Deacetylation فحوصات لكشف تفاعل بين Sirtuins (SIRT2) ومحددة البروتين ركائز

* These authors contributed equally
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. في المختبر Deacetylation الفحص

  1. تنقية SIRT2
    1. إعداد طبق ثقافة 10 سم من خلايا كلوة 293T مثقف في 8 مل DMEM مع 10٪ FBS والمضادات الحيوية ونمت في 37 درجة مئوية، و 5٪ حاضنة الثقافة CO 2 الأنسجة لتكون حوالي 70٪ متكدسة في اليوم التالي.
    2. في اليوم التالي، وشارك في transfect 4 ميكروغرام pCDH-بورو-GFP-SIRT2-العلم (lentivector المحرز في مختبرنا)، 4 ميكروغرام pCMV- dR8.2 dvpr (ناقلات التعبئة والتغليف) و 0.5 ميكروغرام pCMV-VSV-G (ناقلات المغلف) 18 استخدام polyethylenimine (PEI) على نسبة 3 ميكرولتر جزيرة الأمير إدوارد / ميكروغرام الحمض النووي.
    3. تغيير وسائل الإعلام بعد 12 ساعة.
    4. جمع طاف بعد 36-48 ساعة.
    5. إزالة الأنقاض عن طريق الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. بعد تصفية من خلال 0.22 ميكرون مرشحات، وجعل 1 مل aliquots من SIRT2 الفيروسة البطيئة والحفاظ على -80 درجة مئوية.
    7. الفيروسة البطيئة SIRT2 ذوبان الجليد على الجليد (من المهم لتخزين الفيروس في -80 درجة مئوية عند عدم استخدام فيروس).
    8. تصيب لوحة 6 جيدا من 80-90٪ خلايا 293T متموجة كلوة مع 1 مل من الفيروسة البطيئة في وجود 8 ميكروغرام / مل polybrene.
    9. وضع الخلايا المصابة بالفيروسات في الحاضنة 37 درجة مئوية حتى في اليوم التالي (24 ساعة).
    10. استبدال المتوسطة بعد 24 ساعة.
    11. 48 ساعة بعد الإصابة، والتحقق من كفاءة العدوى عن طريق الكشف عن GFP خلايا إيجابية تحت المجهر الفلورسنت.
    12. إذا كانت فعالية العدوى جيدة (40-50٪ على الأقل الخلايا المصابة)، واستبدال المتوسطة مع مستنبت تحتوي على 2 ميكروغرام / مل بوروميسين لاختيار لSIRT2 مستقرا خلال معربا عن الخلايا.
      ملاحظة: هذا يستغرق حوالي 2 أسابيع، ويتم تغيير المتوسطة كل 3-4 أيام. الخلايا غير المصابة تموت خلال هذه الفترة اختيار والخلايا فقط المصابين الفيروسة البطيئة SIRT2 النمو.
    13. تحليل تعبير عن SIRT2 الموسومة العلم من قبل النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة العلم (1: 1000 تمييع) بعد تشغيل 40 ميكروغرام من البروتين الكلي على 10٪ هلام SDS-PAGE قبل بدء purifعملية ication (موصى به) 19،20.
    14. لتنقية SIRT2 النشط، تقسيم الخلايا في 1: 3 نسبة من trypsinization من أجل الحصول على ما يكفي من الأطباق من خلايا كلوة 293T overexpressing مستقر العلم-SIRT2 (لن تن 10 سم أطباق تسمح تنقية ما يكفي من البروتين لتجارب لاحقة).
      1. يعرض للتريبسين الخلايا، وإزالة مستنبت والقضاء على المصل المتبقي قبل الشطف الخلايا مع DPBS العقيمة. ببطء إضافة 2.5 مل من 0.25٪ حل التربسين-EDTA لتغطية أحادي الطبقة الخلية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-45 ثانية. بعد إزالة الحل التربسين-EDTA، في احتضان 37 درجة مئوية حتى تبدأ الخلايا لفصل. ثم إضافة مستنبت ونقل الخلايا إلى أطباق جديدة.
    15. إزالة مستنبت، وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني وجمع الخلايا عن طريق trypsinization تليها الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    16. بيليه الخلية ليز في 500 ميكرولتر العازلة تحلل ألف (20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 18 ملي بوكل، 0.2 ملي EGTA، 1.5 ملي MgCl 2، 20٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40) بما في ذلك كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني و 1 ميكرومتر TSA لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية تحت دوران مستمر.
    17. أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونقل طاف لأنبوب جديد.
    18. أداء مناعي باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة العلم مترافق إلى الاغاروز الخرز كما هو موضح أدناه.
      1. إضافة 200-300 ميكرولتر من مكافحة العلم الأجسام المضادة مترافق إلى الاغاروز الخرز لالمحللة البروتين (10-20 ملغ البروتين الكلي).
      2. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الإثارة مستمر.
      3. جمع immunoprecipitates بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
      4. يغسل بيليه 5 مرات مع 10 مل تحلل عازلة في 1000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بعد كل غسل، بيليه الخرز واستبدال طاف مع العازلة أ.
    19. إعداد 1X حل العلم الببتيد (بما في ذلك حفل كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني و 1 ميكرومتر TSA في برنامج تلفزيوني).
    20. إضافة 500 ميكرولتر من 1X العلم ببتيده حل لحبات الاغاروز واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية تحت دوران مستمر.
    21. جمع طاف بواسطة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    22. كرر الخطوتين السابقتين.
    23. إزالة حبات من طاف باستخدام أنابيب مرشح والطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    24. التركيز عينة مزال حتى تركيز البروتين النهائي هو 1 ميكروغرام / ميكرولتر باستخدام غشاء الترشيح الفائق.
    25. تحقق عملية تنقية من قبل الكهربائي أداء باستخدام 1 ميكروغرام من العينة مزال.
    26. هلام صمة عار مع حل تلطيخ المتاحة تجاريا لتأكيد تنقية SIRT2.
    27. الحفاظ SIRT2 النقي في -80 درجة مئوية.
  2. تنقية الأسيتيل البروتين الركيزة
    1. إعداد 10 سم × أطباق ثقافة 10 سم مع خلايا كلوة 293T أن يكون حوالي 70٪ متكدسة في اليوم التالي.
    2. الخلايا اليوم التالي، وشارك في transfect مع 5 ميكروغرام من العلم الموسومة البلازميد ناقلات expressinز-الركيزة البروتين وكذلك 5 ميكروغرام من أسيتيل ترانسفيراز المحددة التي يمكن acetylate البروتين باستخدام جزيرة الأمير إدوارد في نسبة 3 ميكرولتر جزيرة الأمير إدوارد / ميكروغرام الحمض النووي.
      ملاحظة: إذا لم يعرف أسيتيل ترانسفيراز محددة، وشارك في transfect مع خليط من هيستون المعروف أسيتيل ترانسفيراز (القبعات) مثل P300، الجمارك وحماية الحدود، GCN5، Tip60 وPCAF.
    3. تغيير المتوسطة بعد 12 ساعة.
    4. قبل يوم واحد الناشر الخلايا، وعلاج الخلايا مع 1 ميكرومتر TSA و 2 نيكوتيناميد ملي (NAM) بين عشية وضحاها عن طريق استبدال مستنبت مع المتوسط ​​تحتوي على TSA / NAM لتعظيم مستويات أستلة من البروتين الركيزة عن طريق تثبيط deacetylases.
    5. 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة مستنبت، وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني وجمع الخلايا عن طريق trypsinization تليها الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    6. ليز خلية بيليه في 500 ميكرولتر العازلة تحلل وفي طبق (20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 18 ملي بوكل، 0.2 ملي EGTA، 1.5 ملي MgCl2، 20٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40) بما في ذلك البروتيني طnhibitors كوكتيل، 1 ميكرومتر TSA و 2 حركة عدم الانحياز ملي لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية تحت دوران مستمر.
    7. أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، ونقل طاف لأنبوب جديد.
    8. أداء مناعي باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة العلم مترافق إلى الاغاروز الخرز كما هو موضح أدناه.
      1. إضافة 200-300 ميكرولتر من مكافحة العلم الأجسام المضادة مترافق إلى الاغاروز الخرز لالمحللة البروتين (10-20 ملغ البروتين الكلي).
      2. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الإثارة مستمر.
      3. جمع immunoprecipitates بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
      4. يغسل بيليه 2 مرات مع 10 مل تحلل عازلة في 1000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بعد كل غسل، بيليه الخرز واستبدال طاف مع العازلة تحلل أ.
      5. يغسل بيليه 3 مرات مع 10 مل تحلل عازلة ألف بدون حركة عدم الانحياز في 1000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بعد كل غسل، بيليه الخرز واستبدال طاف مع العازلة تحلل A. ومن importaالإقليم الشمالي بعدم ترحيل أي حركة عدم الانحياز إلى رد فعل deacetylation.
    9. إعداد 1X حل العلم الببتيد (بما في ذلك مثبطات الأنزيم البروتيني و 1 ميكرومتر TSA في برنامج تلفزيوني).
    10. إضافة 500 ميكرولتر من 1X العلم حل الببتيد إلى حبات الاغاروز واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية تحت دوران مستمر.
    11. جمع طاف بواسطة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    12. كرر الخطوتين السابقتين.
    13. إزالة حبات من طاف باستخدام أنابيب مرشح والطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    14. باستخدام غشاء الترشيح الفائق، والتركيز عينة مزال حتى تركيز البروتين هو 1 ميكروغرام / UL.
    15. أداء الكهربائي عن طريق تشغيل 1 ميكرولتر من العينة مزال على 4-12٪ هلام SDS-PAGE.
    16. تأكيد أستلة من البروتين الركيزة التي النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة ضد التيار المتردد-K (1: 1000 تمييع) والبروتين الركيزة (تخفيف يعتمد على الأجسام المضادة المحددة المستخدمة).
    17. الحفاظ بوريالأسيتيل fied البروتين الركيزة عند -80 درجة مئوية.
  3. في المختبر Deacetylation رد الفعل
    1. إعداد المخزن المؤقت deacetylation ب (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم MgCl 2 0.5 ميكرومتر TSA)
    2. إعداد 3 ردود فعل مختلفة في أنابيب مختلفة في 20 الحجم النهائي ميكرولتر (الجدول 1).
    3. تشمل ردود الفعل إضافية لتأكيد deacetylation من البروتين الركيزة التي SIRT2 (اختياري). إضافة 2 ميكروغرام من deacetylation النقي SIRT2 متحولة فارغة (وهذا يمكن أن يتم ذلك باستخدام بروتوكول وصفها في 1.1 بعد استخدام lentivector pCDH-بورو-GFP-SIRT2 H187Y -Flag) إلى رد فعل بدلا من deacetylase SIRT2 نشطة أو إضافة 10 ملي نيكوتيناميد (NAM ) إلى رد فعل لكبح النشاط deacetylation من SIRT2 (الجدول 1).
    4. احتضان ردود الفعل لمدة 3 ساعة على 30 درجة مئوية في إطار التحريض المستمر.
    5. وقف رد الفعل من خلال إضافة 20 ميكرولتر من عينة العازلة 2X وتغلى العينات وأو 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية.
    6. أداء الكهربائي عن طريق تشغيل خليط التفاعل على 4-12٪ هلام SDS-PAGE والكشف عن حالة أستلة من البروتين الركيزة التي النشاف الغربية باستخدام التيار المتردد-K الأضداد المضادة (1: 1000 تمييع) 19،20.

2. في فيفو Deacetylation الفحص

  1. SIRT2 Overexpression في الخلايا المستزرعة
    1. إعداد أطباق 10 سم الثقافة مع خلايا كلوة 293T overexpressing ثابت متجه pCDH-بورو-GFP فارغة، pCDH-بورو-GFP-SIRT2-العلم وpCDH-بورو-GFP-SIRT2 H187Y -Flag (كما هو موضح في 1.1) إلى أن حوالي 70 ٪ متموجة.
    2. بدلا من ذلك، وإعداد أطباق 10 سم والثقافة مع خلايا حوالي 70٪ متموجة وأداء overexpression عابرة استخدام 5 ميكروغرام من ناقلات المذكورة أعلاه باستخدام جزيرة الأمير إدوارد في نسبة 3 ميكرولتر جزيرة الأمير إدوارد / ميكروغرام الحمض النووي.
    3. أداء النشاف الغربي من إجمالي مقتطفات الخلوية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة العلم (1: 1000 تمييع) لإثبات overexpression من العلم تيagged SIRT2 19.
  2. RNA التدخل لضربة قاضية SIRT2 في الخلايا المستزرعة
    1. إعداد طبق ثقافة 10 سم من الخلايا 293T كلوة أن يكون حوالي 70٪ متكدسة في اليوم التالي.
    2. في اليوم التالي، وشارك في transfect 4 ميكروغرام pLKO1-بورو-SH SIRT2 (lentivector) 19، 4 ميكروغرام pCMV- dR8.2 dvpr (ناقلات التعبئة والتغليف) و 0.5 ميكروغرام pCMV-VSV-G (ناقلات المغلف) 18 باستخدام polyethylenimine (PEI) في نسبة 3 ميكرولتر جزيرة الأمير إدوارد / ميكروغرام الحمض النووي.
      ملاحظة: لهدمت SIRT2، ونحن نستخدم shRNAs القاسي بسيطة في ناقلات pLKO.1 lentiviral صممها رني كونسورتيوم (TRC).
    3. اتبع الإجراء كما هو موضح في 1.1 لإنتاج shSIRT2 الفيروسة البطيئة وتصيب الخلايا المستهدفة لضربة قاضية SIRT2.
    4. أداء النشاف الغربي من إجمالي مقتطفات الخلوية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة SIRT2 (1: 1000 تمييع) لإثبات كفاءة ضربة قاضية SIRT2 بعد تشغيل 40 ميكروغرام من البروتين الكلي على 10٪ هلام SDS-PAGE.
    5. بدلا من ذلك،إعداد أطباق 10 سم والثقافة مع خلايا حوالي 70٪ متموجة وتنفيذ ضربة قاضية عابرة من SIRT2 باستخدام الرناوات siRNAs باتباع تعليمات الشركة الصانعة.
    6. أداء النشاف الغربي من إجمالي مقتطفات الخلوية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة SIRT2 (1: 1000 تمييع) لإثبات كفاءة ضربة قاضية SIRT2 بعد تشغيل 40 ميكروغرام من البروتين الكلي على 10٪ هلام SDS-PAGE.
  3. مناعي وImmunoblotting للكشف عن مستويات الأسيتيل في الخلايا المستزرعة
    1. 12 ساعة قبل جمع الكريات خلية من خلايا إما overexpressing SIRT2 (انظر 2.1 أعلاه) أو طرقت SIRT2 أسفل الخلايا (انظر 2.2 أعلاه)، إضافة 1 ميكرومتر TSA إلى مستنبت لمنع عدم الدرجة الثالثة deacetylases هيستون.
    2. إزالة مستنبت، وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني وجمع الخلايا عن طريق trypsinization تليها الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. إضافة 10 مل تحلل عازلة ألف (20 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.9، 18 ملي بوكل، 0.2 ملي EGTA، 1.5ملي MgCl 20٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40) بما في ذلك كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني، TSA 1 ميكرومتر و 2 حركة عدم الانحياز ملم.
    4. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت دوران مستمر.
    5. جمع supernatants بواسطة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    6. حساب تركيز البروتين باستخدام البروتين مقايسة برادفورد.
    7. نقل 1 ملغ من البروتين الكلي لأنابيب جديدة في الحجم النهائي من 1 مل باستخدام العازلة تحلل A. استخدام الجدول 2 كمرجع لإعداد عينات البروتين من الخلايا إما overexpressing SIRT2 أو بعد ضربة قاضية SIRT2.
    8. إجراء مناعي استخدام أجسام مضادة ضد بروتين الركيزة محددة جنبا إلى جنب مع بروتين A / G (ويوصى 40 ميكرولتر حبة الطين). بدلا من ذلك، استخدام الأجسام المضادة ميلان-K مكافحة مترافق إلى الاغاروز الخرز (20 ميكرولتر حبة الطين عادة بما فيه الكفاية) لimmunoprecipitate جميع البروتينات الأسيتيل.
    9. احتضان العينات عند 4 درجات مئوية تحت CONSTAالإقليم الشمالي التناوب بين عشية وضحاها.
    10. جمع immunoprecipitates بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    11. تغسل حبات 5 مرات مع 1 مل العازلة وفي 1000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    12. حبات Resuspend في 40 ميكرولتر من عينة العازلة 2X.
    13. عينات يغلي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية.
    14. أداء الكهربائي عن طريق تشغيل عينات مزال (40 ميكرولتر من الخطوة 2.3.12) على 4-12٪ هلام SDS-PAGE دون إزعاج الخرز أثناء نقل العينات مزال.
    15. كشف عن مستويات الأسيتيل من البروتين الركيزة قبل الغرب النشاف باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة التيار المتردد-K (1: 1000 تمييع) إذا تم استخدام الأجسام المضادة المحددة البروتين الركيزة للمناعي، أو الأجسام المضادة المحددة ضد البروتين الركيزة (متابعة توصيات ل الأجسام المضادة بشأن تخفيف معين) إذا استخدمت حبات المضادة ميلان-K للمناعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من أجل البروتين إلى اعتبار الهدف deacetylation الشرعي لأي إنزيم مع النشاط deacetylation، على حد سواء في التجارب المختبرية وفحوصات deacetylation المجراة تحتاج إلى القيام بها لإقامة التفاعل بين deacetylase وركيزة لها. لفي المختبر deacetylase الفحص، مطلوب تنقية كل من deacetylase والركيزة البروتين الأسيتيل قبل ويمكن أن يتم الفحص. نحن هنا استخدام SIRT2 sirtuin حشوية كما deacetylase محددة لدراستها. SIRT2 هو انزيم deacetylase واستخدام المسخ الذي يفتقر إلى النشاط deacetylase ينصح بشدة كعنصر تحكم السلبية للمقايسة deacetylation. باستخدام الإجراء تنقية وصفها في 1.1، سواء SIRT2 وSIRT2 H187Y يمكن تنقيته بنجاح بتركيز نهائي من 1 ميكروغرام / ميكرولتر. ويمكن التأكد من ذلك بعد تشغيل تنقية البروتينات على هلام تليها تلطيخ(الشكل 1A، والجزء العلوي)، وكذلك بعد النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة العلم منذ يتم تمييزها على حد سواء SIRT2 وSIRT2 H187Y مع الببتيد العلم (الشكل 2A، أقل). يمكن أن يتبع الإجراء تنقية نفسه لتنقية الركيزة البروتين مع بعض التعديلات. يحتاج البروتين لأن الأسيتيل قبل أنها يمكن أن تستخدم لفحص deacetylation مما يعني أنه يحتاج إلى تنقيته في خلايا overexpressing لترانسفيراز الاسيتيل معينة أو خليط من القبعات قادرة على acetylate البروتين. باستخدام الإجراء تنقية وصفها في 1.2، البروتين الأسيتيل يمكن تنقيته (الشكل 1B، العلوي). للتأكد من أن البروتين هو الأسيتيل في الواقع، ويمكن استخدامها لفي المختبر deacetylation الفحص، النشاف الغربية باستخدام التيار المتردد-K الأضداد المضادة ضروري لإظهار زيادة مستويات الأسيتيل من البروتين النقي في خلايا overexpressing للأسيتيل ترانسفيراز (الشكل 1B، لويص).

بعد تنقية البروتين ناجحة، في المختبر deacetylation الفحص لا يمكن أن يؤديها. Sirtuins، بما في ذلك SIRT2، هي من الدرجة الثالثة deacetylases هيستون يسين التي تختلف عن deacetylases أخرى، إذ أنها تتطلب NAD + لوظيفتها الأنزيمية. واتساقا مع ذلك، يمكن الكشف عن أي deacetylation بواسطة النشاف الغربية باستخدام التيار المتردد-K الأضداد المضادة في غياب NAD بغض النظر عن وجود SIRT2 نشاطا تحفيزيا (الشكل 2، 2 لين مقابل 1). على العكس من ذلك، انخفضت مستويات الأسيتيل من البروتين الأسيتيل عند كل SIRT2 وNAD + موجودة في رد فعل تشير إلى أن البروتين يمكن اعتباره هدفا deacetylation لSIRT2. من أجل التحقق من هذه النتائج، وضوابط سلبية مختلفة يمكن استخدامها. على سبيل المثال يمكن الكشف عن أي اختلاف في مستويات deacetylation من البروتين عندما SIRT2 نقص deacetylation (SIRT2 H1يستخدم 87Y) بدلا من النوع البري نشاطا تحفيزيا SIRT2 (الشكل 2، حارة 5 مقابل 4). ويمكن رؤية تأثير مماثل عندما المانع sirtuin راسخة، حركة عدم الانحياز، يضاف إلى خليط التفاعل، مما يعني أن الانخفاض في مستويات الأسيتيل من البروتين بوساطة النشاط deacetylase من SIRT2.

وتشارك deacetylation الشاذة في العديد من العمليات الخلوية والأمراض المرتبطة بالعمر. وهكذا، خطوة حاسمة في تعميق معرفتنا بشأن التفاعل بين deacetylase وركيزة لها في إقامة هذا الربط في الخلايا حيث قد يكون هذه الظاهرة لها تأثير الفسيولوجية. وعلاوة على ذلك، والتحقق من deacetylation في أنظمة زراعة الخلايا في الجسم الحي يسمح دراسة حالة deacetylation في الخلايا او الانسجة سياق محدد والتي يمكن ان تكون مرتبطة بسهولة أكبر إلى النمط الظاهري أو نتائج محددة. هذا يستبعد إمكانية أن الكشف في deac المختبرالنشاط etylation مصطنع بسبب وجود كل من deacetylase وركيزة لها في الأنبوب في الوقت نفسه، والذي قد لا يحدث في ظل ظروف فسيولوجية طبيعية في الخلايا. لفي الجسم الحي deacetylation فحص خلايا overexpressing كلا SIRT2 وSIRT2 H187Y وكذلك الركيزة البروتين يمكن استخدامها وفقا للإجراءات وصفها في 2.1 و 2.2. مقتطفات خلية أعدت من هذه الخلايا يمكن تأكيده للتعبير عن SIRT2، SIRT2 H187Y، والركيزة البروتين النشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة. في مقايسة الموصوفة هنا، والموسومة البروتينات جميعا عن خارجيا لسهولة التجارب أجريت (الشكل 3، اللوحة السفلى للكشف عن SIRT2 الموسومة HA / SIRT2 H187Y ووسط لوحة للكشف عن العلم الموسومة الركيزة البروتين). لتحديد ما إذا كان البروتين المستهدف هو الركيزة deacetylation من SIRT2، يتم تنفيذ مناعي باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة العلم إلى هدم البروتين المستهدف وollowed بواسطة النشاف الغربية باستخدام التيار المتردد-K الأضداد المضادة. انخفاض في مستويات الأسيتيل من البروتين في الخلايا معربا عن SIRT2 (الشكل 3 اللوحة العليا، حارة 3 مقابل 2)، وفشل في التأثير في مستويات الأسيتيل في الخلايا معربا عن deacetylase نقص متحولة SIRT2 (الشكل 3 اللوحة العليا، حارة 4 مقابل 3) تشير إلى أن البروتين الأسيتيل يمكن أن يكون هدفا deacetylation من deacetylase محددة في الجسم الحي. ويمكن التأكد من ذلك أيضا عندما يتم تثبيط deacetylation بوساطة SIRT2 بعد علاج الخلايا مع حركة عدم الانحياز (الشكل 3 اللوحة العليا، حارة 5 مقابل 3) إنشاء محور محددة deacetylase الركيزة في الخلايا المدروسة.

الشكل 1
الشكل 1: تنقية من كل من deacetylase والأسيتيل البروتين الركيزة لاستخدامها في المختبر deacetylation فحصوتم تشغيل (A) 1 ميكروغرام لكل من SIRT2 وSIRT2 H187Y (deacetylation معيب متحولة) على هلام بعد بروتوكول تنقية كما هو موضح في 1.1. كانت ملطخة الجل مع الحل تلطيخ المتاحة تجاريا وبعد destaining، وكلاهما يمكن أن يتم الكشف عن البروتينات النقاء (العلوي). ويمكن الكشف عن البروتينات بعد نقل في الغشاء PVDF والنشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة العلم (أقل). (ب) 1 ميكروغرام من الركيزة البروتين وفرط الأسيتيل الركيزة البروتين (تم استخدام ألفا إينولاز باعتبارها الركيزة SIRT2 بناء على بيانات غير منشورة مطياف الكتلة ولدت في مختبرنا) تم تشغيلها على هلام بعد بروتوكول تنقية كما هو موضح في 1.2. كانت ملطخة الجل مع الحل تلطيخ المتاحة تجاريا وبعد destaining، يمكن الكشف عن الركيزة البروتين المنقى (العلوي). ويمكن الكشف عن أستلة بعد نقل في الغشاء PVDF والنشاف الغربية باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة التيار المتردد-K (وسط). إجمالي ص ويمكن الكشف عن roteins باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة العلم (أقل). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
والمحتضنة في فحص deacetylation المختبر تنقية الركيزة البروتين الأسيتيل (ألفا إينولاز) مع SIRT2 أو SIRT2 H187Y (deacetylation معيب متحولة) في وجود NAD + (الممرات 4 و 5): رقم 2. تم الكشف عن انخفاض مستويات الأسيتيل من النشاف الغربية باستخدام التيار المتردد-K الأضداد المضادة في وجود SIRT2 ولكن ليس في وجود SIRT2 H187Y (حارة 4 مقابل 5). ويلاحظ أي نشاط deacetylation عندما لا يتم تضمين NAD + في خليط التفاعل (حارة 2 ضد 4) أو عند إضافة الحركة إلى خليط التفاعل (حارة 6 مقابل 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): في الجسم الحي deacetylation فحص خلايا HEK293T overexpressing مستقر إما SIRT2 أو SIRT2 H187Y وقد شارك في transfected مع الركيزة البروتين (ألفا إينولاز) والقبعات لزيادة مستويات الأسيتيل من البروتين (حارة 2 مقابل 1). تم فحص Deacetylation في الجسم الحي بعد مناعي باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة العلم لهدم الركيزة البروتين والنشاف الغربية باستخدام التيار المتردد-K الأضداد المضادة. وانخفض أستلة بشكل كبير في الخلايا overexpressing SIRT2 بالمقارنة مع SIRT2 H187Y overexpressing الخلايا (حارة 3 مقابل 4). وdeacetylation بوساطة SIRT2الركيزة البروتين هو مستعمل عندما يتم التعامل مع خلايا حركة عدم الانحياز (حارة 5 مقابل 3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ردود الفعل 1 2 3 4 (اختياري) 5 (اختياري)
النقاء الأسيتيل البروتين الركيزة (10 ميكروغرام) + + + + +
B العازلة + + + + +
SIRT2 النقي (2 ميكروغرام) - + + - +
NAD + (1 mΜ) - - + + +
H187Y SIRT2 النقي (2 ميكروغرام) - - - + -
حركة عدم الانحياز (10 ملم) - - - - +

الجدول 1: المكونات رد الفعل.

عينات overexpression صرع
1 pCDH-بورو-GFP فارغة ناقلات pLKO1 ناقلات فارغة أو للحد من الخطر الاشتراكية
2 pCDH-بورو-GFP-SIRT2-العلم pLKO1 ش SIRT2 1 أو الاشتراكية SIRT2 1
3 pCDH-بورو-GFP-SIRT2 H187Y -Flag pLKO1 ش SIRT2 2 أو الاشتراكية SIRT2 2

الجدول 2: البروتين العينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد المشروع هو موضح هنا عن طريق منحة من المعاهد الوطنية للصحة / NCI (NCI-R01CA182506-01A1)، وكذلك من قبل H. لوري مركز روبرت الشامل للسرطان - وLefkofsky الأسرة مؤسسة / ليز وجائزة البحث اريك Lefkofsky الابتكار لAV نود أن أشكر أعضاء المختبر (كارول اوكالاهان وإليزابيث آن اين) لقراءة نقدية وتحرير هذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
  2. Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modifications by extracellular stimuli. Molecular Cell. 19, 581-593 (2005).
  3. Philp, A., Rowland, T., Perez-Schindler, J., Schenk, S. Understanding the acetylome: translating targeted proteomics into meaningful physiology. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307, C763-C773 (2014).
  4. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51, 786-794 (1964).
  5. Shahbazian, M. D., Grunstein, M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annual Review of Biochemistry. 76, 75-100 (2007).
  6. L'Hernault, S. W., Rosenbaum, J. L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly. The Journal of Cell Biology. 97, 258-263 (1983).
  7. Kim, S. C., et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Molecular Cell. 23, 607-618 (2006).
  8. Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325, 834-840 (2009).
  9. Smith, K. T., Workman, J. L. Introducing the acetylome. Nature Biotechnology. 27, 917-919 (2009).
  10. Roth, S. Y., Denu, J. M., Allis, C. D. Histone acetyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 70, 81-120 (2001).
  11. Ozden, O., et al. Acetylation of MnSOD directs enzymatic activity responding to cellular nutrient status or oxidative stress. Aging. 3, 102-107 (2011).
  12. Anderson, K. A., Hirschey, M. D. Mitochondrial protein acetylation regulates metabolism. Essays in Biochemistry. 52, 23-35 (2012).
  13. Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S., Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10224-10229 (2006).
  14. Haberland, M., Montgomery, R. L., Olson, E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nature Reviews. Genetics. 10, 32-42 (2009).
  15. Finkel, T., Deng, C. X., Mostoslavsky, R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature. 460, 587-591 (2009).
  16. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, 225-238 (2012).
  17. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15, 536-550 (2014).
  18. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501 (2003).
  19. Kim, H. S., et al. SIRT2 maintains genome integrity and suppresses tumorigenesis through regulating APC/C activity. Cancer Cell. 20, 487-499 (2011).
  20. Zhang, H., et al. SIRT2 directs the replication stress response through CDK9 deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13546-13551 (2013).
  21. Weinert, B. T., et al. Proteome-wide mapping of the Drosophila acetylome demonstrates a high degree of conservation of lysine acetylation. Science Signaling. 4, ra48 (2011).
  22. Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. The Journal of Biological Chemistry. 288, 26209-26219 (2013).
  23. Sadoul, K., Wang, J., Diagouraga, B., Khochbin, S. The tale of protein lysine acetylation in the cytoplasm. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 970382 (2011).
  24. Preble, J. M., et al. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. e51682 (2014).
  25. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (2011).
  26. He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics