وضع العمود الفقري مكتبة الببتيد دوري كما المحتملة ضد الطفيليات التداوي عن طريق الميكروويف تشعيع

1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Qvit, N., Kornfeld, O. S. Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation. J. Vis. Exp. (107), e53589, doi:10.3791/53589 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) هي المعنية عن كثب في جميع العمليات الحيوية تقريبا، وترتبط لكثير من الأمراض البشرية. ولذلك، هناك جهد كبير لاستهداف مثبطات مضخة البروتون في مجال البحوث الأساسية وصناعة الأدوية. واجهات البروتين البروتين عادة ما تكون كبيرة، شقة، وغالبا ما تفتقر إلى جيوب، تعقيد اكتشاف الجزيئات الصغيرة التي تستهدف هذه المواقع. نهج استهداف بديلة باستخدام أجسام مضادة لها قيود بسبب سوء التوافر الحيوي عن طريق الفم، وانخفاض الخلية النفاذية، وعدم كفاءة الإنتاج.

استخدام الببتيدات لاستهداف واجهات PPI ديها العديد من المزايا. الببتيدات لديها أعلى من المرونة بتكوين وزيادة الانتقائية، وعادة ما تكون غير مكلفة. ومع ذلك، الببتيدات لها حدودها الخاصة بما في ذلك سوء الاستقرار وعدم الكفاءة عبور أغشية الخلايا. للتغلب على هذه القيود، الببتيد cyclization لا يمكن أن يؤديها. وقد تجلى Cyclization لتحسين الببتيد الانتقائيةوالاستقرار الأيض، والتوافر البيولوجي. ومع ذلك، توقع التشكل النشطة بيولوجيا من الببتيد دوري ليست تافهة. للتغلب على هذا التحدي، واحدة نهج جذابة على الشاشة مكتبة مركزة على الشاشة فيه جميع الببتيدات الحلقية العمود الفقري لها تسلسل الأساسي نفسه، ولكنها تختلف في المعايير التي تؤثر على التشكل، مثل حجم الحلقة والموقف.

وصفنا بروتوكول مفصلة لتجميع مكتبة من العمود الفقري الببتيدات الحلقية التي تستهدف مثبطات مضخة البروتون الطفيلي محددة. باستخدام نهج التصميم الرشيد، وضعنا الببتيدات المستمدة من البروتين سقالة L eishmania مستقبلات لتنشيط C-كيناز (قلة). افترضنا أن تسلسل في LACK التي يتم حفظها في الطفيليات، ولكن ليس في homolog المضيف الثدييات، قد تمثل مواقع التفاعل البروتينات التي تعتبر بالغة الأهمية لبقاء الطفيليات. تم توليفها الببتيدات الحلقية باستخدام أشعة المايكروويف لتقليل زمن رد الفعل وزيادةكفاءة. تطوير مكتبة العمود الفقري الببتيدات الحلقية مع أحجام رنين مختلفة تسهل شاشة منهجية لالتشكل النشطة الأكثر البيولوجي. يوفر هذا الأسلوب بشكل عام، وبسرعة، والسطحية لتجميع الببتيدات الحلقية.

Introduction

تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) تلعب دورا محوريا في معظم العمليات الحيوية، من داخل الخلايا نقل الإشارة إلى خلية الموت 1. وبالتالي، تستهدف مثبطات مضخة البروتون هي ذات أهمية أساسية لالبحوث الأساسية والتطبيقات العلاجية. مثبطات مضخة البروتون يمكن تنظيمها من قبل الأجسام المضادة محددة ومستقرة، ولكن الأجسام المضادة هي مكلفة وصعبة لتصنيع ويعانون من ضعف التوافر البيولوجي. بدلا من ذلك، مثبطات مضخة البروتون يمكن أن تكون مستهدفة من قبل الجزيئات الصغيرة. الجزيئات الصغيرة هي أسهل لتجميع وغير مكلفة بالمقارنة مع الأجسام المضادة. ومع ذلك، فهي نسبيا أقل مرونة وتناسب أفضل لتجاويف صغيرة بدلا من واجهات كبيرة من البروتين البروتين 2،3. وقد أثبتت الدراسات المتنوعة التي الببتيدات، والتي هي أبسط وأرخص من الأجسام المضادة وأكثر مرونة من جزيئات صغيرة، يمكن ربط واجهات البروتين وتنظيم مثبطات مضخة البروتون 4،5. وتقدر قيمة سوق الببتيد العلاجي العالمي حول 15000000000 دولار في عام 2013 وينمو 10.5٪ أنواLLY 6. وعلاوة على ذلك، هناك أكثر من 50 الببتيدات تسويقها، نحو 270 الببتيدات في مراحل مختلفة من الاختبارات السريرية، وحوالي 400 الببتيدات في مراحل ما قبل السريرية المتقدمة 7. على الرغم من أن العديد من الببتيدات تستخدم كأدوية، والببتيدات لا تزال تشكل العديد من التحديات التي تحد من تطبيق على نطاق واسع من بينها قلة التوافر البيولوجي والاستقرار، وعدم الكفاءة في أغشية الخلايا المعبر، والمرونة بتكوين 8،9. بديل واحد لتجاوز هذه العوائق هو تطبيق تعديلات مختلفة مثل المحلي (حمض أميني-D و N-الألكلة) والعالمي (cyclization) القيود 8،10-12. كما تحدث هذه التعديلات بشكل طبيعي. على سبيل المثال، السيكلوسبورين A، الببتيد الطبيعي دوري المناعة، ويحتوي على الأحماض الأمينية-D واحد ويخضع لتعديلات N-الألكلة 13،14.

تعديل الأحماض الأمينية الطبيعية للحث على القيود المحلية، مثل D- وN-الألكلة، وغالبا ما يؤثر على الببتيد9؛ ق النشاط البيولوجي. ومع ذلك، cyclization، التي تتابع الفائدة يمكن أن يبقى كما هو، هو أكثر عرضة للحفاظ على النشاط البيولوجي. Cyclization هو وسيلة جذابة للغاية لتقييد مساحة بتكوين الببتيد عن طريق الحد من التوازن بين التشكل مختلفة. فإنه عادة ما يزيد من النشاط البيولوجي والانتقائية من خلال الحد من الببتيد إلى التشكل النشط الذي يتوسط وظيفة واحدة فقط. Cyclization أيضا يحسن الاستقرار الببتيد عن طريق الحفاظ على الببتيد في التشكل الذي أقل معترف بها من قبل الانزيمات المهينة. في الواقع، عرضت الببتيدات الحلقية قد تحسنت الاستقرار الأيض، التوافر البيولوجي، والانتقائية مقارنة مع نظرائهم الخطية 15-17.

ومع ذلك، يمكن cyclization أن يكون سلاح ذو حدين لأنه في بعض الحالات قد يمنع تقييد الببتيدات من تحقيق التشكل النشطة بيولوجيا. للتغلب على هذه العقبة، مكتبة مركزة فيه جميع الببتيدات لديها نفس sequenc الأوليةيمكن توليفها الإلكترونية وبالتالي ثابتة pharmacophores. الببتيدات في المكتبة تختلف في المعايير التي تؤثر على هيكلها، مثل حجم الحلبة، والموقف، وذلك لفحص في وقت لاحق لالتشكل الأكثر النشطة بيولوجيا 9،18.

الببتيدات يمكن توليفها في كل حل ونهج التوليف الببتيد الحالة الصلبة (SPPS)، والتي هي الآن نهج التوليف الببتيد أكثر انتشارا وسيجري بحثه باستفاضة. SPPS هو العملية التي تتم التحولات الكيميائية على دعم قوي من خلال رابط لإعداد مجموعة واسعة من المركبات الاصطناعية 19. SPPS يتيح تجميع الببتيدات بواسطة اقتران التوالي من الأحماض الأمينية بطريقة متدرجة من C-المحطة، التي يتم تركيبها على دعم قوي، إلى N-المحطة. يجب أن ملثمين الحامض الجانب سلاسل N-α-الأمينية مع حماية الفئات التي هي مستقرة في ظروف التفاعل استخدمت خلال الببتيد استطالة لضمان إضافة حمض أميني واحد في كل شارعالجيش الشعبي. في الخطوة النهائية، يتم تحرير الببتيد من الراتنج والجانب سلسلة حماية الفئات تتم إزالة متزامنة. في الوقت الذي يجري تصنيعه الببتيد، يمكن إزالة جميع الكواشف القابلة للذوبان من الدعم مصفوفة الببتيد الصلبة عن طريق الترشيح وجرفت في نهاية كل خطوة اقتران. مع مثل هذا النظام، وفائض كبير من المواد الكيميائية في تركيز عال يمكن أن تدفع ردود الفعل اقتران على الانتهاء وجميع الخطوات التوليف لا يمكن أن يؤديها في السفينة نفسها دون أي نقل للمواد 20.

على الرغم من SPPS بعض القيود مثل إنتاج ردود فعل غير مكتملة، التفاعلات الجانبية، الكواشف النجسة، فضلا عن الصعوبات رصد رد فعل 21، جعلت من "المعيار الذهبي" لتخليق الببتيد مزايا SPPS. وتشمل هذه المزايا خيار دمج الأحماض الأمينية غير طبيعية، والأتمتة، وتنقية سهلة، والخسائر المادية مصغر، واستخدام الكواشف الزائدة، مما أدى إلىعوائد عالية. وقد تبين SPPS أن تكون مفيدة للغاية في تركيب سلاسل صعبة 21،22، التعديلات الفلورسنت 23، والمكتبات الببتيد 24،25. SPPS هو أيضا مفيد جدا لغيرها من التجمعات بولي سلسلة مثل [أليغنوكليوتيد 26،27، 28،29 يغوساكاريدس، والببتيد الأحماض النووية 30،31. ومن المثير للاهتمام، في بعض الحالات، تبين SPPS ليكون من المفيد لتجميع الجزيئات الصغيرة التي تتم عادة في حل 32،33. يستخدم SPPS سواء في نطاق ضيق للبحث والتدريس 34،35 وكذلك على نطاق واسع في صناعة 36-38.

استراتيجيات تركيب اثنين من التي تستخدم بشكل رئيسي في منهجية SPPS لتركيب الببتيدات هي butyloxycarbonyl (بوك) و 9 fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). كانت الاستراتيجية الأصلية قدم لSPPS بوك، الأمر الذي يتطلب شروط حمض قوية لإزالة جانب سلسلة حماية الفئات ويلتصق الببتيد من صESIN. التوليف الببتيد تستند Fmoc، ومع ذلك، يستخدم الظروف قاعدة المعتدلة ويعتبر بديل أكثر اعتدالا لحمض عطوب بروتوكول بوك 39. استراتيجية Fmoc تستخدم المتعامدة تي بوتيل (TBU) حماية جانبية السلسلة التي تم إزالتها في الخطوة الأخيرة من التوليف بينما الشق الببتيد من راتنج تحت الظروف الحمضية.

ويرد المبدأ العام لتخليق الببتيد على دعم قوي في الشكل 1. والأحماض الأمينية الأولي، من قبل ملثمين مجموعة حماية مؤقتة على N-α-المحطة، يتم تحميل على الراتنج من C-المحطة. ويستخدم فريق حماية شبه دائمة لإخفاء سلسلة الجانب أيضا إذا لزم الأمر (الشكل 1، الخطوة 1). يتم تجميع توليف الببتيد الهدف من C-محطة إلى N-محطة بدورات متكررة من deprotection من مجموعة حماية N-α-مؤقتة (الشكل 1، الخطوة 2) واقتران المقبل الأحماض الأمينية المحمية (الشكل 1 أونج> الخطوة 3). بعد تحميل الماضي الأحماض الأمينية (الشكل 1، الخطوة 4)، هو المشقوق الببتيد من الدعم الراتنج وطرد الجماعات حماية شبه دائمة (الشكل 1، الخطوة 5).

الشكل 1
الشكل 1. مخطط عام للنفايات الصلبة الببتيد مرحلة التوليف. ويرتكز هذا الحمض الأميني N-α محمية باستخدام مجموعة الكربوكسيل عن طريق رابط لالراتنج (الخطوة 1). يتم تجميعها الببتيد المطلوب بطريقة خطية من C-محطة إلى N-محطة بدورات متكررة من deprotection من مجموعة حماية مؤقتة (TPG) من N-α (الخطوة 2) واقتران الأحماض الأمينية (الخطوة 3). بعد إنجاز عملية التوليف (الخطوة 4)، وdeprotected المجموعات حماية شبه دائمة (SPG) أثناء الانقسام الببتيد (الخطوة 5).الحصول = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد تجميع سلسلة الببتيد كاملة، لا يمكن أن يتحقق cyclization عدة بدائل: (A) وجها لالذيل cyclization - وهذا هو وسيلة مريحة ولكن محدودة لأنها توفر خيار واحد فقط لcyclization (الشكل 2A)، (B) cyclization باستخدام الأحماض الأمينية من سلسلة من الفائدة التي تحتوي على المجموعات الوظيفية النشطة بيولوجيا - ومع ذلك، فإن استخدام هذه الأحماض الأمينية قد تؤثر على النشاط البيولوجي (الشكل 2B)، و (C) cyclization بإضافة الأحماض الأمينية (أو اللبنات الأخرى) من دون إزعاج تسلسل النشطة بيولوجيا. إدخال هذه الجزيئات هي على نطاق واسع لأنه يتيح إنتاج المكتبات تركز دون تعديل تسلسل الفائدة (الشكل 2C).

الرقم 2
Figure 2. استراتيجيات cyclization الببتيد البديل (A) الرأس الى الذيل cyclization، من خلال السندات الببتيد بين C-محطة وN-محطة؛ (B) cyclization بين المجموعات الوظيفية مثل السندات ثاني كبريتيد بين السيستين المخلفات (1)، أو سندات أميد بين السلاسل الجانبية من ليسين لالأسبارتيك / حمض الجلوتاميك (2)، أو سلسلة جانبية لN- أو C-محطة (3 -4)؛ (C) cyclization بإضافة الأحماض الأمينية إضافية أو مشتقات الأحماض الأمينية أو الجزيئات الصغيرة، على سبيل المثال قبل (R0) وبعد (R7) تسلسل النشطة بيولوجيا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يستخدم توليف أشعة الميكروويف لتسخين ردود الفعل، وبالتالي تسريع الكيميائية العضوية التي يساعدها الميكروويف التحولات 40،41. ويستند كيمياء الموجات الصغيرة على قدرة كاشف / مذيب لاستيعابالميكروويف الطاقة وتحويله إلى حرارة 42. قبل أن تصبح هذه التكنولوجيا على نطاق واسع، وكان من العوائق الرئيسية التي يجب التغلب عليها، بما في ذلك التحكم واستنساخ بروتوكولات التوليف وعدم وجود نظم المتاحة لدرجة الحرارة والضغط ضوابط كافية 43،44. وقد تم التقرير الأول من التوليف الببتيد بمساعدة الميكروويف باستخدام الميكروويف المطبخ لتجميع عدة الببتيدات قصيرة (7-10 الأحماض الأمينية) مع تحسن ملحوظ في كفاءة اقتران ونقاء 45. وعلاوة على ذلك، وقد تبين طاقة الميكروويف إلى تقليل سلسلة التجميع، والحد من التفاعلات الجانبية، والحد من تروسم، وتحسين معدلات اقتران، وكلها حيوية لتسلسل صعبة وطويلة 46-53.

حاليا استخدام الإشعاع الميكروويف لتركيب الببتيدات أو المركبات ذات الصلة على دعم قوي واسعة النطاق، بما في ذلك (A) التوليف في الماء بدلا من المذيبات العضوية 54؛ (B) توليف الببتيدات معالتعديلات بعد متعدية المشتركة، مثل glycopeptides 55-58 أو 59-61 phosphopeptides، الذي التوليف يصعب عادة بسبب كفاءة اقتران منخفضة من إعاقة sterically مشتقات الأحماض الأمينية. (C) توليف الببتيد مع تعديل في العمود الفقري، مثل azapeptides، والتي يمكن أن يشكلها استبدال C (α) من بقايا الأحماض الأمينية مع ذرة النيتروجين 62، أو peptoids، التي يتم توصيلها إلى سلسلة جانبية النيتروجين أميد بدلا من الذرة Cα 63،64. (D) التوليف من الببتيدات الحلقية 65-71. و (E) توليف المكتبات اندماجي 51،72. وفي العديد من الحالات، ذكرت والكتاب كفاءة أعلى وتخفيض الوقت التوليف باستخدام أشعة الميكروويف بالمقارنة مع البروتوكول التقليدي.

باستخدام تصميم عقلاني 73-75، وضعنا الببتيدات المضادة للالطفيلية التي كانت مستمدة من مستقبلات السقالة L eishmania في FOص تنشيط C-كيناز (قلة). LACK تلعب دورا هاما في المرحلة المبكرة من العدوى الليشمانيا 76. الطفيليات معربا عن مستويات أدنى نقص تفشل في تتطفل حتى الفئران خطر المناعية 77 كما تشارك نقص في عمليات الطفيلي يشير الأساسية وتخليق البروتين 78. لذلك، وعدم هو بروتين سقالة الرئيسي 79 وهدف المخدرات قيمة. التركيز على تسلسل في LACK التي يتم حفظها في الطفيليات، ولكن ليس في البلد المضيف الثدييات homolog RACK، حددنا من الأحماض الأمينية الببتيد 8 (RNGQCQRK) إنخفاضا الليشمانيا ليرة سورية. الجدوى في الثقافة.

هنا، نحن تصف بروتوكول لتركيب العمود الفقري دوري الببتيدات المستمدة من تسلسل البروتين LACK المذكورة أعلاه. تم توليفها الببتيدات على دعم قوي باستخدام الميكروويف التدفئة عن طريق منهجية SPPS مع بروتوكول Fmoc / TBU. تم مترافق الببتيدات إلى TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) الناقل الببتيد من خلال السندات أميد كماجزء من SPPS. وقد استخدم النقل استنادا TAT من مجموعة متنوعة من البضائع إلى داخل الخلايا لأكثر من 15 عاما، وقد تم تأكيد تسليم البضائع إلى العضيات التحت خلوية 80. أربعة linkers مختلفة، السكسينيك وأنهيدريد الغلوتاريك وكذلك الأديبيك وحمض البيميليك، استخدمت لأداء cyclization لتوليد linkers حمض الكربوكسيلية من 2-5 الكربون. وقد تم Cyclization باستخدام طاقة الميكروويف، وأجريت الانقسام وجنبا إلى سلسلة خطوات deprotection النهائية يدويا بدون طاقة الميكروويف. استخدام المزج الميكروويف الآلي تحسين نقاء المنتج، وزيادة المحصول المنتج، وتخفيض مدة التوليف. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول العام للدراسات الأخرى التي تستخدم الببتيدات لفهم الآلية الجزيئية مهمة في المختبر والمجراة وتطوير العقاقير المحتملة لعلاج أمراض الإنسان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

معدات 1. وتحضير الكواشف

  1. معدات إعداد
    1. تنفيذ كافة الخطوات داخل غطاء الدخان استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    2. توليف كيميائيا الببتيدات على دعم قوي باستخدام الميكروويف الببتيد مركب مع وحدة إضافية من اكتشاف مجهزة الألياف الضوئية مسبار درجة الحرارة للسيطرة على تسليم الميكروويف السلطة في وعاء التفاعل تفلون (30 مل، مع فريت الزجاج) أو في البولي بروبلين القابل للتصرف خرطوشة (12 مل، مع فريت الخشنة).
    3. لخلط الصحيح، توصيل التيار النيتروجين في وعاء التفاعل، أو بدلا من ذلك ختم طرفي خرطوشة البولي بروبلين، ووضع على شاكر دوارة.
    4. لاستنزاف خليط من رد فعل أو يغسل، الاتصال فراغ المنزل عن طريق فخ النفايات.
    5. وضع مسبار الألياف الضوئية إلى وعاء التفاعل.
  2. إعداد الكواشف
    1. إعداد الراتنج وزنها عن طريق تزلج أميد الراتنج AM 100-200 شبكة (0.204 ملغ)إضافة 5 مل 1: 1 خليط من N، N -dimethylformamide (DMF) / ثنائي كلورو ميثان (DCM) إلى رد فعل خرطوشة السفينة / البولي بروبلين لغسل الراتنج أسفل، يهز لمدة 2-4 ساعة إلى تضخم بشكل صحيح، واستنزاف.
    2. إعداد 0.2 M 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) -amino الحلول الحمضية عن طريق إذابة المقابلة حمض Fmoc-الأمينية في DMF ودوامة الخليط حتى تذوب الأحماض الأمينية (الجدول 1).
    3. إعداد 0.45 M المنشط مزيج حل عن طريق إذابة 18.96 ز O - (benzotriazol-1-يل) - N، N، N، N 'يذوب hexafluorophosphate -tetramethyluronium (HBTU) في 100 مل DMF وvortexing لالخليط حتى صلب (الجدول 1).
    4. إعداد 2 M قاعدة المنشط مزيج حل من خلال الجمع بين 34.8 مل N، N -diisopropylethylamine (DIEA) مع 65.2 مل 1-ميثيل-2-pyrrolidinone (NMP) (الجدول 1).
    5. إعداد 0.1 M deprotection مزيج حل عن طريق إذابة هيدرات 3.37 ز 1-hydroxybenzotriazole (HOBt)في 250 مل من 20٪ ت / ت حل تأكسد في DMF وvortexing لالخليط حتى يذوب الصلبة (الجدول 1).

2. Fmoc المحمية الأحماض الأمينية اقتران

  1. اقتران الأحماض الأمينية
    1. إضافة الأحماض الأمينية (2.5 مل) / المنشط (1 مل) / قاعدة المنشط (0.5 مل) إلى رد فعل خرطوشة السفينة / البولي بروبلين، والسماح للرد فعل المضي قدما لمدة 300 ثانية (25 W، 75 ° C، الجدول 2). استنزاف الحل.
    2. غسل الراتنج مع DMF. إضافة DMF إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، RT) واستنزاف الحل. كرر خمس مرات.
  2. deprotection Fmoc
    1. إضافة 7 مل من 20٪ تأكسد في DMF مع 0.1 M HOBt إلى رد فعل خرطوشة السفينة / البولي بروبلين واحتضان لمدة 30 ثانية (45 W، 75 ° C، الجدول 2).
    2. استنزاف خليط التفاعل.
    3. إضافة 7 مل من 20٪ تأكسد في DMF مع 0.1 M HOBt إلى رد فعل خرطوشة السفينة / البولي بروبلين واحتضان لمدة 180 ثانية (45 W، 75 ° C، الجدول 2).
    4. استنزاف خليط التفاعل.
    5. غسل الراتنج مع DMF. إضافة DMF إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر خمس مرات.
      ملاحظة: اختياريا، وقفة الإجراء هنا وتستأنف في وقت لاحق.
  3. بعد الأحماض الأمينية خطوة اقتران، وغسل الراتنج مع DCM ومخزن لعدة أيام على الأقل في 4 ° C (لمتجر فترة أطول الراتنج في - 20 ° C).
    1. نقل الراتنج من وعاء التفاعل على خرطوشة البولي بروبلين.
    2. غسل الراتنج مع DCM. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.
    3. ختم خرطوشة البولي بروبلين بإحكام مع الغطاء العلوي ومحبس.
    4. قبل البدء في تركيب جديد، تنتفخ الراتنج لمدة 3-4 ساعة في DMF (7 مل).
  4. رصد التوليف
    1. استخدام اختبار كايزر (النينهيدرين) أو الكلورانيل اختبار لتحديد بسرعة التقدم للالتوليف. اختياريا، نفذ رد فعل الانقسام على نطاق صغير لتحديد النقاء وكتلة الببتيد توليفها. انظر القسم 9.
      ملاحظة: لمزيد من استكشاف الأخطاء وإصلاحها انظر الجدول 3.
  5. كرر الخطوات من 2.1 و 2.2 كما هو مطلوب لتجميع الببتيد المستهدفة: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf).

3. الاندريد / حمض اقتران

  1. اقتران أنهيدريد
    1. غسل الراتنج مع NMP. إضافة NMP إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.
    2. حل 10 يعادله من أنهيدريد المقابلة في NMP (5 مل)، إضافة 1 أي ما يعادل 4-Dimethylaminopyridine (DMAP) و 10 في حكمه DIEA إلى حل (الجدول 1).
    3. إضافة 10: 10 خليط من الخل / DMAP / DIEA إلى الراتنج واحتضان لمدة 300 ثانية (25: 1W، 75 ° C، الجدول 2). استنزاف الحل.
    4. غسل الراتنج مع NMP. إضافة NMP إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.
  2. حمض اقتران
    1. غسل الراتنج مع DMF. إضافة DMF إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.
    2. حل 10 يعادله من حمض ثنائي الكربوكسيل المقابلة في DMF (5 مل). إضافة 1 DMAP أي ما يعادل 10 في حكمه وN، N '-Diisopropylcarbodiimide (DIC) إلى حل (الجدول 1).
    3. قبل تفعيل الخليط عن طريق خلط لمدة 30 دقيقة.
    4. إضافة الخليط إلى الراتنج واحتضان لمدة 300 ثانية (25 W، 75 ° C، الجدول 2)، واستنزاف الحل.
    5. غسل الراتنج مع DMF. إضافة DMF إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف حل. كرر الخطوة ثلاث مرات.

4. N-methyltrityl (الإنتقالي العسكري) حماية المجموعة Deprotectأيون

ملاحظة: تم محمية سلسلة الجانب يسين مع N-methyltrityl (الإنتقالي العسكري) 81، وهي مجموعة حماية التي يمكن deprotected بشكل انتقائي في ظل ظروف عطوب الحمضية 82،83. Deprotect الإنتقالي العسكري حماية مجموعة يدويا على شاكر بدون طاقة الميكروويف.

  1. نقل الراتنج على خرطوشة البولي بروبلين مجهزة المكونات الغطاء ومحبس.
  2. غسل الراتنج مع DCM. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.
  3. إضافة 15-25 مل من خليط من 1٪ حمض Trifluoroacetic (TFA)، و 5٪ Triisopropylsilane (TIS)، و 94٪ DCM لخرطوشة البولي بروبلين في غرام واحد من الراتنج.
    ملاحظة: TFA هو حمض قوي وتآكل وغير مزعجة للغاية على الجلد والعينين، وأنسجة الرئة.
    1. الحفاظ حلول مركزة من TFA في غطاء محرك السيارة في جميع الأوقات.
    2. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (حماية العين، معطف المختبر وقفازات) والعمل في غطاء جيد التهوية. تغيير القفازات فوراإذا كانت تأتي في اتصال مع TFA وتنظيف فورا أي تسرب. اذا كانت بشرتك أو عينيك تأتي في اتصال مع الحامض، مسح المنطقة المصابة على الفور بالماء ويغسل لمدة 15 دقيقة إضافية.
  4. وضع خرطوشة البولي بروبلين على شاكر ويهز لمدة 5 دقائق على RT.
  5. استنزاف الحل من خرطوشة البولي بروبلين من خلال تطبيق فراغ.
  6. كرر الخطوات من 4،3-4،5، ثلاث مرات.
  7. غسل الراتنج مع DCM. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر خمس مرات.

5. Cyclization من الخطي الببتيد

  1. غسل الراتنج مع DCM. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر خمس مرات.
  2. في 50 مل أنبوب البولي بروبلين، ويحل 5 حكمه Benzotriazole-1-لاي-أوكسي تريس، pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) في Dibromomethane (DBM، 5 مل)، وإضافة 10 المعادل DIEA إلى حل (الجدول 1).
  3. الجدول 2). استنزاف الحل.
  4. غسل الراتنج مع DCM. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر ثلاث مرات.

6. الشق وDeprotection من المجموعات الجانبية سلسلة

  1. غسل الراتنج مع DCM وايثر.
    1. إضافة DCM إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر مرتين.
    2. إضافة ايثر إلى الراتنج لمدة 120 ثانية (7 مل، 0 W، غ)، واستنزاف الحل. كرر مرتين.
  2. تجفيف الراتنج في فراغ مجفف في RT لا يقل عن 3 ساعة على هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH، 1-10 ز).
  3. تزن الراتنج المجففة وتحويلها إلى خرطوشة البولي بروبلين.
  4. إضافة 10 مل من تبريده قبل trifluoroacetic حمض (TFA) انشقاق كوكتيل (على سبيل المثال، 90٪ TFA 2.5٪ ماء، 2.5٪ TIS و 5٪ الفينول) إلى كل غرام واحد من الراتنج.
  5. يهز لمدة 3 ساعاتفي RT.
  6. جمع الحل انشقاق TFA من خلال تصفية الراتنج في أنبوب البولي بروبلين 50 مل. لوالترشيح، واستخدام فريت التي هي في خرطوشة البولي بروبلين 12 مل.
  7. إضافة ايثر الباردة (35 مل) إلى أنبوب.
  8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1207 x ج في 4 درجات مئوية.
  9. صب طبقة الأثير.
  10. كرر الخطوة 6،7-6،9، خمس مرات.

7. تجفيف العمود الفقري دوري الببتيد

  1. الحفاظ على الببتيد عجلت في نفس الأنبوب وتجف في غطاء محرك السيارة لمدة 30 دقيقة.
  2. حل الببتيد في 1: 1 خليط من الماء والأسيتونتريل (ACN).
  3. تجميد الحل المنتج النهائي في النيتروجين السائل.
  4. يجفد المنتج النهائي.

8. تميز العمود الفقري دوري الببتيد

  1. حل عينة صغيرة (1 ملغ) من الناتج في الماء (400 ميكرولتر).
  2. حقن ببتيد المنحل (10-200 ميكرولتر) إلى مرحلة العكسي عالية الأداء chromatograp السائلHY (RP-HPLC) نظام لاختبار الببتيد نقاء 34.
  3. تحقق كتلة الببتيد باستخدام مطياف الكتلة مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين (MS-MALDI) 84.
    1. مزيج 1 ميكرولتر (100 ميكرومتر) الببتيد في 1: 1 (ت / ت) خليط من الأسيتونتريل: الماء مع 1 ميكرولتر من المصفوفة (حمض 5 ملغ / مل، α-cyano-4-hydroxycinnamic) في 1: 1 (الخامس / V) خليط من الأسيتونتريل: المياه مع TFA (0.1٪).
    2. بقعة 1 ميكرولتر على لوحة MS-MALDI.
    3. تجفيف العينات ووضعه في مطياف الكتلة.
  4. تزن الببتيد وحساب العائد في المئة.
  5. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

9. رصد التجميعي

  1. كايزر (النينهيدرين) اختبار 85
    1. إعداد الحلول كاشف.
      1. إعداد الحل A عن طريق إذابة 16.5 ملغ من البوتاسيوم السيانيد (KCN) في 25 مل من الماء المقطر. تمييع 1 مل من محلول أعلاه مع 49 مل من البريدين.
      2. إعداد الحل Bعن طريق إذابة 1 غرام من النينهيدرين في 20 مل من الايثانول.
      3. إعداد الحل C عن طريق إذابة 40 جم فينول في 20 مل ايثانول.
    2. استخدام اختبار كايزر للتحقق من إنجاز اقتران الأحماض الأمينية أو deprotection من مجموعة حماية.
      1. نقل بضع حبات من الراتنج إلى أنبوب اختبار.
      2. إضافة ثلاث قطرات (~ 100 ميكرولتر) من كل حل (A، B و C) وتخلط.
      3. حرارة أنبوب الاختبار على كتلة التدفئة في 110 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
        ملاحظة: الخرز الملون الأزرق (نتيجة إيجابية) إلى رد فعل اقتران كاملة أو deprotection من Fmoc مجموعة حماية.
  2. الكلورانيل اختبار 86
    1. إعداد الكواشف التالية جديدة لكل اختبار.
      1. تحضير محلول 2٪ الكلورانيل في DMF، حل A.
      2. تحضير محلول 2٪ الأسيتالديهيد في DMF، حل B.
    2. إجراء اختبار الكلورانيل للتحقق من إنجاز اقتران الأحماض الأمينية أو تيانه deprotection من مجموعة حماية.
      1. مزيج 100 ميكرولتر من محلول A مع 100 ميكرولتر من محلول B في أنبوب 1.5 مل.
      2. إسقاط حبات في ويهز بلطف لمدة 5 دقائق.
        ملاحظة: الخرز الملون البني الداكن (نتيجة إيجابية) تشير deprotection من مجموعة حماية Fmoc أو رد فعل اقتران غير مكتملة.
  3. رد فعل الانقسام على نطاق صغير
    1. إزالة كمية صغيرة من الراتنج لخرطوشة البولي بروبلين 3 مل مجهزة المكونات الغطاء ومحبس.
    2. علاج بمزيج 2 مل من 95٪ TFA، و 2.5٪ و 2.5٪ ماء TIS.
    3. يهز الخليط لمدة 30 دقيقة في RT.
    4. إزالة الراتنج عن طريق الترشيح باستخدام فريت من خرطوشة البولي بروبلين وتتبخر المذيبات من قبل تيار من النتروجين.
    5. حل هذه البقايا في الماء وتحليل المنتج باستخدام HPLC و / أو MS.

10. الليشمانيا الدونوفانية المشيقة الجدوى في الثقافة الفحص

    <لى> الليشمانيا الدونوفانية (L. اللشمانيا الحشوية) ظروف النمو والعلاج
    1. ثقافة L. الطور السوطي اللشمانيا الحشوية في تعديل Dulbecco والنسر والمتوسطة (DMEM) مع 4.5 جم / L الجلوكوز، L-الجلوتامين، والبيروفات الصوديوم في 26 ° C.
    2. علاج L. اللشمانيا الحشوية الطور السوطي مع الببتيدات الحلقية (100 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة على 26 ° C.
  1. الليشمانيا الدونوفانية (L. اللشمانيا الحشوية) الجدوى فحص
    1. تقييم الجدوى الطفيلي مع 20 ميكرولتر alamarBlue وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
    2. تحديد الحد alamarBlue عن طريق قياس مضان (في 570 نانومتر الإثارة و 590 نانومتر الانبعاثات). قيم مضان أعلى تشير إلى زيادة نشاط الأيض وزيادة قابلية الطفيلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نحن هنا وصف وضع مكتبة صغيرة مركزة من العمود الفقري الببتيدات الحلقية التي تستهدف على وجه التحديد مثبطات مضخة البروتون حيوية للطفيل الليشمانيا وبمثابة وكلاء ضد الطفيليات (للمراجعة عن الببتيدات التي تستهدف مثبطات مضخة البروتون كعوامل مضادة للطفيليات 87). من خلال تركيب العمود الفقري رواية الببتيدات الحلقية، يتم حفظها pharmacophores في سقالة من حجم قابلة للتمديد. قوة المكتبة المركزة المقترحة هنا هي القدرة على تغيير أحجام الببتيد سقالة في حين يسمح بدرجة محدودة من حرية بتكوين خلال cyclization. وقد تم تركيب كامل من العمود الفقري الببتيدات الحلقية باستخدام المزج الميكروويف الآلي على دعم قوي، بعد بروتوكول Fmoc / TBU. تم إجراء Cyclization عن طريق إنشاء سندات أميد بين رابط، أنهيدريد / حامض، وأمين جانب سلسلة من ليسين. نفذت الانقسام والجانب سلسلة النهائي deprotection يدويا من دون طاقة الميكروويف (لنظام التوليف وومنتجات إينال هيكل انظر الشكل 3). وتم تحليل المنتج من قبل HPLC إعدادي لانتاج 25 ملغ من مسحوق أبيض المخزنة في -20 ° C. تم فحص عينة من المنتج من قبل MS (الشكل 4)، وتحديد درجته من النقاء باستخدام HPLC التحليلية (الشكل 5). وأرسلت عينة من كل الببتيد دوري لفحص البيولوجي. كان واحدا من أربعة الببتيدات الحلقية (PL1) فعال ضد الليشمانيا الدونوفانية (L. اللشمانيا الحشوية)، طفيلي يسبب داء الليشمانيات الحشوي وداء الليشمانيات أشد في البشر. انخفاض الببتيد PL1 بقاء الطفيلي بنسبة 75٪ مقارنة مع معاملة السيطرة (جدول 4).

الشكل (3)
الشكل 3. مخطط تحضير وهيكل الببتيد دوري العمود الفقري توليفها في هذه الدراسة الكواشف والشروط: (ط) الأمينية اقتران الحمضية: 300 ثانية، 25 W، 75 ° C،باستخدام 1.1: 1: 2.2 الأحماض الأمينية / المنشط / قاعدة المنشط. (ب) deprotection Fmoc: 30 ثانية و 180 ثانية سواء في 45 W، 75 ° C، وذلك باستخدام 20٪ تأكسد في DMF + 0.1 M HOBt. (ج) الاندريد اقتران: 300 ثانية، 25 W، 75 ° C، وذلك باستخدام 10: 10: 1 أنهيدريد / DIEA / DMAP في NMP. (د) الإنتقالي العسكري deprotection: 3 * (300 ثانية، 0 W، غ) باستخدام 1: 5: 94 TFA / TIS / DCM. (ت) Cyclization: 300 ثانية، 25 W، 75 ° C، وذلك باستخدام 5:10 PyBOP / DIEA في DBM. (السادس) الشق وdeprotection: 3 ساعات، 0 W، RT، وذلك باستخدام 90: 2،5: 2،5: 5 TFA / TIS / H 2 O / الفينول. تم مترافق الببتيدات إلى TAT 47-57 (صور-الغليسين-الارجنتين-ليز-ليز-الارجنتين-الارجنتين-GLN-الارجنتين-الارجنتين-الارجنتين) الناقل الببتيد من خلال السندات أميد كجزء من تخليق المرحلة الصلبة. يرجى النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. MALDI-TOF التحليل الطيفي الشامل أثر للالعمود الفقري ممثل الببتيد دوري. كتلة المرصودة، 2853.456 هو في الاتفاق على مقربة من كتلة محسوبة، 2854.271. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
ويبين الشكل 5. التحليلي أثر عكسي المرحلة HPLC من العمود الفقري ممثل الببتيد دوري، وآثار HPLC التحليلية من النفط الخام (A) وتنقيته (B) العمود الفقري الببتيد دوري. كانت أنظمة المذيبات المستخدمة A (H 2 O مع 0.1٪ TFA) وباء (CH 3 CN بنسبة 0.1٪ TFA). A الانحدار الخطي من 5-50٪ B في 1 مل / دقيقة في 15 دقيقة في 40 ° C مع C18، 5 ميكرون، وطبق 150 ملم عمود وكان كشف في 215 نانومتر. الرجاء انقر هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حل كاشف MW (ز / مول) د (ز / مل) الحجم (مل) تركيز (M) الكمية الكلية
- حل الأحماض الأمينية - الأحماض الأمينية ألانين 311.34 0.2 6.23 ز
0.2 M من الأحماض الأمينية في DMF DMF 100 100 مل
وينبغي أن يتم مثالا للحمض الأميني ألانين، ولكن نفس العملية الحسابية لكل الأحماض الأمينية، مع MW المناسب. لإعداد محلول حمض أميني 100 مل حل 6.23 غرام من الأحماض الأمينية ألانين في 100 مل DMF. تخزينها في 4 ° C.
- حل Deprotection- HOBt 135.1 0.1 3.37 ز
20٪ ت / ت حل تأكسد في DMF مع 0.1M HOBt تأكسد 50 50 مل
DMF 200 200 مل
يستخدم Deprotection لإزالة α Fmoc N - حماية المجموعة. لإعداد حل 250 مل deprotection إذابة 3.37 ز HOBt في 200 مل DMF وإضافة 50 مل تأكسد. تخزينها في 4 ° C.
- حل المنشط - HBTU 379.24 0.45 18.96 ز
0.45 M HBTU في DMF DMF 100 100 مل
المنشط هواستخدامها مع قاعدة المنشط لتفعيل الأحماض الأمينية قبل رد فعل اقتران. لإعداد محلول منشط 100 مل حل 18،96 ز HBTU في 100 مل DMF. تخزينها في 4 ° C.
- حل قاعدة المنشط - DIEA 129.24 0،742 2 34.80 مل
2 M DIEA في NMP NMP 65.20 مل
ويستخدم قاعدة المنشط مع المنشط لتفعيل الأحماض الأمينية قبل رد فعل اقتران. إعداد 100 مل قاعدة المنشط مزيج الحل 34.8 مل DIEA و65،2 مل NMP. تخزينها في 4 ° C.
حل كاشف MW (ز / مول) د (ز / مل) الحجم (مل) مكافئ الكمية الكلية
الحل أنهيدريد - 10: 1: 10 أنهيدريد / DMAP / DIEA في NMP الغلوتاريك / السكسينك 114.1 / 100.07 10 0،11 / 0،10 ز
DMAP 122.2 1 0.01 ز
DIEA 129.24 0،742 10 0.09 مل
NMP 5 5 مل
حل 0،11 / 0،10 غرام من الغلوتاريك / السكسينك في 5 مل NMP، إضافة 0،01 غرام من DMAP و0.09 مل من DIEA إلى الحل. يعد حل الطازجة.
حمض الحل - 10: 1: 10 حمض / DMAP / مدينة دبي للإنترنت في DMF الأديبيك / حمض البيميليك 146.14 / 160.17 10 0.15 / 0.16 ز
DMAP </ td> 122.2 1 0.01 ز
مدينة دبي للإنترنت 126.2 0،806 10 0.16 مل
DMF 5 5 مل
حل 0،15 / 0،16 غرام من الأديبيك / البيميليك حامض في 5 مل DMF، إضافة 0،01 غرام من DMAP و 0.16 مل من DIC إلى الحل. يعد حل الطازجة.
حل Cyclization - 05:10 PyBOP / DIEA في DBM PyBOP 520.3 5 0.26 ز
DIEA 129.24 0،742 10 0.09 مل
DBM 5 مل 5 مل
حل 0،26 ز PyBOP في 5 مل DBM وإضافة 0.09 مل من DIEA إلى الحل. إعدادحل جديد.

ويرد الجدول 1. الكواشف والحلول لالعمود الفقري الببتيد التوليف دوري. قائمة الحلول والكواشف لتوليف.

دورة الميكروويف السلطة (واتس) درجة الحرارة (° C) الوقت (ثانية)
1 اقتران الأحماض الأمينية 25 75 300
2 Deprotection من Fmoc مجموعة حماية (أ) deprotection الأولي 45 75 30
(ب) deprotection كاملة 45 75 180


الجدول 2. دورات الموجات الدقيقة للاقتران وdeprotection. دورات الميكروويف لالأمينية اقتران الحامض وFmoc-deprotection. (1) اقتران من الأحماض الأمينية. ويتم (2) Deprotection المجموعة اخفاء Fmoc في خطوتين: (أ) الأولى و (ب) deprotection كاملة.

مشكلة الأسباب المحتملة حل
كايزر أو الكلورانيل الاختبارات إيجابية بعد اقتران الأحماض الأمينية اقتران الأحماض الأمينية غير مكتمل كرر الخطوة اقتران
لا يتم فصل الببتيدات بكفاءة من طاف كميات زائدة من TFA تتبخر العينة باستخدام تيار من النيتروجين
وجود تسلسل الحذف في المنتج إزالة Fmoc غير مكتملة مراقبة deprotection التي كتبها قيصر أو الكلورانيل الاختبارات و / أو انشقاق على نطاق صغير، في حالة إزالة Fmoc هي تكرار ناقصة الخطوة
الأمينية حمض coupling غير مكتمل رصد اقتران التي كتبها قيصر أو الكلورانيل الاختبارات و / أو انشقاق على نطاق صغير، في حالة اقتران الأحماض الأمينية غير مكتمل كرر الخطوة و / أو استخدام أطول وقت رد الفعل

ويرد الجدول 3. استكشاف الأخطاء وإصلاحها المشورة قائمة من الحلول لمواجهة التحديات الاصطناعية الأكثر شيوعا.

الببتيد تسلسل ن السيدة. كال. MS التوليد. HPLC يخضع أو يستسلم بقاء الطفيلي
PL1 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 2 2854.321 2853.456 98٪ 86٪ 25٪
PL2 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 3 2868.348 98٪ 87٪ 100٪
PL3 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 4 2882.375 2881.823 96٪ 89٪ 97٪
pL4 RNGQCQRK-GG-YGRKKRRQRRR 5 2896.402 2895.603 97٪ 85٪ 98٪

الجدول 4. توصيف والنشاط الحيوي من الببتيدات في هذه الدراسة. ويشير n إلى عدد من methylenes في فاصل ألكيل (انظر الشكل 3 لهيكل). وقد تم MS باستخدام تقنية MALDI وتقرر نقاء من قبل HPLC التحليلية. أضيفت الببتيدات إلى الطور السوطي الليشمانيا الدونوفانية وتقييم الجدوى من الطفيليات وكنسبة البقاء على قيد الحياة في المائة مقارنة للسيطرة على الثقافات المحتضنة في غياب الببتيد. فقط كان PL1 النشاط مبيد الليشمانيات عالية. المراقبأصيب بالعمى في ظروف تجريبية. البيانات هي ممثل لثلاث تجارب مستقلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوصف تركيب مكتبة مركزة من العمود الفقري الببتيدات الحلقية المستمدة من البروتين عدم وجود طفيل الليشمانيا في استخدام المزج الميكروويف مؤتمتة بالكامل. وقد وضعت مكتبة مركزة من الببتيدات الحلقية مع pharmacophores التمايز ومختلف linkers. إضافة linkers مختلفة مثل أنهيدريد الغلوتاريك، السكسينك، حمض الأديبيك وحمض البيميليك، ليسين، الأورنيثين، واللبنات الأخرى يمكن استخدامها لزيادة متنوعة من مساحة بتكوين من الببتيدات الحلقية. تركيب مكتبة الببتيدات الحلقية مركزة يسمح للباحثين للكشف عن مساحة بتكوين الأمثل. منذ التشكل من الببتيدات الحلقية يختلف باختلاف المعلمات مثل حجم الحلبة، والموقف، ويمكن أن تتولد النظير متنوعة مع التشكل المختلفة، والتي قد تكون مفيدة في البيولوجية العلاقة بين الهيكل والنشاط يدرس 88.

ويتمثل التحدي الرئيسي في SPPS هي تشخيص syntيتم عزل التقدم hetic وحل مشكلة لأنه لا سيطة. لذلك، العديد من الاختبارات اللونية يمكن استخدامها لرصد رد الفعل، مثل تلك التي تحدد الأمينات حرة بحلول كايزر والكلورانيل الاختبارات. إذا القيصر أو الكلورانيل الاختبارات ليست الإرشادية (على سبيل المثال، البرولين وهيدروكسي برولين لا تتفاعل مع النينهيدرين في نفس الطريقة التي يعامل بها الأحماض الأمينية الأخرى لمجموعة أمينية ألفا على جزء من حلقة خماسية)، وهو رد فعل الانقسام على نطاق صغير وتحليل الطيف الكتلي يمكن تطبيقها لرصد التقدم المحرز التوليف.

يمكن تعديل الوقت الانقسام وكوكتيل الانقسام على أساس الخصائص الكيميائية وعدد من المجموعات حماية المستخدم. فمن المستحسن أن الانقسام المحاكمة الأولي باستخدام كمية صغيرة من الراتنج (1-10 ملغ) أن يؤديها للتحقق الظروف الملائمة. الملك وآخرون قد اختبرت الكوكتيلات الانقسام مختلفة لمختلف الببتيدات والمبادئ التوجيهية التفصيلية يمكن استخدامها لتحسين reactioن الظروف 89. لالعمود الفقري الببتيدات الحلقية، ويوصى الحضانة لا يقل عن 3 ساعة كإعداد افتراضي للانشقاق كامل. ومع ذلك، الببتيدات التي تحتوي على عدد كبير من الجماعات حماية أو جماعات حماية صعبة (على سبيل المثال، استر تي بوتيل أو pentamethyl-2،3-dihydrobenzofuran-5-السلفونيل) ينبغي المحتضنة لفترة أطول لضمان deprotection كاملة. هنا، ونحن لم تدرس بشكل منهجي الوقت الأمثل الانقسام أو كوكتيل. ومع ذلك، وجدنا أن الوقت الشق قصيرة (أقل من 2 ساعة) أدى إلى انشقاق ناقصة من بعض الجماعات حماية.

بروتوكول التوليف الببتيد الميكروويف هو معيار طريقة ينطبق بشكل عام لتركيب مجموعة متنوعة من الببتيدات. في معظم الحالات، واستخدام المزج الميكروويف التلقائي يقلل من مدة التوليف ويزيد من المحصول والنقاء من المنتجات. وعلاوة على ذلك، فإنه يقلل التفاعلات الجانبية مثل تروسم وتشكيل aspartimide. على الرغم من أننا لم تفعلمقارنة جنبا إلى جنب الميكروويف والتوليف التقليدية في هذه الدراسة، استنادا لدينا خبرة ومختبرات أخرى، تبين أن استخدام التوليف بمساعدة الميكروويف متفوقة على البروتوكول التقليدي 61،70. تقريبا كل المنشطات وراتنجات يمكن استخدامها بشكل فعال في SPPS الميكروويف ويمكن أيضا طريقة عامة يمكن تطبيقها على تركيب مجموعة متنوعة من الببتيدات المعدلة، مثل، glycopeptides، phosphopeptides، azapeptides، peptoids، والببتيدات الحلقية 90.

Cyclization هو وسيلة مريحة لتعزيز قوة واستقرار السلائف الخطية. يمكن أن الببتيدات الحلقية الحصول على التشكل مرغوب فيه قيود التي قد تسهم في زيادة تقارب ملزم والانتقائية. وعلاوة على ذلك، الببتيدات الخطية يمكن تعديل لاحتواء حلقات دورية متعددة، وتمكينهم من المحتمل استهداف متعددة البروتين الذاتية واجهات ملزمة 91. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن cyclization لا necessيؤدي arily إلى تحسينات في جميع أو في بعض الأحيان أي من هذه الخصائص. يمكن بعض الببتيدات الحلقية يؤدي في التشكل التي لا تعترف بها مستقبلات المستهدفة (على سبيل المثال 92،93). لذلك، مكتبة مركزة من الببتيدات الحلقية ضرورية للكشف عن النشاط الحيوي. في الختام، الببتيدات الحلقية الاصطناعية يحمل الخصائص الدوائية مرغوب فيه، هي صغيرة بما يكفي لعبور غشاء الخلية، وكبيرة بما يكفي ليكون الانتقائية العالية. عالية الفعالية والنوعية، والبيانات الشخصية آمنة تسهم في الوعد الببتيدات الحلقية "كمرشحين المخدرات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر لورين فان فاسينهوف، Sunhee هوانج، وداريا Mochly روزين لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIH منح RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) لكيو زيارتها للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Solid support, Rink Amide AM resin ML CBL BR-1330 loading: 0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH Advanced Chemtech FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH Advanced Chemtech FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH Advanced Chemtech FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH Advanced Chemtech FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH Advanced Chemtech FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH Advanced Chemtech FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH Advanced Chemtech FE2237
Fmoc-Gly-OH Advanced Chemtech FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH Advanced Chemtech FH2316
Fmoc-Ile-OH Advanced Chemtech FI2326
Fmoc-Leu-OH Advanced Chemtech FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH Advanced Chemtech FK2390
Fmoc-Met-OH Advanced Chemtech FM2400
Fmoc-Phe-OH Advanced Chemtech FF2425
Fmoc-Pro-OH Advanced Chemtech FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH Advanced Chemtech FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH Advanced Chemtech FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH Advanced Chemtech FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH Advanced Chemtech FY2563
Fmoc-Val-OH Advanced Chemtech FV2575
1-Methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma 328634 Caution Toxic/Highly flammable/Irritant.
N,N-Dimethylformamide (DMF) Alfa Aesar 43465 Caution Toxic.
Use high quality DMF to eliminate side reactions such as Fmoc removal as a result of the dimethylamine traces from DMF decomposition.
Dichloromethane (DCM) Sigma D65100 Caution Harmful
Dibromomethane (DBM) Sigma D41868 Caution Harmful
Trifluoroacetic acid (TFA) Sigma T62200 Caution Corrosive/Toxic
Trifluoroacetic acid, HPLC grade (TFA) Sigma 91707 Caution Corrosive/Toxic
Diethylether Sigma 31690 Caution Highly flammable/Harmful
Triisopropylsilane (TIS) Sigma 233781 Caution Irritant/Flammable
Water, HPLC grade Sigma 270733
Acetonitroile, HPLC grade (ACN) Fisher Scientific A998-4 Caution Flammable/Irritant/Harmful
N,N-Diisopropylethylamine (DIEA) Sigma 3440 Caution Corrosive/Highly flammable
Piperidine Sigma W290807 Caution Toxic/Highly flammable
Pyridine Sigma 270970 Caution Highly flammable/Harmful
Ethanol (EtOH) Sigma 459844 Caution Highly flammable/Irritant
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt) Sigma 157260 Caution Highly flammable/Irritant/Harmful
O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′- tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Sigma 12804 Caution Irritant/Harmful
Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate (PyBOP) Advanced Chemtech RC8602 Caution Irritant
Ninhydrin Sigma 454044 Caution Harmful
Phenol Sigma P3653 Caution Corrosive/Toxic
Potassium cyanide (KCN) Sigma 11813 Caution Very Toxic
Potassium hydroxide (KOH) Sigma 221473 Caution Toxic
N,N’-Diisopropylcarbodiimide (DIC) Sigma 38370 Caution Flammable/ Toxic
4-Dimethylaminopyridine (DMAP) Sigma 522805 Caution Toxic/Irritant
Glutaric anhydride Sigma G3806 Caution Flammable/Irritant/Harmful
Succinic anhydride Sigma 239690 Caution Irritant/Harmful
Adipic acid Sigma A26357 Caution Toxic/Irritant
Pimelic acid Sigma P45001 Caution Toxic/Irritant
Chloranil Sigma 23290 Caution Toxic/Irritant
Acetaldehyde Sigma 402788 Caution Flammable/ Toxic
EQUIPMENT
Centrifuge Beckman Coulter Allegra 6R centrifuge
Lyophilizer Labconco freezone 4.5
Vacuum pump Franklin Electric model 1101101416 with 3/4 HP Alcatel pump with Franklin Motor 
Polypropylene cartridge 12 ml Applied Separation 2419
Cap plug for 12 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8157
Polypropylene cartridge 3 ml Applied Separation 2413
Cap plug for 3 ml polypropylene cartridge Applied Separation 8054
Stop cocks PTFE Applied Separation 2406
Tubes flat, 50 ml VWR 21008-240
Extraction manifold, 20 pos, 16 x 100 mm tubes Waters WAT200609
Shaker, BD adams nutator mixer Fisher scientific 22363152
Nalgene HDPE narrow mouth IP2 bottles, 125 ml Fisher scientific 03-312-8
Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB-501, 500 ml
Heating block Thermolyne 1760 dri bath
Disposable borosilicate glass tubes with plain end Fisher Scientific 14-961-25
Micropipettes and tips Finnpipette Thermo 20–200 and 100–1,000 μl
HPLC vials - micro vl pp 400 µl PK100   VWR 69400-124
HPLC vial- Blue Snap-It Cap VWR 66030-600
Analytical HPLC column Peeke Scientific U1-5C18Q-JJ ultro 120 5 µm C18Q, 4.6 mm ID 150 mm
Prep HPLC column, XBridge  Waters OBD C18 5 µm column 19 mm × 150 mm
Mass spectrometer Applied Biosystems Voyager DE-RP 
Nitrogen cylinder
Desiccator
Analytical RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-20AD solvent delivery unit, SIL-20AC autosampler, DGU-20A5 degasser (Shimadzu, MD, USA).
Preparative RP-HPLC system Shimadzu LC-20 equipped with: CBM-20A system controller, SPD-20A detector, CTO-20A column oven, 2 x LC-6AD solvent delivery unit and FRC-10A fraction collector (Shimadzu, MD, USA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wells, J. A., McClendon, C. L. Reaching for high-hanging fruit in drug discovery at protein-protein interfaces. Nature. 450, (7172), 1001-1009 (2007).
  2. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. (4), 301-317 (2004).
  3. Mandell, D. J., Kortemme, T. Computer-aided design of functional protein interactions. Nat. Chem. Biol. 5, (11), 797-807 (2009).
  4. Friedler, A., et al. Backbone cyclic peptide, which mimics the nuclear localization signal of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein, inhibits nuclear import and virus production in nondividing cells. Biochemistry. 37, (16), 5616-5622 (1998).
  5. Brandman, R., Disatnik, M. H., Churchill, E., Mochly-Rosen, D. Peptides derived from the C2 domain of protein kinase C epsilon (epsilon PKC) modulate epsilon PKC activity and identify potential protein-protein interaction surfaces. J. Biol. Chem. 282, (6), 4113-4123 (2007).
  6. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J., Khrestchatisky, M. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug discov today. 15, (1-2), 40-56 (2010).
  7. Marx, V. Watching Peptide Drugs Grow Up. Chemical & Engineering News. 83, American Chemical Society. 17-24 (2005).
  8. Denicourt, C., Dowdy, S. F. Medicine. Targeting apoptotic pathways in cancer cells. Science. 305, (5689), 1411-1413 (2004).
  9. Qvit, N., et al. Synthesis of a novel macrocyclic library: discovery of an IGF-1R inhibitor. J Comb Chem. 10, (2), 256-266 (2008).
  10. Patch, J. A., Barron, A. E. Mimicry of bioactive peptides via non-natural, sequence-specific peptidomimetic oligomers. Curr. Opin. Chem. Biol. 6, (6), 872-877 (2002).
  11. Kessler, H. Peptide Conformations .19. Conformation and Biological-Activity of Cyclic-Peptides. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21, (7), 512-523 (1982).
  12. Gazal, S., Gelerman, G., Gilon, C. Novel Gly building units for backbone cyclization: synthesis and incorporation into model peptides. Peptides. 24, (12), 1847-1852 (2003).
  13. Fesik, S. W., et al. NMR studies of [U-13C]cyclosporin A bound to cyclophilin: bound conformation and portions of cyclosporin involved in binding. Biochemistry. 30, (26), 6574-6583 (1991).
  14. Kornfeld, O. S., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species at the Heart of the Matter: New Therapeutic Approaches for Cardiovascular Diseases. Circ. Res. 116, (11), 1783-1799 (2015).
  15. Boguslavsky, V., Hruby, V. J., O'Brien, D. F., Misicka, A., Lipkowski, A. W. Effect of peptide conformation on membrane permeability. J. Pept. Res. 61, (6), 287-297 (2003).
  16. Eguchi, M., et al. Solid-phase synthesis and structural analysis of bicyclic beta-turn mimetics incorporating functionality at the i to i+3 positions. J. Am. Chem. Soc. 121, (51), 12204-12205 (1999).
  17. Altstein, M., et al. Backbone cyclic peptide antagonists, derived from the insect pheromone biosynthesis activating neuropeptide, inhibit sex pheromone biosynthesis in moths. J. Biol. Chem. 274, (25), 17573-17579 (1999).
  18. Cheng, M. F., Fang, J. M. Liquid-phase combinatorial synthesis of 1,4-benzodiazepine-2,5-diones as the candidates of endothelin receptor antagonism. J. Comb. Chem. 6, (1), 99-104 (2004).
  19. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis I. the Synthesis of a Tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
  20. Pfeiffer, C. T., Schafmeister, C. E. Solid phase synthesis of a functionalized bis-peptide using 'safety catch' methodology. J Vis Exp. (63), e4112 (2012).
  21. Coin, I., Beyermann, M., Bienert, M. Solid-phase peptide synthesis: from standard procedures to the synthesis of difficult sequences. Nat. Protoc. 2, (12), 3247-3256 (2007).
  22. Qvit, N., et al. Design and synthesis of backbone cyclic phosphorylated peptides: the IκB model. Biopolymers. 91, (2), 157-168 (2009).
  23. Sainlos, M., Imperiali, B. Tools for investigating peptide-protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores through SPPS-based 'building block' approach. Nat. Protoc. 2, (12), 3210-3218 (2007).
  24. Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nat. Protoc. 2, (6), 1333-1349 (2007).
  25. Qi, X., Qvit, N., Su, Y. C., Mochly-Rosen, D. A novel Drp1 inhibitor diminishes aberrant mitochondrial fission and neurotoxicity. J. Cell Sci. 126, (Pt 3), 789-802 (2013).
  26. Beaucage, S. L. Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11, (2), 203-216 (2008).
  27. Dhanawat, M., Shrivastava, S. K. Solid-Phase Synthesis of Oligosaccharide Drugs: A Review. Mini Rev Med Chem. 9, (2), 169-185 (2009).
  28. Seeberger, P. H., Werz, D. B. Synthesis and medical applications of oligosaccharides. Nature. 446, (7139), 1046-1051 (2007).
  29. Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid-phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291, (5508), 1523-1527 (2001).
  30. Komiyama, M., Aiba, Y., Ishizuka, T., Sumaoka, J. Solid-phase synthesis of pseudo-complementary peptide nucleic acids. Nat. Protoc. 3, (4), 646-654 (2008).
  31. Christensen, L., et al. Solid-Phase synthesis of peptide nucleic acids. J. Pept. Sci. 1, (3), 175-183 (1995).
  32. Qvit, N., et al. Development of bifunctional photoactivatable benzophenone probes and their application to glycoside substrates. Biopolymers. 90, (4), 526-536 (2008).
  33. O'Neill, J. C., Blackwell, H. E. Solid-phase and microwave-assisted syntheses of 2,5-diketopiperazines: small molecules with great potential. Comb Chem High Throughput Screen. 10, (10), 857-876 (2007).
  34. Qvit, N., Barda, Y., Shalev, D., Gilon, C. A Laboratory Preparation of Aspartame Analogs Using Simultaneous Multiple Parallel Synthesis Methodology. J. Chem. Educ. 84, (12), 1988-1991 (2007).
  35. Truran, G. A., Aiken, K. S., Fleming, T. R., Webb, P. J., Markgraf, J. H. Solid phase organic synthesis and combinatorial chemistry: A laboratory preparation of oligopeptides. J. Chem. Educ. 79, (1), 85-86 (2002).
  36. Verlander, M. Industrial applications of solid-phase peptide synthesis - A status report. Int. J. Pept. Res. Ther. 13, (1-2), 75-82 (2007).
  37. Bray, B. L. Large-scale manufacture of peptide therapeutics by chemical synthesis. Nature reviews. Drug discovery. 2, (7), 587-593 (2003).
  38. Qvit, N. Development and therapeutic applications of oligonucleotides and peptides. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 29, (2), 4-7 (2011).
  39. Carpino, L. A., Han, G. Y. 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino-Protecting Group. J. Org. Chem. 37, (22), 3404-3409 (1972).
  40. Gedye, R., et al. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27, (3), 279-282 (1986).
  41. Giguere, R. J., Bray, T. L., Duncan, S. M., Majetich, G. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis. Tetrahedron Lett. 27, (41), 4945-4948 (1986).
  42. Kappe, C. O., Dallinger, D. The impact of microwave synthesis on drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 5, (1), 51-63 (2006).
  43. Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, (46), 6250-6284 (2004).
  44. de la Hoz, A., Diaz-Ortiz, A., Moreno, A. Microwaves in organic synthesis. Thermal and non-thermal microwave effects. Chem. Soc. Rev. 34, (2), 164-178 (2005).
  45. Yu, H. M., Chen, S. T., Wang, K. T. Enhanced coupling efficiency in solid-phase peptide synthesis by microwave irradiation. J. Org. Chem. 57, (18), 4781-4784 (1992).
  46. Mingos, D. M. P., Baghurst, D. R. Tilden Lecture. Applications of microwave dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry. Chem. Soc. Rev. 20, (1), 1-47 (1991).
  47. Gabriel, C., Gabriel, S., Grant, E. H., Halstead, B. S. J., Mingos, D. M. P. Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating. Chem. Soc. Rev. 27, (3), 213-224 (1998).
  48. Sabatino, G., Papini, A. M. Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 11, (6), 762-770 (2008).
  49. Banerjee, J., Hanson, A. J., Muhonen, W. W., Shabb, J. B., Mallik, S. Microwave-assisted synthesis of triple-helical, collagen-mimetic lipopeptides. Nat. Protoc. 5, (1), 39-50 (2010).
  50. Bacsa, B., Kappe, C. O. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation. Nat. Protoc. 2, (9), 2222-2227 (2007).
  51. Murray, J. K., Gellman, S. H. Parallel synthesis of peptide libraries using microwave irradiation. Nat. Protoc. 2, (3), 624-631 (2007).
  52. Palasek, S. A., Cox, Z. J., Collins, J. M. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis. J Pept Sci. 13, (3), 143-148 (2007).
  53. Murray, J. K., Aral, J., Miranda, L. P. Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation. Methods Mol. Biol. 716, 73-88 (2011).
  54. Galanis, A. S., Albericio, F., Grotli, M. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Organic Letters. 11, (20), 4488-4491 (2009).
  55. Rizzolo, F., Sabatino, G., Chelli, M., Rovero, P., Papini, A. M. A convenient microwave-enhanced solid-phase synthesis of difficult peptide sequences: Case study of Gramicidin A and CSF114(Glc). Int. J. Pept. Res. Ther. 13, (1-2), 203-208 (2007).
  56. Matsushita, T., Hinou, H., Kurogochi, M., Shimizu, H., Nishimura, S. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis. Org Lett. 7, (5), 877-880 (2005).
  57. Nagaike, F., et al. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester. Org Lett. 8, (20), 4465-4468 (2006).
  58. Naruchi, K., et al. Construction and structural characterization of versatile lactosaminoglycan-related compound library for the synthesis of complex glycopeptides and glycosphingolipids. J. Org. Chem. 71, (26), 9609-9621 (2006).
  59. Brandt, M., Gammeltoft, S., Jensen, K. J. Microwave heating for solid-phase peptide synthesis: General evaluation and application to 15-mer phosphopeptides. Int. J. Pept. Res. Ther. 12, (4), 349-357 (2006).
  60. Harris, P. W. R., Williams, G. M., Shepherd, P., Brimble, M. A. The Synthesis of Phosphopeptides Using Microwave-assisted Solid Phase Peptide Synthesis. Int. J. Pept. Res. Ther. 14, (4), 387-392 (2008).
  61. Qvit, N. Microwave-assisted Synthesis of Cyclic Phosphopeptide on Solid Support. Chem. Biol. Drug Des. 85, (3), 300-305 (2014).
  62. Kato, D., Verhelst, S. H., Sexton, K. B., Bogyo, M. A general solid phase method for the preparation of diverse azapeptide probes directed against cysteine proteases. Org Lett. 7, (25), 5649-5652 (2005).
  63. Olivos, H. J., Alluri, P. G., Reddy, M. M., Salony, D., Kodadek, T. Microwave-assisted solid-phase synthesis of peptoids. Org Lett. 4, (23), 4057-4059 (2002).
  64. Gorske, B. C., Jewell, S. A., Guerard, E. J., Blackwell, H. E. Expedient synthesis and design strategies for new peptoid construction. Org Lett. 7, (8), 1521-1524 (2005).
  65. Grieco, P., et al. Design and microwave-assisted synthesis of novel macrocyclic peptides active at melanocortin receptors: discovery of potent and selective hMC5R receptor antagonists. J. Med. Chem. 51, (9), 2701-2707 (2008).
  66. Boutard, N., Jamieson, A. G., Ong, H., Lubell, W. D. Structure-Activity Analysis of the Growth Hormone Secretagogue GHRP-6 by alpha- and beta-Amino gamma-Lactam Positional Scanning. Chem. Biol. Drug Des. 75, (1), 40-50 (2010).
  67. Jamieson, A. G., et al. Positional scanning for peptide secondary structure by systematic solid-phase synthesis of amino lactam peptides. J. Am. Chem. Soc. 131, (22), 7917-7927 (2009).
  68. Hossain, M. A., Bathgate, R. A. D., Tregear, G., Wade, J. D. De Novo Design and Synthesis of Cyclic and Linear Peptides to Mimic the Binding Cassette of Human Relaxin. Annals of the New York Academy of Sciences. 1160, 16-19 (2009).
  69. Fowler, S. A., Stacy, D. M., Blackwell, H. E. Design and synthesis of macrocyclic peptomers as mimics of a quorum sensing signal from Staphylococcus aureus. Org Lett. 10, (12), 2329-2332 (2008).
  70. Cemazar, M., Craik, D. J. Microwave-assisted Boc-solid phase peptide synthesis of cyclic cysteine-rich peptides. J Pept Sci. 14, (6), 683-689 (2008).
  71. Miles, S. M., Leatherbarrow, R. J., Marsden, S. P., Coates, W. J. Synthesis and bio-assay of RCM-derived Bowman-Birk inhibitor analogues. Org Biomol Chem. 2, (3), 281-283 (2004).
  72. Murray, J. K., et al. Efficient synthesis of a beta-peptide combinatorial library with microwave irradiation. J. Am. Chem. Soc. 127, (38), 13271-13280 (2005).
  73. Churchill, E. N., Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Rationally designed peptide regulators of protein kinase. C. Trends Endocrinol. Metab. 20, (1), 25-33 (2009).
  74. Mochly-Rosen, D., Qvit, N. Peptide inhibitors of protein-protein interactions. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 28, (1), 14-16 (2010).
  75. Qvit, N., Mochly-Rosen, D. Highly specific modulators of protein kinase C localization: applications to heart failure. Drug Discov. Today Dis. Mech. 7, (2), e87-e93 (2010).
  76. Mougneau, E., et al. Expression cloning of a protective Leishmania antigen. Science. 268, (5210), 563-566 (1995).
  77. Kelly, B. L., Stetson, D. B., Locksley, R. M. Leishmania major LACK antigen is required for efficient vertebrate parasitization. J. Exp. Med. 198, (11), 1689-1698 (2003).
  78. Choudhury, K., et al. Trypanosomatid RACK1 orthologs show functional differences associated with translation despite similar roles in Leishmania pathogenesis. PLoS One. 6, (6), e20710 (2011).
  79. Gonzalez-Aseguinolaza, G., Taladriz, S., Marquet, A., Larraga, V. Molecular cloning, cell localization and binding affinity to DNA replication proteins of the p36/LACK protective antigen from Leishmania infantum. Eur. J. Biochem. 259, (3), 909-916 (1999).
  80. Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol. Med. 13, (10), 443-448 (2007).
  81. Aletras, A., Barlos, K., Gatos, D., Koutsogianni, S., Mamos, P. Preparation of the very acid-sensitive Fmoc-Lys(Mtt)-OH. Application in the synthesis of side-chain to side-chain cyclic peptides and oligolysine cores suitable for the solid-phase assembly of MAPs and TASPs. Int. J. Pept. Protein Res. 45, (5), 488-496 (1995).
  82. Li, D., Elbert, D. L. The kinetics of the removal of the N-methyltrityl (Mtt) group during the synthesis of branched peptides. J. Pept. Res. 60, (5), 300-303 (2002).
  83. Bourel, L., Carion, O., Gras-Masse, H., Melnyk, O. The deprotection of Lys(Mtt) revisited. J Pept Sci. 6, (6), 264-270 (2000).
  84. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J Vis Exp. (57), e3373 (2011).
  85. Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D., Cook, P. I. Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides. Anal. Biochem. 34, (2), 595-598 (1970).
  86. Christensen, T. Qualitative Test for Monitoring Coupling Completeness in Solid-Phase Peptide-Synthesis Using Chloranil. Acta Chem. Scand. Ser.B-Org. Chem. Biochem. 33, (10), 763-766 (1979).
  87. Qvit, N., Crapster, J. A. Peptides that Target Protein-Protein Interactions as an Anti-Parasite Strategy. chimica Oggi / CHEMISTRY today. 32, (6), 62-66 (2014).
  88. Byk, G., et al. Synthesis and biological activity of NK-1 selective, N-backbone cyclic analogs of the C-terminal hexapeptide of substance P. J. Med. Chem. 39, (16), 3174-3178 (1996).
  89. King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Protein Res. 36, (3), 255-266 (1990).
  90. Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chemical Society Reviews. 41, (5), 1826-1844 (2012).
  91. Colangelo, A. M., et al. A new nerve growth factor-mimetic peptide active on neuropathic pain in rats. J. Neurosci. 28, (11), 2698-2709 (2008).
  92. Mesfin, F. B., Andersen, T. T., Jacobson, H. I., Zhu, S., Bennett, J. A. Development of a synthetic cyclized peptide derived from alpha-fetoprotein that prevents the growth of human breast cancer. J. Pept. Res. 58, (3), 246-256 (2001).
  93. Mizejewski, G. J., Muehlemann, M., Dauphinee, M. Update of alpha fetoprotein growth-inhibitory peptides as biotherapeutic agents for tumor growth and metastasis. Chemotherapy. 52, (2), 83-90 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics