Deacetylering Analyser til Løs Samspil mellem sirtuins (SIRT2) og specifikt protein-substrater

* These authors contributed equally
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Song, H. Y., Park, S. H., Kang, H. J., Vassilopoulos, A. Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates. J. Vis. Exp. (108), e53563, doi:10.3791/53563 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. In vitro Deacetylering assay

  1. Oprensning af SIRT2
    1. Der fremstilles en 10 cm dyrkningsskål af HEK 293T celler dyrket i 8 ml DMEM med 10% FBS og antibiotika og dyrket i en 37 ° C, 5% CO2 vævsdyrkningsinkubator at være ca. 70% sammenflydende den næste dag.
    2. Den næste dag, co-transficere 4 ug pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag (lentivector fremstillet i vores laboratorium), 4 ug pCMV dR8.2 dvpr (emballage vektor) og 0,5 ug pCMV-VSV-G (kuvert vektor) 18 under anvendelse af polyethylenimin (PEI) i et forhold på 3 pi PEI / ug DNA.
    3. Skift medier efter 12 timer.
    4. Saml supernatanten efter 36-48 timer.
    5. Fjerne snavs ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min ved 4 ° C.
    6. Efter filtrering gennem 0,22 um filtre, gør 1 ml portioner af SIRT2 lentivirus og holde ved -80 ° C.
    7. Tø SIRT2 lentivirus på is (det er vigtigt at opbevare viruset ved -80 ° C, når viruset ikke anvendes).
    8. Inficere en plade med 6 brønde på 80-90% sammenflydende HEK 293T-celler med 1 ml lentivirus i nærvær af 8 ug / ml polybren.
    9. Placer virusinficerede celler i 37 ° C inkubator indtil den næste dag (24 timer).
    10. Udskift medium efter 24 timer.
    11. 48 timer efter infektion, kontrollere infektion effektivitet ved påvisning GFP-positive celler under et fluorescensmikroskop.
    12. Hvis infektionseffektivitet er god (mindst 40-50% inficerede celler), udskiftes mediet med dyrkningsmedium indeholdende 2 ug / ml puromycin for at selektere for stabile SIRT2 løbet udtrykkende celler.
      Bemærk: Dette tager ca. 2 uger, og mediet skiftes hver 3-4 dage. Ikke-inficerede celler dør i løbet dette valg periode og kun inficerede celler med SIRT2 lentivirus vokse.
    13. Analyser ekspression af FLAG-mærket SIRT2 ved western blotting under anvendelse af et anti-Flag-antistof (1: 1.000 fortynding) efter at have kørt 40 ug totalt protein på en 10% SDS-PAGE-gel før start af purifgement proces (anbefales) 19,20.
    14. For at rense aktiv SIRT2, opdele celler i forholdet 1: 3 ved trypsinbehandling for at have nok retter af HEK 293T-celler stabilt overeksprimerer Flag-SIRT2 (Ti 10 cm skåle vil tillade rensning af nok protein til efterfølgende eksperimenter).
      1. At Trypsinisér cellerne fjernes dyrkningsmediet og fjerne resterende serum ved at skylle celler med sterile DPBS. Tilsæt langsomt 2,5 ml af en 0,25% trypsin-EDTA-opløsning for at dække cellemonolaget, inkuberes ved stuetemperatur i 30-45 sek. Efter fjernelse af trypsin-EDTA-opløsning, inkuberes ved 37 ° C, indtil cellerne begynder at løsne sig. Derefter tilsættes dyrkningsmedium og overføre celler til nye retter.
    15. Fjern dyrkningsmedium, vaskes cellerne to gange i PBS og indsamle celler ved trypsinisering efterfulgt af centrifugering ved 1000 xg i 10 min ved 4 ° C.
    16. Lyse cellepelleten i 500 pi lysis buffer A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCI, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 20% glycerol, 0,1% NP-40), der indbefatter en proteasehæmmere cocktail og 1 uM TSA i 30 minutter ved 4 ° C under konstant rotation.
    17. Centrifuger ved 14.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C og overførsel supernatant til et nyt rør.
    18. Udfør immunpræcipitation under anvendelse af et anti-Flag-antistof konjugeret til agarose beads som beskrevet nedenfor.
      1. Tilføj 200-300 pi anti-Flag-antistof konjugeret til agarose perler til protein lysatet (10-20 mg totalt protein).
      2. Inkuber natten over ved 4 ° C med konstant omrøring.
      3. Indsamle immunpræcipitater ved centrifugering ved 1000 x g i 5 min ved 4 ° C.
      4. Vask pelleten 5 gange med 10 ml lysis buffer A ved 1.000 xg i 5 min ved 4 ° C. Efter hver vask, pelletere kuglerne og erstatte supernatanten med buffer A.
    19. Forbered 1x Flag peptidopløsning (herunder en proteasehæmmere cocktail og 1 pM TSA i PBS).
    20. Tilføj 500 pi 1x Flag peptide løsning på agaroseperler og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C under konstant rotation.
    21. Samle bundfald ved centrifugering ved 6.000 x g i 2 minutter ved 4 ° C.
    22. Gentag to foregående trin.
    23. Fjern perler fra supernatanten ved hjælp af filterrør og centrifugering ved 15.000 x g i 1 min ved 4 ° C.
    24. Koncentrer eluerede prøve, indtil den endelige proteinkoncentration er 1 pg / pl anvendelse af en ultrafiltreringsmembran.
    25. Check rensningsprocessen ved udførelse af elektroforese under anvendelse af 1 ug af den eluerede prøve.
    26. Stain gel med en kommercielt tilgængelig farvning løsning til at bekræfte SIRT2 rensning.
    27. Hold oprenset SIRT2 ved -80 ° C.
  2. Oprensning af Acetyleret Protein-substrat
    1. Forbered 10 cm x 10 cm dyrkningsskåle med HEK 293T-celler til at være omkring 70% sammenflydende den næste dag.
    2. De næste dage, co-transfektion celler med 5 pg et Flag tagget plasmidvektor expressing protein-substrat samt 5 ug af den specifikke acetyl-transferase, som kan acetylere proteinet under anvendelse af PEI i et forhold på 3 pi PEI / ug DNA.
      Bemærk: Hvis den specifikke acetyl-transferase ikke er kendt, co-transficere med en blanding af kendte histon acetyl-transferaser (HATS) såsom p300, CBP, GCN5, TIP60 og PCAF.
    3. Skift medium efter 12 timer.
    4. Dagen før lyse af cellerne, behandle cellerne med 1 uM TSA og 2 mM nicotinamid (NAM) natten ved at erstatte dyrkningsmediet med medium indeholdende TSA / NAM at maksimere acetyleringsniveauer af proteinet-substrat ved at hæmme deacetylaser.
    5. 48 timer efter transfektion, fjerne dyrkningsmediet, vaskes cellerne to gange i PBS og indsamle celler ved trypsinisering efterfulgt af centrifugering ved 1.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
    6. Lyse cellepelleten i 500 pi lysis buffer A pr skål (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCI, 0,2 mM EGTA, 1,5 mM MgCl2, 20% glycerol, 0,1% NP-40), der indbefatter en protease inhibitors cocktail, 1 uM TSA og 2 mM NAM i 30 min ved 4 ° C under konstant rotation.
    7. Centrifuger ved 14.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C og overførsel supernatant til et nyt rør.
    8. Udfør immunpræcipitation under anvendelse af et anti-Flag-antistof konjugeret til agarose beads som beskrevet nedenfor.
      1. Tilføj 200-300 pi anti-Flag-antistof konjugeret til agarose perler til protein lysatet (10-20 mg totalt protein).
      2. Inkuber natten over ved 4 ° C med konstant omrøring.
      3. Indsamle immunpræcipitater ved centrifugering ved 1000 x g i 5 min ved 4 ° C.
      4. Vask pelleten 2 gange med 10 ml lysis buffer A ved 1.000 xg i 5 min ved 4 ° C. Efter hver vask, pelletere kuglerne og erstatte supernatanten med lysis buffer A.
      5. Vask pelleten 3 gange med 10 ml lysis buffer A uden NAM ved 1.000 xg i 5 min ved 4 ° C. Efter hver vask, pelletere kuglerne og erstatte supernatanten med lysis buffer A. Det er important ikke at overføre nogen NAM til deacetyleringsreaktion.
    9. Forbered 1x Flag peptidopløsning (herunder proteasehæmmere og 1 pM TSA i PBS).
    10. Der tilsættes 500 pi 1x Flag peptidopløsning til agaroseperlerne og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C under konstant rotation.
    11. Samle bundfald ved centrifugering ved 6.000 x g i 2 minutter ved 4 ° C.
    12. Gentag to foregående trin.
    13. Fjern perler fra supernatanten ved hjælp af filterrør og centrifugering ved 15.000 x g i 1 min ved 4 ° C.
    14. Anvendelse af en ultrafiltreringsmembran, koncentreres eluerede prøve indtil proteinkoncentrationen er 1 ug / ul.
    15. Udføre elektroforese ved at køre 1 pi den eluerede prøve på en 4-12% SDS-PAGE-gel.
    16. Bekræft acetylering af protein-substrat ved western blotting under anvendelse af antistoffer mod Ac-K (1: 1.000 fortynding) og proteinet-substrat (fortynding afhænger af den specifikke anvendte antistof).
    17. Hold puriceret acetyleret protein-substrat ved -80 ° C.
  3. In vitro deacetyleringsreaktion
    1. Forbered deacetylering puffer B (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 0,5 uM TSA)
    2. Forbered 3 forskellige reaktioner i forskellige rør i 20 pi slutvolumen (tabel 1).
    3. Medtag yderligere reaktioner for at bekræfte deacetylering af protein-substrat ved SIRT2 (valgfrit). Tilsæt 2 ug oprenset deacetylering null mutant SIRT2 (dette kan gøres ved hjælp protokollen beskrevet i 1.1 efter at have brugt en pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -flag lentivector) til reaktionen i stedet for deacetylase aktiv SIRT2 eller tilføje 10 mM nikotinamid (NAM ) til reaktionsblandingen for at inhibere deacetylering aktivitet af SIRT2 (tabel 1).
    4. Inkuber reaktioner i 3 timer ved 30 ° C under konstant omrøring.
    5. Reaktionen standses ved tilsætning af 20 pi 2x prøvebuffer og koges prøverne feller 10 min ved 95 ° C.
    6. Udføre elektroforese ved at køre reaktionsblandingen på en 4-12% SDS-PAGE-gel og detektere acetylering status protein-substrat ved western blotting ved anvendelse af et anti Ac-K-antistof (1: 1.000 fortynding) 19,20.

2. In vivo Deacetylering assay

  1. SIRT2 Overekspression i dyrkede celler
    1. Forbered 10 cm petriskåle med HEK 293T-celler stabilt overeksprimerer pCDH-puro-GFP-tom vektor, pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag og pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -flag (som beskrevet i 1.1) til at være omkring 70 % sammenflydende.
    2. Alternativt fremstilling af 10 cm dyrkningsskåle med cellerne ca. 70% konfluente og udfører transient overekspression anvendelse af 5 pg af ovennævnte hjælp PEI i et forhold på 3 pi PEI / ug DNA vektorer.
    3. Udfør western blotting af totale cellulære ekstrakter ved hjælp af et anti-Flag-antistof (1: 1000 fortynding) for at demonstrere overekspression af Flag-tagged SIRT2 19.
  2. RNA-interferens til Knockdown SIRT2 i dyrkede celler
    1. Der fremstilles en 10 cm dyrkningsskål af HEK 293T-celler til at være omkring 70% sammenflydende den næste dag.
    2. Den næste dag, co-transficere 4 ug pLKO1-puro-sh SIRT2 (lentivector) 19, 4 ug pCMV dR8.2 dvpr (emballage vektor) og 0,5 ug pCMV-VSV-G (kuvert vektor) 18 under anvendelse af polyethylenimin (PEI) i et forhold på 3 pi PEI / ug DNA.
      Bemærk: vælte SIRT2, vi bruge enkle hårnål shRNAs i pLKO.1 lentivirusvektoren designet af The RNAi Consortium (TRC).
    3. Følg proceduren som beskrevet i 1.1 til frembringelse shSIRT2 lentivirus og inficere målceller til knockdown SIRT2.
    4. Udfør western blotting af totale celleekstrakter anvendelse af et anti-SIRT2 antistof (1: 1.000 fortynding) at demonstrere effektiv SIRT2 knockdown efter kører 40 ug totalt protein på en 10% SDS-PAGE-gel.
    5. Alternativtfremstilling af 10 cm dyrkningsskåle med cellerne ca. 70% konfluente og udfører forbigående knockdown af SIRT2 hjælp siRNA'er følgende producentens anvisninger.
    6. Udfør western blotting af totale celleekstrakter anvendelse af et anti-SIRT2 antistof (1: 1.000 fortynding) at demonstrere effektiv SIRT2 knockdown efter kører 40 ug totalt protein på en 10% SDS-PAGE-gel.
  3. Immunopræcipitation og Immunoblotting at Detect acetyleret Niveauer i dyrkede celler
    1. 12 timer før indsamlingen cellepellets fra enten celler, der overudtrykker SIRT2 (se 2.1 ovenfor) eller SIRT2 slået ned celler (se 2.2 ovenfor), tilsættes 1 um TSA til dyrkningsmediet at hæmme ikke klasse III histondeacetylaser.
    2. Fjern dyrkningsmedium, vaskes cellerne to gange i PBS og indsamle celler ved trypsinisering efterfulgt af centrifugering ved 1000 xg i 10 min ved 4 ° C.
    3. Der tilsættes 10 ml lysis buffer A (20 mM HEPES pH 7,9, 18 mM KCI, 0,2 mM EGTA, 1,5mM MgCl2, 20% glycerol, 0,1% NP-40), der indbefatter en proteasehæmmere cocktail, 1 uM TSA og 2 mM NAM.
    4. Der inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter under konstant rotation.
    5. Saml supernatanter ved centrifugering ved 20.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
    6. Beregn proteinkoncentration ved anvendelse af et Bradford protein assay.
    7. Transfer 1 mg totalt protein til nye rør i et endeligt volumen på 1 ml med lysisbuffer A. Brug tabel 2 som en henvisning til fremstilling proteinprøver fra celler enten overudtrykker SIRT2 eller efter SIRT2 knockdown.
    8. Udfør en immunopræcipitation under anvendelse af et antistof mod det specifikke protein-substrat sammen med protein A / G (40 pi bead opslæmning anbefales). Alternativt kan du bruge en anti Ac-K antistof konjugeret til agaroseperler (20 pi perle gylle er normalt nok) til at immunpræcipitere alle acetylerede proteiner.
    9. Inkuber prøverne ved 4 ° C under CONSTAnt rotation natten over.
    10. Indsamle immunpræcipitater ved centrifugering ved 1000 xg i 2 min ved 4 ° C.
    11. Vask perler 5 gange med 1 ml puffer A ved 1.000 xg i 2 min ved 4 ° C.
    12. Resuspender perler i 40 pi 2x prøvebuffer.
    13. Boil prøver til 10 minutter ved 95 ° C.
    14. Udføre elektroforese ved at køre de eluerede prøver (40 pi fra trin 2.3.12) på en 4-12% SDS-PAGE-gel uden at forstyrre perlerne mens overførsel de eluerede prøver.
    15. Detect acetylerede niveauer af proteinet-substrat ved Western blotting under anvendelse af et anti-Ac-K-antistof (1: 1.000 fortynding), hvis et protein-substrat specifikt antistof blev anvendt til immunpræcipitation, eller et specifikt antistof mod proteinet-substrat (følg anbefalinger til det specifikke antistof vedrørende fortynding) hvis anti Ac-K perler blev anvendt til immunfældning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at et protein, der skal betragtes som en legitim deacetylering mål for enhver enzym med deacetylering aktivitet, både in vitro og in vivo deacetylering assays skal udføres for at etablere samspillet mellem deacetylase og dets substrat. Til in vitro-deacetylase assay oprensning af både deacetylase og acetylerede proteinsubstrat kræves før analysen kan udføres. Vi bruger den cytoplasmatiske sirtuin SIRT2 som den specifikke deacetylase der skal undersøges. SIRT2 er en deacetylase enzym og anvendelse af en mutant, som mangler deacetylase aktivitet anbefales som en negativ kontrol for deacetylering assay. Under anvendelse oprensningsproceduren beskrevet i 1.1, kan både SIRT2 og SIRT2 H187Y med held oprenses ved en slutkoncentration på 1 pg / pl. Dette kan bekræftes efter kører de oprensede proteiner på en gel efterfulgt af farvning(Figur 1A, øvre) og efter western blotting under anvendelse af et anti-Flag-antistof, da både SIRT2 og SIRT2 H187Y er markeret med en FLAG-peptid (figur 2A, lavere). Den samme rensningsprocedure kan følges til oprensning af proteinsubstratet med nogle modifikationer. Proteinet skal acetyleres, før det kan anvendes til deacetylering assay, som betyder, at det skal renses i celler, der overudtrykker særlige acetyltransferase eller en blanding af hatte i stand til at acetylere proteinet. Under anvendelse oprensningsproceduren beskrevet i 1.2, kan det acetylerede protein oprenses (figur 1B, øvre). For at bekræfte at proteinet faktisk er acetyleret og kan anvendes til in vitro deacetylering assay, western blotting under anvendelse af et anti Ac-K antistof er nødvendigt at vise forøgede acetylerede niveauer af det oprensede protein i celler, der overudtrykker acetyl-transferaser (figur 1B, lower).

Efter vellykket proteinoprensning, kan in vitro deacetylering testes for. Sirtuins, herunder SIRT2, er klasse III histon lysin deacetylaser som adskiller sig fra andre deacetylaser da de kræver NAD + for deres enzymatiske funktion. I overensstemmelse hermed kan ikke deacetylering detekteres ved western blotting ved anvendelse af et anti Ac-K-antistof i fravær af NAD +, uanset tilstedeværelsen af katalytisk aktiv SIRT2 (figur 2, bane 2 vs 1). Tværtimod faldt acetylerede niveauer af det acetylerede protein, når både SIRT2 og NAD + er til stede i reaktionen tyder på, at proteinet kan betragtes som et mål for deacetylering SIRT2. For at efterprøve disse resultater, kan forskellige negative kontroller anvendes. For eksempel kan påvises nogen forskel i deacetylering niveauer af proteinet, når en deacetylering mangelfuld SIRT2 (SIRT2 H187Y) anvendes i stedet for den katalytisk aktive vildtype SIRT2 (figur 2, bane 5 vs 4). Lignende virkning kan ses, når en veletableret sirtuin inhibitor, NAM, tilsættes til reaktionsblandingen, hvilket indebærer, at faldet i de acetylerede niveauer af proteinet medieres af deacetylase aktivitet SIRT2.

Afvigende deacetylering er involveret i flere cellulære processer og aldersrelaterede sygdomme. Således et afgørende skridt i at uddybe vores viden om samspillet mellem en deacetylase og dets substrat er at etablere denne sammenkobling i celler, hvor dette fænomen kan have en fysiologisk effekt. Desuden kontrol deacetylering i cellekultursystemer in vivo muliggør studiet af deacetylering begivenhed i en celle eller et væv specifikke kontekst som lettere kan forbindes til en bestemt fænotype eller resultat. Dette udelukker muligheden for, at den detekteres in vitro Deacetylation aktivitet er kunstig grund af tilstedeværelsen af ​​både deacetylase og dens substrat i røret på samme tid, som aldrig kan ske under normale fysiologiske betingelser i celler. Til in vivo deacetylering assay kan celler, der overudtrykker både SIRT2 og SIRT2 H187Y samt proteinsubstratet anvendes følge procedurerne beskrevet i 2.1 og 2.2. Celleekstrakter fremstillet ud fra disse celler kan bekræftes at udtrykke SIRT2, SIRT2 H187Y, og proteinsubstratet ved western blotting under anvendelse af specifikke antistoffer. I assayet beskrevet her, alle eksogent udtrykte proteiner er tagget for at lette de udførte eksperimenter (figur 3, nederste panel til påvisning HA-mærkede SIRT2 / SIRT2 H187Y og midterste panel til påvisning Flag-mærket protein-substrat). For at bestemme om målproteinet er en deacetylering substrat af SIRT2 er immunpræcipitation udført under anvendelse af et anti-Flag-antistof til at trække ned målproteinet followed ved western blotting ved anvendelse af et anti Ac-K antistof. Fald i de acetylerede niveauer af proteinet i celler, der udtrykker SIRT2 (figur 3 øvre panel, bane 3 vs 2) og manglende påvirke acetylerede niveauer i celler, der udtrykker deacetylase deficiente SIRT2 mutant (Figur 3 øvre panel, bane 4 vs 3) antyder, at det acetylerede protein kan være en deacetylering mål for den specifikke deacetylase in vivo. Dette kan bekræftes yderligere, når SIRT2-medieret deacetylering hæmmes efter behandling celler med NAM (Figur 3 øverste panel, bane 5 vs 3) fastlæggelse af de specifikke deacetylase-substrat akse i de undersøgte celler.

Figur 1
Figur 1: Oprensning af både deacetylase og acetylerede protein-substrat, der skal anvendes til in vitro-deacetylering assay. (A) 1 ug både SIRT2 og SIRT2 H187Y (deacetylering defekt mutant) blev kørt på en gel efter oprensningen protokol som beskrevet i 1.1. Gelen blev farvet med en kommercielt tilgængelig farvningsopløsning og efter affarvning, begge kan detekteres oprensede proteiner (øvre). Proteiner kan detekteres efter overførsel i PVDF-membran og western blotting under anvendelse af et anti-Flag-antistof (nedre). (B) 1 ug proteinsubstrat og hyper acetyleret proteinsubstrat (alfa-enolase blev anvendt som SIRT2 substrat baseret på massespektrometri upublicerede data genereret i vores laboratorium) blev kørt på en gel efter oprensningen protokol som beskrevet i 1.2. Gelen blev farvet med en kommercielt tilgængelig farvningsopløsning og efter affarvning, kan detekteres det oprensede proteinsubstrat (øvre). Acetylering kan detekteres efter overførsel i PVDF-membran og western blotting under anvendelse af et anti-Ac-K-antistof (midten). Total p roteins kan påvises ved hjælp af en anti-Flag-antistof (lavere). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. In vitro deacetylering assay Oprenset acetyleret proteinsubstrat (alfa-enolase) inkuberes med SIRT2 eller SIRT2 H187Y (deacetylering defekt mutant) i nærværelse af NAD + (bane 4 og 5). Nedsat acetylerede niveauer detekteres ved western blotting ved anvendelse af et anti Ac-K-antistof i nærvær af SIRT2 men ikke i nærvær af SIRT2 H187Y (bane 4 vs 5). Nr deacetylering aktivitet observeres når NAD + ikke er inkluderet i reaktionsblandingen (bane 2 vs 4), eller når NAM sættes til reaktionsblandingen (bane 6 vs 4).: //www.jove.com/files/ftp_upload/53563/53563fig2large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. In vivo deacetylering assay HEK293T celler, der stabilt overudtrykker enten SIRT2 eller SIRT2 H187Y blev cotransficeret med proteinsubstratet (alfa-enolase) og hatte for at øge de acetylerede niveauer af proteinet (bane 2 vs 1). Deacetylering blev kontrolleret in vivo efter immunfældning anvendelse af et anti-Flag-antistof til at trække ned proteinsubstratet og western blotting under anvendelse af et anti Ac-K antistof. Acetylering er signifikant reduceret i de SIRT2 overudtrykker celler sammenlignet med SIRT2 H187Y overudtrykkende celler (bane 3 vs 4). Den SIRT2-medieret deacetyleringaf proteinet substrat hæmmes, når celler behandles med NAM (bane 5 vs 3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Reaktioner 1 2 3 4 (valgfrit) 5 (valgfrit)
oprenset acetyleret protein-substrat (10 ug) + + + + +
puffer B + + + + +
oprenset SIRT2 (2 ug) - + + - +
NAD + (1 mu) - - + + +
renset SIRT2 H187Y (2 ug) - - - + -
NAM (10 mM) - - - - +

Tabel 1: Reaction ingredienser.

prøver overekspression slå ned
1 pCDH-puro-GFP-tom vektor pLKO1 tom vektor eller si ctr
2 pCDH-puro-GFP-SIRT2-Flag pLKO1 sh SIRT2 1 eller si SIRT2 1
3 pCDH-puro-GFP-SIRT2 H187Y -flag pLKO1 sh SIRT2 2 eller si SIRT2 2

Tabel 2: Protein prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Den her beskrevne Projektet blev støttet af en bevilling fra NIH / NCI (NCI-R01CA182506-01A1) samt af Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center - Den Lefkofsky Family Foundation / Liz og Eric Lefkofsky Innovation Research Award til AV Vi vil gerne at takke medlemmerne af laboratoriet (Carol O'Callaghan og Elizabeth Anne Wayne) for kritisk læsning og redigering dette manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture dishes Denville Scientific Inc. T1110 and T1115
pCDH-puro-GFP lentiviral vector System Biosciences CD513B-1
pCMV- dR8.2 dvpr (packaging vector) Addgene 8455
pCMV-VSV-G (envelope vector) Addgene 8454
polyethylenimine (PEI)  Polysciences Inc. 24885 other transfection reagents can be used as well. PEI is cost effective and very efficient in transfecting 293T cells
0.22 μm filters Denville Scientific Inc. F5512
polybrene Sigma H9268
fluorescent microscope Carl Zeiss MicroImaging Inc. Axiovert 200
puromycin Invivogen A11138-03
PBS Corning 21-031-CM
anti-Flag antibody Sigma F3165
HEPES  Sigma H3375
KCl Sigma P9541
Glycerol Sigma G5516
NP-40 Sigma 74385
MgCl2 Sigma M9272
EGTA Sigma 34596
protease inhibitors coctail 100x Biotool B14001
Trichostatin A (TSA) Sigma T8552 selective inhibitor of class I and II histone deacetylases (HDACs) but not class III HDACs (sirtuins)
anti-Flag agarose beads Sigma A2220
centrifuge Eppendorf 5417R
rotator Thermo Scientific 415220Q
filter tubes Millipore UFC30HV00
Flag peptide  Sigma F3290
Vivaspin Centrifugal Concentrator Sartorius Stedim Biotech S.A. VS0102
SimplyBlue SafeStain solution  Invitrogen LC6060
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Techologies NP0007
Tris-HCl pH 7.5 Sigma T5941
NAD+ Sigma N0632 required cofactor for sirtuins
nicotinamide (NAM) Sigma 72340 selective inhibitor class III HDACs (sirtuins)
pLKO.1 lentiviral vector  Addgene 8453
SIRT2 si RNA  Qiagen GS22933
anti-SIRT2 antibody Proteintech 15345-1-AP
Bradford protein assay BIO-RAD 500-0006
anti Ac-K agarose beads Immunechem ICP0388

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28, 730-738 (2007).
  2. Gao, M., Karin, M. Regulating the regulators: control of protein ubiquitination and ubiquitin-like modifications by extracellular stimuli. Molecular Cell. 19, 581-593 (2005).
  3. Philp, A., Rowland, T., Perez-Schindler, J., Schenk, S. Understanding the acetylome: translating targeted proteomics into meaningful physiology. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307, C763-C773 (2014).
  4. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 51, 786-794 (1964).
  5. Shahbazian, M. D., Grunstein, M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation. Annual Review of Biochemistry. 76, 75-100 (2007).
  6. L'Hernault, S. W., Rosenbaum, J. L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified in the flagella during flagellar assembly. The Journal of Cell Biology. 97, 258-263 (1983).
  7. Kim, S. C., et al. Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey. Molecular Cell. 23, 607-618 (2006).
  8. Choudhary, C., et al. Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions. Science. 325, 834-840 (2009).
  9. Smith, K. T., Workman, J. L. Introducing the acetylome. Nature Biotechnology. 27, 917-919 (2009).
  10. Roth, S. Y., Denu, J. M., Allis, C. D. Histone acetyltransferases. Annual Review of Biochemistry. 70, 81-120 (2001).
  11. Ozden, O., et al. Acetylation of MnSOD directs enzymatic activity responding to cellular nutrient status or oxidative stress. Aging. 3, 102-107 (2011).
  12. Anderson, K. A., Hirschey, M. D. Mitochondrial protein acetylation regulates metabolism. Essays in Biochemistry. 52, 23-35 (2012).
  13. Schwer, B., Bunkenborg, J., Verdin, R. O., Andersen, J. S., Verdin, E. Reversible lysine acetylation controls the activity of the mitochondrial enzyme acetyl-CoA synthetase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10224-10229 (2006).
  14. Haberland, M., Montgomery, R. L., Olson, E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy. Nature Reviews. Genetics. 10, 32-42 (2009).
  15. Finkel, T., Deng, C. X., Mostoslavsky, R. Recent progress in the biology and physiology of sirtuins. Nature. 460, 587-591 (2009).
  16. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13, 225-238 (2012).
  17. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15, 536-550 (2014).
  18. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9, 493-501 (2003).
  19. Kim, H. S., et al. SIRT2 maintains genome integrity and suppresses tumorigenesis through regulating APC/C activity. Cancer Cell. 20, 487-499 (2011).
  20. Zhang, H., et al. SIRT2 directs the replication stress response through CDK9 deacetylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13546-13551 (2013).
  21. Weinert, B. T., et al. Proteome-wide mapping of the Drosophila acetylome demonstrates a high degree of conservation of lysine acetylation. Science Signaling. 4, ra48 (2011).
  22. Still, A. J., et al. Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation. The Journal of Biological Chemistry. 288, 26209-26219 (2013).
  23. Sadoul, K., Wang, J., Diagouraga, B., Khochbin, S. The tale of protein lysine acetylation in the cytoplasm. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 970382 (2011).
  24. Preble, J. M., et al. Rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration. Journal of Visualized Experiments : JoVE. e51682 (2014).
  25. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (2011).
  26. He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism: TEM. 23, 467-476 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics