분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

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Vjestica, A., Merlini, L., Dudin, O., Bendezu, F. O., Martin, S. G. Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle. J. Vis. Exp. (109), e53801, doi:10.3791/53801 (2016).

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Abstract

Introduction

두 셀 간의 유전자 교환 유성 생식의 중앙 이​​벤트이지만, 그것은 세포 분화를 촉진 파트너의 선택을 허용, 세포 - 세포 융합을 수행하고 유전체의 안정성을 유지하는 일련의 사건에 의존한다. 따라서 성적 기간이 발달 스위치 관련 생물학적 질문들을 연구하는 모델 시스템 자체를 제시 분열 효모 이러한 현상을 연구 성적 사이클 탐색 등의 외적 자극 세포막 융합, 염색체 분리에 반응의 이점을 가져온다 모델 시스템의 강력한 유전학, 높은 처리량 방법과 정교한 현미경을 잘 설립. 분열 효모에서 섹스는 P-셀과 별개의 결합 유형의 M 세포 사이의 이형 이벤트입니다. 두 세포 유형은 차동 분비 P- 생산 및 M-페로몬, 페로몬 수용체 map3 체크하고 Mam2뿐만 아니라 페로몬 테아위한 포함한 유전자 1,2-들을 표현할SES Sxa1 및 Sxa2. 이러한 일반적으로 사용 H90 균주로서 Homothallic 균주, 단일 게놈 모두 결합 타입 유전 정보를 전달 및 세포 (참조. 3에서 검토) 분열주기에 걸쳐 결합 형 스위칭 복잡한 패턴을 겪는다. 거의 또는 전혀 결합 유형을 전환하지 heterothallic 분열 효모의 여러 균주는 일반적으로 가장 눈에 띄게, H + N (P 형) 및 시간 -S (M 형) 균주를 4를 사용한다.

분열 효모에서 성적 라이프 사이클에 진입 엄격한 영양 조절을 받고있다. 만 질소에 굶주린 분열 효모 세포 유사 분열 재생을 체포하고 짝짓기 파트너의 존재를 신호하고 (참조. 5에서 검토)의 성적 사이클의 추가 단계를 촉진 확산 성 페로몬을 생산하고 있습니다. 질소 부족의 발달 스위치 역할을하며 전자를 촉진 상대 Ste11의 주요 전사 조절을 드-억압페로몬 수용체와 페로몬 생산 유전자 6,7를 포함하여 특정 유전자 짝짓기의 xpression. 페로몬 수용체의 결합은 더욱 따라서 짝짓기 파트너 사이의 긍정적 인 피드백에 페로몬 생산을 증가, Ste11 전사 활동 8-10을 향상 수용체 결합 단백질 G 알파 및 다운 스트림 MAPK 신호를 활성화합니다. 페로몬 수준은 세포 극성의 Rho 가족는 GTPase Cdc42 (11)의 마스터 주최자를 조절하여 다른 세포 편광 상태를 유도하기에 매우 중요하다. 페로몬 낮은 농도에 노출시 활성 Cdc42은 세포 주위를 둘러 동적 패치 시각화하고, 어떤 세포 성장이 단계에서 관찰되지 않는다. 증가 페로몬 레벨 단일 영역과 편광 돌기의 성장에 Cdc42 활동의 안정화를 촉진 접촉 상대 세포를 제공 내가 어릴 때 좋아했던 연재 만화를 불린다. 이어서, 두 개의 반수체 결합 파트너 배체의 접합자를 형성하는 퓨즈. 최근 작품은 일을 계시상대 유도 formin FUS1 (12)에 의해 조립 융합에 필수적인 새로운 액틴 구조의 전자의 존재. 이 융합 포커스 따라서 세포 용해 (12)없이 세포막의 접촉을 허용하도록 칸막이 벽의 개장을 허용 타입 V 미오신 종속 프로세스 집중과 세포벽 분해 장치를 위치. 세포 - 세포 융합 후, 핵 접촉하고 karyogamy을 겪는다. 접합자 (말 꼬리 운동) 내부 핵의 눈에 ​​띄는 네인 의존 전후 운동은 감수 분열 뒤에 염색체 상 동체 (13, 14)의 페어링을 촉진한다. 마지막으로, 감수 분열의 네 제품은 포자 동안 개별 포자로 포장됩니다.

때문에 복잡성과 관련된 수많은 단계, 상대의 상세한 모니터링에 도전하고있다. 두 주목할만한 문제는 전체 프로세스가 아니라 다섯 시간 이상을 소요하고 세포를 동기화하기 어려운 것이 있습니다. 이 라ifficulties은 단일 셀 현미경 접근 방식에 의해 피할 수 있습니다. 여기에 일반적인 프로토콜은 분열 효모의 성적 라이프 사이클이 제시 조사합니다. 약간의 조정으로,이 프로토콜은 프로세스의 모든 다른 단계, 상대 유전자 산물, 비 자매 파트너 짝짓기 형 스위칭 후 자매 세포 사이 사이에 셀 편광 및 페어링, 세포 - 세포 융합, 즉 유도의 연구를 허용, 및 사후 융합 말 꼬리 운동, 감수 분열과 포자. 이 방법은 쉽게 시각화 형광 동안 및 사후 융합, 시간 사전을 통해 단백질 태그)을 1로 할 수 있습니다; 2) 대향 결합 형 세포의 행동을 식별; 3) 측정 및 shmooing, 결합, 융합 또는 포자 효율과 같은 매개 변수를 정량화.

Protocol

분열 효모 유성 생식의 현미경 분석

1. 미디어 준비

  1. 포도당 : 10g의 /의 L, KH 2 PO 4 : 1g / L, 염화나트륨 : 다음과 같은 구성 요소가 혼합하여 최소 포자 형성 배지 (MSL-N) (15)을 준비 0.1 g / L, 황산 ·을 7H 2 O : 0.2 g / 엘. 추가 추적 요소 (10000) : 100 μL / L, 비타민 (1000 배) : 1 ㎖ / L, 0.1 M CaCl2를   ㎖ / L. 실온 (RT)에서 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 저장소 필터 살균.
    1. 다음과 같은 비타민을 사용 (1000 배) 재고 : 판토텐산 : 1 그램 /의 L, 니코틴산 : 10g / L, 이노시톨 : 10g / L, 비오틴 : 10 ㎎ / ℓ. 4 ℃에서 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 저장소 필터 살균.
    2. 붕소 산 : : 5g / L, MnSO 4 : 4 그램 /의 L, ZnSO 4 · 7H 2 O : 4g / L, 50ml을 2 · 6H 2 O : 2g / L 다음과 같은 미량 원소 (10000) 주식을 사용하여 ,을 MoO 3 : 0.4 그램 /의 L, KI : 1g / L, CuSO 4· 5H 2 O : 0.4 g / L, 구연산 : 10g / L. 4 ℃에서 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 저장소 필터 살균.
  2. 아가 로스를 0.2 g과 MSL-N 10ml를 조합하여 MSL-N 아가에게 (아가 패드 챔버를 만들기 위해 사용) 2 %를 준비한다. 마이크로 원심 튜브에 아가로 용해하고 0.5 ml의 분취 량까지 전자 레인지 고전력 ~ 2 분 동안 용융. 실온에서 보관하십시오.
  3. 1g / L, 류신 : 0.225 g / L, 아데닌 : 0.225 그램 /의 L, 우라실 (NH 4) 2 SO 4 추가하여 질소 MSL-N에서 (MSL + N)와 최소 포자 형성 매체를 준비 0.225 g / L를 . 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 이용하여 필터 멸균. 실온에서 보관하십시오.
    주 : 류​​신, 아데닌 및 우라실이 영양 요 구성 균주의 성장을 허용하기 위해 배지에 첨가된다. 사용 된 균주 (예를 his3Δ에 대한) 별개의 영양 요구를 전달하는 경우 추가 아미노산 보충이 포함되어야한다. 또한 완전히 prototroph 균주와 그 일을 양해 해 주시기 바랍니다 만 같이 추천이러한 균주는 높은 결합 효율을 수 있습니다.
  4. 챔버 밀봉 200 ml의 VALAP을 준비합니다. 비커에 라놀린, 바셀린 (또는 다른 석유 젤리), 및 파라핀의 동일한 가중치를 추가합니다. 철저하게 혼합 될 때까지 열이 낮은 온도에서 혼합물 가끔 저어. 여러 개의 작은 배양 접시에 믹스를 나누어지는. 실온에서 보관하십시오.

짝짓기 실험 2. 배양 분열 효모 균주 (그림 1).

  1. 1 일, 저녁 :
    MSL + N 3 ㎖를 포함하는 배양 튜브에 고체 배지에서 갓 줄무늬 균주를 접종한다. 약 2.5 cm 직경의 평면 바닥 튜브를 사용합니다. 적응 문화 볼륨과 다른 문화 튜브 또는 플라스크를 사용합니다. 밤새 품어 (O / N) 25 ° C, 200 rpm으로 진탕. heterothallic 균주로 작업하는 경우, 별도로 접종.
    1. 문화가 광학 밀도가 저녁에 0.4-0.8의 600 nm의 (OD 600)에서 측정이 있는지 확인하기 위해 다음 아침에 미디어 세포 현탁액을 희석.
      노트 :OD는 분열 효모 세포 농도의 프록시 (600)의 측정은 약 0.1 ~ 1.0의 범위에서 선형이다. 우리의 분광 광도계 OD 600 = 0.1 ml의 당 1.4 × 10 6 세포에 해당합니다. 초기 OD (600)는 읽는 경우 따라서, 샘플 신뢰할 수있는 측정을위한 농축 / 희석 할 필요가이 범위를 벗어납니다.
  2. 2 일, 저녁 :
    100 ㎖ 플라스크에서 600 = 0.025 중독하는 MSL + N 배지 20ml에 세포를 희석. 30 ° C, 200 rpm에서 균주 O / N을 품어.
    참고 : 야생 형 세포 배양은 OD 600 ~ 0.8 다음 아침 (15 시간 이상)에 도달한다. 이상 발생 시간 균주로 작업하는 경우 그에 따라 희석을 조정합니다.
  3. 3 일, 아침 :
    문화가 OD 600 ~ 0.8의 세포 밀도가 있는지 확인하기 위해 OD 600을 측정합니다. heterothallic 균주로 작업하는 경우, 파트너 세포의 동일한 숫자를 혼합한다. 1.5 ml의 1,000 XG 및 전송에서 펠렛 세포튜브. MSL-N 매체의 1 ml의 세포를 세 번 씻는다. MSL-N 배지 3 ㎖에 세포를 다시 일시 중단 = 1.5 600 중독에 셀을 희석.
    1. 직접 영상에 대한 세포를 장착 자매 세포 사이의 결합을 모니터링하려면 (프로토콜 2.4 절 참조). 결합 형 스위칭 질소 박탈 이후에 발생하는 유사 분열 분열 동안 열린다있는 homothallic H90 균주를 사용합니다. 아가로 오스 패드 세포의 직접 장착은 세포 분열 후, 자매 세포가 서로 옆에 남아 것을 보장한다.
    2. 셀 편광 (탐색 역학과 shmooing)를 모니터링 30 ° C, 영상에 대한 사전 설치 세포에 3 ~ 4 시간 동안 200 rpm으로 세포 배양의 1-3 ml에 품어합니다. 이 3 ~ 4 시간 내 마지막 유사 분열 부문 발생한 것입니다. 몇 세포는 편광을 시작했다하지만 그들의 탐색 편광 역학 시작됩니다 대부분.
    3. 세포 - 세포 융합 30 ° C에서 세포 배양의 1-3 ml에 품어 모니터링하려면, 200 rpm으로 4 ~ 6 시​​간의 PRI에 대한나에 이미징 세포를 장착.
    4. 모니터링하려면 포스트 융합 이벤트는 30 ° C에서 세포 배양의 1-3 ml의 이전 영상에 대한 세포를 장착 8 시간 동안 200 rpm으로 품어.
    5. (만 heterothallic 균주에 대한) 특정 페로몬 농도에 반응을 모니터링하기 위해 30 ° C에서 세포 배양 3 ㎖를 품어, 200 rpm으로 3 ~ 4 시간 동안 이미징 세포를 장착하기 전에.
      1. 95 ° C 열 블록의 MSL-N 함유 microcentrifuge 관을 제거 (프로토콜 섹션 2.4.1을 참조하십시오. 아래). 용융 MSL-N 아가로 오스에서 직접 원하는 농도로 P-인자 또는 M-요소를 추가합니다. 즉시 패드를 준비하기 전에 텍싱에 의해 잘 섞는다.
      2. 셀을 장착 한 후, 이전 영상 25 ° C에서 15 ~ 30 분 동안 패드를 품어. P-M-인자 및 인자 페로몬 메탄올 1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액으로부터 사용 하였다.
        참고 : 돌연변이와 함께 작업하는 배양 시간이 다를 수 균주합니다. 세포의 응집 액체 m에서 장기간 배양 후 발생할 수있는edia 일부 돌연변이 균주에 특히 강한 될 수있다. 응집되어 세포 단층을 아가 로스에서 패드 상에 발견함으로써 자동 초점 화상하기 어려운 수 없다. 광범위한 세포 응집되는 경우에는 즉시 세척 후 아가로 오스 패드에 세포를 장착하고 다시 정지를 질소 부족 미디어 (프로토콜 2.3.1 절에서와 같이.) 전에 영상 30 ° C에서 그들을 품어.
  4. 이미징을위한 세포 장착 :
    1. 10 ~ 15 분 동안 95 ° C 열 블록으로 나누어지는 용융 및 스페이서 (그림 1B)에 의해 분리 된 두 개의 유리 슬라이드 사이에 200 μl를 추가하여 MSL-N에게 아가로 오스 패드 (16)를 준비합니다. ~ 0.5 mm의 두께를 갖는 스페이서를 사용한다. 스페이서하려면 사용 스트립은 제한 효소로 전달 된 것과 같은, 판지에서 잘라.
    2. 1 분 동안 1,000 XG에서 세포를 100 μl를 펠렛 뜨는을 제거하고 잔류 2-4 μl의 배지에서 세포를 다시 일시 중지합니다. 그것이 지연으로하지 마십시오 신선한 매체에 다시 일시 중지교배.
    3. 2 ~ 3 분 후에 조심스럽게 스페이서 상단 유리 슬라이드를 제거합니다. 몇몇 균주가 장착되는 경우, 세포가 아가 로스 패드를 제조하기 전에 농축 물을 준비.
    4. 패드 세포의 1 μl를 추가하고 드롭 커버 슬립으로 덮고 VALAP로 밀봉하기 전에 (~ 1 분) 건조 시작할 때까지 기다립니다.
    5. 패드는 25 ° C 또는 RT에서 촬영하기 전에 적어도 30 분 동안 앉아 보자.
    6. 짝짓기의 다양한 단계에서 세포의 혼합물을 얻으려면, MSL-N (2.3 절을 참조하십시오.)에서 세척 후 즉시 패드를하고 18 ° CO / N (~ 15 시간)에 품어. 이 방법은 약한 신호 높은 시간 해상도가 필요하거나 샘플과 별개의 결합 단계에서 세포를 영상화하는 데 유용합니다.

상대 효모 세포의 3. 라이브 셀 이미징

  1. 이미지 인식 설정을 조정합니다.
    참고 : 여기에 제시된 이미지 획득 설정은 사용자 정의 올림푸스 IX-71으로 구성된 DeltaVision 플랫폼에 최적화 된계획 아포 60X / 1.42 NA 또는 U-계획 아포 100X / 1.4 NA 목표, CoolSNAP HQ2 카메라와 인사이트 SSI ​​7 색 조합 단위 조명과 거꾸로 현미경. 하드웨어는 디지털 자동 초점을 가능하게 softWoRx의 v4.1.2에 의해 제어된다.
    1. 장시간에 걸쳐 Z 드리프트 소프트웨어 자동 초점 시스템의 용량을 넘어 설 수 있기 때문에 오토 포커싱 간격이 15 분을 초과하지 않도록. 하드웨어 기반의 자동 초점 시스템을 이용하면, 큰 간격을 사용한다.
    2. 촬영 간격을 조정합니다. 형광 처음으로 단백질을 태그로 작업 할 때 시작점으로 15 시간 ~에 대한 이미지마다 10 분 가져 가라. 이 간격은 광범위한 표백 않고 전체 정합 프로세스의 양호한 개요를 제공한다.
      1. 이러한 융합으로 더 정확하게 시간 이벤트 5 분 간격으로 이하와 이​​미지. 짧은 간격으로 낮은 노출 시간과 약간의 표백을 가능하게 강한 형광을 필​​요로한다. 1 분 피하기 O / N 현미경 아래 간격 이미징프로토콜 섹션 2.4.6에 설명 된대로 대신 모두 결합 단계의 혼합물을 준비합니다.
    3. 이미지 노출 시간을 조정합니다. 50 ~ 300 밀리 초 사이의 시험 노출 시간. (일반적으로 100) 뚜렷한 신호와 시간 - 다수의 지점을 달성하도록 신호 대 잡음비 및 광표백 간의 균형을 목표로한다.
    4. Z-절편을 조정합니다. 섹션마다 0.3 ㎛의 피복이 5㎛ 좋은 촬상 깊이를 제공한다. (- 전체 표본 깊이의 단일 스위프 취득 광축 통합) OAI을 사용하여 최소화 할 수있는 Z-절편 더욱 증가 광 손상을 참고. 좋은 자동 초점 시스템은 많은 Z 섹션에 대한 필요성을 감소시키고, 추천된다.
  2. 팁 결합 형 특정 동작을 연구합니다 :
    1. heterothallic 균주, H- 사용하여 두 종류의 세포를 구별 할 수 있도록 H + 세포는 형광을 발현하는 별개. 어떤 유전자 인코딩 fluoropho를 사용하여우리가 sfGFP, GFP (17)의 빠른 접는 변형 좋은 성공이 있었다하지만, 내인성 단백질을 세포질 버전 또는 융합으로 표현 다시. 내인성 단백질은 일반적으로 상동 재조합 (14)에 의해 자신의 내생 게놈 궤적에 태그가 지정됩니다.
    2. homothallic 균주 각각 PM 세포에서 발현을 유도하는 등 페로몬 수용체 유전자 map3 체크하고 mam2의 것과 결합 형 특이 적 프로모터의 제어하에 유전자 부호화 세포질 형광 단백질을 발현. map3 체크mam2의 프로모터는 식물의 성장 기간 동안 비활성 질소 기아 (18, 19)에 유도된다. 이러한 프로모터의 통제하에 GFP 또는 세포질 mCherry의 발현을 구동 구조체는 일반적으로 성적주기 (12)의 정상적인 진행을 방해하지 않는 게놈 유전자좌 (ura4, leu1)에 통합된다.
    (프로토콜 3.2.2 절에서와 같이)를 사용하여 결합 형 특정 세포질 형광은 다른 하나의 파트너 세포에서 형광 신호의 전송으로 시각 세포 융합의 정확한 타이밍을 결정합니다.

결합 및 융합 효율성 4. 정량

  1. 위의 단계 2.3.1에서와 같이, MSL-N 아가로 오스 패드에 세척 직접 MSL-N 후 결합 및 융합 효율성 11, 12, 스팟 세포를 정량화하고, 25 ° C 전에 이미징 (그림 1A)에서 24 시간 동안 둡니다. 이 homothallic 야생형 균주의 결합 효율에 도달 프로토콜 ~ 60 % 융합 효율 99 % 사용. 돌연변이 균주에서 관찰이 값의 삭감 터미널 표현형 또는 지연을 반영 여부를 테스트하기 위해 36 시간의 배양 시간과 실험을 반복한다.
  2. 같은 결합 효율을 계산 Equation1 결합 쌍에서 확인 접합체, ASCI 및 융합 세포 쌍을 포함서로에 대한 그들의 위치와 성장.
  3. 같은 융합 효율을 계산 Equation2
    참고 융합 결합 쌍는 연구중인 돌연변이 포자 형성에 영향을주지 않는 것으로 알려져 있다면 포자를 형성하는 능력에 의해 식별된다. 포자는 판독으로 사용할 수없는 경우, 융합 파트너 모두에 하나의 결합 파트너 표현 세포질 마커의 확산을 관찰함으로써 결정된다.

Representative Results

질소 소스를 제거하면 분열 효모의 성장과 결합 역학
질소 기아는 분열 효모에서 유성 생식의 시작을위한 전제 조건이기 때문에, 야생형 homothallic H90 균주는 그림 1에 설명 된 프로토콜에 따라 질소가 풍부한 질소 박탈 매체 (그림 2)에서 변화에 따라 측정 하였다. 요약하면, 세포를 , MSL + N 매체에 지수 상 (OD = 0.5 (600))에 O / N 성장 수집, 세척 및 최종 OD 600 = 1.5 MSL-N 액체 배지에 재현 탁 하였다. 세포의 각 2 시간 씩 스테인드 CALCOFLUOR 및 (- D 그림 2A)을 이미지화했다.

CALCOFLUOR 염색법 (도 2a)은 질소가 풍부한 배지에서 세포의 ~ 21 %가 septating 것으로 확인 (N> 300,도 2b) 및 디비에서 그 평균 셀 길이시온은 15.2 ± 1.4 μm의 (N = 50, 그림 2C)이었다. 비 - 분할 세포는 다양한 세포 길이 분포 (n은> 200,도 2d 8-14 μm의)을 보였다. 그러나 두 시간 MSL-N 매체 시프트 후에 미만 9 μm의 (N> 200,도 2d)를 인 세포의 60 % 이상 비 - 분할 세포의 길이 분포에 급격한 변화가 있었다. 셀 격막은 9.8 ± 0.8 μm의 (N = 50,도 2A, 2C)의 감소 된 길이에서 검출되었다. MSL-N이 증가 비 분할하고, 분할 셀 모두의 길이를 더 감소는 시간으로 관찰 하였다. 실제로, 8 시간 후 문화의 격막 지수는 2 % (N> 300) 이하로 감소하고 세포의 85 % 이상이 길이보다 짧은 7 μm의 (N> (200), 그림 2D)에서 자신의 세포주기를 체포했다.

세포는 액체 MSL-N으로 변화 한 후에 쌍 네 시간 짝짓기 형성 시작매체 (<1 %, 그림 2A). 다음에 (N> 200,도 2B) 정합 쌍의 수는 급격히 증가하고 세포 이동의 10 %는 8 시간 후에 결합 파트너를 결합.

상대 역학을 모니터링하려면 6 시간 기아 유도 한 후, 세포의 나누어지는 또한 이미징을위한 MSL-N 아가로 오스 패드에 장착되었다. 세포는 명백한 동시성 (동영상 S1)없이 연속 21 시간에 shmooing, 융합과 포자 (그림 2E, 2F)을 시행 하였다. 단층 (도 2G영화 S1)에 고밀도로 배치 될 때 세포의 60 % 이상을 임의의 시야에서의 상대 위치와 세포의 밀도에 의존 결합 효율은 결합 파트너.

야생형 heterothallic의 H +H-분열 효모 균주는 또한과 동일한 프로토콜을 실시질소 제거시에 일대일의 비율 H +H-세포를 혼합 N 개의 추가 단계를 포함한다. 유사 기아 상대 역학이 관찰되었지만, 상대 효율 (도 2G, 영화 S2)이 약간 낮았다.

상대 분열 효모 세포에서 찬란 태그 단백질의 역학 모니터링
기본 궤적에서 Myo52-3GFP를 발현하는 세포 짝짓기에 입력-V의 미오신 Myo52 (참조 20)의 역학을 모니터링하려면 기하 급수적으로 성장 H-세포는 시간 + 세포가 유사 P에서 Myo52-tdTomato뿐만 아니라 세포질 GFP를 표현 혼합 하였다 특정 map3 체크 프로모터를 -cell. 세포 현탁액은 MSL-N 매체에 희석하고, 30 ºC에서 6 시간 동안 인큐베이션, 세정 한 후, 부착 세포를 200 RPM 전에 10 분 간격으로 O / N 이미징 MSL-N 아가 패드 상.

앞서 11,1보고셀 피질에 걸쳐 2 Myo52 초기에 형성된 동적 영역 (그림 3A, 화살촉 및 영화 S3). Myo52 신호는 단지 시간 내지 + H- 셀로 세포질 GFP 신호의 전송에 의해 가시화 된 융합 이벤트 전에 하나의 포커스 (도 3a의 화살표와 Movie S3)을 안정화시켰다 (도 3A영화 S3) . Myo52-tdTomato 신호는 또한 확장시 융합 목에서 관찰 할 수 있지만, 접합자는 포자 (그림 3a영화 S3)로 진행으로 뚜렷한 신호가 분명하지 않았다.

외부 페로몬에 노출 Heterothallic 분열 효모 세포의 행동을 모니터링
탈감작을위한 P-요인을 저하 Sxa2 단백질 분해 효소가없는 Heterothallic H-세포는 쉽게 합성 P-요인에 반응한다. H- 11 마커로서 Scd2-GFP를 발현 sxa2Δ 균주, 따라서 설명 프로토콜, MSL + N 배지에서 성장시켰다. 세포 MSL-N 매체 세정 30 ºC에서 4 시간 동안 배양 하였다. 메탄올 (도시되지 않은 데이터)를 0.1 ㎍ / ㎖ (낮은 페로몬,도 3b) 또는 1 ㎍ / ml를 함유 MSL-N 아가 패드 (높은 페로몬는도 3C) P-요소의 절단을 준비하고 새로운 슬라이드 상에 배치했다 다른 페로몬 양을 함유하는 소형 패드를 생성한다. 세포 현탁액 0.5 μL를 5 분 간격으로 O / N 촬상 각 소형 패드 상에 장착 하였다.

P-인자 높은 수준 따라서 하나의 셀 극에서 내가 어릴 때 좋아했던 연재 만화 신장을 유도 하나 Scd2 영역을 안정화하면서 번역 결과 (11)와 일치에서는 저 P-인자 수준이 증가 (도 3B, 영화 S4)없이 동적 Scd2 영역의 형성을 촉진 (Figure 3C, 영화 S5).

그림 1
그림 1 :.. 프로토콜의 도식 표현 (A) 장기 이미징 분열 효모 샘플을 준비하는 분열 효모 성적 라이프 사이클 및 (B)를 모니터링하는 데 사용되는 프로토콜의 도식 설명 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2 :. MSL-N 미디어에 MSL + N 어긋난 분열 효모 세포의 성장과 결합 역학 CALCOFLUOR - 염색 된 세포의 (A) 표면 형광 현미경 사진은 시간의 표시 기간 동안 MSL-N 미디어로 이동했다. (B) 비율septating의 (다크 블루 라인, n은 평가시기 별> 300)과 짝짓기 (밝은 파란색 선, n은 평가시기 별> 300) 세포는 시간이 표시된 기간 동안 MSL-N 미디어로 이동했다. septating 셀 (C)의 평균 길이는 시간의 표시 기간 (n은 평가시기 당 50 시간의 평가시기 N = 20 8 제외)에 대한 MSL-N 미디어로 이동했다. 비 분열 세포 (D) 길이 분포는 시간의 표시 기간 (평가시기 당 N> 200)에 대한 MSL-N 매체로 시프트. (E) 융합 (다크 블루 라인)의 평균 비율, 융합 (밝은 파란색 선)와 H90 야생형 효모의 인구에서 세포를 (검은 선) 포자 시간이 표시된 기간 동안 MSL-N 미디어로 이동하고 평가시기 6 시간 (세 가지 timelapses에서 평가시기 당 N> 900 세포)에서 한천 패드에 장착. 세포는 파트너 사이에 굴절 세포 벽 특검팀의 득점 골에 사용 된 DIC 현미경과 포자 세포벽의 형성에서 볼 수 없을 때 융합 간주되었다세포를 orulating. 상대측 셀 (F) DIC 현미경 시간 표시 기간 MSL-N 매체로 시프트. H90 (다크 블루 도트)에 대한 아가로 오스 패드에 세포 밀도의 함수로 (G) 연결 효율과 시간 + / H-(밝은 파란색 점) 세포는 24 시간 동안 MSL-N 미디어로 이동했다. 장기 이미징을위한 세포의 최적 밀도는 / mm 2 약 25,000 세포에서 얻을 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 3 :. 지시 된 유전자형과 세포의 형광 단백질의 동적 현지화 분열 효모 결합시 (A) Deconvolved 하나의 Z-평면 표면 형광 현미경은 6 시간 동안 MSL-N 미디어에 MSL + N에서 이동과에 탑재지정된 시간 동안 MSL-N 아가로 오스 패드. 화살촉은 동적 Myo52-3GFP 영역을 나타내는 화살표가 융합 초점에서 Myo52 현지화를 지적한다. (B) 표시 유전자형을 가진 세포 (C) Deconvolved 단일 Z 평면 표면 형광 현미경 사진 (B) 4 시간 동안 MSL-N 매체 MSL + N 어긋나 0.1 ㎍ / ml를 함유 MSL-N 아가 소형 패드 상에 장착 또는 1 μg의 지정된 시간에 대한 P-인자 / ㎖ (C). 화살촉은 동적 (B) 또는 안정 (C) Scd2-GFP 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

극장 1
기업 영화 1 : 야생 형 H90의 분열 효모 가전의 DIC timelapse에 LLS 질소에 굶주린 이전 영상 6 시간 동안했다 그. (오른쪽 다운로드 클릭).

Movie2
보충 영화 2 . 혼합 및 질소 고갈 이전 영상 6 시간 동안 있던 야생 형 H +와 H-분열 효모 세포의 DIC timelapse에 (오른쪽 다운로드 클릭).

Movie3
"> 보충 영화 3 시간 + 세포가 P-셀 특정 map3 체크 프로모터의 기본 궤적과 세포질 GFP에서 Myo52-tdTomato을 표현 혼합 Deconvolved 하나의 Z-평면 표면 형광 및 기본 궤적에서 Myo52-3GFP을 표현 H-세포의 DIC timelapse에 세포가 30 ºC에서 6 시간 동안 MSL-N 배지에서 배양 하였다. 영상 이전. H-셀에 세포질 GFP의 전송 융합 시간을 정의합니다. (오른쪽 다운로드 클릭).

Movie4
보충 영화 4 : Deconvolved 하나의 Z-평면 표면 형광 및 H-sxa2 세포 특급의 DIC timelapse에네이티브 프로모터에서 ressing Scd2-GFP는 0.1 μg의 / ㎖의 P-인자로 치료. 세포 이미징 전에 30 ºC에서 4 시간 동안 MSL-N 배지에서 배양 하였다. (오른쪽 다운로드 클릭).

Movie5
보충 영화 5 : . Deconvolved 하나의 Z-평면 표면 형광 및 1 μg의 / ㎖의 P-인자 세포 치료의 기본 프로모터에서 Scd2-GFP를 표현 H-sxa2 세포의 DIC timelapse에 30 ºC에서 4 시간 동안 MSL-N 배지에서 배양 하였다 촬영하기 전에. (오른쪽 다운로드 클릭).

YSM995 H- 중량
YSM1371 시간 + 중량
YSM 1396 H90 중량
YSM2534 H-myo52-3GFP :: kanMX
YSM2730 H + myo52-tdTomato :: natMX
Pmap3 : GFP :: ura4 + @ ura4locus
YSM2731 H-scd2-GFP :: natMX sxa2Δ :: kanMX

표 S1 : 본 연구에 사용 된 균주.

Discussion

환경 조건, 영양 가용성은 특히 강하게 분열 효모의 생리에 영향을 미칩니다. 질소 기아는 유성 생식에 헌신 필요하고 초기에 유사 분열 세포주기 진행에 눈에 띄는 변화 (참조. 21그림 2)에 연결됩니다. 기하 급수적으로 증가하는 인구에서 질소 제거 후, 부문 셀 크기가 빠르게 (도 2C) 감소하고 세포의 대부분은 새로 태어난 기하 급수적으로 성장 세포 (참조. 21,도 2D)의 길이보다 짧은 유사 분열 진행을 저지. 반대 짝짓기 종류의 세포가 유사 분열 진행을 체포으로 그들은 파트너 짝짓기 참여하고 접합체 및 sporulate (그림 2B, 2E, 2F)를 형성하기 위해 진행합니다. H90 세포를 60 % 이상의 야생형 세포의 2 차원 단층의 경우, 세포 융합 (도 2G를 받게 될 것이다 거의 모든 파트너와 결합하며 것 (도 2G)에 의존한다. 높은 결합 효율을 얻을 수있는 프로토콜의 가장 중요한 특징 중 하나는 셀에 걸쳐 표시된 농도 내에서 유지되도록하기위한 것이다. 그림 2와 같이 셀 크기와 결합 효율성 매개 변수의 모니터링은 세포가 효율적으로 유성 생식을 입력하는 간단한 제어를 제공한다.

우리는 그림 2E와 2G에 제시된 것과 같은 높은 결합 효율은 완전히 prototrophic 균주를 얻을 수 있습니다, 중간 부족 어떤 질소원 짝짓기 이후 (아미노산과 질소 기지도 낮은 금액을 제외), 있습니다. 영양 요 구성 균주를 사용할 수 있지만 세포는 프로토콜에 명시된 세포 밀도 내에서 항상 유지되도록 추가 치료를 필요로 할 수있다. 도주의 만낮은 결합 효율이 관찰됩니다. 결합 효율은 결합 과정에서 온도에 민감한 돌연변이 대립 유전자의 사용을 제한 할 수있다 승온에서 관찰 낮은 효율과 온도에 의해 영향을 받는다.

여기에 제시된 방법은 주로 형광 리포터 장기 이미징에 사용된다. 촬상이 장기간에 걸쳐 수행되기 때문에, 분열 효모의 성공적인 짝짓기 촬상 가능한 현미경 설정에 크게 의존한다. 이를 위해, 자동 초점 시스템 현미경 설정, 감도 및 접속의 안정성이 매우 중요하다. 어느 소프트웨어 기반 또는 내장 하드웨어 자동 초점 시스템도 가능하다. 또한, 멀티 취득을 가능하게하는 동력 단계는 또 다른 중요한 품질, 처리량을 증가시킵니다.

이미지 품질은 관심의 형광의 특성에 의해 제한된다. Protoco에 자세히 MSL-N 액체 배지에서 배양 시간 구별리터 2.3 절은 페로몬에 의한 태그 단백질에 형광을 최적화하고 관심의 짝짓기 단계 이미징 불필요한 표백을 최소화하기위한 것이다. 풍부한 또는 매우 찬란 초점화 구현 태그 단백질은 전체 성적 수명주기 (동영상 S3)의 과정을 통해 시간 지점의 수백의 취득을 허용하지만, 다른 단백질로 인해 사진 표백에 같은 긴 시간에 걸쳐 이미지에 도전한다. 이미지 품질은 선택된 형광 일반적 GFP 유도체에 의존한다. 우리는 반복적으로 빠른 반응 속도 폴드 sfGFP 17 (superfolder GFP)을, 강한 자식 작용이 빠른 단백질 회전율을 유도 가능성이 있기 때문에, 짝짓기 과정에서 우수한 신호를 제공하는 것을 관찰했다. 중요한 것은 형광 단백질 성숙 17, 22 필요한 산소의 이용 가능성을 모니터하지 않았다. 따라서,이 세포이다 mounte 후 발현 된 단백질의 수준을 정량화하는 형광 측정을 사용하는데 신중하도록 권장슬라이드 상에 D, 또는 실험을 수행하는 다른 산소 투과성 마이크로 유체 장치를 사용한다. 또한, 아가로 오스 패드는 저녁에 세포를 발견 및 패드는 유성 생식의 모든 단계에서 세포의 혼합물을 포함하기 때문에 이미지 약한 기자들에게 매우 유용 한 18 ºC O / N로 유지.

분열 효모의 짝짓기는 동시성가 발생하지 않습니다 세포는 쉽게 다른 세포가 이미 (영화 S1, S2)를 포자와 함께 shmooing을 시작 볼 수 있습니다. 이러한 집단 역동 선택 방법 여기에 설명 된 단일 세포 현미경을 사용하는 것이 전형적인 벌크 생화학 기법 어렵게 렌더링한다. 모든 현미경 기반 접근은 원칙적으로 여기에서 설명하는 프로토콜 전지 제조에 적용 할 수있다. 중요한 것은, 이러한 접근은 Dudin 및 동료 (12)에 의해 기술 된 세포 - 세포 융합과 같은 유형 특정 역학 짝짓기 나타낼 프로세스를 모니터링 할 수 있습니다. 비대칭, 결합 형 기자를 모니터링하려면특히 유용합니다 (그림 3A)이었다. H-의 단백질과 시간 + 세포에 태그를 별개의 형광을 이용하여 heterothallic 균주로 작업 할 때 두 가지 결합 유형을 구별 쉽게 달성된다. 그러나,이 균주 homothallic 가능하지 않다. H90 세포의 결합 형태를 구별하기 위해 개발 된 방법은 결합 형 특이 적 프로모터의 제어하에 세포질 형광 단백질을 발현하는 것이다. 특히, 페로몬 수용체 유전자 map3 체크하고 mam2의 프로모터는 각각 P에서 GFP 또는 mCherry 단백질 M 세포의 발현을 구동하는 데 사용 하였다. 또한, 이들 마커는 서로 상대측 셀에서 형광 신호의 전달 시각으로서 세포 - 세포 융합의 정확한 타이밍을 허용했다.

상대의 페로몬은, 효모 11 유성 생식의 고유 한 단계를 통해 진행에 중요한 결정이다23. 분열 효모에서 별개의 세포 편광 상태 (그림 3B, 3C 및 참조. 11)에 합성 페로몬 리드의 다른 수준. 이 프로토콜은 위의 포함 별개의 외생 페로몬 수준은 세포의 생리에 미치는 영향을 평가 할 수 있습니다. 페로몬 단백질 분해 효소 Sxa2 빠르게 P-인자, 단백질 분해 효소가 재현 가능한 결과를 얻기 위해 사용 된 삭제 된 heterothallic 돌연변이 균주를 저하 때문입니다. 그러나, 대향 교배형뿐만 아니라 레벨뿐만 아니라 결합 파트너에 의해 방출 페로몬의 공간적 분포의 세포 혼합물에 중요한 것으로 보인다. 세포 반응에 페로몬 공간 분포의 효과를 분석하는 것은 효모 (24, 25) 신진에 사용되는 마이크로 유체 장치와 같은 더 복잡한 설정의 개발이 필요합니다.

요약하면, 우리는 분열 효모 성주기의 장기 현미경 기본적인 방법을 제시한다. 이 프로토콜에 약간의 조정은 resear 허용채널 성적 라이프 사이클의 서로 다른 단계에서 세포 반응에 초점을 맞 춥니 다. 단일 세포 생화학 도구와 마이크로 유체 장치와이 방법을 결합하면 더 강력한 모델 시스템으로 분열 효모 유성 생식을 촉진 할 것이다.

Acknowledgments

AV는 EMBO 장기 박사 친교에 의해 지원되었다. 마틴 실험실에서 연구 ERC 시작 부여 (GeometryCellCycle)과 SGM에 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 (31003A_155944)에 의해 투자된다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucose Sigma-Aldrich G8270-10KG
KH2PO4 Sigma-Aldrich 1.05108.0050
NaCl Sigma-Aldrich 71381
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 63140
CaCl2 Sigma-Aldrich 12095
Pantothenate AppliChem A2088,0025
Nicotinic Acid AppliChem A0963,0100
Inositol AppliChem A1716,0100
Biotin AppliChem A0967,0250
Boric Acid Sigma-Aldrich B6768-1KG
MnSO4 AppliChem A1038,0250
ZnSO4•7H2 Sigma-Aldrich Z4750
FeCl2•6H2O AppliChem A3514,0250
Molybdenum oxide (VI) (MoO3) Sigma-Aldrich 69850
KI AppliChem A3872,0100
CuSO4•5H2O AppliChem A1034,0500
Citric Acid  AppliChem A2344,0500
Agarose Promega V3125
(NH4)2SO4  Merck 1.01217.1000
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-100G
Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% Sigma-Aldrich A9126-100G
Uracil  Sigma-Aldrich U0750
Lanolin Sigma-Aldrich L7387
Vaseline Reactolab 92045-74-4
Paraffin Reactolab 7005600

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References

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