Идентификация MyoD интерактомные Использование Тандем Аффинная очистка В сочетании с масс-спектрометрии

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Boyarchuk, E., Robin, P., Fritsch, L., Joliot, V., Ait-Si-Ali, S. Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (111), e53924, doi:10.3791/53924 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Скелетная мышца терминальная дифференцировка начинается с обязательством плюрипотентных клеток-предшественников мезодермальными к миобластов. Эти клетки имеют еще способность пролиферировать или они могут дифференцироваться и запал в многоядерные мышечные трубки, которые нагноиться далее с образованием мышечные волокна. Скелетных мышц терминала дифференциация оркестрованы скоординированные действия различных факторов транскрипции, в частности, члены мышце регуляторных факторов или MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5 и Mrf4), которая также называется миогенная bHLH факторов транскрипции семейства. Эти факторы сотрудничают с хроматином ремоделирования комплексов в сложной транскрипционной регуляторной сети для достижения скелетной миогенез. В этом, MyoD считается мастером миогенная фактор транскрипции в инициировании мышцы терминальной дифференцировки. Это понятие усиливается благодаря способности MyoD конвертировать не-мышечные клетки в клетках скелетных мышц. Здесь мы опишем подход, используемый для идентификации MyoDпартнеров белка исчерпывающим образом для того, чтобы выяснить различные факторы, участвующие в скелетных мышц терминальной дифференцировки. Долгосрочная цель состоит в том, чтобы понять эпигенетические механизмы , участвующие в регуляции генов скелетных мышц, то есть., MyoD целей. партнеры MyoD идентифицированы с помощью Тандем аффинной очистки (TAP-Tag) с гетерологичным системы, связанной с масс-спектрометрии (МС) характеристики, а затем путем подтверждения роли соответствующих партнеров во время скелетных мышц терминальной дифференцировки. Аберрантных форм миогенных факторов, или их аномальным регулирования, связаны с целым рядом мышечных нарушений: врожденная миастения, миотонической дистрофии, рабдомиосаркома и дефектов в мышечной регенерации. Таким образом, миогенные факторы обеспечивают пул потенциальных терапевтических мишеней в мышечных расстройств, как с точки зрения механизмов, которые вызывают самой болезни и регенеративные механизмы, которые могут повысить эффективность лечения заболевания. Таким образом, детальное understanдинь межмолекулярных взаимодействий и генетических программ, контролируемых миогенных факторов имеет важное значение для рациональной разработки эффективных методов лечения.

Introduction

Эукариотические многоклеточные организмы состоят из различных органов и тканей. Каждая функциональная ткань имеет специфический экспрессии генов, которая определяется на каждом этапе дифференцировки. Клеточная дифференцировка включает в себя активацию специфических генов, поддержание их экспрессии и, как правило, глушителей из набора генов, таких лиц, участвующих в пролиферации клеток. Скелетная дифференцировки мышц, или миогенез, таким образом, является многоступенчатый процесс, который начинается с определения мезодермальных стволовых клеток в миобласты, а затем приводит к терминальной дифференцировки этих миобластов в первую моно-зарождаются, а затем мульти-зарождаются, мышечных трубочек , Таким образом, миобласты являются "определены" клетки, которые все еще способны размножаться, но они полны решимости скелетных мышц линии, и, следовательно, могут дифференцироваться только в клетках скелетных мышц либо во время эмбрионального развития или в регенерации взрослых мышц. Процесс скелетных мышц терминала отличаютсяentiation является оркестровка определенной генетической программой , которая начинается с постоянного выхода из клеточного цикла клеток - предшественников миобластов , что приводит к окончательному глушителей пролиферации генов , ассоциированных, таких как E2F генов - мишеней 1. Действительно, в процессе терминальной дифференцировки, арест пролиферации миобластов является важным шагом , который предшествует экспрессии скелетных мышц специфических генов и слияние миобластов в мышечные трубки 2. Такая программа позволяет взрослых мышечные стволовые клетки, также называемые сателлитные клетки, дифференцироваться во время процесса регенерации после поврежденными скелетными мышцами.

Млекопитающим миогенез критически зависит от семьи миогенного основной спираль-петля-спираль (bHLH) транскрипционные факторы MyoD, Myf5, Mrf4 и Myogenin, часто называют семейством скелетных мышц факторов определения или MRFs (мышцы регуляторные факторы) 3. Каждый из них играет существенную роль в спецификации и дифференциации скелетных мышечных клеток и имеет специфический характер экспрессии 4 5-7. Активация Myf5 и MyoD представляет собой определяющий шаг, обязывающее клетки к миогенной линии, и последующее выражение Myogenin вызывает миогенез с активацией скелетных мышц специфических генов, таких как ГХК (Muscle креатинкиназы). Миогенные bHLH факторы транскрипции сотрудничать с членами семьи Mef2 в активации генов мышечных от ранее немого локусов 8. Они также стимулируют скелетную транскрипцию гена мышечной как гетеродимеры с повсеместным bHLH белками, Е12 и Е47, известные как Е белки, которые связываются с так называемыми электронные ящики в различных генных регуляторных областей 8. Twist, Id (ингибитор дифференцировки) и других факторов , отрицательно регулируют этот процесс, конкурируя с MyoD для Е - связывающих белков 8.

MyoD рассматривается как главный игрок в инициировании терминальной дифференцировки мышц 9 10-13. Действительно, принудительная экспрессия MyoD индуцирует транс-дифференциацию различных клеточных типов , даже те , которые получены из другого эмбриологического происхождения 12. Например, MyoD может конвертировать гепатоциты, фибробласты, меланоциты, нейробласты и адипоциты в мышечные клетки типа. Транс-differentiative действие MyoD включает аномальную активацию миогенный генетической программы (в частности, его генов-мишеней) в не-мышечной среде, сопутствующую к молчанию оригинальной генетической программы (в частности, гены пролиферации).

В пролиферирующих миобластов, MyoD выражается , но не может активировать свои гены - мишени , даже если он связывается с их промоторов 14-16. Таким образом, требование MyoD быть постоянно выражается в недифференцированных миобластов остается довольно EluSIVE. MyoD может подавлять свои гены - мишени из - за набора репрессивных хроматин-модифицирующими ферментов в пролиферирующих миобластов перед загрузкой активации хроматина ферментов 14,17. Например, в пролиферирующих миобластов, MyoD связан с транскрипционной корепрессор KAP-1, гистондезацетилаз (HDACs) и репрессивных метилтрансферазам лизина (КМЦ), в том числе гистона Н3 лизина 9 или H3K9 и H3K27 КМЦ, а также активно подавлять его экспрессию генов-мишеней путем создания локально репрессивной структуры хроматина 14,17. Важно отметить, что в недавнем докладе указывается , что MyoD сама непосредственно метилируется самая H3K9 КМТ G9a приводит к торможению его трансактивирующей деятельности 16.

В эпигенетические механизмы, участвующие в этом транс-дифференциации без мышечных клеток путем MyoD в значительной степени неизвестны. Следует отметить, что некоторые клеточные линии, устойчивые к MyoD-индуцированный транс-дифференцировки. Таким образом, в клетках HeLa, MyoD либо неактивны илидаже может функционировать как репрессор вместо активатора транскрипции из - за отсутствия экспрессии BAF60C субъединицы хроматина комплекс SWI / SNF 18. Таким образом, эта модель может быть выбор, чтобы лучше охарактеризовать механизмы MyoD-индуцированной репрессии генов. Он также подходит для анализа способности MyoD вызывать репрессивную среду хроматина на своей целевой локусов со своими ассоциированными партнерами и , следовательно , раскрыть репрессивные механизмы MyoD-зависимых в пролиферирующих миобластов для тонкой настройки терминальной дифференцировки.

Здесь мы опишем протокол для идентификации партнеров MyoD с помощью Тандем аффинной очистки (TAP-Tag) в сочетании с масс-спектрометрии (МС) характеристики. Использование клеток HeLa-S3, стабильно экспрессирующих Flag-HA-MyoD допускается, чтобы получить достаточное количество материала для очистки MyoD комплексов из фракционированного ядерных экстрактов. Идентификация партнеров MyoD в гетерологичной системе последовали validatiна в соответствующей системе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Получение HeLa-S3 Ядерный Соль-извлекаемых и хроматина связанных фракций

  1. Сбор клеток
    1. Расти HeLa-S3 Flag-HA-MyoD и HeLa-S3 Flag-HA (клеточная линия управления) в Дульбекко модифицированной Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (рост среда) при температуре 37 ° с и 5% СО 2 во влажном инкубаторе.
      Примечание: HeLa-S3 клетки , стабильно экспрессирующие Flag-HA-MyoD и HeLa-S3 клетки трансдуцированных с пустым вектором (HeLa-S3 Flag-HA) может быть либо с использованием протокола , описанного в: 19,20, или предоставленных авторами.
    2. Amplify клетки до 10 полностью сливающихся 150 мм блюд каждой клеточной линии (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD и HeLa-S3 Flag-HA клетки).
    3. Соберите супернатант (содержат не прилегающего субпопуляции) в 5 л блесны.
    4. Вымойте прилипшие субпопуляции с 10 мл PBS на 150 мм блюдо, Trypsinize клетки в течение 1 мин при комнатной ТЭМратура (0,05% раствор трипсина-ЭДТА, 2 мл в течение 15 см чашку).
    5. Добавляют 4 мл среды на 150 мм чашку и сбора клеток в 50 мл пробирки.
    6. Смешайте супернатант от стадии 1.1.3 (в 5 л) и обтекатель втулки клеток из стадии 1.1.5, добавляют 500 мл свежего подогретого ростовой среды для каждой клеточной линии.
    7. Передача клеточной суспензии в 5 л обтекателя втулки и роста клеток в течение по крайней мере 60 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2 во влажном инкубаторе.
    8. Добавить 500 мл свежей среды для роста и роста клеток в течение 24 часов.
    9. Добавить 1 л свежей среды для роста и роста клеток в течение 24 часов.
    10. Возьмите 1 мл клеточной суспензии для подсчета клеток и проверить жизнеспособность клеток. Цвет 30 мкл клеточной суспензии с 30 мкл 0,4% трипанового синего и сосчитать живых (не синий) клеток под микроскопом с использованием гемоцитометра.
    11. Держите плотность клеток в 2 - 6 × 10 5 клеток / мл добавлением свежей среды роста ежедневно; не превышает 1 × 10 6 клеток / мл. Максимумобъем для одного 5 л блесны 2,5 Л.
      Примечание: Для следующих шагов, необходимо выполнить партиями по 2 - 2,5 л культуры при плотности 1 × 10 6 клеток / мл. Повторите шаги 1.1.12 - 1.1.14 собрать около 20 л (≈ 20 г сухой гранулы) из каждой клеточной линии, прежде чем перейти к следующему шагу.
    12. Гранул клетки центрифугированием при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
    13. Ресуспендируют клеток в 100 мл охлажденного льдом PBS пипетированием и центрифуге при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° C, чтобы промыть осадок.
    14. Повторите Мытье ресуспендирования клеток с 25 мл охлажденного на льду PBS, перенос суспензии в 50 мл пробирку и центрифугировали при 500g в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
      Примечание: Клеточные гранулы могут быть либо использованы немедленно, или замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С в течение нескольких дней.
  2. Выделение ядер
    Примечание: Выполните шаги 1.2.1 - 1.4.3 в холодном помещении.
    1. Pre-чилл BuffeRS и гомогенизаторы.
    2. При использовании замороженного материала, быстро оттаивают гранул клеток в водяной бане при 37 ° С.
    3. Ресуспендируют 20 г (≈ 20 мл) клеток в 20 мл (объем , равный размеру клеточного осадка) гипотонического буфера А (таблица 3) , с использованием 10 мл буфера сначала, а затем добавляя по 5 мл, а затем добавить еще 5 мл. Вымойте хорошо пипеток со свежим буфером, чтобы получить максимум клеток.
    4. Передача клеточной суспензии 40 мл в предварительно охлажденный гомогенизатор с плотно закрывающейся пестик.
    5. Однородный клетки с 20 ударами в гомогенизаторе (20 в и движений) и переносят клеточную суспензию в 50 мл пробирку.
    6. Промыть гомогенизатора 7 мл буфера сахарозы (1/3 первоначального объема клеток, таблица 3) , чтобы восстановить максимум клеток. Перенесите эту суспензию быстро в 50 мл трубки с шага 1.2.5 для сохранения ядра и ограничить утечку.
    7. Пятно 30 мкл аликвоты с 30 мкл 0,4% трypan синий, анализируют под микроскопом, чтобы контролировать эффективность лизиса (если лизис прошло успешно, все ядра должны быть синим). При необходимости повторите шаг гомогенизации.
    8. Центрифуга в течение 7 мин при 10000 х г и 4 ° С для осаждения ядра. Сохраните супернатант в качестве цитоплазматической фракции.
  3. Получение ядерной Соль-извлекаемого (SE) Фракция
    1. Ресуспендируют Ядра гранул в 8 мл буферного раствора сахарозы (объем, равный объему с размером ядра гранулы). Добавить по каплям при перемешивании тщательно на вихре 8 мл солевого буфера с высоким (1 ядер объема гранул, таблица 3) , чтобы получить конечную концентрацию 300 мМ NaCl. Инкубировать в течение 30 мин на льду и перемешивают каждые 5 мин.
    2. Снижение концентрации NaCl до 150 мМ добавлением 8 мл (1/3 от общего объема) буфера сахарозы. Центрифуга в течение 10 мин при 13000 х г и 4 ° С. Соберите супернатант (ядерная соль фракциюэкстрагированую, SE).
      Примечание: Либо перейдите к шагу 1.3.3 или оставить SEдоля на льду во время подготовки хроматина связанной фракции, а затем ультра-центрифугу обе фракции одновременно.
    3. Ультра-центрифуга SE в течение 30 мин при 85000 х г при 4 ° С. Возьмем супернатант (≈ 26 мл).
    4. Замораживание 100 мкл аликвоты в жидком азоте. Перейдите к шагу 2 "белковый комплекс очистки", используя остальную часть экстракта.
      Примечание: аликвоты должна использоваться в качестве элемента управления вводом во время этапа 5.1.1.
  4. Получение хроматина-связанной фракции
    1. Ресуспендируют осадок (со стадии 1.3.5.) Тщательно в 7 мл (объем, равный размеру гранул) буфера сахарозы.
    2. Добавить CaCl 2 до конечной концентрации 1 мМ (28 мкл 0,5 М CaCl 2 на 14 мл суспензии) , чтобы активировать MNase (этап 1.4.4) и перемешать.
    3. Предварительно подогревают суспензию в течение 1 мин при температуре 37 ° С.
    4. Добавить 70 мкл микрококковую нуклеазы (MNase), чтобы получить конечную концентрацию 0,0025 ед / мкл (1/200 разбавления от 0,5U / мкл акций) и перемешать.
    5. Инкубировать ровно 12 минут при 37 ° C. Смешайте каждые 4 мин.
    6. Сразу же место реакция на льду.
    7. Чтобы остановить активность MNase, добавьте 112 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0 (1/125 разведение) до конечной концентрации 4 мМ. Инкубировать в течение 5 минут на льду.
    8. Разрушать ультразвуком 5 раз в течение 1 мин при высокой амплитуде, между двумя sonications позволяют сделать перерыв в 1 мин (10 мин в общей сложности).
    9. Ультрацентрифуга в течение 30 мин при 85000 х г и 4 ° С.
    10. Соберите супернатант (нуклеосома обогащенную фракцию, NE, ≈ 12 мл).
    11. Замораживание 50 мкл аликвоты в жидком азоте. Перейдите к шагу 2 "белковый комплекс очистки", используя остальную часть экстракта.
      Примечание: аликвоты должна использоваться в качестве элемента управления вводом во время этапа 5.1.1.

2. Белковые комплексы очистки

Примечание: Установка производится в параллельных выписок из каждой клеточной линии (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD и контроля, HELA-S3 Флаг-HA).

  1. на основе Flag- Очистка
    1. Предварительная стирка Флаг смолы. Используйте 600 мкл флага смолы (от коммерческой 50% акций) для каждой экспериментальной точки (SE и NE фракций для каждой клеточной линии).
    2. Инжекцией смолы в 15 мл пробирку, ресуспендируют в 13 мл холодной TEGN (таблица 3), центрифуге в течение 2 мин при 1000 х г и удалить супернатант. Повторить 5 раз. После последней промывки ресуспендируют флага смолы в равном объеме TEGN (300 мкл для каждой экспериментальной точки).
    3. Для каждой экспериментальной точки, смешать 600 мкл промытой флага смолы и соответствующие белковые экстракты (в 15 мл пробирку для 12 мл NE и в 50 мл пробирку за доли по 26 мл SE, соответственно). Инкубируют на вращающемся колесе в течение ночи при температуре 4 ° С.
    4. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 мкг при 4 ° С, отложить в сторону супернатант и хранить при температуре 4 ° С до результата проверки эффективности очистки (2.2).
    5. Для образцов SE, ресуспендируют Flag смолыв 4 мл TEGN и переноса в 15 мл пробирку. Повторите этот шаг 3 раза, каждый раз, когда перенос на той же 15 мл трубки, чтобы избежать потери бусинки. Центрифуга 2 мин при 1000 XG и 4 ° C и удалить супернатант.
    6. Мытье Флаг смолы 7 раз в 15 мл пробирку с использованием 13 мл TEGN и центрифугирование 2 мин при 1000 х г и 4 ° С.
    7. После последней промывки Ресуспендируют в 1 мл TEGN и передачи в 1,5 мл низкой связывании трубки. Центрифуга 2 мин при 1000 XG и 4 ° C и удалить супернатант.
    8. Ресуспендируют в 200 мкл раствора пептида Flag в дозе 4 мг / мл при рН 7,8 для каждой экспериментальной точки. Смешайте шарики и пептид. Добавьте 200 мкл буфера TEGN и инкубируют при 4 ° С в течение не менее 4 часов или в течение ночи для элюирования связанных белков.
    9. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при 4 ° С и переносят смолу и надосадочную жидкость (флаг элюат) в пустой ротационную колонку, помещенной в 2 мл пробирку.
    10. Центрифуга колонна, собрать левый над супернатанта в 2 мл пробирку. Собирают Flag смолы путем добавления TEGN буфера в колонну и перейти ко второму Флага элюции 200 мкл раствора пептида Flag (4 мг / мл) в течение ночи при температуре 4 ° С для каждой экспериментальной точки.
    11. Повторите шаги 2.1.9 - 2.1.10, чтобы собрать второй вымывание. Объединить первый и второй элюатов.
  2. Тест очистки Эффективность
    Примечание: Во время этапа 2.1.11 - 2.1.12, выполнить SDS-PAGE и окрашиванием серебром (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Возьмите 15 мкл элюата, добавьте 5 мкл 4х буфера для загрузки и 2 мкл 10х восстановителем, кипятят в течение 5 мин при 96 ° С и запустить SDS-полиакриламидном 4 - 12% геля в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Пятно гель с использованием серебра набора для окрашивания (следуйте инструкциям производителя). Если есть четкие различия в структуре белка между Flag-HA-MyoD и Flag-HA имитировали элюатов, в частности полоса флага-HA MyoD (около 50 кДа, Рисунок 1А), переходите к следующему STEп.
  3. Гемагглютинина () Очистка основанное
    1. Мытье ХА смолы путем переноса в 15 мл пробирку, ресуспендирования в 13 мл TEGN и центрифугирование 2 мин при 1000 х г при температуре 4 ° С. Повторите этап промывки 5 раз. После последней промывки Ресуспендируют бисером в равном объеме буфера TEGN.
      Примечание: Объем должен быть отрегулирован в соответствии с эффективностью очистки флага на основе. Начните с 300 мкл с коммерческой 50% акций для каждой экспериментальной точки.
    2. Передача HA смолы для каждой экспериментальной точки в 1,5 мл низкой связывающей трубки. Центрифуга 2 мин при 1000 х г при 4 ° С, устранить максимум промывочного буфера (таблица 3) и добавьте элюатов от очистки флага , основанного на смоле HA.
    3. Инкубируйте пробирки на вращающемся колесе в течение ночи при температуре 4 ° С.
    4. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при 4 ° С, отложить в сторону супернатант и хранить при температуре 4 ° С до тех пор, в результате испытаний на эффективность очистки (2.3.12.).
    5. реприостановить смолы HA в 0,5 мл TEGN, переход к новой низким связыванием 1,5 мл трубки. Повторите взмучивания один раз при добавлении к тому же 1,5 мл трубки, чтобы избежать потери бусинки и центрифугировать 2 мин при 1000 х г и 4 ° С. Удалить супернатант.
    6. Промыть бусин в 8 раз с помощью 1 мл TEGN каждый раз, центрифугирование 2 мин при 1000 х г и 4 ° C и удалением надосадочной жидкости (во избежание потери бусинки). После последней промывки передать бусинки в 0,5 мл пробирки.
    7. Удалить столько супернатант, насколько это возможно. Добавьте 100 мкл HA свободного пептида раствора (4 мг / мл) при рН 7,8 на шариках для элюирования связанных белков. Инкубируют на вращающемся колесе в течение ночи при температуре 4 ° С.
      Примечание: Количество HA-пептида должна быть скорректирована в зависимости от обилия комплексов.
    8. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при 4 ° С и переносят смолу и надосадочную жидкость (HA) элюата в пустой ротационную колонку, помещенной в 2 мл пробирку.
    9. Центрифуга колонку, чтобы собрать использованную в течение супернатанта в 2 мл пробирку. Провести вторую элюции 100 мкл HA пептида (4 мг / мл) для каждой экспериментальной точки. Инкубируют на вращающемся колесе в течение ночи при температуре 4 ° С. Повторите шаг 2.3.8 - 2.3.9, чтобы собрать второй вымывание.
    10. Объединить первый и второй элюатов.
    11. Испытание эффективности очистки с помощью SDS-PAGE и окрашиванием серебром (см шаги 2.2.) (Фигура 1А).
    12. Концентрат элюата HA 30 мкл с использованием центробежных фильтров с 10 кДа светотеневой (номинальный предел молекулярной массы NMWL) в соответствии с инструкциями изготовителя.
    13. Разделить концентрированные образцы на две части: 22,5 (3/4) и 7,5 (1/4) мкл. Привязка замерзнуть 1/4 образцов в жидком азоте и хранят при -80 ° С. Используйте 3/4 часть для шага 3.
      Примечание: 1/4 замороженный часть должна быть использована для подтверждения результатов массовых спектрометрических Вестерн-блот (этап 5.1).

Анализ 3. Масс-спектрометрия

Примечание: Следующие шаги должны быть обсуждены с установкой масс - спектрометрии , который будет выполнять анализ.

  1. Дополнение 3/4 (22,5 мкл) образцов с 7,5 мкл 4х буфера для загрузки и 3,3 мкл 10-кратного восстановителем и кипятят в течение 5 мин при температуре 96 ° С.
  2. Образцы нагрузка на SDS-полиакриламидном 4 с - 12% геля. Гель-при 150 В постоянной в течение 5 мин, чтобы позволить всем белкам проникать в гель без разделения.
  3. Вымойте гель с водой; зафиксировать в течение 20 - 30 мин с Фиксирующий раствор (10% -ной уксусной кислоты, 50% метанола, 40% ультра-чистая вода), а затем промыть Фиксированный гель 5 раз в ультра-чистой воды.
  4. Нарезать кольцами, содержащими белки, хранить в 1 мл воды в 1,5 мл пробирку и отправить в масс-спектрометрического объекта.

Анализ 4. Данные

Примечание: Это общее руководство для анализа. Точные шаги будут зависеть от конкретного режима данных , данных MS объектаиспользуется для выполнения анализа (например, 21,22).

  1. Сравните список идентифицированных белков в "Myod" элюата со списком, полученным из соответствующего отрицательного контрольный препарат. Исключить из анализа белков, найденные в обоих списках.
  2. Удалить белки, которые имеют ≤2 общее количество идентифицированных пептидов из оставшегося списка.
  3. Доступ к функциональным аннотаций и функциональной классификации полученного списка белков с использованием DAVID биоинформатики ресурсов (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) и классифицировать список белков 23,24.
  4. (Необязательно) Удалить из списка "автостопщиков", заряженные неядерные белки с сильным придаточные связывания с отрицательно заряженными ДНК 25. Они содержат цитоскелета, цитоплазмы, митохондрий, мембран и рецепторных белков (сворачивания белка, цитоскелета и белки группы Разное в таблицах 1 и 2). </ Li>
  5. Сравните полученные списки MyoD interactors от SE и NE фракций , чтобы определить общие белки и белки , специфичные для каждой фракции (рисунок 2).

5. Подтверждение опознанных Interactors Вестерн-блот

  1. Подтверждение в HeLa-S3 Flag-HA-MyoD и HeLa-S3 Flag-HA
    1. Оттепель элюата образцов, полученных на стадии 2.3.14 (7,5 мкл) на льду. Добавьте 12 мкл буфера TEGN 10 мкл 4х буфера для загрузки и 3 мкл 10х восстановителем. Образцы кипятят в течение 5 мин при 96 ° С.
    2. Подготовка входных выборок для вестерн-блоттинга.
      1. Оттепель аликвот от шагов 1.3.9 и 1.4.11 и измеряют концентрацию белка, например, с использованием BCA набора (следуйте инструкциям производителя).
      2. С помощью 15 мкг белка на дорожку. Мера соответствующее количество экстракта и регулировать объем образца до 15 мкл с помощью буфера TEGN.
      3. Добавьте 5 мкл буфера 4x и загрузки1,5 мкл 10х восстановителя. Образцы кипятят в течение 5 мин при 96 ° С.
    3. Выполните Вестерн-блоттинга с антителами интереса (специфических для кандидата партнера, выявленных в ходе анализа MS) с использованием 15 мкл элюата образцов. Использование входных экстрактов в качестве контроля эндогенных уровней белка (фиг.3А).
  2. Подтверждение в соответствующей сотовой системы
    1. Получение полного ядерного экстракта С2С12 миобластов мыши.
      1. Grow С2С12 миобластов мыши в DMEM среде , содержащей 15% фетальной сыворотки теленка, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° С и 5% CO 2 во влажном инкубаторе. Никогда не превышать 80% слияния клеток для поддержания клеток в пролиферативной состоянии.
      2. Grow по крайней мере, два 150 мм блюда С2С12 для одной точки (одно антитело) иммунопреципитации (IP). Аспирируйте среды, промыть клетки дважды с 10 мл PBS.
      3. Скрип клетки и собирают в 15 мл пробирку. Centrifuge при 250 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант.
      4. Расчетный объем клеточного осадка (= V клетки). Аккуратно ресуспендируют осадок в 3 объемах V ячейки гипотонического буфера B для разрушения цитоплазматической мембраны (таблица 3).
      5. Добавить объем V клеток 0,44 х 10% NP-40 , чтобы достичь конечной концентрации 1% (об / об). Аккуратно переверните трубку несколько раз перемешать.
      6. Добавить объем V клеток 0,89 х SR (таблица 3) , чтобы сохранить целостность ядер. Осторожно Переверните пробирку несколько раз, чтобы гомогенизировать суспензии и центрифуги в течение 5 мин при 2000 х г в гранулах ядра.
      7. Удалить супернатант (цитозольной фракции). Расчетный объем ядер гранул (= V КНУ). Ресуспендируют ядер гранул в одном объеме V пис буфера сахарозы.
      8. Добавить по каплям при перемешивании тщательно вихревым одну единицу объема V NUC высокой буферной соли , чтобы получить конечную концентрацию 300 мМNaCl, и инкубировали в течение 30 мин на льду. Смешайте каждые 5 мин.
      9. Добавьте один объем V NUC буфера сахарозы (для уменьшения концентрации NaCl до 150 мм) и CaCl 2 (конечная концентрация 1 мМ). Смешивание.
      10. Предварительно подогревают суспензию в течение 1 мин при температуре 37 ° С, добавить микрококковую нуклеазы, чтобы получить окончательное от концентрации 0,0025 ед / мкл (1/200 запаса 0,5 ед / мкл) из. Смешивание.
      11. Инкубировать ровно 12 минут при 37 ° C. Смешайте каждые 3 мин.
      12. Сразу же место реакция на льду и добавляют ЭДТА (конечная концентрация 4 мМ), чтобы остановить активность MNase. Инкубировать в течение 5 минут на льду.
      13. Разрушать ультразвуком в 5 раз в течение 0,5 мин каждый при высокой амплитуде. Между двумя sonications, позволяют сделать перерыв 0,5 мин (5 мин в общей сложности).
      14. Ультра-центрифуга в течение 30 мин при 85000 х г и 4 ° С. Соберите супернатант (всего ядерного экстракта).
      15. Измерение концентрации белка от общего ядерного экстракта, например, с использованием набора BCA (следуйте инструкциям изготовителя) и продолжить immediatEly к этапу 5.2.2.
    2. Иммунопреципитации (IP) эндогенного MyoD.
      1. Чтобы предварительно ясно, экстракты, моют 10 мкл белка G агарозных шариков для каждой точки IP.
        1. Перенесите необходимый объем белка G агарозном бусин в 1,5 мл пробирку, Ресуспендируют в 1,4 в мл холодной TEGN, центрифуге в течение 2 мин при 1800 х г и удалить супернатант. Повторите 3 раза.
      2. Смешать предварительно промытой белок G агарозном шарики с соответствующим объемом полного ядерного экстракта. С помощью 500 мкг общего белка от ядерного экстракта в точке IP.
      3. Инкубируют на вращающемся колесе при 4 ° С в течение 2 ч, чтобы получить предварительно очистить экстракты.
      4. Центрифуга в течение 5 мин при 1800 х г при 4 ° С. Держите супернатант.
      5. Смешайте 5 мкг MyoD Ab или 5 мкг кролика IgG с 500 мкг предварительно очистили общего количества ядерных экстрактов в 1,5 мл низких связывающих труб. Добавить TEGN буфера до 1 мл. Инкубируют на вращающемся колесе при 4 ° С в течение ночи.
        Примечание: Выполните пollowing шаги на этапе 5.2.2.3.
      6. Предварительная стирка 7,5 мкл белка A / G раствор в наличии бусинки на одну точку IP.
        1. Перенесите необходимый объем гранул, в 1,5 мл пробирку, ресуспендирования бусин в 1 мл TEGN и центрифуге при 1800 мкг при 4 ° С в течение 2 мин. Удалить супернатант. Повторите 3 раза.
      7. Ресуспендируют белка A / G бусин в 1,5 мл блокирующего раствора (таблица 3) и инкубировать на вращающемся колесе в течение ночи при 4 ° С.
      8. Центрифуга всего экстракты ядер, инкубированные с Abs (этап 5.2.2.5) при 16000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Держите супернатант.
      9. Центрифуга блокировали белок A / G смолы (шаг 5.2.2.7) при 1800 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант и ресуспендируют в 1 мл буфера TEGN. Повторная центрифуге при 1800 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С, чтобы промывать блокирующего буфера.
      10. Ресуспендируют блокировали белок A / G смолы в 1 мл TEGN буфера и аликвоты в новые пробирки с низким белком связывания с получением 7,5 мкл Блотрахнуться белок A / G смолы на одну точку IP. Центрифуга при 1800 х г при 4 ° С в течение 2 мин и удалить как можно больше супернатанта.
      11. Добавьте общие ядерные экстракты инкубировали с Абс (или контроль IgG) к A / G смолы. Смешать и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре (RT) на вращающемся колесе.
      12. Центрифуга суспензии 1,800 XG при комнатной температуре в течение 2 мин. Удалите супернатант, ресуспендируют в 1 мл буфера для промывки и переноса суспензии в новые низким связыванием труб. Инкубируют при комнатной температуре на вращающемся колесе в течение 5 мин.
      13. Центрифуга подвески на 1,800 мкг при комнатной температуре в течение 2 мин, вновь суспендируют в 1 мл промывочного буфера и инкубируют при комнатной температуре на вращающемся колесе в течение 5 мин. Повторить 4 раза. Для последней передачи промывной к новой низкой связывающей трубки.
      14. Удалить максимум надосадочной жидкости. Добавить 7 мкл промывочного буфера, 7 мкл 4х буфера для загрузки и 3 мкл 10х восстанавливающего агента к гранулам, перемешать и кипятят в течение 5 мин при температуре 96 ° С.
      15. Выполните Вестерн-блоттинга с антителами Interest (специфичные для кандидата партнера для иммунной осажденного белка). С помощью 1% (5 мкг) входных экстрактов в качестве контроля эндогенных уровней белка (фигура 3В).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для того, чтобы понять регулирование MyoD деятельности, мы провели исчерпывающее характеристику Myod комплексов с использованием биохимического очистки, основанный на иммуноочистки двойной меченой форме MyoD с последующим масс-спектрометрии (МС). Применение клеточной линии HeLa-S3 экспрессии Flag-HA-меченый MyoD и управления клеточную линию, выражающую разрешений Flag-HA, чтобы получить достаточное количество материала, чтобы очистить MyoD комплекс, выполняя очистку двойного сродства Flag-HA-MyoD.

Мы фракционировали экстракты клеток в цитоплазматических и ядерных фракций, затем дополнительно фракционируют ядерную фракцию экстрагированный солью (ядерная соль экстрагируемые, SE) и обогащенные для нуклеосом (нуклеосом обогащенный, NE) фракций. Очистка TAP-Tag от этих разделенных ядерных фракций (рис 1, таблицы 1 и 2) разрешается разгадке партнеров , которые имеют относительно низкий ABundance, когда локализованы в одном конкретном субъядерной отсеке. Кроме того, такая стратегия была использована для выявления партнеров несвязанного (SE) по сравнению с ДНК-связанным (NE) MyoD , чтобы получить представление о регулировании MyoD деятельности.

Для очистки ТАР-Tag, была использована система тандем эпитоп Flag-HA. Небольшой гидрофильным Флаг и HA эпитопы обладают минимальным вмешательством в функции белка и являются весьма доступными для взаимодействия антитело-антиген. Anti-Flag и анти-HA смолы на основе последовательного иммуноочистки проводили с последующим элюированием иммунологически комплексов с использованием флага, так и HA пептидов. Элюированные белки затем запускались на SDS-PAGE, чтобы все белки, чтобы войти в гель. Куски геля, содержащие все очищенные белки были вырезаны; белки были извлечены, трипсин-переваривается и идентифицировали с помощью масс-спектрометрии (МС).

Как показано на рисунке 2, (рис 2 и 3) 26-28. Это проливает свет на ДНК переплете партнеров MyoD и возможных совместных регулирующих органов, которые могут установить репрессивный-хроматина среды. Например, HP1 белки, которые были определены в качестве партнеров MyoD по описанной методике, как известно, связывают денатурат H3K9 поддерживать репрессии генов и структуру гетерохроматина. Действительно, HP1 ингибирует MyoD транскрипционной активности , что приводит к нарушению экспрессии гена - мишени MyoD и терминальной дифференцировки 26 мышц.

Дальнейшее фракционированието MyoD комплексы SE и NE на глицеринового градиента (как описано в разделе 29) раскрыли Myod суб-комплексов в двух субъядерных отсеков (рис 1b). В частности, SE MyoD распространяется в трех суб-комплексов, в то время как хроматина переплете MyoD относится в основном к одному комплексу.

Некоторые из TAP-таг / МС показал interactors были подтверждены вестерн-блоттинга на MyoD комплексов. К ним относятся фактор транскрипции БФК, отливов, MTG8R и субъединицу BAF47 SWI / SNF (SNF5) (рис 3А, слева) и HP1 белки (CBX1 и CBX3) (рис 3А, справа). Важно отметить, что, так как клетки HeLa не являются мышечные клетки и не выражают MyoD, необходимо подтвердить взаимодействия между вновь выявленных interactors и MyoD в миобластов (рисунок 3 BD). Следует отметить, что для такой проверки, суммарные ядерные экстракты (без разделения на SE и NE) обычно достаточно, whicч позволяет уменьшить количество миобластов, используемых для приготовления образца. В пробирке анализы взаимодействия как в 26,27, способствовать дальнейшему санкционировал эти выводы. Наконец, функциональные значения этих взаимодействий в мышечных клетках должны быть дополнительно рассмотрены как в 26-28.

В совокупности представлены данные показывают, глобальное представление о Повсеместно выраженных партнеров MyoD и проложить путь к дальнейшим функциональных исследований в более соответствующей модели мышц.

Рисунок 1
Рисунок 1: MyoD комплексов , выделенных с помощью сдвоенного аффинной очистки (А) окрашивания серебром двойных eMyoD комплексов аффинно-очищенными , выделенных из ядерной соли экстрагируемые (SE) или нуклеосом обогащенный (NE) ядерных фракций клеточных линий HeLa-S3 стабильно. выражающий Флаг-HA-MyoD (MyoD комплекс)d линия контроля клеток (Мок). MW, молекулярный маркер вес в кило Дальтон (кДа). Стрелка указывает флаг-HA-MyoD (eMyoD). Это исследование было первоначально опубликовано в 37. Copyright Американское общество по биохимии и молекулярной биологии. Эта цифра была изменена с 26: переулки с притворным очисток и eMyoD комплекс изолирован от SE ядерных фракций представлены. (В) Двойные очищенные методом афинной хроматографии eMyoD комплексы , как в (А) фракционировали на градиенте глицерина в интервале от 20% до 41%. Фракции были вручную собирали, концентрировали и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга (WB) с использованием анти-FLAG антитела. Обратите внимание на наличие нескольких eMyoD содержащих суб-комплексов в ядерной соли экстрагируемые (SE) фракции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2 Рис . 2: Сравнение хроматина переплете (нуклеосома обогащается, NE) по сравнению с ядерной Растворимо (ядерная соль извлекаемые, SE) MyoD Partners Top: Венна диаграмма , показывающая перекрытие между eMyoD interactors , выделенных из ядерной соли-извлекаемые (SE) и нуклеосомой обогащенные ( NE) фракцию. Рибосомных белков, перевод-инициирующие факторы, репарации ДНК факторы и тубулиновые изоформы были исключены из анализа , поскольку они присутствуют в различных различных наборов данных , полученных ТАР и рассматриваются как неспецифическое Bottom:. The MyoD interactors найдены в обоих SE и NE фракции (общие) или специфические для одной из фракций (уникальных) были разделены на группы, основанные на их функциональных аннотациями. Цитоскелет связанные и другие различные белки не изображены. Подчеркнутые белки MyoD interactors валидированные либо в HeLa и / или в myoblasТ.С. путем совместной иммунопреципитации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рис . 3: Проверка выбранного набора MyoD Interactors (A) Проверка MyoD interactors, которые были определены с помощью масс - спектрометрии, в клеточной линии HeLa-S3 , стабильно экспрессирующие Flag-HA-MyoD (eMyoD) Левая панель:. Вестерн - блот анализ двойного сродства -purified MyoD комплексы, выделенные из ядерной соли-извлекаемого (SE) или нуклеосомные обогащенный (NE) фракций клеточной линии HeLa-S3, стабильно экспрессирующих eMyoD или контроль клеточной линии (Mock) с указанными антителами. MW, маркер молекулярной массы Правая панель:. Вестерн - блот - анализ двойных MyoD комплексов аффинно очищенными изолированы от ядерных нуклеосомные обогащенного фракций HeLa-S3 клеточной линии сtably выражая eMyoD или клеточную линию управления (Mock) с указанными антителами. Эта панель была первоначально опубликована в журнале Biological Chemistry. Yahi H, L Фрич, Philipot O, Guasconi V, Souidi М, Робин P, Полесская A, Losson R, Харель-Bellan A, Айт-Si-Ali S. J Biol Chem. 29 августа 2008; 283 (35): 23692-700. DOI: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Июль 2. Авторское Американское общество по биохимии и молекулярной биологии. Эта цифра была изменена с 26: тип и размер полиции был изменен , и текст был повернут для унификации маркировки внутри фигуры. MyoD был обозначен как eMyoD, чтобы избежать путаницы с эндогенным IP, представленной в других панелях. (BD) Проверка MyoD interactors в С2С12 миобластов мыши. (Б) Ядерные суммарные экстракты из пролиферирующих миобластов С2С12 были использованы для иммунопреципитации (IP) с антителами против BAF47 (SNF5) или MyoD, или с контрольным IgG. Полученные осадки анализируют с помощью ВБ именноч указанные антитела. Для анти-MyoD антител дольше (долго экспо.) И более короткой (короткой выставки.) Время экспозиции показаны. Входные экстракты были загружены, чтобы показать уровень эндогенного белка. Эта панель была опубликована в 28 под лицензией Creative Commons Attribution (CC BY) лицензии (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/~~HEAD=pobj). Эта цифра была изменена с 28: тип и размер полиции был изменен , и тест был повернут , чтобы объединить разметку внутри фигуры. (С) использовали ядерные полные выдержки из пролиферирующих миобластов С2С12 для иммунопреципитации с антителами , индуцированными против MyoD, Suv39h1 (положительный контроль), или контролировать IgG (отрицательный контроль). Полученный осадок затем подвергают WB с указанными антителами. Эта панель была первоначально опубликована в журнале Biological Chemistry. Yahi H, L Фрич, Philipot O, Guasconi V, Souidi М, Робин P, Полесская A, Losson R, Харель-Bellan A, Айт-Si-Ali S. J Biol Chem. 29 августа 2008; 283(35): 23692-700. DOI: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Июль 2. Авторское Американское общество по биохимии и молекулярной биологии. Эта цифра была изменена с 26: тип и размер полиции был изменен , и текст был повернут для унификации маркировки внутри фигуры. (D) , ядерные полные экстракты из пролиферирующих (Пролиф.) И дифференцирующие C2C12 миобластов (48 ч, указанный в качестве Diff.) Были использованы для иммунопреципитации (IP) , с антителами , индуцированными против MyoD и Myf5, или с нормальной кроличьей IgG и с пустыми шариками в качестве отрицательный контроль. Полученные осадки анализируют с помощью ВБ с указанными антителами. Входные экстракты были загружены, чтобы показать уровень эндогенного белка. Эта панель была опубликована в 27 под лицензией Creative Commons Attribution (CC BY) лицензии (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/~~HEAD=pobj). Эта цифра была изменена с 27: тип и размер полиции был изменен , и текст был повернут для унификации маркировки в Figure. Панели с результатами , полученными из пролиферирующих и дифференциации С2С12 разделены на две части, в отличие от исходной фигуры. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1:. Список белков , идентифицированной MS анализа в Double аффинно очищенным eMyoD комплексов , выделенных из ядерных Соль фракциюэкстрагированую после вычитания фона Белки (протеины , идентифицированные с помощью МС в элюатов из контрольной клеточной линии рассматривались как неспецифический фон .) данные представляют собой сумму четырех независимых очисток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Таблица 2: Список белков Identified с помощью MS анализа в Double аффинно очищенным eMyoD комплексов , выделенных из нуклеосом фракции , обогащенной после вычитания фона белков. Данные представляют собой сумму трех независимых очисток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Таблица 3. Буферные композиции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Представленный метод позволяет исчерпывающую идентификацию партнеров фактора транскрипции, MyoD. Оно показало партнеров MyoD в гетерологичной системе, устойчивой к MyoD-индуцированной дифференцировки, а именно HeLa-S3 клетки. Таким образом, по определению, идентифицированные партнеры MyoD экспрессируются повсеместно. Они включают в себя общие и последовательности специфических факторов транскрипции, хроматин-модифицирующие ферменты, белки процессинга РНК, киназ (таблицы 1 и 2). Так как клетки HeLa-S3 клетки устойчивы к MyoD-индуцированный транс-дифференцировки, MyoD активность, в основном, репрессивное и идентифицированным партнеры, вероятно, будут MyoD со-репрессоры. Это подтверждается наличием Id белков (таблицы 1 и 2, рисунок 2), известный ингибировать MyoD трансактивационную способность 8. Важно отметить, что такая репрессивная состояние соответствует статусу MyoD в пролиферирующих миобластов. Действительно, мы подтвердили, что MyoD взаимодействия с CBFβ, в MyoDпартнер идентифицируется с помощью описанного способа, могут быть обнаружены в пролиферирующих С2С12 миобластов, но теряются , когда клетки претерпели дифференциацию (рис 3D). Тем не менее, важно отметить, что одним из основных недостатков представленной методологии является отсутствие MyoD идентификации коактиваторов. Последовательно, не используя этот метод ни один из известных Myod коактиваторов, таких как гистонацетилтрансфераза 32 были идентифицированы.

Очистка MyoD комплексов либо из растворимой фракции (ядерной соли, извлекаемой SE) ядра или хроматина обогащенной фракции (нуклеосомнои обогащается, NE) (рис 1А) служит по крайней мере две основные функции. Во-первых, такая фракционирования увеличивает представление нестехиометрических партнеров, которые будут замаскированы, если очистка MyoD осуществляется от общего количества ядерных экстрактов. Во-вторых, это позволяет разделение двух функциональных субпопуляций MyoD: предварительно осажденный / ЭВИКTed (SE) и хроматина переплете (NE). Среди interactors специфичных для ДНК-несвязанный MyoD, многие киназ, факторов транскрипции, незаконный оборот белков, а также были выявлены некоторые хроматина (рис ремонтом 2). Когда полностью подтверждено, такая сеть может обеспечить понимание способа регуляции активности ДНК-несвязанный MyoD. Дополнительный поиск MyoD посттрансляционных модификаций в этих двух ядерных отсеков масс-спектрометрии, могли бы еще больше распутать регуляции активности MyoD. Наконец, фракционирование растворимых и хроматина переплете MyoD комплексов на градиенте глицерина показал , что в то время как хроматина переплете MyoD в основном содержится в одном комплексе, ДНК-несвязанный MyoD распределяется по трем подразделам комплексов (рис 1В). Характеристика этих суб-комплексов либо МС и / или вестерн-блоттинга против кандидатов белка должны выяснить далее режим регулирования MyoD.

Как подчеркивалось выше, HeLa клетки, естественно, не expreсс мышцы фактора транскрипции MyoD. Поэтому важно , чтобы подтвердить обнаруженные взаимодействия в скелетной модели мышечной (рисунок 3). Во многих докладах подтвержденных в соответствующих моделях такие функциональные взаимодействия между MyoD и некоторые из партнеров, указанных в представленном анализе TAP-тегов. Это, например, случай для прохибитин 33, ddx17 34, Meis1 35, CBF 27, HP1 26 и SWI / SNF хроматин-переделанный комплекса 36,28,30.

Обратите внимание, что можно выполнить такую ​​очистку ТАР-Таг от низкого количества клеток, таких, как из миобластов, в сочетании с чувствительными MS. Действительно, недавно опубликованной работе описаны партнеры MyoD характеристику после индуцируемой экспрессии Flag-меченый MyoD в миобластов 30. Так как стабильная и непрерывная MyoD избыточная экспрессия в миобластов является вредным, альтернативный подход будет добавить теги Flag-HA в эндогенный MyoD аллеля (ов) в миобластовс помощью генома редактирования методов, таких как CRISPR-cas9 31. Следует отметить, что добавление тега (ов) потенциально могут изменить функцию белка и / или ассоциацию с партнерами по связыванию, поэтому место тега (N- или С-конца) следует выбирать с осторожностью. Функциональный анализ слитого белка в соответствующей системе должны быть выполнены предварительной очистки для TAP-метки для обеспечения меченый белок является функциональным. Иммунопреципитации эндогенных белков позволяет избежать этих проблем, однако, зависит от наличия специфического и антитела с высоким сродством, которое редко имеются в наличии.

Другая добавленная стоимость описанного подхода является возможность определить посттрансляционные модификации (PTMs) самого очищенного белка и его богатых партнеров. Таким образом, с помощью этой функции очистки ТАР-тег подходит для идентификации не только новых партнеров взаимодействия, но и новые ферментативные функции, связанные с представляющим интерес белком и / или его партнеров. Вслучай хроматина-связывающего белка (то есть., транскрипционные факторы, ферменты), этот метод , таким образом , адаптирован для идентификации соответствующего "гистонов код". Действительно, Аминоконцевая гистонов, которые подвергаются воздействию на нуклеосомнои поверхности, подвержены нескольким ковалентных PTMs. Гистоновые PTMs придают уникальную подпись на нуклеосом, участвующих. Сочетание различных модификаций гистона N-терминальный хвостах может, таким образом, изменять структуру хроматина, чтобы позволить регуляции экспрессии генов. Таким образом, характеризующие такие модификации , связанные с данным белком может дать представление о роли и механизмах действия изученных хроматина-связывающих белков 22.

Таким образом, представленная методика позволяет всестороннюю идентификацию партнеров Myod. Очистка TAP-тег представляет собой альтернативу другим подходам, таким как GST отжимания, дрожжевые дигибридная анализы и фаговых. Даже если по практическим причинам (Productioп большого количества ядерных экстрактов), мы должны использовать гетерологичный системы сотовой связи, нам удалось подтвердить причастность выявленных партнеров MyoD в скелетной мышечной дифференцировки. Полученные данные показывают, что MyoD миогенная фактор, кажется, взаимодействуют с множеством белков, начиная от транскрипционных регуляторов к РНК-связывающих белков, предлагая различные механизмы, регулирующие активность фактора транскрипции.

В заключение отметим, что тот же самый методологический подход может быть использован для идентификации Повсеместно выраженных партнеров многочисленных ядерных факторов, которые могут быть трудными для изучения их специфического клеточного контекста.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
HeLa-S3 ATCC CCL-2.2
C2C12 ATCC CRL-1772
Equipment
Spinner Corning 778531
Homogenizer:  Dounce homogenizer  Wheaton 432-1273 and 432-1271
Agitating device for spinners Bellco 778531
Sonicator Diagenode UCD 200
Hemocytometer Marienfeld Superior  640610
Low-binding tubes Sorenson 27210
Empty spin column Bio-Rad 7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gel Life technologies NP0336BOX
4x loading buffer  Life technologies NP0007
10x reducing agent Life technologies NP0004
Silver staining kit Life technologies A8592
Centrifugal filter units, 10K Millipore UFC501024
Protein G agarose beads Sigma-Aldrich P4691
Protein A/G  Resin Thermo Scientific 53132
Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) Sigma-Aldrich A2220
HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) Sigma-Aldrich A2095
MNase Sigma-Aldrich N3755
Flag free peptide (DYKDDDDK) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
HA free peptide (YPYDVPDYA) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit Thermo Scientific 23225
Protease inhibitors Sigma-Aldrich S8830
Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate Life technologies 34075
BSA Sigma-Aldrich A9647
Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) Sigma-Aldrich D1626
Spermine tetrahydrochloride Sigma-Aldrich S1141
Spermidine Sigma-Aldrich S0266
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
PBS Sigma-Aldrich D8537
MOPS running buffer Life technologies NP0001
DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich D0822 Pre-warm  at 37 °C before use
Trypsin-EDTA (0.05% phenol red Life technologies 25300-054
Serum GE healthcare life sciences  PAA A15-102 Each lot of serum has to be first tested for your cells.
Penicillin and Streptomycin  Life technologies 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061
Water (sterile-filtered) Sigma-Aldrich W3500
Antibodies
HA from rat (12CA5) Roche 11583816001
Flag Sigma-Aldrich A8592
MyoD Santa Cruz sc-32758 To use for western blotting
MyoD Santa Cruz SC-760 To use for immunoprecipitation and western blotting
CBFbeta Santa Cruz FL-182 
HP1alpha Euromedex 2HP2G9
HP1beta Euromedex 1MOD1A9AS
HP1gamma Euromedex 2MOD1GC
Suv39h1 Cell Signaling Technology 8729
BAF47 BD Biosciences 612111
Myf5 Santa Cruz SC-302
Tubulin Sigma-Aldrich T9026
Actin Sigma-Aldrich A5441
IgG Mouse Santa Cruz SC-2025
IgG Rabbit Santa Cruz SC-2027
Goat anti-rat -HRP Sigma-Aldrich A9037
Goat anti-rabbit -HRP Sigma-Aldrich A6154 
Goat anti-mouse -HRP Sigma-Aldrich A4416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23, (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24, (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8, (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11, (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8, (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6, (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40, (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185, (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132, (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47, (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25, (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22, (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31, (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20, (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37, (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8, (12), R270 (2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283, (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5, (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9, (10), e108858 (2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12, (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29, (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10, (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117, (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11, (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27, (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316, (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283, (35), 23692-23700 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics