La inyección de células de melanoma murino singénico para determinar su potencial metastásico en los pulmones

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Timmons, J. J., Cohessy, S., Wong, E. T. Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs. J. Vis. Exp. (111), e54039, doi:10.3791/54039 (2016).

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Abstract

Introduction

La metástasis es una causa importante de muerte entre los pacientes con tumores malignos. El proceso de la diseminación metastásica de las células cancerosas es poco conocida pero parece implicar varios pasos, incluyendo la invasión de los tejidos adyacentes, intravasación en los vasos linfáticos y la vasculatura, la supervivencia y la translocación dentro del sistema circulatorio, la extravasación de la vasculatura en el lugar de la metástasis, la adaptación al nuevo microambiente del nuevo sitio, y la colonización en el nuevo sitio de la proliferación y la formación de tumores secundarios. 1 Cada uno de estos eventos biológicos implican la transformación, la difusión y la supervivencia de las células tumorales metastásicas. Por ejemplo, la transformación del fenotipo epitelial de la célula tumoral en un fenotipo mesenquimal, junto con la interacción exitosa con la matriz extracelular, que puedan invadir los tejidos adyacentes y metastatizar a otras partes del cuerpo. 2,3 Además, estos metastásico Célulasdebe sobrevivir en el torrente sanguíneo circulante y evadir la vigilancia inmune del huésped. 4,5 Por último, cuando se implanta en un sitio distante dentro del cuerpo, las células tumorales deben adaptarse a su microambiente con el fin de proliferar y formar tumores secundarios. 6,7 Por lo tanto , a pesar de la metástasis es un fenómeno común entre los pacientes con cáncer, las células tumorales metastásicas tienen múltiples áreas de vulnerabilidad que son susceptibles de intervención terapéutica.

Dada la naturaleza inmunogénica de melanoma, y el reciente interés en inmunoterapias, modelos para el melanoma son cada vez más útil. 8 Sólo en los Estados Unidos, el melanoma es la causa de un estimado de 9.000 muertes al año. 9 lugares comunes de metástasis de melanoma son los huesos, el cerebro , el hígado y los pulmones. La mayoría de las metástasis a sitios distantes se producen a través del torrente sanguíneo. Las células tumorales circulantes en la sangre puede eludir aclaramiento inmunitario, llegar a un lecho capilar de un órgano distal yinvadir a través de las células endoteliales de los vasos sanguíneos con el fin de establecer con éxito a sí mismos. 4-7,10, 11

Para imitar los fenómenos comunes y virulentas de metástasis, se ha creado la línea de células B16-BL6 murino. A difunto de la C57BL / 6 línea celular de melanoma parental B16-F0, B16-BL6 es el producto final de 10 selecciones sucesivas de metástasis de pulmón de la inyección intravenosa (que resulta en B16-F10), seguido de 6 selecciones sucesivas de penetración de la membrana de la vejiga. 12 Como tal, es una línea de células de melanoma fiable para el establecimiento de focos metastásicos en el ratón, sobre todo cuando se inyecta por vía intravenosa. 13

Después de la inyección de una cantidad suficiente de B16-BL6 células en la vena de la cola de un ratón 6 / B57BL, seguido de dos o más semanas para permitir la implantación y el crecimiento de las células B16 / BL6, focos metastásicos se formará en los pulmones. Tras la eutanasia y la inspección por microscopía de disección, el número defocos individuales presentes se puede cuantificar. Esto, a su vez, puede ser usado para establecer un efecto dosis-metástasis, como el número de células B16-BL6 inyectados se correlaciona con el número de focos formados en la superficie de los pulmones. Este modelo es conocido como "la metástasis experimental", donde se introducen directamente las células conocidas metastásico en el torrente sanguíneo, lo que facilita una rápida dispersión y establecimiento y predecible en los pulmones, el hígado, u otro órgano de investigación. Esto está en contraste con la "metástasis espontánea", donde se implantan células tumorales, a menudo por vía subcutánea, y las metástasis se originan a partir orgánicamente eliminar las células cancerosas. 14,15

Es importante para inyectar una cantidad apropiada de células B16 / BL6 en las venas de la cola de los ratones. Demasiados, y los pulmones serán cubiertos con metástasis y la vecina focos serán indistinguibles unos de otros. Demasiado pocos, y la influencia de un agente terapéutico será indiscernible debido a vari inherenteciones entre las inyecciones. Con el fin de obtener un número óptimo de focos en los pulmones de los ratones C57BL / 6, es necesario correlacionar el número de células inyectadas con la cantidad de focos metastásicos establecido sobre la superficie de los pulmones, teniendo en cuenta la distinguibilidad de individuo focos. Este protocolo demostrará un modelo de melanoma murino metastásico de ratones C57BL / 6.

Protocol

Declaración de Ética: El uso de ratones en la investigación sólo es aceptable en los casos en que podría avanzar en la comprensión humana de la biología fundamental o hacia el eventual tratamiento de la enfermedad.

1. Orden

  1. Compra hembra C57BL / 6 ratones (edad de 6 - 8 semanas), 5 ratones por grupo. Se requieren varios días para los ratones para ajustar.

2. Preparación de las células B16-BL6

  1. Retire las placas de cultivo celular de incubadora a 37 grados y coloque en una campana estéril. Las placas deben ser aproximadamente 70% confluentes con células de melanoma murino B16-BL6. A mayor confluencia puede alterar las células potencial metastásico.
  2. Añadir 1 ml de 0,05% tripsina-EDTA por placa, dejar reposar durante 1 minuto, y luego aspirar la solución de tripsina-media.
  3. Añadir 1 ml de tripsina por placa y las placas de volver a la incubadora durante 10 min.
  4. Después de mover las placas de la incubadora a la campana estéril, añadir 4 ml de suero libre de Rosewell Parque Memorial Institute Medium (RPMI) a cada placa.
  5. Recoger las células con una pipeta estéril, motorizado. Expulsar células contra la parte inferior de la placa, con la punta presionado en un muy ligero ángulo, para romper las células. Repetir varias veces con el fin de asegurar la separación adecuada de los grupos de células, que de otro modo podrían obstruir la aguja de inyección. Recordar y transferir a un tubo cónico de 50 ml.
  6. Use un hemocitómetro para determinar la densidad celular. Mantener el número total de células B16-BL6 constante, determinar el volumen de RPMI libre de suero necesario para alcanzar concentraciones finales de 0, 0,065, 0,015, 0,25, y 0,5 millones de células / ml.
  7. Igualmente alícuota los medios de comunicación en el tubo de 50 ml a 15 ml tubos cónicos. Centrifugar los tubos cónicos a 2.250 xg durante 5 min. Decantar los medios de comunicación. Añadir un volumen apropiado de RPMI libre de suero y confirmar la densidad celular deseada a través de hemocitómetro. Ajuste densities- añadiendo RPMI adicional o hilado y resuspensión en un volumen-más pequeño en consecuencia.
  8. Alícuotas 500 lde cada suspensión celular en 1,8 ml etiquetados tubos en hielo.

3. vena de la cola de inyección

  1. Tome un ratón, que tuvo lugar por la cola, y lo guiará trasera por primera vez en el limitador del ratón. Con el torso en la cámara principal del retenedor, con la cola fuera de ella, tira del ratón hacia el final del inmovilizador. Inserte el limitador-émbolo, sin dejar de empujar hasta que el ratón es seguro.
  2. Girar el ratón 90 grados de tal manera que una de las venas de la cola lateral esté orientado hacia arriba. El uso de una almohadilla con alcohol, limpie vigorosamente el lado de la cola del ratón, en particular cuando la vena de la cola es más visible.
    Nota: Una buena iluminación es esencial para la visualización de la vena de la cola efectiva en 6J / B57BL. Las lámparas de calor o almohadillas de cirugía climatizada, aunque no es necesario, también ayudan a aumentar el volumen de la vena de la cola.
  3. En una campana de cultivo estéril, recoger 300 l de medio de cultivo celular del tubo de 2 millones de células / ml. Invertir la aguja, moviendo los side y empujando el émbolo, para expulsar las burbujas de la jeringa. Expulsar cultivo RPMI para dar lugar a un volumen final de 250 l.
  4. Extender el ratón de cola con la mano no dominante. Mantenga la cola con el extremo proximal de la cola elevada con el dedo índice de la mano no dominante, y la parte distal de la cola deprimido con el pulgar.
    Nota: En este modo, la vena de la cola se mantiene en una posición lateral, paralela a la superficie de contención, con una entrada congruente posible en la parte más distal de la cola.
  5. Insertar la aguja en la vena de la cola, hacia el extremo distal, en un ángulo descendente minutos para empezar, y luego ajustar la aguja para que coincida con el ángulo de la vena de la cola a la inserción adicional (bajando extremo del émbolo de la jeringa respecto a la aguja) .
  6. Insertar la aguja aproximadamente 1 cm en la vena de la cola. Después de la inserción, comienzan a empujar el émbolo, se mantiene la aguja constante.
    Nota: Si la aguja está en la vena de la cola y el extremo de la aguja es not obstruido los medios de comunicación debe fluir sin obstáculos en la vena. inyección eficaz se caracteriza por depuración de la sangre de la vena. Si hay resistencia, o una burbuja empieza a formar en el lugar de la inyección, retire la aguja e inténtelo de nuevo en una ubicación más proximal a lo largo de la vena de la cola.
  7. Retire la aguja de la vena y lo descarta. Mantenga una gasa contra el sitio de entrada para detener cualquier sangrado.
  8. Retire el émbolo del retenedor y colocar el puntero del ratón en la jaula destinatario.
  9. Repita este procedimiento para todas las demás concentraciones.
    Nota:. Pulmón establecimiento focos tarda aproximadamente 2 - 3 semanas, con una variabilidad dependiendo de la línea celular y el tamaño deseado de los focos 9 En el ínterin, los ratones deben ser monitorizados para detectar síntomas que podrían justificar la eutanasia temprano, como jadeo excesivo.

4. Contar el pulmón Focos

  1. La eutanasia el ratón mediante la colocación de una cámara de CO 2 y la exposición al 100% de CO2
  2. Splay el ratón sobre la espuma de poliestireno. Usando tijeras quirúrgicas, crear una incisión quirúrgica a lo largo del esternón.
  3. Haga dos incisiones adicionales, tanto de la parte superior de la incisión del esternón y la ramificación hacia los hombros del ratón, la exposición de la caja torácica.
  4. Hacer dos cortes, cada uno a lo largo de los lados laterales del esternón, para eliminar de la caja torácica del torso, la exposición de los pulmones y el corazón.
  5. Sosteniendo el corazón con pinzas quirúrgicas, cortar la tráquea y el esófago, liberando el corazón y los pulmones del ratón. Colocar debajo de un microscopio de disección, un aumento de 10x, para una mejor visualización.
  6. Diseccionar el corazón de los pulmones y retire el timo, dejando sólo los dos pulmones.
  7. Con los pulmones bajo un microscopio de disección, comenzar a contar los focos de pulmón. Cada focos debe aparecer como una intromisión circular, de color marrón en la superficie de los pulmones.
    1. porla coherencia entre los ratones, contar el número de focos en la superficie de un lóbulo, y luego invertir ese lóbulo. Hacer cada uno de los cuatro lóbulos permite individualmente para el recuento más fácil.
  8. Guardar y fijar los pulmones si se realiza IHC, de lo contrario, desechar los restos.

Representative Results

Tras una inspección visual, la variación en los focos de la superficie es evidente. Contar el número de tumores en virtud de un microscopio de disección debe producir una relación lineal entre el número de células tumorales inyectadas y el número de focos resultante y contable. El uso de un número óptimo de células inyectables, el objetivo es una donde los pulmones no están completamente cubiertas, ya que están en 500.000 células / ml en la Figura 1A, y que no están cubiertos demasiado escasa, ya que están en 62.500 células / ml y 125.000 células / ml. Esto también es cuantificable por correlación lineal (Figura 1B).

Figura 1
Figura 1. Los focos de pulmón resultante de vena de la cola inyectaron células B16 / BL6. (A) focos de pulmón puede ser visualizado en la superficie de los pulmones de ratones C57BL / 6 como masas circulares marrones (focos representante en virtud de las flechas). Como los antrosdad del cultivo celular inyectada (por encima de cada imagen) aumenta, también lo hace el número correspondiente de resultante focos de pulmón (por debajo de cada imagen). Los pulmones del ratón con la mayor densidad de células inyectadas tiene la mayor cobertura visual de focos de pulmón. Las barras de escala representan 20 mm. (B) Enumeración de los focos de pulmón en relación con la densidad de cultivo de células. Existe una relación aproximadamente lineal por encima de 125.000 células / ml, según lo determinado por hemocitómetro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Las células tumorales circulantes de una inyección en vena de cola representar las metástasis que evaden sitios de crecimiento primario y migrar a través de rutas como el torrente sanguíneo o el sistema linfático, de vez en cuando establecerse en los lechos capilares de lugares distantes. 14 el protocolo descrito anteriormente sirve como un modelo para secundaria metástasis. Con un número óptimo de células B16-BL6 inyectado, los experimentadores pueden determinar el efecto relativo de un fármaco administrado o población de células inmunes, post-neutralización, sobre la metástasis de células de cáncer.

Este protocolo tiene sus limitaciones. Las células tumorales circulantes se han seleccionado por su capacidad de metástasis y por lo tanto son no inmunogénicos, que tiene menores niveles de mayor histocompatibilidad de clase 1 moléculas. 12 Además, la introducción repentina y agrupada de gran número de metástasis es a diferencia de la situación típica en pacientes donde un pequeño número de células tumorales metastásicasdisipar durante un período prolongado de tiempo de la localización del tumor primario. Además, las células tumorales por vía intravenosa introducidas son de cultivo de tejidos y no de un origen del tumor primario. Por lo tanto, estas células son a diferencia de las metástasis secundarias que resultan de alteraciones en la adhesión celular, la migración, el reconocimiento inmune y el receptor establecimiento de órganos. 15,16

Un protocolo alternativo sería la inyección subcutánea de B16 / BL6 para la generación de tumores primarios y el análisis de los resultantes metástasis pulmonares "espontáneas". Se han encontrado estas metástasis "espontáneas" para contener una mayor heterogeneidad que sus contrapartes "experimentales", más muy similares a los de los pacientes humanos. El protocolo es limitante en su capacidad para determinar la influencia de un compuesto experimental sobre la metástasis. Con una inyección vena de la cola lateral, el número de células de melanoma inyectadas en el torrente sanguíneo se puede aproximar a través de hemocytometer. Con la metástasis "espontánea", sin embargo, hay una mayor heterogeneidad entre los tumores, la adición de una variable adicional para el número de focos de pulmón resultante. 16

En conclusión, el modelo de melanoma murino B16-BL6 vena de la cola representa un modelo sencillo para determinar la influencia de un tratamiento o la inmunoterapia en la metástasis. Por vía intravenosa la inyección de células tumorales circulantes, los investigadores pueden replicar, en cierta medida, los pacientes post-metástasis. Teniendo en cuenta los efectos destructivos de células tumorales metastásicas en los pacientes de cáncer, este modelo es una herramienta poderosa para la comprensión del proceso de múltiples etapas de la metástasis.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Apoyado en parte por una subvención del Instituto Nacional del Cáncer 1R03CA172923.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin Corning MT25052CV
RPMI 1640 Medium Corning MT15040CM
Phase Contraast Hemacytometer Hausser 02-671-54
Micro-Fine IV Insulin Syringes BD 14-829-1D
Sterile Alcohol Prep Pads Fisherbrand 22-363-750
Mouse Restrainer Braintree Scientific NC9999969 Restrainer choice depends on age/size of mice
Heating Pad Harry Schein NC0012697 Optional

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