Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen

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Timmons, J. J., Cohessy, S., Wong, E. T. Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs. J. Vis. Exp. (111), e54039, doi:10.3791/54039 (2016).

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Abstract

Introduction

Metastasierung ist eine der Hauptursachen für Todesfälle bei Patienten mit malignen Erkrankungen. Der Prozess der metastatischen Verbreitung von Krebszellen ist wenig verstanden, aber scheint mehrere Schritte beinhalten, einschließlich Invasion benachbarter Gewebe, intravasation in die Lymphgefäße und Blutgefäße, das Überleben und Translokation innerhalb des Kreislaufsystems, Extravasation aus dem Gefäßsystem am Ort der Metastasierung, Adaptation Jede dieser biologischen Ereignisse an den neuen Mikroumgebung der neuen Website und Kolonisation am neuen Standort durch die Proliferation und Bildung von sekundären Tumoren. 1 umfassen die Transformation, die Verbreitung und das Überleben von metastasierenden Tumorzellen. Zum Beispiel kann die Umwandlung des epithelialen Phänotyps der Tumorzelle in einen mesenchymalen Phänotypen, verbunden mit der erfolgreichen Wechselwirkung mit der extrazellulären Matrix, damit sie benachbarte Gewebe einzudringen und sich auf andere Teile des Körpers metastasieren. 2,3 Darüber hinaus können diese metastatischen Zelleninnerhalb des zirkulierenden Blutstrom und entziehen Immunüberwachung vom Host überleben muss. 4,5 Wenn schließlich an einer entfernten Stelle im Körper implantiert, müssen die Tumorzellen zu ihrer Mikroumgebung um Sekundärtumoren zu proliferieren und bilden anzupassen. 6,7 Deshalb , obwohl Metastasierung ein häufiges Phänomen bei Krebspatienten ist, haben metastasierten Tumorzellen mehrere Bereiche der Verwundbarkeit, die therapeutische Intervention zugänglich sind.

In Anbetracht der immunogene Natur des Melanoms, und die jüngste Interesse an Immuntherapien, Modelle für Melanome sind immer nützlich. 8 In den Vereinigten Staaten allein ist das Melanom die Ursache von schätzungsweise 9.000 Todesfälle pro Jahr. 9 Gemeinsame Positionen von Melanom - Metastasen sind Knochen, Gehirn , Leber und Lunge. Die Mehrheit von Metastasen zu entfernten Stellen auftreten, durch den Blutkreislauf. Zirkulierende Tumorzellen im Blut muss Immunclearance entziehen, ein kapillares Bett eines distalen Organ erreichen unddringen durch die Endothelzellen des Blutgefäßes, um sich erfolgreich zu etablieren. 4-7,10, 11

Zur Nachahmung wurde die gemeinsamen und virulent Phänomene der Metastasierung, die Maus-B16-BL6-Zelllinie erstellt. A decedent der parentalen C57BL / 6 Melanomzelllinie B16-F0, B16-BL6 ist das Endprodukt von 10 aufeinander folgenden Selektionen für Lungenmetastasen von intravenöser Injektion (resultierend in B16-F10), gefolgt von 6 aufeinanderfolgenden Auswahlen für Blasenmembranpenetration. 12 als solches ist es ein zuverlässiges Melanomzelllinie für die Einrichtung von metastatischen Foci in der Maus, insbesondere bei intravenöser Injektion. 13

Nach dem Einspritzen einer ausreichenden Menge von B16-BL6-Zellen in die Schwanzvene einer B57BL / 6-Maus, gefolgt von zwei oder mehr Wochen der Implantation und das Wachstum der B16 / BL6 Zellen zu ermöglichen, wird Metastasenherde in der Lunge bilden. Nach Euthanasie und die Überprüfung durch Sezieren Mikroskopie, die Zahl dereinzelne Brennpunkte vorhanden quantifiziert werden können. Dies wiederum kann verwendet werden, um eine Dosis-Metastase Wirkung herzustellen, da die Anzahl der injizierten B16-BL6 Zellen, die mit der Anzahl von Foci korreliert auf der Oberfläche der Lunge gebildet. Dieses Modell wird als "experimentelle Metastasierung", bekannt, bei denen bekannt-metastatischen Zellen direkt in den Blutstrom eingeführt werden, eine rasche und vorhersehbare Verbreitung und Etablierung in der Lunge, Leber oder andere Organe der Untersuchung zu erleichtern. Dies steht im Gegensatz zu "spontanen Metastasierung" , wo Tumorzellen implantiert werden, oft subkutan und Metastasen stammen aus kontrolliert biologischem Krebszellen zu vergießen. 14,15

Es ist wichtig, eine geeignete Menge an B16 / BL6-Zellen in die Schwanzvenen der Mäuse zu injizieren. Zu viele, und die Lungen werden mit Metastasen und benachbarten Brennpunkte werden voneinander nicht zu unterscheiden abgedeckt sein. Zu wenig, und der Einfluss eines therapeutischen Mittels wird aufgrund inhärenter vari ununterscheidbar seintionen zwischen den Injektionen. Um eine optimale Anzahl von Foci in den Lungen der C57BL / 6-Mäusen zu erhalten, ist es notwendig, die Anzahl der injizierten Zellen mit der Menge von etablierten metastasierenden Foci auf der Oberfläche der Lunge, während unter Berücksichtigung der Unterscheidbarkeit der einzelnen zu korrelieren Brennpunkte. Dieses Protokoll wird ein metastasierendem murine Melanommodell für C57BL / 6-Mäuse zeigen.

Protocol

Ethik-Statement: Die Verwendung von Mäusen in der Forschung ist nur dann akzeptabel, in Fällen, in denen es die menschliche Verständnis der grundlegenden Biologie oder zur endgültigen Behandlung von Krankheiten voranbringen könnten.

1. Bestellung

  1. Kauf weiblichen C57BL / 6-Mäuse (Alter von 6 - 8 Wochen), 5 Mäuse pro Gruppe. Erlauben mehrere Tage für die Mäuse einzustellen.

2. Herstellung von B16-BL6 Zellen

  1. Entfernen Zellkulturplatten aus einem 37-Grad-Inkubator und in einer sterilen Haube. Platten sollten etwa 70% konfluent mit B16-BL6 murine Melanom-Zellen sein. Eine größere Zusammenfluß können die Zellen metastatische Potential verändern.
  2. 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA pro Platte, lassen für 1 Minute sitzen, und dann die Trypsin-Media-Lösung absaugen.
  3. 1 ml Trypsin pro Platte und Rückplatten in den Inkubator für 10 min.
  4. die Platten aus dem Inkubator in die sterile Haube, 4 ml Serum-freien Rosewell Park Memorial Institute Mediu Nach dem Umzugm (RPMI) zu jeder Platte.
  5. Sammeln Sie die Zellen mit einer sterilen, motorisierten Pipette. Eject-Zellen gegen die Unterseite der Platte, mit der Spitze in einem sehr kleinen Winkel gedrückt, um die Zellen aufzubrechen. Mehrmals wiederholen, um eine ausreichende Trennung von Zellklumpen zu gewährleisten, die sonst die Auswurf Nadel verstopfen könnten. Erinnere und Transfer zu einem 50 ml konischen Röhrchen.
  6. Verwenden Sie ein Hämozytometer die Zelldichte zu bestimmen. Halten der Gesamtanzahl von B16-BL6 Zellen konstant das Volumen der serumfreien RPMI bestimmen benötigt Endkonzentrationen von 0, 0,065, 0,015, 0,25 und 0,5 Millionen Zellen / ml zu erreichen.
  7. Ebenso Aliquotierung die Medien in der 50-ml-Tube zu 15 ml konischen Röhrchen. Zentrifugiere die konische Röhrchen bei 2.250 xg für 5 min. Dekantiert die Medien. Fügen Sie ein geeignetes Volumen von Serum-freiem RPMI und bestätigen Sie die gewünschte Zelldichte über Hemacytometer. Stellen Sie densities- durch Hinzufügen zusätzlicher RPMI oder Spinnen und Resuspendieren in einem kleineren volumen- entsprechend.
  8. Aliquot 500 uljeder Zellsuspension in beschriftete 1,8 ml Röhrchen auf Eis.

3. Schwanzveneninjektion

  1. Nehmen Sie eine Maus, am Schwanz gehalten, und führen Sie ihn rück zuerst in die Maus Verzögerer. Mit dem Rumpf in der Hauptkammer des Verzögerer, mit dem Schwanz außerhalb, ziehen Sie die Maus gegen Ende des Verzögerer. Legen Sie die Verzögerer-Kolben, weiter zu drücken, bis die Maus sicher ist.
  2. Drehen Sie die Maus um 90 Grad, so dass eine der seitlichen Schwanzvenen nach oben zeigt. Mit einem Alkoholtupfer reinigen kräftig auf die Seite der Schwanz der Maus, insbesondere dort, wo die Schwanzvene am deutlichsten sichtbar.
    Hinweis: Eine gute Beleuchtung für eine effektive Schwanzvene Visualisierung auf B57BL / 6J Mäuse wesentlich ist. Heizlampen oder erhitzte Chirurgie Pads, während die nicht erforderlich ist, wird auch dazu beitragen, indem das Volumen der Schwanzvene zu erhöhen.
  3. In einem sterilen Kulturhaube, sammeln 300 ul Zellkulturmedien von den 2 Millionen Zellen / ml Röhrchen. Kehren Sie die Nadel, blätterte die side und den Kolben drückt, um Blasen aus der Spritze auszustoßen. Auszuwerfen Kultur RPMI in einem Endvolumen von 250 ul zu ergeben.
  4. Ziehen Sie die Maus-Leitwerk mit nicht-dominanten Hand. Halten den Schwanz mit dem proximalen Ende des Endstücks mit dem Zeigefinger der nicht-dominanten Hand erhöht, und der distale Teil des Schwanzes mit dem Daumen niedergedrückt.
    Hinweis: Auf diese Weise wird die Schwanzvene in einer seitlichen Position gehalten wird, parallel zu der Verzögerer Oberfläche, mit einem kongruenten Eintrag möglich, in der mehr distalen Teil des Schwanzes.
  5. Führen Sie die Nadel in die Schwanzvene, zum distalen Ende hin, in einer Minute Winkel nach unten zu beginnen, und dann stellen Sie die Nadel den Winkel der Schwanzvene bei weiterem Einführen (Senkung Kolbenende der Spritze relativ zur Nadel) zu entsprechen .
  6. Führen Sie die Nadel ca. 1 cm in die Schwanzvene. Nach dem Einsetzen beginnen den Kolben zu drücken, wobei die Nadel stabil zu halten.
    Hinweis: Wenn die Nadel in die Schwanzvene ist und das Ende der Nadel not behindert die Medien ungehindert in die Vene fließen sollte. Effektive Injektion wird durch Blut-Clearance von der Vene aus. Wenn es Widerstand gibt, oder eine Blase beginnt an der Stelle in Injektion zu bilden, entfernen Sie die Nadel und versuchen Sie es erneut an einer proximalen Stelle entlang der Schwanzvene.
  7. Entfernen Sie die Nadel aus der Vene und entsorgen. Halten Sie Gaze gegen die Eintrittsstelle eine Blutung zu stoppen.
  8. Entfernen Sie den Kolben aus der Verzögerer und legen Sie die Maus in den Empfänger Käfig.
  9. Wiederholen Sie dies für alle anderen Konzentrationen.
    . Hinweis: Lungenherde Einrichtung dauert ca. 2 - 3 Wochen, mit Variabilität je nach Zelllinie und die gewünschte Größe der Brennpunkte 9 In der Zwischenzeit Mäuse sollten für Symptome beobachtet werden , die früh Euthanasie, wie übermäßige Keuchen rechtfertigen könnte.

4. Zählen der Lung Foci

  1. Euthanize der Maus durch in einem CO 2 Kammer platziert und Belichten auf 100% CO 2
  2. Spreizen Sie die Maus auf Styropor. Mit chirurgische Scheren, erstellen Sie einen chirurgischen Schnitt entlang des Brustbeins.
  3. Bilden zwei zusätzliche Einschnitte, die beide von der Oberseite des Brustbeins Inzision und gegenüber den Schultern der Maus Verzweigungs, den Brustkorb ausgesetzt wird.
  4. Machen Sie zwei Schnitte, die jeweils entlang der seitlichen Seiten des Brustbeins, den Brustkorb vom Rumpf zu entfernen, die Lungen und das Herz aussetzt.
  5. das Herz mit chirurgischen Pinzette halten, schneiden Sie die Speiseröhre und Luftröhre, das Herz und die Lungen von der Maus zu befreien. Legen Sie unter einem Binokular, bei 10-facher Vergrößerung, für eine bessere Visualisierung.
  6. Präparieren Sie das Herz von den Lungen und den Thymus zu entfernen, nur die beiden Lungen zu verlassen.
  7. Mit den Lungen unter einem Binokular, beginnen die Lungenherde zu zählen. Jede Foci sollte als kreisförmiger, braun obtrusion auf der Oberfläche der Lunge auftreten.
    1. FürKonsistenz zwischen Mäusen, die Anzahl der Foci auf der Oberfläche eines Lappens zählen und dann diese Lappen invertieren. jeder der vier Lappen tun können einzeln für eine einfachere Zählen.
  8. Speichern und die Lunge festsetzen, wenn der IHC mit, andernfalls verwerfen die Reste.

Representative Results

Bei Sichtprüfung ist die Variation in der Oberflächen Foci evident. Zählen der Anzahl von Tumoren unter einem Präpariermikroskop sollte eine lineare Beziehung zwischen der Anzahl der injizierten Tumorzellen und die Anzahl der daraus resultierenden und zählbar Foci ergeben. Verwendung einer optimalen Anzahl von injizierbaren Zellen ist das Ziel , eine , wenn die Lunge nicht vollständig abgedeckt, da sie auf 500.000 Zellen / ml in 1A sind, und nicht zu dünn bedeckt ist , wie sie bei 62.500 Zellen / ml und 125.000 Zellen / ml. Dies ist auch quantifizierbar durch lineare Korrelation (1B).

Abbildung 1
Abbildung 1. Lung Foci Resultierend aus Schwanzvene injiziert B16 / BL6 Zellen. (A) Lung Foci auf der Oberfläche der Lungen von C57BL / 6 - Mäuse als braune Kreis Massen (repräsentative Foki unter Pfeile) visualisiert werden. Da die Höhlenkeit der Zellkultur injiziert (über jedem Bild) erhöht, so die entsprechende Anzahl tut Lungenherde resultierenden (unter jedem Bild). Die Lungen aus der Maus mit der höchsten Dichte der injizierten Zellen hat die größte optische Abdeckung von Lungenherde. Maßstabsbalken repräsentieren 20 mm. (B) Enumeration der Lunge Brennpunkte relativ zu der Zellkulturdichte. Es ist eine annähernd lineare Beziehung über 125.000 Zellen / ml, wie durch Hämocytometer bestimmt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Zirkulierende Tumorzellen von einem Schwanzveneninjektion die Metastasen darstellen, die Websites von primären Wachstum entziehen und wandern durch Routen wie Blut oder lymphatischen Systems, gelegentlich selbst in den kapillaren Betten von entfernten Standorten zu etablieren. 14 Die oben beschriebenen Protokoll dient als Modell für die Sekundär Metastasen. Mit einer optimalen Anzahl von B16-BL6-Zellen injiziert, kann Experimentatoren bestimmen die relative Wirkung eines verabreichten Arzneimittels oder Immunzellpopulation, post-Neutralisierung, auf Metastasierung von Krebszellen.

Dieses Protokoll hat seine Grenzen. Die zirkulierenden Tumorzellen wurden für ihre Fähigkeit ausgewählt , zu metastasieren und sind daher nicht immunogen, geringere Mengen an Haupthistokompatibilitäts mit komplexen Klasse 1 - Moleküle. 12 Ferner ist die plötzliche und gruppierten Einführung einer großen Anzahl von Metastasen im Gegensatz zu dem typischen Szenario ist bei Patienten , wo eine kleine Anzahl von metastatischen Tumorzelleneinen verlängerten Zeitraum aus der primären Tumorlokalisation dissipieren über. Zusätzlich werden die intravenös eingeführten Tumorzellen aus der Gewebekultur und nicht die von einem Primärtumor Ursprungs. Daher sind diese Zellen im Gegensatz zu den sekundären Metastasen , die sich aus Veränderungen in der Zelladhäsion führen, Migration, Immunerkennung und Empfängerorgan Einrichtung. 15,16

Ein alternatives Protokoll würde für die Erzeugung von Primärtumoren und der Analyse der resultierenden "spontanen" Lungenmetastasen die subkutane Injektion von B16 / BL6 sein. Diese "spontane" Metastasen gefunden wurden, um mehr Heterogenität als ihre "experimentell" Pendants enthalten, genauer die der menschlichen Patienten entsprechen. Das Protokoll ist die Begrenzung in seiner Fähigkeit, den Einfluss einer experimentellen Verbindung auf die Metastase zu bestimmen. Mit einer seitlichen Schwanzveneninjektion, die Anzahl von Melanomen in den Blutstrom injizierten Zellen über h approximierenemocytometer. Mit "spontanen" Metastasierung jedoch gibt es eine größere Heterogenität zwischen Tumoren, Hinzufügen eine zusätzliche Variable für die Anzahl der Lungenherde entstehen. 16

Zusammenfassend stellt die Schwanzvene B16-BL6 murine Melanommodell ein einfaches Modell des Einflusses einer Behandlung oder Immuntherapie auf Metastase zu bestimmen. Durch intravenöse Injektion zirkulierende Tumorzellen können Forscher replizieren, zu einem gewissen Grad Patienten post Metastasierung. Betrachtet man die zerstörerischen Auswirkungen des metastasierten Tumorzellen in den Krebspatienten, dieses Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die mehrstufiger Prozess der Metastasierung zu verstehen.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Unterstützt durch ein National Cancer Institute Zuschuss 1R03CA172923 teilweise.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin Corning MT25052CV
RPMI 1640 Medium Corning MT15040CM
Phase Contraast Hemacytometer Hausser 02-671-54
Micro-Fine IV Insulin Syringes BD 14-829-1D
Sterile Alcohol Prep Pads Fisherbrand 22-363-750
Mouse Restrainer Braintree Scientific NC9999969 Restrainer choice depends on age/size of mice
Heating Pad Harry Schein NC0012697 Optional

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