DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J. Vis. Exp. (106), e53551, doi:10.3791/53551 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

myofibers الفردية هي خلايا المخلوي كبيرة، عالية التنظيم. هناك عدد قليل من النماذج خلية ثقافة العضلات. ومع ذلك، فإن هذه النماذج لديها كما قيدا رئيسيا على أنها لا تفرق تماما في myofibers ناضجة. على سبيل المثال، وتستمد خطوط الخلايا C2C12 وL6 من الفئران والجرذان على التوالي 1-4. في ظل ظروف المجاعة في الدم، وخلايا وحيدة النواة "شبيهة بالخلايا العضلية الجذعية" وقف انتشار الأسلحة النووية، تخضع لدورة الخلية الانسحاب، ويدخل في برنامج عضلي تشكيل خلايا متعددة النوى مع sarcomeres، ويشار إلى myotubes. مع الظروف الثقافة لفترات طويلة، قد myotubes يظهر خصائص مقلص و"نشل" في الثقافة. وقد جرى الآن أيضا إنشاء خطوط الخلايا البشرية 5. وبالإضافة إلى هذه خطوط الخلايا خلده، myoblasts وحيدات النوى يمكن عزلها عن العضلات وتحت ظروف مماثلة من الجوع الدم ستشكل myotubes. هذه خطوط الخلايا والثقافات بالخلايا العضلية الجذعية الأساسية هي استخدام عاليةفول لأنها يمكن أن تكون مع transfected البلازميدات أو transduced مع الفيروسات واستخدامها لدراسة العمليات البيولوجية الخلية الأساسية. ومع ذلك، هذه الخلايا، حتى عندما يسببها لتشكيل myotubes، تفتقر إلى العديد من الميزات البارزة لتنظيم العضلات ناضجة. على وجه التحديد، myotubes هي أصغر بكثير من myofibers ناضجة الفردية وتفتقر إلى الشكل الطبيعي للmyofibers. الأهم من ذلك، myotubes تفتقر عرضية (T-) الأنابيب، وشبكة غشائي اللازمة لكفاءة الكالسيوم 2+ إطلاق سراح جميع أنحاء هيولى عضلية.

طريقة بديلة لبالخلايا العضلية الجذعية الأولية أو خطوط الخلايا عضلي يستلزم استخدام myofibers ناضجة. ويمكن استخدام Transgenesis لإقامة التعبير عن البروتينات الموسومة، ولكن هذه الطريقة مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. وقد برزت في الجسم الحي Electroporation للمن العضلات الماوس بوصفه الأسلوب المفضل لسرعته والموثوقية 10/06.

طرق لفي الجسم الحي Electroporation للوالعزلة الفعالة من myofibers هكتارلقد تم تحسين للماوس الباسطة للأصابع القصيرة (FDB) في العضلات 6. الأساليب يمكن أن تكتمل بسهولة وهم الغازية الحد الأدنى للحث في التعبير المجراة من البلازميدات. يتم الجمع بين هذا النهج الآن مع أساليب التصوير عالية الدقة بما في ذلك التصوير بعد انقطاع ليزر من 6،7 غمد الليف العضلي. مزيج من الأصباغ الفلورية والتعبير عن البروتينات fluorescently المسمى يمكن استخدامها لمراقبة العمليات الحيوية في الخلية myofibers ناضجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ الطرق في هذه الدراسة وفقا الأخلاقي مع مدرسة فاينبيرغ جامعة نورث وسترن الطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) وافق المبادئ التوجيهية. تم بذل كل الجهود للحد من المعاناة.

1. الإجراءات التجريبية في الجسم الحي Electroporation للمن المثنية القصيرة للأصابع (FDB) العضلات حزمة في ماوس

  1. البلازميدات تصميم لفي الجسم الحي التعبير باستخدام المروج المعروفة للتعبير في خلايا الثدييات (على سبيل المثال، الفيروس المضخم للخلايا، CMV) أو في العضلات (مثل العضلات الكرياتين كيناز، MCK) 6،7. البلازميدات أكبر قد مبديا في المستويات الدنيا. وقد استخدم المروج CMV على نطاق واسع 6،7.
  2. تنقية البلازميدات من E. القولونية باستخدام ظروف خالية الذيفان الداخلي في تعليمات الشركة الصانعة. حل البلازميد في العقيمة، الذيفان الداخلي العازلة TE مجانا في 2-5 ميكروغرام البلازميد / ميكرولتر.
  3. تمييع وقسامة البلازميد إلى concentratioن من 20 ميكروغرام من الحمض النووي في 10 ميكرولتر من الذيفان الداخلي معقمة خالية TE (2 ميكروغرام / ميكرولتر) العازلة في الحقن في أنبوب microcentrifuge العقيمة. إعداد قسامة واحدة لكل الحقن.
  4. تمييع الأسهم من هيالورونيداز ل1x أخرى العقيمة مع الفوسفات مخزنة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS - / -) إعطاء تركيز النهائي من 8 وحدات. قسامة 10 ميكرولتر من هيالورونيداز المخفف للحقن في أنبوب microcentrifuge العقيمة.
  5. تخدير الماوس باستخدام 2.5٪ الأيزوفلورين حتى مخدرا وتستجيب إلى الذيل أو أخمص القدمين معسر. وضع الحيوان في موقف ضعيف على وسادة التدفئة أو جدول التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم العادية.
  6. تنظيف قاطع الطريق من الفأرة مع تطبيق بالتناوب من فرك البوفيدون اليود والكحول ثلاث مرات باستخدام تقنية الإعدادية منشؤها من موقع الإبرة ويشع إلى الخارج. تحتفظ هذه التقنية موقع الإبرة في حالة العقيم، والتقليل من العوامل المسببة للأمراض المقدمة.
  7. حقن قاطع الطريق من الالبريد الفأر مع 10 ميكرولتر من الحل 1X هيالورونيداز (2 ملغ / مل = 8 وحدات) بين الجلد والعضلات باستخدام معقمة 1 مل حقنة. هيالورونيداز يساعد على هضم مكونات المصفوفة خارج الخلية للسماح دخول أكثر كفاءة البلازميد إلى myofibers. أدخل في قاعدة كعب ودفع الإبرة في اتجاه أصابع القدم. الافراج عن ببطء السائل كما هو تراجع الإبرة. وموقع الحقن تحت الجلد توسيع والبدء في تحويل الوردي.
  8. كرر الخطوات من 1.6 و 1.7 على سفح المقابل.
  9. افصل التخدير ومكان الماوس مرة أخرى في قفص. السماح الماوس ليتعافى تماما من التخدير.
  10. الانتظار 2 ساعة.
  11. تكرار إجراءات التعقيم التخدير والقدم، خطوات 1.5 و 1.6.
  12. حقن DNA البلازميد المخفف في قاطع الطريق في نفس منوال هيالورونيداز. ضمان أن الحد الأقصى لحجم 20 ميكرولتر أو أقل. لالمزدوج التعبير البلازميد حقن 20 ميكروغرام لكل البلازميد مع الحد الأقصى لحجم 20 &# 181؛ ل أو أقل.
  13. تكرار حقن البلازميد على قاطع الطريق المقابل أو استخدام القدم المقابل لحقن السيطرة.
  14. على القدم التي تم حقن في البداية، ورفع الجلد بعيدا عن العضلات يؤكد بالملقط الجميلة ومكان واحد 27 إبرة G عن طريق الكرات من الجلد بالقرب من أصابع القدم في وضع عمودي على خط شفاء أخمص القدمين القدم. خذ الثانية العقيمة 27 G الإبرة ووضعه أفقيا من خلال الجلد في كعب. مكان الإبر موازية لبعضها البعض ~ 1 سم عن بعضها البعض.
  15. استخدام المشابك التمساح، أسلاك المشبك إلى الإبر موازية التأكد من الإبر عدم الاتصال بعضها البعض. استخدام الصلصال يمكن تأمين المشابك في المكان.
  16. توصيل الأقطاب الكهربائية إلى التحفيز والتشجيع والكهربائية.
  17. Electroporate العضلات عن طريق تطبيق 20 البقول، 20 ميللي ثانية في مدة / لكل منهما، في 1 هرتز، 100 V / سم. أصابع القدم قد نشل مع التحفيز.
  18. كرر الإجراء التحفيز على سفح المقابل إذا لزم الأمر.
  19. إزالة الإبر. مسح قاطع الطريق مع البوفيدون اليود فرك.
  20. إيقاف التخدير. عودة الماوس إلى القفص الانتعاش والنشاط الشاشة. إذا أجريت الإجراء كما هو متوقع، يجب الحيوان استعادة التمشي العادي خلال 30 دقيقة، وتظهر أي اختلاف في التمشي أو النشاط مستوى من السلوك ما قبل الحقن. ولذلك، هناك حاجة إلى أي المسكنات بعد العملية. بعد شفائهم، والعودة الحيوان إلى الحظيرة.
    ملاحظة: تعبير البروتين يمكن أن يعاير في أقرب وقت 48 ساعة بعد Electroporation لل. ومع ذلك، للسماح للانتعاش أكثر اكتمالا بعد Electroporation لل، ونحن نفضل العزلة ودراسة myofibers 7 - بعد 14 يوما Electroporation لل10. التعبير يمكن يعاير طويلة مثل بعد 4 أسابيع Electroporation لل.

2. إجراء التجريبية للعزل من المثنية القصيرة للأصابع (FDB) ألياف

  1. كولاجيناز ذوبان الجليد. لكل حزمة FDB إعداد بئرين في 12-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. في واحدة إضافة جيدا 1 مl من قبل تحسنت Dulbecco لتعديل النسور وسائل الإعلام بالإضافة إلى الأبقار مصل الزلال (DMEM + BSA) والآخر إضافة جيدا 1 مل من قبل تحسنت قارعو الأجراس الحل. بالإضافة إلى ذلك، إضافة 10 مل جديدة من 1X قارعو الأجراس حل لل35 مم Sylgard الطبق.
  2. التضحية الحيوانية من خلال CO 2 أو استنشاق الغاز المخدر، تليها خلع عنق الرحم أو أي طريقة أخرى لضمان الموت.
  3. إزالة قدميه الخلفيتين فوق مفصل الكاحل باستخدام شفرة حلاقة نظيفة ويغرق في 1X قارعو الأجراس الحل في 35 ملم Sylgard الطبق.
  4. دبوس قدم واحدة ضيقة، وحيد مواجهة، على طبق Sylgard مع 30 الإبر G من خلال كل من النصائح اصبع القدم 5 وعند الكاحل.
  5. بدءا من الكاحل، قص الجلد مباشرة من الناحية القدم على طول شعري نحو أصابع القدم، والحرص على عدم شق العضلات تحت الجلد. كرر على الجانب الآخر من القدم.
  6. القابضة للجلد عند قاعدة الكاحل مع ملقط غرامة، وقطع الجلد في كعب.
  7. رفع الجلدرفرف بالملقط، نشير المقص الخاص نحو الجلد حتى لا نيك العضلات. قص النسيج الضام الكامنة، وإزالة بشكل فعال على الجلد.
  8. لإزالة قطع حزمة العضلات FDB وتر كبير في كعب لتحرير وتر من العظام. عقد الوتر مع ملقط، تشريح حزمة FDB من وتر أبيض كبير إزالة بعناية أي النسيج الضام تعلق على FDB مع مقص. إذا فعلت بشكل صحيح حزمة ورفع بسهولة الخروج من الأوتار وراء الكشف عن الأوتار بيضاء مشرقة مما يؤدي إلى الأرقام الفردية. قطع FDB في الأوتار بالقرب من أصابع تحرير حزمة من القدم.
  9. وضع حزمة العضلات بأكملها في تحتوي جيدا DMEM + BSA.
  10. كرر على القدم المقابل.
  11. مرة واحدة يتم عزل جميع العضلات FDB، إضافة 100 ميكرولتر من كولاجيناز لتحتوي كل منها على جيدا DMEM + BSA والعضلات.
  12. تحقق من نجاح Electroporation للفي مجهر فلوري مقلوب قبل الهضم. إذا فعلت بصورة ملائمةذ، لا يمكن أن يتحقق ما يزيد عن 90٪ كفاءة ترنسفكأيشن.
  13. احتضان لوحة في ترطيب، 37 ° C الحاضنة في 10٪ CO 2 لحوالي 1 ساعة. قد تختلف فترة حضانة اعتمادا على نموذج المرض والخلفية والكثير من كولاجيناز.
  14. بعد 1 ساعة، ونقل بعناية حزمة FDB إلى تحتوي أيضا الحل الوحيد قارعو الأجراس.
  15. يسحن حزمة FDB في البئر مع الحل قارعو الأجراس باستخدام ماصة 1 مل. قطع نهاية طرف ماصة مع شفرة حلاقة نظيفة مثل أن حزمة يمكن أن يمر بسهولة من خلال طرف ماصة. يسحن بلطف العضلات (~ 15 مرات) السماح للحزمة لتمرير صعودا وهبوطا موازية لطرف. والألياف سليمة تسقط في الحل قارعو الأجراس. عندما الألياف لا تقع بسهولة قبالة حزمة، ضع العضلات مرة أخرى إلى حل كولاجيناز.
  16. لوحة ألياف معزولة على طبق ~ 500 ميكرولتر لكل لوحة.
  17. السماح للعضلات لهضمها في البئر لمدة 15 دقيقة.
  18. كرر الخطوات من 2.15إلى 2.17 حتى يقلل من حزمة في الحجم ونأت معظم الألياف من حزمة (عادة ما مجموعه 2-3 مرات). مرة واحدة فصل العضلات يمر بسهولة من خلال ماصة 1 مل.
  19. السماح الألياف نعلق على طبق مدة لا تقل عن 15 دقيقة. ويمكن أن يضاف الحل قارعو الأجراس جديدة لوحة لتخفيف كولاجيناز المتبقية أو تغييرها تبعا ضيق الوقت.
    ملاحظة: الالياف هي الآن جاهزة للتصوير.

3. الإجراءات التجريبية لالتصور التي يسببها الليزر غشاء الأضرار باستخدام متحد البؤر المجهري

  1. الألياف تحميل مباشرة قبل التصوير مع 300 ميكرولتر من 2.5 ميكرومتر FM 1-43 من FM 4-64 الصبغة في حل قارعو الأجراس. عموما، ألياف الصورة 15 دقيقة إلى 2 ساعة بعد العزلة. ومع ذلك، يمكن تصوير الألياف تصل إلى 24 ساعة بعد العزلة.
  2. وضع الطبق أسفل الزجاج على المجهر متحد البؤر مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية والهدف 60X / 63X.
  3. تحديد موقع الألياف. ضمان إرفاق الألياف بحزمعلى طبق من خلال الاستفادة من قاعدة المجهر. استبعاد الألياف التي تضررت في عملية التفكك. قد تحتوي على الألياف التالفة الفقاعات الغشاء، وارتفاع مستويات الإقبال على صبغ FM، حليقة أو ينحني بشكل مكثف.
  4. للحث على الضرر غشاء على الألياف، ضع غمد الليف العضلي في وسط النافذة التصوير مع حقل واضح من النوى. التركيز على غمد الليف العضلي باستخدام الصبغة قناة FM بحيث غمد الليف العضلي هو حاد للغاية.
  5. وضع الشعر ROI عبر عن غمد الليف العضلي باستخدام قناة FM 4-64.
  6. أشرق نقطة 1 بكسل في 80٪ من الطاقة لمدة 3 ثانية (~ 350 نانومتر س 350 منطقة نانومتر). وصبغ FM يدخل الخلية في موقع الإصابة. يمكن تعديل الطاقة والوقت لزيادة أو نقصان مجال الإهانة.
  7. التقاط الصور من الألياف قبل الضرر، في وقت الضرر، كل 2 ثانية بعد الضرر، ثم كل 10 ثانية لمدة تصل إلى 5 دقائق. يمكن تعديل التوقيت حسب الحاجة. ويمكن تحويل الصور الفردية للأفلام مرور الزمن في صورة J.
  8. كرر الخطوات3.3 من خلال 3.7 على ما يصل إلى 3 الألياف لكل طبق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Electroporation للهو أسلوب الغازية الحد الأدنى الذي يقدم كفاءة تنقية DNA البلازميد في العضلة القابضة لأصابع القصيرة (FDB) حزمة العضلات (الشكل 1A). سبعة أيام بعد ترنسفكأيشن fluorescently هو تصور البروتين الموسومة في myofibers معزولة (الشكل 1B). الألياف معزولة ثم يتم مطلي، وأعد للتصوير في المجهر متحد البؤر. الألياف يمكن أن تخضع ليزر الناجم عن الإصابة. يمكن استخدام صبغة FM لتحديد موقع تلف غشاء (الشكل 1C)

أثناء عملية الهضم، وعدد قليل من myofibers قد أصيب (السهم الأبيض) (الشكل 2A). ويمكن تحديد myofibers التي تضررت من blebbing غشاء حاضرا في غمد الليف العضلي (السهم الأسود). الألياف التالفة ليست مناسبة لمزيد من التجارب، وينبغي عدم استخدامها. صور مبائر الممثل تظهر س التعبير اتحاد كرة القدم بروتين فلوري الانصهار داخل myofibers معزولة الشكل 2B. الاستفادة من المروج CMV يدفع الأمثل البروتين التعبير في myofibers. يظهر DIC التصوير الألياف الأمثل. FM 4-64 موجودة في الغشاء عند مستويات منخفضة قبل الضرر (الشكل 2C).

صورة ممثل ليف عضلي محملة FM 4-64 تصويرها على المجهر متحد البؤر ايكا SP 5. وتتركز غمد الليف العضلي في مجال الرؤية (المربعات البيضاء) والتقاطع العائد على الاستثمار (الأبيض خ) يتم محاذاة على هش، حافة الفلورسنت من غمد الليف العضلي في منطقة خالية من myonuclei (الشكل 3، وسط). يتم تجنب نواة لأنها يمكن أن تؤثر FM صبغ التصوير بعد التحليل. على الضرر الغشاء، صبغ FM يدخل الحد الأدنى myofibers العادية (الشكل 3، يمين). والألياف العضلية التالفة في إصلاح غشاء عرض زيادة مستويات FM صبغ امتصاص على الأضرار الناجمة عن الليزر.

-together.within صفحة = "1"> الشكل 1
الشكل 1. رسم تخطيطي للفي الجسم الحي Electroporation للوالليزر بروتوكول الأضرار. يتم حقن (A) هيالورونيداز في قاطع الطريق من الماوس تخدير. ثم يتم حقن الحمض النووي البلازميد ويتم تطبيق الجهد. (B) سبعة أيام بعد الحقن، والقصيرة الباسطة للأصابع (FDB) حزمة (السهم الأبيض وسط لوحة) معزول من قاطع الطريق وترك الأوتار وراء يتعرض (السهم الأسود). ومطلي (C) ألياف، ويتم تنفيذها الأضرار الناجمة عن الليزر على myofibers الحية. اللوحة اليسرى، على نطاق و50 ميكرون. اللوحة اليمنى، مقياس مكون من 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3551fig2.jpg "/>
الشكل 2. Myofibers معزولة تعرب عن الموسومة fluorescently البروتينات سبعة أيام بعد Electroporation لل، تم الكشف عن البروتين التعبير في جميع أنحاء ليف عضلي. (A) نتائج إجراء العزل في عدد قليل من myofibers غير صالحة للاستعمال مع متميزة blebbing غشاء (السهم الأسود) واضطرابات غشاء (السهم الأبيض). مقياس مكون من 5 ميكرون. (B) صورة الممثل من ليف عضلي سليم. وتصور sarcomeres متباعدة بشكل متساو في مدينة دبي للإنترنت التصوير (يسار). A ليف عضلي معربا عن annexin A6 ذات الكلمات الدلالية مع GFP (لوحة الوسط). هناك الحد الأدنى FM صبغ إشارة قبل الضرر (اللوحة اليمنى). مقياس مكون من 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. محاذاة الليزرمرمى على غمد الليف العضلي-FM إيجابي. وتتركز المنطقة من الفائدة على غمد الليف العضلي داخل مجال الرؤية. يتم تكبير غمد الليف العضلي (مربع منقط أبيض) ومرمى ROI محاذاة على-FM إيجابي حافة حادة من غمد الليف العضلي في منطقة خالية من النوى (لوحة الوسط). على الضرر، يدخل صبغ FM في موقع الإصابة (اللوحة اليمنى، السهم الأبيض). مقياس مكون من 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هي مناسبة للاستخدام Electroporation لللدراسة البروتينات الموسومة fluorescently في الجسم الحي مثالي لدراسة العضلات نظرا لعدم وجود نماذج خط الخلية المناسبة التي تحاكي بأمانة هيكل الخلية بأكملها من العضلات. يصف هذا البروتوكول استخدام Electroporation للوعالية الدقة متحد البؤر المجهري لتوفير صور مفصلة للتوطين البروتين والنبات بعد إصابة ليزر. هذه الطريقة يمكن تكييفها لدراسة العمليات الخلوية الأخرى بما في ذلك إعادة تنظيم الهيكل الخلوي، والاتجار، والانصهار.

باستخدام هذا البروتوكول، ما يصل إلى 90٪ من myofibers ضمن حزمة العضلات FDB صريح البلازميد، وهذا يمكن ملاحظته بسهولة من قبل مضان المجهري قبل وبعد ليف عضلي التفكك على حد سواء. عادة ما يكون هناك تدرج التعبير مع ارتفاع التعبير احظ أقرب إلى موقع الحقن. بسبب التدرج التعبير، وتأثير متفاوتة التعبير البروتين يمكن رصدها جيئة وذهاباأماه تجربة واحدة. كما هو الحال مع جميع طرائق نقل، وهذا النهج محدودة بسبب قضايا تتعلق overexpression. والجدير بالذكر، مع التعبير مستوى عال، يمكن أن يحدث البروتين التجميع. في تجربتنا، توضح علامة فلوري mCherry المزيد من التجميع من العلامة تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) تقليل دقة والحدة من المجالات البروتين (على سبيل المثال انظر الشكل 4 في 7). بالإضافة إلى ذلك، mTurquise2 والزهرة العلامات الفلورية كل من تثبت التعبير مضان كافية. ومع ذلك، على حد سواء البروتينات هي أقل سطوعا من EGFP.

هذه الطريقة يمكن استخدامها لmyofibers الصورة الحية في إطار مجموعة من الشروط بما في ذلك العوامل اختبار الأدوية وإصابة الخلية. كنا إصابة ليزر لتعطيل غمد الليف العضلي، ولكن عمليات اصابة أخرى يمكن أن تتكيف مع هذا الأسلوب. تحقيقا لهذه الغاية، وتشكيل غشاء الفقاعات التي أنشأتها صدمة التناضحي فضلا عن إصابة الغشاء الناجمة عن المتداول الخرز الزجاجي يمكن أن يكون أيضاتقييم استخدام myofibers electroporated 11،12. لجرح الليزر، ونوع وقوة الليزر، وكذلك الهدف تؤثر على المدة الزمنية اللازمة لخلق الآفة الأغشية 13،14. وعلاوة على ذلك، سوف مخازن الخارجية، وتحديدا في تركيز الكالسيوم وصبغ FM داخل المخزن المؤقت تؤثر على عملية الإصلاح 13،15. وقد تم اختبار هذه المنهجية على نظامي التصوير متحد البؤر نيكون وايكا وكلاهما قادر على أداء هذه التقنية. FM 4-64 مناسب تماما للتجريب مع بروتين الفلورية الخضراء 7. وقد استخدم آخرون FM 1-43، صبغ محبة للدهون أخرى التي تربط سالبة الشحنة الفوسفورية مع ذروة الإثارة في 470 نانومتر، والانبعاثات ذروتها عند 610 نانومتر، مما يحد من تطبيق هذه الصبغة 13،15،16. photobleaching من والضيائية على حد سواء نتائج محتملة، بسبب الإفراط في التصوير. تحديد التوازن السليم بين وقت التعرض، وتردد صورة وعدد من القنوات المصورةهي المعلمات التلاعب بها بسهولة للحد من هذه الآثار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

هناك أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS047726، NS072027، وAR052646.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11995-073 Dissection Media
Dilution: 50 ml +100 g BSA
Collagenase, Type II Life Technologies 17101-015 Fiber Digestion
Dilution: 160 mg / 4 ml DMEM (stock 40 mg/ml aliquot)
Falcon 12-well dishes Fisher Scientific 877229 Fiber Digestion
Ringers Solution Fiber Digestion and Imaging
Dilution: 146 mM NaCl
5 mM   KCl
2 mM   CaCl2
1 mM   MCl2
10 mM HEPES
pH7.4 in H2O
1 ml Pipettes Axygen T-1000-C-R Digestion
Razor Blades Personna 94-120-71 Digestion
Precision Glide 30 G needle BD Biosciences 305128 Dissection
1x PBS (-/-) Life Technologies 14190-250 Dissection
Sylgard 184 Fisher Scientific 50-366-794 Dissection
Forceps FST by Dumont #5/45 Dissection
Forceps Roboz RS-4913 Dissection
Scissors World Precision Instruments 500260 Dissection
BSA Sigma A7906 Dissection media
Dilution: 100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm dishes Fisher Scientific 08772B Dissection- used to hold sylgard
Clay Electroporation
Stimulator  Grass s88x Electroporation
Clamps Radio Shack 270-356 Electroporation
Triadine Aplicare 82-220 Electroporation
Precision Glide 27 G needle BD Biosciences 305136 Electroporation
Simulator Grass SIU-V Electroporation
Gauze Covidien 2146 Electroporation
Hyaluronidase Sigma H4272 Injection
Dilution: Add 160 ul PBS (1x) to 40 µl 5x stock
1 cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2)  BD Biosciences 329420 Injection
Eppendorf Tubes Fisher Scientific 02-682-550 Injection
35 mm glass bottom Microwell dish MaTek P35G-1.5-14-C Microscopy
FM 4-64 Life Technologies T-13320 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
FM 1-43 Life Technologies T-35356 Microscopy
Dilution: Final 2.5 ug/ml
Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid Purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
  2. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
  3. Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
  4. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
  5. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
  6. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. (2009).
  7. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
  8. Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
  9. Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
  10. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
  11. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
  12. Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
  13. Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
  14. Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
  15. Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
  16. Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics