106), e53516, doi:10.3791/53516 (2015).

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Abstract

Introduction

Emulsões duplas consistem em gotículas separadas a partir de uma fase de transportador por intermédio de uma camada de fluido, imiscível, e são de particular interesse devido a suas potenciais utilizações em aplicações industriais, produtos farmacêuticos e aplicações biológicas 1. Em alguns casos, a capacidade de encapsular compostos de alto valor em um núcleo de emulsão dupla permite que o material a ser protegido e lançado de uma maneira controlada. Por exemplo, as drogas podem ser encapsulados sob condições de solubilidade não apropriados para o fluido de transporte externo 2. Além disso, a camada intermédia do óleo pode ser usado como um modelo para a cápsula de encapsulamento e de entrega de drogas, cosméticos, e nutrientes 3. Em biologia, emulsões duplos também são úteis para triagem de alto rendimento, porque eles permitem um grande número de experiências sub-nanolitros a ser levada a cabo, e, em seguida, detectados utilizando um classificados de células activadas por fluorescência (FACS) instrumento 4,5.

ENT "> O design de emulsões duplas com características de desempenho desejadas exige o controlo preciso do tamanho de emulsão dupla, composição e uniformidade. Embora os processos de emulsificação a granel, tais como emulsificação da membrana, são usadas na indústria, as emulsões resultantes são altamente polidispersos, exibindo um grande variedade de propriedades funcionais 1. O campo de gota de microfluídica é naturalmente adequadas a geração de emulsões monodispersas com composição cuidadosamente controlada 6. geração de emulsão dupla Microfluidic foi conseguido com duas estratégias principais, para preparar queda seqüencial e de fluxo capilar de vidro de focagem. emulsões duplas podem ser gerado em planares dispositivos PDMS usando uma gota de duas fases processo de tomada. Em primeiro lugar, aquosa-em-óleo são criados a partir de água-em-óleo região de um dispositivo com as paredes do canal hidrofóbico de tomada de gota. Em seguida, a emulsão pode ser fluiu ou reinjetado em uma região de tomada de gota com paredes hidrofílicos adequados para óleo em águagota de tomada 4. No entanto, o tratamento de superfície hidrófila de PMDS requer um passo de fabrico adicional e é muitas vezes temporária 7. O método mais controlável e reproduzível para formar emulsões duplas é por fluxo de co-axial de focagem, utilizando uma técnica pioneira Microfluidics capilar de vidro, pelo qual um jacto concêntrico contendo as três fases é cortado por meio de um pequeno orifício para produzir gotas monodispersas 8. Esta técnica permite a produção de gotículas muito mais pequenas do que as dimensões do canal, com o tamanho e a composição exacta da emulsão dupla é uma função das taxas de fluxo de cada fase. A grande diferença entre gota e tamanho do canal e do fluxo de bainha protetora externa impede gotas de entrar em contato com as paredes do canal, tornando desnecessário o tratamento de superfície. No entanto, esses dispositivos de vidro exigem fabricação personalizada de dicas de capilares afilados, juntamente com a montagem cuidadosa e selagem. Investigadores anteriores usaram litografia suave 3Dgrafia de gerar emulsões duplas utilizando fluxo de focagem física, mas estes dispositivos produziram emulsões com diâmetros> 150 uM 9,10, cerca de uma ordem de grandeza maior do que os objectos tipicamente classificadas com FACS. Uma alternativa atractiva que incluem a funcionalidade robusta e pequena geração de gotículas de fluxo coaxial capilar de vidro de focagem com a facilidade de fabrico de PDMS litografia macia.

Neste artigo, descreve um gerador de emulsão dupla que utiliza o fluxo de co-axial com foco para a produção de ≤ 50 mm emulsões e é construído inteiramente em 3D utilizando litografia macia 11. O nosso dispositivo utiliza uma abordagem de concha para fabricar dispositivos que inclui um pequeno canal de corte (Figura 1) para aproximar os processos de formação de emulsão em um bico capilar de vidro puxado. Mais importante ainda, estes dispositivos requerem nenhum tratamento de superfície específica, e toda a construção de polímero proporciona fácil e reproduzível sc fabricaçãoalable para um grande número de dispositivos duplicados. Aqui, descrevemos o projeto, fabricação e testes do gerador de emulsão dupla. Geração de emulsão dupla é mostrado para ser robusta e reproduzível para baixo para diâmetros de gotículas de 14 mm. O acoplamento de funcionalidade com a facilidade de fabrico torna este dispositivo uma opção atraente para o desenvolvimento de novas aplicações de emulsão dupla.

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Protocol

1. SU8 Mestre Fabrication

  1. Projetar as estruturas microfluídicos para dois fabricação camada utilizando o software AutoCAD e têm os desenhos impressos por um fornecedor em filme placa de circuito com resolução de 10 m. Os detalhes da concepção do dispositivo são dadas em uma referência anexado 11 e as geometrias de canal são mostradas na Figura 1. As camadas deverá incluir marcas de alinhamento para ajudar a colocar características de cada camada 12 de fabricação.
  2. Coloque uma pré-limpeza de 3 polegadas de diâmetro wafer de silício em um revestidor de rotação e ligue o vácuo para afixá-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-3035 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida 30 segundos a 2000 rpm, proporcionando uma espessura de camada de 50 um.
  3. Remover a bolacha e assar em uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 30 min. Permitir que o wafer arrefecer à RT antes de passar para a próxima etapa.
  4. Exponha o wafer revestido para o st máscara de camada 1 (Figura 2A
  5. Coloque o wafer no revestidor de rotação e ligue o vácuo para afixá-lo para o mandril. Aplicar 1 ml de SU8-2050 no centro da bolacha e centrifugação durante 20 segundos a 500 rpm, em seguida 30 segundos a 1375 rpm, o que resulta em uma camada que proporciona uma espessura adicional de 135 uM.
  6. Remover a bolacha e assar em uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 30 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de passar para a próxima etapa.
  7. Alinhar a camada de máscara 2 ND (Figura 2B) para a geometria modelada em 1.3 e expor a pastilha revestida a uma colimado 190 mW, a 365 nm LED durante 3 min. Após a exposição, colocar sobre uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 1 min, em seguida, arrefecer attemperatura ambiente, antes de prosseguir para o passo seguinte.
  8. Desenvolver as máscaras por imersão num banho em agitação de acetato de éter propilenoglicol monometílico, durante 30 min. Lava-se a bolachaem isopropanol e assar em uma placa de aquecimento de 135 ° C durante 1 min. Colocar o mestre desenvolvido numa placa de Petri de 100 mm para a moldagem por PDMS.

2. PDMS fabricação de dispositivos

  1. Preparar 10: 1 PDMS combinando 50 g de base de silicone com 5 g de agente de cura em um copo de plástico. Misture o conteúdo com uma ferramenta rotativa equipada com um pedaço de pau mexa. Desgaseificar a mistura no interior de um exsicador durante 30 minutos, ou até que todas as bolhas de ar são removidas.
  2. Despeje o PDMS para dar uma espessura de 3 mm sobre o mestre e coloque de volta no secador durante mais de desgaseificação. Uma vez que todas as bolhas são removidas, o dispositivo de cozer a 60 ° C durante 2 horas.
  3. Corte o dispositivo a partir do molde utilizando um bisturi e coloque sobre uma superfície limpa, com o lado modelado up. Cortar o molde PDMS ao meio com uma lâmina de barbear para separar master 1 da Master 2 (Figura 3a). Na peça que contém a geometria manuseio 50 um fluido impresso por Master 1, socos fluídicos as entradas e saídas com 0,75 mm de punção para biópsia.
  4. Plasma tratar os dispositivos a 1 mbar de O2 no plasma durante 60 segundos em um aspirador de plasma 300 W. Molhar a superfície da peça unpunched de PDMS com uma gota de água Dl para retardar temporariamente PDMS-PDMS ligação e servir como um lubrificante. Durante a visualização através de um microscópio estéreo, lugar Master 1 no Master 2 superfície e deslize as superfícies relativamente até que um bloqueio mecânico é alcançada quando os quadros recesso e molduras salientes na Figura 3A companheiro.
  5. Coloque o dispositivo num forno de 60 ° C e assar o dispositivo montado (Figura 3B) durante dois dias a 60 ° C para evaporar a água e a ligação completa.

3. Preparação dos Reagentes

  1. Encha seringa de 1 mL com água destilada para a fase interior.
  2. Preencha seringa de 1 ml com HFE 7500 óleo fluorado com um peso. % Surfactante biocompatível surfactante 13 para a fase intermediária.
  3. Preencha seringa de 10 ml com 10 wt. % Polietilenoe glicol (PEG) em solução de água contendo 1 em peso. % De Tween 20 e 1 em peso. % De dodecilsulfato de sódio para a fase contínua.

4. Sistema de Preparação

  1. Coloque o chip microfluídico no palco de um microscópio invertido acoplado com uma câmera digital capaz de <100 ms velocidades do obturador.
  2. Montar todas as seringas em bombas de seringa e anexar 27 agulhas G. Anexar ~ 30 cm de comprimento de tubagem de PE-2 sobre as agulhas e inserir as extremidades soltas na apropriado perfurados orifícios no dispositivo.
  3. Inserir um comprimento de 10 cm de EP-2 para a porta de saída do dispositivo e colocar a outra extremidade num contentor de recolha de resíduos.
  4. Primeiro o dispositivo, executando as bombas de seringa, a altas taxas de velocidades (2,000 mL / min) até que o fluido nos segmentos de tubagem atinge os orifícios de entrada do dispositivo.

5. Emulsão Geração

  1. Concentre o microscópio sobre uma região que contém o 50 um x 50 um orifício eocanal de saída a jusante.
  2. Definir as bombas de seringa para fornecer o fluido para o gerador de emulsão dupla a taxas de fluxo de 250 mL / h durante a fase interior, com 100 ul / h durante a fase de meio, e 700 ul / h durante a fase contínua e esperar 10 minutos para equilíbrio.
  3. Manter as velocidades de fluxo das fases interna e meia em 250? L / h e 100 l / h, respectivamente. Definir a taxa de fluxo da fase exterior em 1.050 mL / hr. Espere 3-5 minutos para a geração de casal emulsões para estabilizar sob este conjunto de condições de escoamento.
  4. Adquirir 5 segundos de imagens de vídeo a 30 Hz para processamento off-line através de análise de imagem manual.
  5. Repetir 5.3 e 5.4 com as taxas de fluxo indicadas na Tabela 1. As taxas de fluxo da fase interna e do meio são mantidas constantes e a taxa de fluxo da fase portadora é variada por ajustamento da configuração da bomba de seringa.

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Representative Results

O gerador de emulsão dupla é constituída por um dispositivo de focagem de fluxo coaxial criado utilizando PDMS 3D fabricação (Figura 1A). A geometria permite que a formação de um jacto coaxial de três fases para ser cortada num quadrado, de 50 um x 50 um orifício, permitindo a formação de água / óleo / água emulsões duplas (Figura 1B, Figura 1C). A fase aquosa interna e a fase de óleo secundária são unidas numa junção com dimensões de canal de 10 um x 50 um (Figura 1D, ponto "1"). Devido à hidrofobicidade do PDMS, os abraça óleo fluorados as paredes do canal e as estadias fase interior no centro do canal do que os fluidos de viajar em um jacto contínuo, até que uma expansão do canal de expansão brusca é atingido (Figura 1D, ponto "2" ). Neste local, as duas fases são injectados no interior do centro de uma altura de 320 mícrons Juncção que permite a introdução relativamente concêntrica da fase de veículo aquoso. As três fases são forçados a uma 50 um x 50 um orifício (Figura 1D, ponto "3"), pelo que a taxa de fluxo elevada da tesoura de fase da portadora do Inner duas fases em uma longa, mecha fina que se decompõe a partir de gotículas uniformes ( Figura 1E).

A fabricação de PDMS 3D requer o acoplamento de dois moldes originais PDMS em uma configuração após a moldagem em forma de concha duas camadas mestres litográficas. Uma camada de 50 mm de altura é utilizada para formar os canais de tratamento de líquidos interna e média, juntamente com o orifício de cisalhamento na Master 1 (Figura 2A), juntamente com uma armação saliente e um recesso complementar em oposição mestre. Uma camada adicional de altura 135 uM é usada para criar o fluido de transporte e os canais de saída (Figura 2B). Assembléia do gerador de emulsão dupla utiliza tele recesso e armações salientes (Figura 3A) para o alinhamento geométrico após o tratamento com plasma (Figura 3B).

O dispositivo de emulsão dupla foi testado a uma variedade de condições de fluxo para demonstrar a formação de tamanho variado, emulsões duplas monodispersas. Para estas experiências, as taxas de fluxo da fase interna e média foram mantidos constantes e a taxa de fluxo da fase portadora foi modificada para afectar a força de corte durante a geração de gotículas. As condições experimentais estão parametrizada pela razão entre o caudal de fase de portadora (Q c) para a soma das duas fases interna flui (soma Q). Imagens de geração de gotículas de experiências realizadas em Q C / Q soma a partir de 3 a 57 são apresentados na Figura 4. Uma região alongada contendo as duas fases interna é observada a sobressair para o 50 um x 50 um orifício e quebras em gotículas que são convecção a jusante. Euncreasing o fluxo da fase da portadora (aumentando Q C / Q soma) conduz às fases interna a ser cortado em regiões progressivamente mais finas que produzem gotículas menores. Emulsões duplas produzidos pelo dispositivo a diferentes taxas de fluxo apresentam um coeficiente de variação médio de diâmetro de 5,2%. Histogramas de diâmetros de gotículas para SELECT valores de soma Q C / Q também mostram a relativa uniformidade no tamanho das gotículas geradas (Figura 5). O dispositivo demonstra uma capacidade de formar emulsões duplas significativamente menor a largura do orifício, e apresenta uma tendência decrescente com o aumento claro Q C / soma Q (Figura 6). Na maior transportador de fluxo da fase testados, 14 uM emulsões duplas foram formadas usando o 50 um x 50 um orifício.

figura 1
Figura 1. A geometria da DOUBLgerador e emulsão. (A) modelo 3D do dispositivo fabricado. (B) corte vertical do canal central mostrando introdução do interior (cinza), médio (vermelho), e portador (azul) fases. (C) Corte transversal mostrando o jacto de duas fases contendo os interiores que entram no orifício quadrado. (D) Top vista de geração de emulsão no dispositivo. Na junção de (1) a injecção do meio de fase hidrofóbica é auxiliado por PDMS hidrofílicos, que faz com que para revestir as paredes do canal. Na junção (2) o canal expande e um jacto de duas fases interior é cortado para o orifício (3), pelo aumento da taxa de fluxo do fluido contínuo a um ponto em que a formação de gotículas causa física. A imagem do microscópio de geração de emulsão dupla no dispositivo (E). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ p>

Figura 2
Figura 2. litografia produção dos mestres. (A) A máscara usada para a preparação de 50 uM características. Master 1 é utilizado para moldar as entradas de fluidos, a junção interna / fase intermédia, o orifício de geração de emulsão, e uma calha rebaixada para o alinhamento. 2 Mestre contém uma crista levantada usado para o alinhamento. (B) A máscara usada para a preparação de 135 uM características. Os mestres são imagens de espelho que contêm os canais de encaminhamento de fluido transportador e do canal de saída. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Montagem do dispositivo PDMS. ( (B) Montado, os quadros de bloqueio para proporcionar um óptimo alinhamento de recursos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Imagens de emulsões duplas gerados em diferentes taxas de fluxo. A taxa de fluxo da fase exterior é alterado para alterar Q C / Q soma, que é dado à esquerda de cada imagem. Aumentar Q soma c / Q estreita a jato dos fluidos internos sendo cortadas através do orifício, criando cada vez mais pequenas gotículas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 5. Os histogramas de gotículas de emulsão dupla tamanhos a diferentes taxas de fluxo. O coeficiente médio de variação do diâmetro de gotas de emulsão produzidos em um determinado conjunto de condições de fluxo é de 5,2%. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. gota diâmetro contra parâmetro da velocidade de fluxo normalizada. Ajustar a taxa de fluxo da fase contínua permite a produção de emulsões duplas que são 30% a 100% do diâmetro do orifício. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Q i [l / h] Q m [l / h] Soma Q [l / h] Q C [l / h] Q c / Soma Q 100 250 350 1050 3 100 250 350 2100 6 100 250 350 3850 11 100 250 350 5950 17 100 250 350 8050 23 100 250 350 10150 29 100 250 350 11900 34 100 250 350 17150 49 100 250 350 19950 57

Tabela 1. parâmetros de taxa de fluxo utilizados para os experimentos. A fase interior e as taxas de fluxo da fase secundária (Q i, Q m) são mantidos constantes, dando uma taxa de fluxo constante combinado (soma Q). A taxa de fluxo de fase de portadora (QC) é variada para produzir emulsões duplas com diferentes diâmetros. A relação Q c / Q soma é o principal parâmetro não dimensional descrevendo condições experimentais.

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Discussion

A geometria de geração de emulsão dupla descrito aqui é projetado para imitar a física de dispositivos de capilares de vidro 8. Nestes, capilares de vidro cilíndricos alinhados são usadas para criar um jacto coaxial de três fases, que é cortado em gotículas uniformes de emulsão dupla. A função do nosso dispositivo de PDMS 3D é dependente do alinhamento central das características pequenas formadas com 50 mm de altura de fabricação da fase da portadora com canais que são de 320 mícrons na altura total. Existe um potencial significativo para a desalinhamento das características mais altas modelado por a camada de máscara na etapa 1.7 em relação à altura de 50 um a geometria se máscaras não são alinhados com precisão. O alinhamento adequado pode ser auxiliado através da concepção de marcas de alinhamento, tais como círculos concêntricos em máscaras para ser co-localizados durante padronização foto. A ligação do plasma de dois PDMS metades do dispositivo é um segundo processo que pode conduzir a distorções significativas do dispositivo final. Ligação Plasmade PDMS PDMS é geralmente instantânea, de modo que no passo 2.4, descrevemos o humedecimento de uma superfície de dispositivo com água Dl para retardar a ligação e permitem a manipulação de modo a que os quadros de alinhamento mostrado na Figura 3A pode ser permitido para bloquear. Se isso é tentado sem molhamento suficiente, as superfícies PDMS vai irreversibilidade ligação antes de entrar em alinhamento adequado, eo dispositivo deve ser eliminado de novos moldes e PDMS feito.

O dispositivo de emulsão dupla foi concebido para tirar vantagem das técnicas de fabricação que levam a que as propriedades de superfície uniformemente hidrofóbicos. No entanto, a operação fora dos parâmetros descritos no protocolo requer alguma compreensão dos processos fluídicos necessários. A junção das fases interna e média (Figura 1D, ponto "1"), um relativamente elevado fluxo da fase interna e baixo fluxo da fase de meio criar um jacto de duas fases, com a fase de meio hidrofóbico revestindo as paredes do canal. E seo fluxo proporcional da fase intermediária é aumentada, a geração de gotículas discretas de água-em-óleo irá começar a ocorrer, eliminando a capacidade de formar um jacto de três fase coerente para a formação da gota no orifício (Figura 1D, ponto "3" ). Após a expansão do canal (Figura 1D, ponto "2"), uma quantidade significativa de fluxo de fase de portadora é necessária para criar a separação geométrica entre a fase intermédia e as paredes do canal hidrofóbico. As reduções no fluxo de fase da portadora acabará por levar à fase meio molhar as paredes do dispositivo hidrofóbicas. Reduções significativas no fluxo de fase da portadora podem criar condições de fluxo que são insuficientes para tosquiar as fases internas em uma longa, filamento fino, assim, alterando radicalmente a física da formação de dupla emulsão de gotículas.

Uma vez construído, este dispositivo é projetado para produzir emulsões duplas, de 14 a 50 um, um tamanho conveniente para a triagem usando FACS comerciaisinstrumentos. Se emulsões duplas fora desta gama de tamanho são desejadas, as dimensões do orifício precisa ser dimensionada a partir do tamanho de 50 um x 50 um aqui utilizado. Uma vez que o dispositivo é destinado a produzir água / óleo / água com propriedades de emulsões duplas de superfície uniformemente hidrofóbicos, óleo / água / óleo não pode emulsões duplas criado a menos que houvesse um tratamento de superfície aplicado para tornar o dispositivo uniformemente hidrofílico.

Este trabalho demonstra um fácil de fabricar dispositivo PDMS capaz de formação robusta de água / óleo / água emulsões duplas. Embora os investigadores anteriores relataram a formação de emulsões duplas em dispositivos criados utilizando litografia 3D 14,15, as emulsões duplas formadas nos seus dispositivos tinham diâmetros foram medidos em que 100s de um. O dispositivo aqui relatado é adequado para a produção de emulsões duplas uma ordem de grandeza menor do que esta, fornecendo volumes semelhantes às células de mamíferos e bem adaptada para a triagem por FACS.

Embora estes resultados também podem ser atingidos utilizando Microfluidics capilares de vidro, fabricar dispositivos de vidro é trabalhoso e requer muitos mãos sobre-passos por dispositivo. Para o nosso dispositivo de todos os PDMS, fabricação consiste basicamente de moldagem, colagem, e lajes cozimento PDMS, processos que são simples, repetitivo, e fácil de se adaptar a grandes números.

A utilidade de um litograficamente dispositivo fabricado para gerar emulsões duplas utilizando fluxo de co-axial com foco tem sido demonstrada. Esperamos que a fabricação simples e robusta funcionalidade deste projeto duplo gerador de emulsão deve levar à sua adaptação para aplicações científicas e industriais. Investigadores anteriormente dissuadido pelo habilidades especializadas necessárias para trabalhar em microfluídica capilar de vidro, deve ser mais confortável usando PDMS litografia macia, agora uma técnica de laboratório comum. Além disso, os pequenos tamanhos de gotículas que podem ser produzidos é bem adequado para PERFORm célula e ensaios biológicos em gotas, e a quantificação e a triagem utilizando FACS. Para aplicações industriais, já foi mostrado que estes tipos de dispositivos podem ser fabricados em conjuntos e em paralelo 10, permitindo que as taxas de geração de emulsão dupla para aumentar em ordens de magnitude, em comparação com os dispositivos individuais. Além disso, a capacidade de formar pequenas emulsões duplas em grandes canais de fluxo de focagem coaxial deve tornar o dispositivo resistente à incrustação e entupimentos, o que é crítico quando paralelização os dispositivos destinados a funcionar durante períodos de tempo longos sem a intervenção.

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Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma concessão da pesquisa do California Institute for Quantitative Biosciences (QB3), o Bridging the Award Gap da fundação da família de Rogers, a Sandler / Programa Foundation UCSF para Breakthrough de Pesquisa Biomédica, uma bolsa da BASF, ea NSF, através Programa Faculdade Início de Carreira Desenvolvimento (CARREIRA) (DBI-1253293).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photomasks CadArt Servcies
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
SU-8 3035 Microchem Y311074
SU-8 2050 Microchem Y111072
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
1 ml syringes BD 309628
10 ml syringes BD 309604
27 gaugue needles BD 305109
PE 2 polyethylene tubing Scientific Commodities, Inc. B31695-PE/2
Novec 7500 Fisher Scientific 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
Biocompatable surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
35,000 MW PEG Sigma Aldrich 1546660
Tween 20 Sigma Aldrich P1369
Sodium dodecyl sulfate  Sigma Aldrich L3771

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References

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