Selective Cellule élimination de Mixed Culture 3D en utilisant une technique proche infrarouge Photoimmunotherapy

1Molecular Imaging Program, National Cancer Institute
Bioengineering

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Sato, K., Choyke, P. L., Hisataka, K. Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique. J. Vis. Exp. (109), e53633, doi:10.3791/53633 (2016).

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Abstract

Introduction

L'élimination des cellules spécifiques sans endommager d'autres cellules est extrêmement difficile, en particulier dans le tissu mis en place, et il y a un besoin urgent d'une méthode d'élimination des cellules dans le domaine de l'ingénierie tissulaire. Aujourd'hui , dans le domaine de la médecine régénérative, les cultures de tissus en utilisant des cellules souches embryonnaires (ES), les cellules souches pluripotentes (PSC), ou induite par les cellules souches pluripotentes (iPS) sont des matériaux prometteurs 1-3.

Bien que cette régénération tissulaire est prometteur, la contamination par des cellules non désirées est une préoccupation majeure. De plus, il y a un problème de sécurité tumorigène après transplantation 4,5. Bien que de nombreuses études se sont focalisées sur ces points pour éliminer les cellules spécifiques, en particulier dans la médecine régénératrice 6 - 8, aucune méthode pratique a été développée.

photoimmunotherapy proche infrarouge (NIR-PIT) est un traitement basé sur un conjugat anticorps-photoabsorbante (APC). L'APC se compose d'un anticorps monoclonal spécifique à la cellule (mAb) et un photoabsorbeur, IR700. IR700 est un dérivé de silice-phtalocyanine hydrophile et ne provoque pas lui - même par phototoxicité 9. IR700 est conjugué de manière covalente à l'anticorps par l'intermédiaire des résidus amide de la chaîne latérale de molécules de lysine. Le CPA se lie à des molécules cibles sur la membrane cellulaire et induit une nécrose cellulaire quasi immédiate après une exposition à une lumière proche infrarouge à 690 nm. Au cours de l'exposition au NIR-lumière, les ruptures de la membrane cellulaire conduisant à la mort des cellules 9-14. RIN-PIT est révélée être efficace avec plusieurs anticorps ou fragments d' anticorps, y compris des anti-EGFR, anti-HER2 et anti-PSMA, anti-CD25, anti-mésothéline, anti-GPC3 et anti-CEA 15-21. Par conséquent, le NIR IPP peut être utilisé contre une grande variété de molécules cibles. Par ailleurs, NIR-PIT est un traitement bien contrôlé qui permet le traitement sélectif des régions spécifiques en limitant le NIR-light irradiation 18,22.

Ici, nous présentons une méthode d'élimination de cellules spécifiques en utilisant NIR-PIT à partir de cultures mixtes 3D.

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Protocol

Remarque: Le protocole suivant décrit les étapes nécessaires pour éliminer les cellules spécifiques en utilisant NIR-PIT. Commandes et autres détails sur NIR-PIT et la viabilité des cellules peuvent être trouvées ailleurs 18.

1. Conjugaison IR700 à des anticorps monoclonaux (mAb)

  1. Préparer un mAb d'intérêt à 2-5 mg / ml dans 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,6) la solution.
  2. Mélanger 6,8 nmol de mAb avec 30,8 nmol mM IR700 10 dans 0,1 M Na 2 HPO 4 solution (pH 8,6) dans un tube à centrifuger et incuber à température ambiante pendant 1 h, recouverts d' une feuille d'aluminium.
  3. Laver la colonne PD-10 (voir le tableau des matériaux / équipement) avec 15 ml de PBS, deux fois. Chargez l'échantillon de l'étape 1.2.
  4. On purifie le mélange par l'intermédiaire de la colonne PD-10 par élution de PBS selon les instructions du fabricant.
    Note: Ici, l'élution a été le long de la couleur de la bande de IR700. Pour un échantillon de 300 pi, fraction d'élution PBS est typiquement entre 2,5 ml à 4,4 ml.
  5. Détermine lela concentration en protéine avec coloration de Coomassie , en mesurant l'absorption à 595 nm avec un spectrophotomètre 9. Déterminer la concentration de IR700 avec une absorption à 689 nm pour confirmer le nombre de molécules de fluorophore conjugué à chaque molécule de mAb 9.
    Note: Il est important de déterminer un nombre optimal de conjugaison de molécules IR700 en 1 mAb avec un spectrophotomètre. En général, environ 3 molécules d'IR700 dans 1 molécule mAb est optimale pour les deux in vitro et in vivo de travail. méthodes HPLC et SDS-PAGE peuvent être utilisés pour confirmer si le mAb et IR700 sont liés ou non.
  6. Conserver à 4 ° C, après la détermination de la concentration en protéines.

2. Préparation de la culture mixte de Cell 3D (Mixed Spheroid)

  1. Appliquer de l'eau stérile (environ 1 ml) dans la section de réservoir de la plaque de la pendaison plaques de chute.
  2. Préparer divers rapports des types d'intérêt de cellules - cellules A431-luc-GFP et les cellules 3T3-DP -pour chaque échantillon contenant 5000 cellules au total, en suspension dans 50 ul de milieu de culture.
    Note: Préparer 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, etc. rapports de types de cellules d'intérêt dans le milieu de culture en fonction du type de cellule.
  3. Laisser incuber le mélange pendant 5-7 jours dans la plaque de puits suspendu goutte 96 dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone. Changer les milieux de culture tous les 2 jours. Remarque: Pour faire de la 3D sphéroïde précisément, manipuler délicatement la plaque, sous forme de gouttes contenant des cellules tombent facilement avant de former des formes 3D.
  4. Observer la morphologie et la taille des sphéroïdes en utilisant un microscope inversé à fond clair 10X - 40X. Note: Bien que cela dépende des types de cellules et la taille de goutte suspendue, veiller à ce que le diamètre du sphéroïde est d'environ 400-600 um après 7 jours d'incubation dans le 96 puits suspendus plaque de chute.

3. In Vitro NIR-PIT pour la culture cellulaire mixte 3D

  1. Changer les médias de l'haNging plaques de chute de 10 pg / ml d'anticorps conjugué photoabsorbeur (APC), les milieux contenant, et laisser incuber pendant 6 heures dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone.
  2. Après 6 heures d'incubation, laver le sphéroïde deux fois avec un milieu de culture frais (sans rouge de phénol). transférer doucement le sphéroïde à un 50 mm plat en verre à fond avec 100 ul de phénol rouge frais des milieux de culture libre en utilisant une pointe de pipette 200 pi stérile avec la pointe coupée. Placez un sphéroïde dans chaque plat.
  3. Observer le sphéroïde avec un microscope inversé à fond clair pour détecter le changement de la morphologie. Pour observer les journalistes optiques (par exemple, GFP et RFP) utiliser un microscope à fluorescence avec les paramètres de filtre suivants: GFP - filtre d'excitation 469 nm, et un filtre d'émission de 525 nm; RFP - 559 nm filtre d'excitation et 630 nm filtre d'émission.
  4. Placez la diode électroluminescente (LED) au-dessus du plat à fond de verre pour l'irradiation.
    Note: Spheroids peuvent être exposés à NIRla lumière soit sur le microscope ou dans la hotte laminaire.
    1. Mesurer la densité de puissance du RIN-lumière avec un mesureur de puissance optique 9. Selon cette mesure, irradier NIR-lumière par l' intermédiaire des diodes électroluminescentes (DEL) qui émettent de la lumière à des longueurs d' onde de 710 nm à 670 à 2 J / cm 2.
      Remarque: la lumière LED peut pénétrer la profondeur maximale d'environ 5 pouces. Les effets cytotoxiques de NIR-PIT ne dépend que de l' énergie donnée indépendamment de la densité de puissance et la durée de l' exposition 23.
  5. Après irradiation, le transfert du sphéroïde dans une nouvelle plaque de goutte suspendue avec 50 ul de milieu de culture frais et on incube pendant 1 jour dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone.
  6. transférer doucement le sphéroïde dans un plat à fond de verre avec 100 ul de milieu de culture frais (rouge de phénol libre) à l'aide d'une pointe de pipette 200 pi stérile avec la pointe coupée. Observer le sphéroïde avec un microscope à fluorescence 1 jour après NIR-PIT en utilisant fiparamètres ltre décrits dans l'étape 3.3.
    1. Détecter les cellules mortes en ajoutant de l'iodure de propidium à la presse à une concentration finale de 2 pg / ml, soit par la perte de fluorescence de la GFP cytoplasmique en utilisant un microscope à fluorescence (figure 2B) 14,18,22.
  7. Répéter les étapes 3.1 à 3.6 si les cellules cibles ne sont pas complètement éliminés.

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Representative Results

Pour surveiller optiquement l'effet de NIR-PIT, la lignée cellulaire A431, qui surexprime EGFR, a été génétiquement modifié pour exprimer également la GFP et la luciférase (A431-luc-GFP). En tant que non-cible de NIR-PIT, la lignée cellulaire Balb / 3T3 a été optiquement modifiée pour exprimer RFP (3T3-RFP). L'APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), a été synthétisé. Sphéroïdes mixtes, qui ont été composées de divers rapports de cellules (A431-luc-GFP et 3T3-DP) ont été fabriqués selon ce protocole (Figure 1). Répétée NIR-PIT a été réalisée avec l'incubation de pan-IR700 (voir schéma de la figure 2A). Cible élimination des cellules de cette culture mixte 3D a été réalisée et surveillée par fluorescence et la luciférase activités (figure 2B, C). D'autre part, les cellules non-cibles ont continué de croître.

Figure 1
16 ans. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Cible élimination des cellules dans les sphéroïdes de cellules (3D des sphéroïdes mixtes de cellules A431-Luc-GFP et 3T3-DP). (A) NIR IPP (2 J / cm 2) , schéma est représenté. (B) répétée NIR-PIT complètement éliminé les cellules cibles (A431-luc-GFP) sans nuire à des cellules non-cibles (3T3-DP), dans un sphéroïde 3D ​​mixte. Bar = 200 um. (C) Quantification des activités luciférase (rapport RLU)élimination complète démontrée des cellules cibles (n = 10 dans chaque groupe de sphéroïdes). Ce chiffre a été modifié depuis 18 ans. Les données sont exprimées en moyenne ± sem S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Nous démontrons une méthode d'élimination de cellules spécifiques à partir d'une culture cellulaire 3D mixte sans endommager les cellules non-cibles en utilisant NIR-PIT. Jusqu'à présent, il n'y a pas de méthode pratique de l'élimination des cellules une fois que le tissu est établie ou après la transplantation. Ainsi, NIR-PIT est une méthode prometteuse pour accomplir cela. Cette technique pourrait également être utilisé in vivo , 18,22, étant donné que les APC présentent une pharmacocinétique similaire à Acm lui - même. Le type de cellule cible peut être adaptée à divers APC. Divers anticorps ou fragments d' anticorps, y compris des anti-EGFR et anti-PSMA, anti-mésothéline et anti-CEA ont déjà été utilisées en tant que véhicules blindés 15-21. De plus, en changeant la région du proche infrarouge permet de minimiser l'irradiation de la région traitée. Ici, avec une quantification de l'activité luciférase et de la fluorescence sur les cellules cibles, l'élimination complète de cellules spécifiques a été confirmée.

NIR-PIT est une thérapie de lumière sur la base, donc un point critique est til distance entre la source NIR-lumière et la cible, étant donné que l'énergie lumineuse et donc diminution de la nécrose des cellules selon une loi du carré inverse (étape 3.4). Pour rendre la 3D sphéroïde précisément, la plaque doit être traitée et incubé aussi doucement que possible. Les cellules gouttes contenant sont facilement détruits ou tombent par un petit choc avant de former des formes 3D.

NIR-PIT a plusieurs avantages uniques. Tout d'abord, NIR-PIT TTB démontrent la pharmacocinétique par voie intraveineuse semblables à des anticorps non conjugués des parents, en raison des caractéristiques hydrophiles de IR700, qui mènent à la liaison hautement spécifique aux cellules cibles et un minimum d'accumulation non-cible. Ainsi, même après la transplantation du tissu, NIR-PIT peut traiter les cellules cibles par injection intraveineuse de l'APC, suivie par l'exposition de la région d'intérêt pour NIR. Deuxièmement, NIR-lumière peut pénétrer plus profondément dans les tissus que les UV ou la lumière visible, par conséquent, NIR-PIT pourrait traiter non seulement la surface mais aussi le entire épaisseur du tissu transplanté par l'exposition à NIR à la surface. Enfin, NIR-PIT peut être utilisé à plusieurs reprises pour éliminer les cellules cibles sans limitation. Cette méthode est utile lorsque les cellules cibles expriment des copies suffisantes des molécules cibles sur la surface cellulaire 18.

Cependant, il existe quelques limitations à cette technique. Tout d'abord, la perméabilité de l'APC est limitée, car il est d'une grande molécule. Pour surmonter ce problème, répétés de traitement ou d' anticorps fragments NIR-PIT peuvent être exploitées 18,19,22. Une autre limitation est pénétration de la lumière. Bien que le NIR-lumière peut bien pénétrer la culture in vitro, la traduction à un traitement in vivo nécessiterait des approches adaptées telles que l' endoscopie digestive, bronchoscopie ou thoracoscopie direct avec fiberoptics pour déplacer la source de lumière plus proche de la région cible.

D'autres adaptations de NIR-PIT permettront l'utilisation de cette méthode à la fois locale et spectib élimination des cellules dans de nombreux domaines, tels que immunomodulation ou tumeur microenvironnement 24 - 26.

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Disclosures

Les auteurs ont rien à révéler.

Acknowledgements

Cette recherche a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health, National Cancer Institute, Centre de recherche sur le cancer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA) 929-70011
Na2HPO4 SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA) S9763
Sephadex G25 column (PD-10)  GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA) 17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates 3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA) HDP1096-8
Optical power meter Thorlabs (Newton, NJ, USA) PM100
LED: L690-66-60 Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA) L690-66-60
Vectibix (panitumumab) Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm Cellvis (Mountain View, CA, USA) D35-10-0-N

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