Deacetylation فحوصات لكشف تفاعل بين Sirtuins (SIRT2) ومحددة البروتين ركائز

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تنفيذ فحوصات إزالة الأسيتيل في المختبر وفي الجسم الحي من أجل تحديد دور البروتينات كركائز إزالة الأسيتيل المحددة للسيرتوينات. على الرغم من العدد المتزايد من البروتينات التي وجد أنها أسيتيل ، مما يدعو إلى وجود واسع النطاق للأستيلات ، لم يتم تحديد إنزيمات معينة تنظم هذه التعديلات لمعظم هذه البروتينات. الميزة الرئيسية لهذه المقايسات هي أنه من خلال إنشاء بروتين كركيزة شرعية لديستيلاز معين ، يمكن الكشف عن الأدوار والوظائف الجديدة للديستيلاز.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتحديد الركيزة الخاصة بالسيرتوين 2 ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها ، مع تعديلات طفيفة ، على أعضاء آخرين من عائلة سيرتوين. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد طبق ثقافة 10 سم من خلايا HEK 293 T في ثمانية ملليلتر من DMEM ، مع 10٪ FBS في المضادات الحيوية بحيث تكون الخلايا حوالي 70٪ ملتقية بعد النمو بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا بما يلي: أربعة ميكروغرامات من العدسات ، معبرة عن GFP و SIRT2 الموسومة ب FLAG ، وأربعة ميكروغرامات من ناقل التغليف و 0.5 ميكروغرام من ناقل المغلف.

استخدم بولي إيثيلينيمين، أو PEI، بنسبة ثلاثة ميكرولترات من PEI لكل ميكروغرام من الحمض النووي. بعد 12 ساعة من التعداد، قم بتغيير الوسط. بعد 36 إلى 48 ساعة، اجمع المادة الطافية.

قم بإزالة الحطام عن طريق الطرد المركزي عند 1,000 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، قم بعمل مليلتر واحد من فيروس العدسات SIRT2 ، وقم بتخزينه عند سالب 80 درجة مئوية. عندما تكون جاهزا لإصابة الخلايا ، قم بإذابة فيروس العدسات SIRT2 على الجليد.

تصيب صفيحة من ستة آبار من 80 إلى 90٪ خلايا HEK 293 T ملتصقة بملليلتر واحد من فيروس العدسات في وجود ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر من Polybrene. ضع الخلايا المصابة بالفيروس في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط.

بعد 48 ساعة من الإصابة ، تحقق من كفاءة العدوى عن طريق اكتشاف الخلايا الإيجابية ل GFP تحت المجهر الفلوري. إذا كانت كفاءة العدوى لا تقل عن 40 إلى 50٪ ، فاستبدل الوسط بوسط مزرعة يحتوي على ميكروغرامين لكل مليلتر من Puromycin لاختيار خلايا SIRT2 المستقرة التي تفرط في التعبير. أعد الخلايا إلى الحاضنة.

سيستغرق اختيار خلايا SIRT2 المستقرة التي تفرط في التعبير حوالي أسبوعين ، ويجب تغيير الوسيط كل ثلاثة إلى أربعة أيام. لتنقية SIRT2 ، قم بإعداد ما لا يقل عن 10 أطباق بطول 10 سنتيمترات من خلايا HEK 293 T التي تعبر عن FLAG SIRT2. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة وسط الثقافة ، واغسل الخلايا مرتين في PBS وجمع الخلايا عن طريق التربسين ، متبوعا بالطرد المركزي عند 1 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

قم بتحلل حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من محلول التحلل A لكل طبق يتضمن كوكتيلا مثبطا للبروتياز وميكرومولار واحد من TSA ، وهو مثبط هيستون ديستيلاز غير من الفئة الثلاثة. احتضن لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية تحت الدوران المستمر. بعد 30 دقيقة ، جهاز الطرد المركزي عند 14،000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. قم بإجراء الترسيب المناعي باستخدام جسم مضاد مضاد ل FLAG مترافق مع حبات الاغاروز. أضف 200 إلى 300 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل FLAG إلى محللة البروتين واحتضنه عند أربع درجات مئوية مع تحريك مستمر طوال الليل.

في اليوم التالي ، اجمع الرواسب المناعية عن طريق الطرد المركزي عند 1 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. اغسل الحبيبات خمس مرات باستخدام 10 ملليلتر من محلول التحلل A.بعد الغسيل الخامس ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف 500 ميكرولتر من محلول الببتيد X FLAG الذي يتضمن كوكتيل مثبط للبروتياز و TSA إلى حبات الاغاروز. احتضان عند أربع درجات مئوية ، تحت الدوران المستمر ، لمدة 30 دقيقة.

اجمع المادة الطافية عن طريق الطرد المركزي عند 6000 جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة حبات الاغاروز من المادة الطافية باستخدام أنابيب الترشيح والطرد المركزي عند 15،000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. أخيرا ، استخدم غشاء الترشيح الفائق لتركيز العينة المخفوطة حتى يصبح تركيز البروتين النهائي ميكروغراما واحدا لكل ميكرولتر.

حافظ على SIRT2 المنقى عند سالب 80 درجة مئوية. ابدأ هذا الإجراء بإعداد 10 أطباق استزراع بحجم 10 سم من خلايا HEK 293 T ، بحيث تكون حوالي 70٪ ملتقية في اليوم التالي. في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا بخمسة ميكروغرامات من مصاب البلازما الموسومة ب FLAG الذي يعبر عن ركيزة البروتين وخمسة ميكروغرامات من أسيتيل ترانسفيراز المحدد الذي يمكنه أسيتيل البروتين.

إذا كان الأسيتيل ترانسفيراز المحدد غير معروف ، فاستخدم مزيجا من أسيتيل ترانسفيراز الهيستون المعروف. استخدم PEI بنسبة ثلاثة ميكرولتر من PEI لكل ميكروغرام من الحمض النووي. احتضان الخلايا المنقولة لمدة 12 ساعة.

ثم قم بتغيير الوسيط واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة. عالج الخلايا بميكرومولار TSA واحد ومليمولار نيكوتيناميد لمدة 12 ساعة عن طريق استبدال وسط المزرعة بوسط يحتوي على TSA والنيكوتيناميد. سيؤدي ذلك إلى زيادة مستويات الأستلة في ركيزة البروتين عن طريق تثبيط الديستيلاز.

بعد 48 ساعة من التعداء ، قم بإزالة وسط الثقافة وغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. اجمع الخلايا عن طريق التربسين ، متبوعا بالطرد المركزي عند 1000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. لتحلل حبيبات الخلية ، أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل A لكل طبق ، والذي يتضمن كوكتيل مثبط للبروتياز ، وميكرومولار TSA واثنين من نيكوتيناميد المليمولار ، واحتضانه عند أربع درجات مئوية ، تحت دوران مستمر ، لمدة 30 دقيقة.

جهاز طرد مركزي عند 14 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. قم بإجراء الترسيب المناعي باستخدام جسم مضاد مضاد ل FLAG مترافق مع حبات الاغاروز ، كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد تركيز العينة المخفوطة على ميكروغرام واحد لكل مليلتر ، حافظ على ركيزة البروتين الأسيتيل المنقى عند سالب 80 درجة مئوية.

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول في تأكيد تنقية ركيزة البروتين الأسيتيل بواسطة البروتين ، باستخدام جسم مضاد خاص بالبروتين وجسم مضاد مضاد للأستيلات قبل تفاعل إزالة الأسيتيل في المختبر. قبل بدء تفاعل نزع الأسيتيل في المختبر ، قم بإعداد عازلة نزع الأسيتيل B. بعد ذلك ، قم بإعداد ثلاثة تفاعلات في ثلاثة أنابيب مختلفة ، كل منها بحجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولترا ، كما هو موضح في هذا الجدول. تحتوي جميع الأنابيب الثلاثة على ركيزة بروتين أسيتيل منقى ومخزن مؤقت إزالة الأسيتيل B ، لكن الأنبوب الثاني يحتوي أيضا على SIRT2 المنقى ، ويحتوي الأنبوب الثالث أيضا على SIRT2 و NAD plus المنقى.

لتأكيد نزع الأسيتيل لركيزة البروتين بواسطة SIRT2 ، يمكن تضمين تفاعل رابع اختياري ، حيث يتم إضافة طفرة فارغة منقاة من SIRT2 بدلا من SIRT2 النشط من deacetylase. احتضان التفاعلات عند 30 درجة مئوية تحت تحريض مستمر لمدة ثلاث ساعات. أوقف التفاعلات بإضافة 20 ميكرولترا من عينتين من عينتين X إلى كل أنبوب، وغلي العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، يتم تشغيل مخاليط التفاعل على هلام صفحة SDS من أربعة إلى 12٪ ، ويتم الكشف عن حالة الأستلة لركيزة البروتين عن طريق النشاف الغربي ، باستخدام جسم مضاد ضد الأسيتيل ليسين الأسيتيل. باستخدام هذا البروتوكول ، تم تنقية SIRT2 من النوع البري وطفرة معيبة إزالة الأسيتيلاسیون ، SIRT2 Hi87Y بتركيز نهائي قدره ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر. نظرا لأن كلا البروتينين تم تمييزهما بببتيد FLAG ، يمكن تأكيد التنقية عن طريق النشاف المناعي ، باستخدام جسم مضاد مضاد ل FLAG.

كما تم تنقية ركيزة البروتين وركيزة البروتين الأسيتيل. أكد النشاف المناعي باستخدام جسم مضاد للأسيتيل ليسين زيادة مستويات الأسيتيل للبروتين المنقى في الخلايا التي تفرط في التعبير عن الأسيتيل ترانسفيراز. تم الكشف عن البروتينات الكلية باستخدام جسم مضاد مضاد ل FLAG.

في مقايسة نزع الأسيتيل في المختبر ، عندما تم احتضان ركيزة البروتين الأسيتيل المنقى ب SIRT2 من النوع البري أو الطفرة المعيبة لنزع الأسيتيل في وجود NAD plus ، تم الكشف عن انخفاض مستويات الأسيتيل عن طريق النشاف المناعي ، باستخدام جسم مضاد مضاد للأسيتيل ليسين في وجود SIRT2 ، ولكن ليس في وجود الطفر. لم يلاحظ أي نشاط إزالة الأسيتيل عندما لم يتم تضمين NAD plus في خليط التفاعل ، مما يؤكد أن SIRT2 يتطلب NAD plus لوظيفته الأنزيمية. تم تثبيط نزع الأسيتيل أيضا عند إضافة مثبط سيرتوين ، NAM ، إلى خليط التفاعل ، مما يعني أن الانخفاض في مستويات الأسيتيل للبروتين يتم بوساطة نشاط ديستيلاز SIRT2.

من أجل اعتبار البروتين هدفا لإزالة الأسيتيل لأي إنزيم ، يجب إجراء مقايسة إزالة الأسيتيل في المختبر وفي الجسم الحي لإنشاء التفاعل بين deacetylase وكل ركيزة. يمكن أن توفر فحوصات نزع الأسيتيل في الجسم الحي في الخلايا في ظل ظروف تجريبية محددة مزيدا من التبصر فيما يتعلق بالتفاعل بين deacetylase والركيزة المحتملة في السيناريوهات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية ، وتحديد الدور الوظيفي لحدث deacetylation ، في سياق فسيولوجي. نظرا للاهتمام المتزايد فيما يتعلق بدور السيرتوين في تنظيم العمليات الخلوية المتنوعة ، يمكن استخدام فحوصات إزالة الأسيتيل الموصوفة مع تعديلات طفيفة لتحديد ركائز جديدة لأعضاء آخرين في عائلة السيرتوين ، بغض النظر عن توطينها تحت الخلوية.

يمكن دمج كل من فحوصات إزالة الأسيتيل في المختبر وفي الجسم الحي التي يتم إجراؤها بواسطة deacetylases محددة مع تحليل قياس الطيف الكتلي على نطاق صغير للكشف عن اللايسينات المستهدفة على الركيزة لتمييز مواقع الأستلة الوظيفية عن الليسينات الأسيتيل غير التنظيمية.