पूर्व नैदानिक ​​Orthotopic Murine मानव प्रोस्टेट कैंसर के मॉडल

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Shahryari, V., Nip, H., Saini, S., Dar, A. A., Yamamura, S., Mitsui, Y., Colden, M., Bucay, N., Tabatabai, L. Z., Greene, K., Deng, G., Tanaka, Y., Dahiya, R., Majid, S. Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (114), e54125, doi:10.3791/54125 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

प्रोस्टेट कैंसर संयुक्त राज्य अमेरिका में पुरुषों के बीच कैंसर मौतों (9%) के दूसरे सबसे प्रचलित कारण, अगले फेफड़े और श्वसनी (28%) 1 के कैंसर के लिए है। हाल के आंकड़ों के अनुसार, यह अनुमान है कि 220, 800 नव निदान प्रोस्टेट कैंसर के मामलों और 27, 540 लोगों की मृत्यु 2015 1 में घटित होगा। पंचवर्षीय प्रारंभिक चरण में प्रोस्टेट कैंसर के रिश्तेदार जीवित रहने की दर> 99% है, जबकि उन्नत metastatic रोग की है कि केवल 28% 1। उन्नत metastatic रोग के उपचार के लिए एक बड़ी चुनौती इस रोग की प्रवृत्ति अंतर्निहित, अन्य अंगों को metastasize करने के लिए विशेष रूप से हड्डी है, जो प्रोस्टेट कैंसर के लिए एक लगातार साइट है आणविक तंत्र की समझ की कमी है। इसलिए, वहाँ आदेश उन्नत metastatic रोग 2,3 के लिए प्रगति के खिलाफ प्रभावी उपचार परहेजों का विकास करने के लिए इन प्रोस्टेट ट्यूमर की आणविक मेकअप अध्ययन करने के लिए एक स्पष्ट की जरूरत है।

प्रोस्टेट ट्यूमर प्रदर्शनी higप्रगति के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित मार्ग के बिना ज जैविक विविधता। मेटास्टेसिस अक्सर ट्यूमर invasiveness 4 का कोई पूर्व संकेत के साथ होते हैं। यह नैदानिक ​​विविधता प्रोस्टेट कैंसर की आणविक विविधता के लिए जिम्मेदार ठहराया है। इन घातक ट्यूमर के आणविक मेकअप को समझना इस रोग के लिए बेहतर नैदानिक ​​और चिकित्सीय रणनीतियों डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है। नतीजतन, प्रोस्टेट कैंसर अनुसंधान वर्तमान समझ और मेटास्टेसिस को रोकने पर ध्यान केंद्रित किया है।

पूर्व नैदानिक ​​इन विवो माउस मॉडल विकल्प उन्नत मेटास्टेटिक रोग से प्रोस्टेट कैंसर की प्रगति के आणविक तंत्र को समझने के लिए की एक किस्म की पेशकश करते हैं। इसके अलावा, इन मॉडलों को इस बीमारी के खिलाफ नए चिकित्सकीय रणनीति के preclinical मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे अधिक इस्तेमाल पशु मॉडल ट्रांसजेनिक माउस मॉडल, पूंछ-नस में इंजेक्शन, इंट्रा-हृदय आरोपण और मानव ओर्थोटोपिक माउस मॉडल शामिल हैं। ट्रांसजेनिक पढ़ाई के समय consumi हैंएनजी और मनुष्यों के साथ कि चूहों में प्रोस्टेट कैंसर के विकास के संबंध परिवर्तनशीलता 11 से पता चला है। सहज मेटास्टेटिक माउस मॉडल में, कोशिकाओं के संचलन में सीधे इंजेक्ट कर रहे हैं और हालांकि, वे तेजी से बदलाव का समय है, वे प्राथमिक ट्यूमर या metastatic झरना 5 में प्रारंभिक कदम का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। Orthotopic जेनोग्राफ्ट मॉडल हड्डी मेटास्टेटिक घावों, प्रोस्टेट कैंसर मेटास्टेसिस के आम साइट के विकास की सीमा है। बहरहाल, मानव ओर्थोटोपिक प्रोस्टेट कैंसर xenograft माउस मॉडल अच्छी तरह से विशेषता है और व्यापक रूप से प्राथमिक ट्यूमर के विकास, ट्यूमर और अंग microenvironment, मेटास्टेटिक रोग और चिकित्सकीय हस्तक्षेप 6 के लिए प्रयोगात्मक दवाओं के उपयोग के प्रारंभिक चरण के बीच परस्पर बात की आणविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है , 7,8-11।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं के लिए प्रोटोकॉल की समीक्षा की और एक संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए। देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए आधिकारिक तौर पर मंजूरी दे दी प्रक्रियाओं का पालन करें। इंट्रा-प्रोस्टेटिक इंजेक्शन खुले पेट की सर्जरी की आवश्यकता है और जानवरों के एक नामित सर्जरी कमरे में जहां उचित शल्य सड़न रोकनेवाला तकनीक पूरी प्रक्रिया के दौरान उपयोग किया जाता है के साथ एक रोगज़नक़ मुक्त वातावरण में रखा जाना चाहिए।

1. आरोपण के लिए कक्ष की तैयारी

नोट: अनुसंधान की जरूरत के आधार पर, किसी भी प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइन का इस्तेमाल किया जा सकता है। सेल लाइनों आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के अनुसार सुसंस्कृत हैं।

  1. PC3M ल्यूक-सी 6 सेल लाइन है कि स्थिरतापूर्वक जुगनू luciferase जीन व्यक्त करता है के लिए, न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) में संस्कृति कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1x गैर-जरूरी aminoacids के साथ पूरक, 1x Phleomycin डी 1 और 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट । एक मशीन w में कोशिकाओं को बनाए रखेंith 95% हवा और 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण 37 डिग्री सेल्सियस पर। PC3M ल्यूक-सी 6 कोशिकाओं UCSF कोर सुविधा से प्राप्त किया गया।
  2. trypsinization द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं। फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक बार संस्कृति प्लेटों को धो लें। 2 मिलीलीटर 0.05% trypsin 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% हवा और 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण के साथ एक मशीन में एक 10 सेमी पकवान में जोड़ें और 3-5 मिनट के लिए सेते तक कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं।
    1. clumping से बचने के लिए, मार या कोशिकाओं को अलग करने के लिए इंतजार कर रहे हैं, जबकि डिश झटकों से कोशिकाओं को उत्तेजित नहीं है। पूरा मीडिया के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को इकट्ठा और 200 x जी पर 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन। पीबीएस के साथ सेल गोली धो लें trypsin हटा दें।
  3. trypan नीले बहिष्कार परख द्वारा जीवित कोशिकाओं की गणना करें। 0.4% के 10 μl (भार / वी) trypan नीले समाधान के साथ पीबीएस में सेल निलंबन के 10 μl मिक्स। एक hemocytometer या गिनती चैम्बर स्लाइड में मिश्रण भार और एक माइक्रोस्कोप के तहत तुरंत कोशिकाओं की गिनती या एक सेल cou में चैम्बर स्लाइड पढ़ेंnter।
    1. 10 μl मीडिया में 2.5 x 10 5 कोशिकाओं से युक्त एक सेल निलंबन तैयार करें। 10 μl तहखाने झिल्ली की तरह बाह्य मैट्रिक्स निकालने के साथ सेल निलंबन मिक्स और बर्फ पर कोशिकाओं जगह है। चूहों में इंजेक्शन लगाने से पहले;: (शेयर 30 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता 200 μl 1) सेल निलंबन के लिए luciferin जोड़ें।
      नोट: यह विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के बीच सेल इंजेक्शन की निरंतरता की जाँच करने के लिए अनुमति देता है जानवरों के तत्काल जैव इमेजिंग। trypsinization के बाद, के रूप में जल्दी संभव के रूप में कोशिकाओं इंजेक्षन अधिमानतः 30 मिनट के भीतर सेल व्यवहार्यता टुकड़ी के बाद तेजी से कम हो जाती है के बाद से।

2. शल्य चिकित्सा क्षेत्र की तैयारी

  1. एक सुव्यवस्थित, कीटाणुरहित क्षेत्र है कि अपूतिता को बढ़ावा देता में सर्जरी प्रदर्शन।
  2. सर्जरी से पहले ब्लीच समाधान के साथ काउंटर / प्रयोगशाला बेंच साफ करता।
    नोट: शराब के उपयोग के लंबे समय तक संपर्क समय प्रभाव (15 मिनट) लेने की आवश्यकता के कारण निराश है।
  3. बाँझ पर्दे का प्रयोग करें,absorbable पैड या तौलिए से साफ है, और प्रत्येक शल्य चिकित्सा सत्र के बाद इन सामग्रियों की जगह। सभी उपकरणों का उपयोग करने से पहले जीवाणुरहित। पसंदीदा तरीकों एक भाप आटोक्लेव, गिलास मनका बनानेवाला पदार्थ, एथिलीन ऑक्साइड गैस, या हाइड्रोजन पेरोक्साइड भाप नसबंदी कर रहे हैं।
  4. शल्य प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए एक aseptically साफ विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें या अनुभवी शोधकर्ताओं ने एक माइक्रोस्कोप के बिना यह प्रदर्शन कर सकते हैं।

3. ट्यूमर कोशिकाओं के आरोपण

  1. का प्रयोग करें पुरुष 6-8 सप्ताह पुरानी immunocompromised Balb / सी या इशारा / SCID चूहों।
    नोट: यह और अधिक मुश्किल छोटे जानवरों और बड़े जानवरों पर संचालित करने के लिए ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस की धीमी कैनेटीक्स हो जाते हैं।
  2. जानवरों की सुविधा के निर्देशों के अनुसार पूर्व सर्जरी दर्द की दवा इंजेक्षन। उदाहरण के लिए, 0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन की एक खुराक पर इंट्रा-पेरिटोनियल Buprenorphine इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. ऑक्सीजन और पानी में 1-3% isoflurane के साथ एक isoflurane कक्ष में उन्हें रखने के द्वारा जानवरों anesthetizeजब तक यह पूरी तरह से जानवरों anesthetized हैं। सुनिश्चित इस बिंदु पर मांसपेशियों टोन की कोई पैर की अंगुली पलटा नहीं है। सामान्य संज्ञाहरण के दौरान शुष्काक्षिपाक के कारण अंधापन को रोकने के लिए उचित पशु चिकित्सा नेत्र मरहम चिकनाई का प्रयोग करें।
    नोट:, अन्वेषक का पसंदीदा तरीका उदाहरण के द्वारा जानवरों असंवेदनता pentobarbital सोडियम के लिए, प्रति ग्राम शरीर के वजन 0.05 मिलीग्राम इंट्रा-पेरिटोनियल या अक्स / xylazine समाधान प्रशासित किया जाता है (एकाग्रता: 17.16 मिलीग्राम / एमएल) 65 मिलीग्राम की एक खुराक पर / किग्रा शरीर के वजन subcutaneously प्रयोग किया जाता है। Isoflurane साँस लेना anesthetization की एक पसंदीदा तरीका है। आँख मरहम धीरे कॉर्निया के खिलाफ रगड़ के बिना लागू किया जाना चाहिए।
  4. isoflurane कक्ष से पशु निकालें और ऑक्सीजन में 1-2% isoflurane की निरंतर प्रवाह के साथ एक नाक शंकु तंत्र में जगह सुनिश्चित करने के लिए पशु आगे बढ़ने से पहले पूरा संज्ञाहरण के तहत है।
    1. शेविंग द्वारा चूहों से बालों को हटाने या प्रक्रिया की शुरुआत से पहले एक बाल हटाने क्रीम का उपयोग करें।
      नोट: यह सर्जरी के दौरान एक बाँझ हीटिंग पैड पर माउस जगह के लिए बेहतर होगा।
  5. एक लापरवाह स्थिति में माउस रखें। डब्ल्यू / डब्ल्यू povidone आयोडीन समाधान 70% इथेनॉल के फाहे से पीछा 10% के साथ पेट के निचले हिस्से को साफ करें।
  6. ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ, preputial ग्रंथि के ऊपर 2 मिमी त्वचा के एक क्षेत्र उठा, लिंग म्यान से ऊपर के बारे में 1-2 सेमी और पसलियों के नीचे से नीचे के बारे में 2-3 सेमी।
  7. एक छुरी के साथ त्वचा के माध्यम से पहले और उसके बाद एक कैंची (चित्रा 1) के साथ मांसपेशियों परत के माध्यम से लंबाई में एक midline चीरा 1cm बनाओ।
  8. शरीर गुहा में मूत्राशय का पता लगा। यह एक पीले रंग-हल्के भूरे रंग का गोलाकार अंग, चीरा (चित्रा 1) के तहत सीधे स्थित है।
  9. मूत्राशय ठीक संदंश पकड़ की एक जोड़ी के साथ और ऊपर तो नीचे लिंग म्यान के प्रति शरीर गुहा के बाहर उठा। यह दो लाभदायक vesicles जो सफेद saclike अंगों की एक जोड़ी और स्पष्ट रूप से अलग कर रहे हैं का खुलासा होगा।
  10. के साथकपास झाड़ू एक हाथ में, लाभदायक vesicles, एक एक करके अमल में लाना है, और उन्हें शरीर गुहा के बाहर खींचने के लिए और रखना उन्हें बीच में मूत्राशय (चित्रा 2) के साथ पेट की बाहरी सतह पर नीचे चेहरा।
  11. कपास swabs का प्रयोग, धीरे मूत्राशय गर्दन के पास प्रविष्टि के बिंदु पर लाभदायक vesicles वापस झुकाव, लिंग म्यान की ओर है, ताकि दो पृष्ठीय प्रोस्टेट पालियों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। गीला कपास swabs का उपयोग ऊतकों को नुकसान (चित्रा 3) से बचने के लिए।
  12. सिरिंज में लोड करने से पहले एक micropipette के साथ सेल निलंबन आंदोलन।
  13. एक कपास झाड़ू के साथ स्थिति में लाभदायक vesicles रखने, वहीं खुर्दबीन के नीचे पृष्ठीय प्रोस्टेटिक पालि (चित्रा 4) में सिरिंज सुई डालें। जब तक एक बुल्ला गठन की पहचान की है धीरे-धीरे सेल निलंबन के 20 μl इंजेक्षन। एक उभड़ा बुल्ला इंगित करता है कि इंजेक्शन सही है।
  14. साथ इंजेक्शन साइट पर हल्के से सुई, प्रेस retracting जबकिएक कपास झाड़ू और कुछ सेकंड के लिए रुक रिसाव को रोकने के लिए।
  15. ध्यान से कपास swabs के साथ लाभदायक vesicles उठा और एक मूत्राशय के द्वारा पीछा करके उन्हें शरीर गुहा एक में वापस डालें। बचें आंतरिक अंगों 'twirling जबकि इस प्रक्रिया का प्रदर्शन।
  16. अंगों शरीर गुहा में वापस रखने के बाद, गैर absorbable 4-0 नायलॉन शल्य सीवन के साथ त्वचा बंद होने के द्वारा पीछा absorbable 4-0 क्रोमिक तार टांके के साथ एक बाधित पैटर्न में पहली सिवनी पेशी परत। त्वचा भी एक साथ निकाला जा सकता है और शल्य चिकित्सा अकड़न के साथ बंद चीरा पूरी तरह से बंद करने के लिए।
    नोट: चूहे भी टांके के साथ की सिफारिश की है scratching और उनके घाव है, जो फिर से खोलने के घाव, इसलिए ऊतक गोंद का उपयोग करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं पर काट करने की आदत है। छवि जानवरों तुरंत आश्वस्त करने के लिए है कि वहाँ सभी प्रयोगात्मक समूहों के बीच बराबर bioluminescent तीव्रता।
  17. जानवरों के पिंजरों को साफ और उन्हें एक वार्मिंग दीपक या गर्मी के तहत रखने के लिए लौटेंपैड हैैं। लगातार जब तक वे पूरी तरह से संज्ञाहरण से उबरने और स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए जानवरों की निगरानी।

4. पशु की निगरानी

  1. प्रयोग के अंत तक नियमित रूप से पशुओं को मॉनिटर, संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार। तो शल्य धातु क्लिप का उपयोग कर, एक से दो सप्ताह के बाद हटा दें। प्रयोग की अवधि के विशिष्ट अनुसंधान की जरूरत पर निर्भर करता है।
    नोट: इस प्रयोग से 21 दिनों के लिए आयोजित किया गया था माउस प्रोस्टेट में प्रत्यारोपित कैंसर की कोशिकाओं की सफल स्थापना की जांच करने के लिए।
  2. जानवरों की सुविधा के निर्देशों के आधार पर दर्द की दवा प्रशासन। उदाहरण के लिए, 0.1 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन की एक खुराक पर इंट्रा-पेरिटोनियल Buprenorphine 6 घंटा और अतिरिक्त खुराक लेने के बाद एक दूसरी खुराक के साथ प्रक्रिया के समय में इस्तेमाल किया जा सकता हर 8-12 मानव संसाधन के रूप में की जरूरत है।
  3. पशु वजन, भोजन की खपत, त्वचा का रंग और बनावट, गतिविधि और पेशाब और शौच की आवृत्ति की निगरानी। जानवरों immed Euthanizeiately अगर वहाँ 15% से अधिक शरीर के वजन का एक महत्वपूर्ण नुकसान है।
    1. इच्छामृत्यु के लिए, सीओ 2 एक दबाव टैंक से एक संयुक्त राष्ट्र के भीड़ भरे पिंजरे में एक प्रवाह दर पर चैम्बर या पिंजरे मात्रा / मिनट की 10-30% विस्थापित करने के लिए देने, सीओ 2 धीरे-धीरे कक्ष में प्रवेश करने के लिए इतना है कि बेहोशी और पूरा नींद लानेवाली औषधि से होनेवाली बेहोशी घटित इजाजत दी मौत से पहले।
    2. सांस की गिरफ्तारी के बाद कम से कम एक मिनट के लिए सीओ 2 प्रवाह बनाए रखने और एक पर्याप्त समय तो यह है कि मौत एक भौतिक विधि प्रदर्शन करने से पहले होता है के लिए चैम्बर में जानवरों को छोड़ दें।
    3. प्रदर्शन करना शिरच्छेद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या किसी अन्य IACUC जानवरों रासायनिक euthanizing के बाद शारीरिक विधि को मंजूरी दे दी।
      ध्यान दें: काफी कम शरीर के वजन को अक्सर एक सुस्त हालत इंगित करता है। ट्यूमर असर पशुओं प्रयोग के अंत तक ट्यूमर की उपस्थिति के लिए छोड़कर अच्छे स्वास्थ्य में होना चाहिए। इच्छामृत्यु इच्छामृत्यु पर AVMA दिशा-निर्देश के अनुरूप होना चाहिए और Liste होना चाहिएअनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल में घ।

पशु की 5. गैर इनवेसिव जैव इमेजिंग

  1. साप्ताहिक एक गैर इनवेसिव इमेजिंग तकनीक का उपयोग कैंसर की कोशिकाओं, ट्यूमर के विकास और किसी भी दूर मेटास्टेसिस के औपनिवेशीकरण ट्रैक करने के लिए जानवरों की निगरानी।
    नोट: इस तरह के GFP-इमेजिंग, luciferase इमेजिंग, एक्स-रे या 3 डी सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी (UCT) आदि के रूप में इमेजिंग तौर तरीकों विशिष्ट अनुसंधान पर आधारित इस्तेमाल किया जा सकता 12-15 की जरूरत है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पीछे प्रोस्टेटिक पालि में PC3M ल्यूक-सी 6 कोशिकाओं के ओर्थोटोपिक आरोपण के बाद, चूहों साप्ताहिक प्रयोग के पाठ्यक्रम (- बी चित्रा 5 ए) से अधिक कोशिकाओं के उपनिवेशवाद और ट्यूमर के विकास की निगरानी के लिए एक जीवित जानवर bioluminescence इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करके imaged थे। bioluminescent संकेत की मात्रा संकेत दिया कि PC3M ल्यूक-सी 6 कोशिकाओं को सफलतापूर्वक प्रोस्टेट पालियों उपनिवेश। वृद्धि bioluminescence प्रयोग (चित्रा 5 ब) के पाठ्यक्रम में वृद्धि हुई प्राथमिक ट्यूमर के विकास का सूचक है। अनुसंधान लक्ष्य के आधार पर, चूहों ट्यूमर के विकास और किसी दूर के मेटास्टेटिक घावों पर नजर रखने के लिए रेडियोग्राफी, प्रतिदीप्ति या luminescence इमेजिंग द्वारा साप्ताहिक गैर invasively पर नजर रखी जा सकती है। अन्य मापदंडों है कि इस मॉडल के साथ प्राप्त किया जा सकता है: शरीर के वजन और प्रयोग के दौरान अधिक भोजन की खपत में परिवर्तन; ट्यूमर के आकार और वजन पर नशीली दवाओं के उपचार के प्रभाव; मात्रा का ठहरावप्रयोग की समाप्ति पर ट्यूमर के आकार और वजन के; डीएनए / आरएनए / प्रोटीन की निकासी के प्रयोग की समाप्ति के बाद प्राथमिक ट्यूमर के अंदर होने वाली आणविक परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए।

आकृति 1
चित्रा 1:। ट्यूमर कोशिकाओं के इंट्रा-प्रोस्टेटिक आरोपण के लिए उदर midline चीरा पेट midline चीरा लगभग 1-2 सेमी लंबा है। मूत्राशय चीरा के तहत सीधे है। चीरा के दोनों किनारों पर कोमल दबाने मूत्राशय बहर करने में मदद करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: में लिए लाभदायक vesicles की व्यवस्थाटीआरए-प्रोस्टेटिक ट्यूमर कोशिकाओं का आरोपण। लाभदायक vesicles सफेद थैली की तरह अंग हैं और सीधे मूत्राशय के निकट स्थित हैं। लाभदायक vesicles कपास swabs के साथ exteriorized कर रहे हैं और छोड़ दिया व्यवस्था की और सही केंद्र में मूत्राशय के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। प्रोस्टेट की पीठ प्रविष्टि के बिंदु पर, धीरे वापस लाभदायक vesicles लिंग म्यान की ओर झुकाव इतना है कि दो पृष्ठीय प्रोस्टेट पालियों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए गीला कपास swabs का प्रयोग करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4:।। ट्यूमर कोशिकाओं के इंट्रा-प्रोस्टेटिक आरोपण ट्यूमर कोशिकाओं प्रोस्टेट के पृष्ठीय पालि में इंजेक्ट कर रहे हैं यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। इंट्रा-प्रोस्टेटिक आरोपण मॉडल के vivo bioluminescence इमेजिंग में (ए) में विवो luciferase लेबल PC3M ल्यूक-सी 6 कोशिकाओं के बाद प्रयोगात्मक समय के पाठ्यक्रम पर चूहों के bioluminescence छवियों नग्न चूहों के पृष्ठीय प्रोस्टेटिक पालि में प्रत्यारोपित किया गया। (बी) bioluminescence संकेत की मात्रा से पता चलता है कि PC3M ल्यूक-सी 6 कोशिकाओं को सफलतापूर्वक बढ़ाने के साथ प्रोस्टेट ग्रंथि उपनिवेशप्रयोग के पाठ्यक्रम पर ओर्थोटोपिक ट्यूमर के विकास एड। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह पांडुलिपि एक मानव ओर्थोटोपिक प्रोस्टेट कैंसर xenograft माउस मॉडल की स्थापना के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करता है। यह मॉडल immunocompromised चूहों के पृष्ठीय प्रोस्टेटिक खण्डों में मानव प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइन PC3M ल्यूक-सी 6 का सीधा आरोपण द्वारा स्थापित किया गया था। ट्यूमर प्रयोग के पाठ्यक्रम पर विकसित करने के लिए अनुमति दी गई। ट्यूमर के विकास को प्रयोग के दौरान एक गैर इनवेसिव bioluminescence इमेजिंग प्रणाली द्वारा साप्ताहिक नजर रखी थी।

जेनोग्राफ्ट ट्यूमर मॉडल स्थापित करने में सबसे महत्वपूर्ण कारक ट्यूमर कोशिकाओं का प्रत्यारोपण भर में स्थिरता प्राप्त करने के लिए है। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह 5-10 चूहों को शामिल करना चाहिए और ट्यूमर के आकार भिन्नता औसत ट्यूमर के आकार के 10 से अधिक% से अधिक नहीं होना चाहिए। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, प्रोटोकॉल के भीतर कुछ महत्वपूर्ण कदम, जैसे महत्वपूर्ण हैं: i) क्षेत्र में सर्जरी है कि सर्जरी के दौरान अपूतिता बढ़ावा आयोजन; द्वितीय) कोशिकाओं होना चाहिए transplanteजितनी जल्दी हो सके डी संस्कृति से अलगाव के बाद; iii) इंजेक्शन की मात्रा के अनुरूप होना चाहिए; iv) में और शरीर गुहा के बाहर की कोशिकाओं का प्रत्यारोपण के दौरान आंतरिक अंगों की सावधान उठाने; v) सभी जानवरों को एक ही तकनीक और एक अन्वेषक द्वारा इंजेक्शन का उपयोग कर किया जाना चाहिए; vi) पशु ट्यूमर सेल आरोपण के बाद प्रयोगात्मक समूहों में बेतरतीब किया जाना चाहिए।

कुछ समस्याओं का हो सकता है कि कर रहे हैं: i) ट्यूमर सभी में विकास नहीं करता या ट्यूमर पिंड अन्त्रपेशी या शरीर गुहा में विकसित करना; ii) असमान ट्यूमर के आकार में एक ही प्रयोगात्मक समूह के बीच मनाया जाता है; iii) वहाँ उच्च सर्जरी से संबंधित मृत्यु दर हो सकती है। इन समस्याओं जैसे साधारण उपायों के द्वारा दूर किया जा सकता है: i) माइकोप्लाज्मा आदि के साथ किसी भी संक्रमण के लिए सेल संस्कृति का परीक्षण; ii) इंजेक्शन के दौरान अन्त्रपेशी और उदर गुहा में ट्यूमर सेल निलंबन के रिसाव को रोकने; iii) प्रत्येक सिरिंज लोड करने से पहले सेल निलंबन आंदोलन; iv) उचित संज्ञाहरण खुराक fol होना चाहिएइजाजत दे दी और हीटिंग पैड प्रक्रिया के दौरान शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

डेटा की एक विस्तृत विविधता इस मॉडल माउस वजन, भोजन की खपत, ट्यूमर के आकार और वजन, ट्यूमर कोशिकाओं है कि क्षेत्रीय लिम्फ नोड मेटास्टेसिस 10 के रूप में रूप में अच्छी तरह ट्यूमर के विकास के लिए योगदान में आनुवंशिक और आणविक परिवर्तन सहित एक विशेष अनुसंधान लक्ष्य के आधार पर उपयोग एकत्र किया जा सकता 16। हॉफमैन और उनके समूह शल्य ओर्थोटोपिक आरोपण (एसओआई) की तकनीक विकसित की है और बड़े पैमाने पर प्रोस्टेट, मूत्राशय और मूषक 17 में गुर्दे के कैंसर सहित मानव कैंसर के प्रमुख प्रकार की histologically बरकरार टुकड़े प्रत्यारोपण के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है। के रूप में वे सही नैदानिक ​​कैंसर 18,19 प्रतिनिधित्व करते हैं ये ओर्थोटोपिक मॉडल ट्रांसजेनिक या चमड़े के नीचे माउस मॉडल पर फायदा है। इन मॉडलों को भी immunodeficient सवार की इसी अंग को ट्यूमर के रोगियों से सीधे लिया प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया गयाएनटीएस। Orthotopic मॉडल भी अच्छी तरह से ट्यूमर के विकास और लिम्फ नोड मेटास्टेसिस 10 पर नशीली दवाओं के उपचार के प्रभाव की जांच करने के लिए अनुकूल हैं। उन्होंने यह भी बदल जीन अभिव्यक्ति पूर्व vivo के प्रभाव की जांच, और ट्यूमर घटना पर उसके प्रभाव के साथ ही इंट्रा-प्रोस्टेटिक विकास और मेटास्टेसिस 20 का निर्धारण करने के लिए उपयोगी होते हैं। हालांकि, ओर्थोटोपिक प्रोस्टेट कैंसर के मॉडल की एक सीमा है कि ऐसी कोई मॉडल हड्डी जो प्रोस्टेट कैंसर मेटास्टेसिस 12 के लिए सबसे लगातार साइट है सहज मेटास्टेसिस के लिए नेतृत्व करने के लिए सूचित किया गया है।

हड्डी मेटास्टेसिस को प्राप्त करने में विफलता किसी भी हड्डी मेटास्टेटिक घावों विकसित कर सकते हैं इससे पहले कि मूत्र रुकावट से मर चूहों की वजह से हो सकता है, क्योंकि या माउस की microenvironment मानव microenvironment पुनरावृत्ति करने के लिए विफल रहता है, इस प्रकार की हड्डी को विकसित करने में नाकाम रहने के 12 metastases। बहरहाल, इस मॉडल का आवेश और ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवेश करने से पहले मेटास्टेटिक झरना में प्रारंभिक घटनाओं की पुनरावृत्ति करता हैसंचलन में है और इसलिए प्राथमिक ट्यूमर, मेटास्टेटिक परिवर्तन के लिए और नए चिकित्सकीय रणनीति 10,12 के preclinical मूल्यांकन के लिए प्रारंभिक प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PC3 prostate cancer cell line  ATCC CRL-1435
Minimum Essential Medium (MEM)  GIBCO,Life Technology 11095-080
PBS GIBCO,Life Technology 10010-023
FBS GIBCO,Life Technology 10437-028
Zeocin Invitrogen,Life Technology R250-01
Trypsin  GIBCO,Life Technology 25300-54
IVIS  Xenogen-Caliper
Insulin Syringes (300 µl, 28.5 g) Becton Dickinson 309300
Mice Charles River Laboratories, Inc
Alcohol Swabs MEDEquip Depot 326895 BD
PVP Iodine Prep Pad MEDEquip Depot C12400PDI
Surgical CatGut Chromic Suture Demetech CC224017F0P
Matrigel Corning 354248

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65, (1), 5-29 (2015).
  2. Andrieu, C., et al. Heat shock protein 27 confers resistance to androgen ablation and chemotherapy in prostate cancer cells through eIF4E. Oncogene. 29, (13), 1883-1896 (2010).
  3. Fusi, A., et al. Treatment options in hormone-refractory metastatic prostate carcinoma. Tumori. 90, (6), 535-546 (2004).
  4. Hughes, C., Murphy, A., Martin, C., Sheils, O., O'Leary, J. Molecular pathology of prostate cancer. J Clin Pathol. 58, (7), 673-684 (2005).
  5. Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. J Vis Exp. (79), e50873 (2013).
  6. Pettaway, C. A., et al. Selection of highly metastatic variants of different human prostatic carcinomas using orthotopic implantation in nude mice. Clin Cancer Res. 2, (9), 1627-1636 (1996).
  7. Rembrink, K., Romijn, J. C., van der Kwast, T. H., Rubben, H., Schroder, F. H. Orthotopic implantation of human prostate cancer cell lines: a clinically relevant animal model for metastatic prostate cancer. Prostate. 31, (3), 168-174 (1997).
  8. Kim, S. J., et al. Blockade of epidermal growth factor receptor signaling in tumor cells and tumor-associated endothelial cells for therapy of androgen-independent human prostate cancer growing in the bone of nude mice. Clin Cancer Res. 9, (3), 1200-1210 (2003).
  9. Kim, S. J., et al. Targeting platelet-derived growth factor receptor on endothelial cells of multidrug-resistant prostate cancer. J Natl Cancer Inst. 98, (11), 783-793 (2006).
  10. Park, S. I., et al. Targeting SRC family kinases inhibits growth and lymph node metastases of prostate cancer in an orthotopic nude mouse model. Cancer Res. 68, (9), 3323-3333 (2008).
  11. Zhang, J., et al. AFAP-110 is overexpressed in prostate cancer and contributes to tumorigenic growth by regulating focal contacts. J Clin Invest. 117, (10), 2962-2973 (2007).
  12. Park, S. I., Kim, S. J., McCauley, L. K., Gallick, G. E. Pre-clinical mouse models of human prostate cancer and their utility in drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 14, Unit 14.15 (2010).
  13. Johnson, L. C., et al. Longitudinal live animal micro-CT allows for quantitative analysis of tumor-induced bone destruction. Bone. 48, (1), 141-151 (2011).
  14. Steinbauer, M., et al. GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice. Clin Exp Metastasis. 20, (2), 135-141 (2003).
  15. Yang, M., et al. A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer. Cancer Res. 59, (4), 781-786 (1999).
  16. Stephenson, R. A., et al. Metastatic model for human prostate cancer using orthotopic implantation in nude mice. J Natl Cancer Inst. 84, (12), 951-957 (1992).
  17. Hoffman, R. M. Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic. Invest New Drugs. 17, (4), 343-359 (1999).
  18. Wang, X., An, Z., Geller, J., Hoffman, R. M. High-malignancy orthotopic nude mouse model of human prostate cancer LNCaP. Prostate. 39, (3), 182-186 (1999).
  19. An, Z., Wang, X., Geller, J., Moossa, A. R., Hoffman, R. M. Surgical orthotopic implantation allows high lung and lymph node metastatic expression of human prostate carcinoma cell line PC-3 in nude mice. Prostate. 34, (3), 169-174 (1998).
  20. Kim, S. J., et al. Reduced c-Met expression by an adenovirus expressing a c-Met ribozyme inhibits tumorigenic growth and lymph node metastases of PC3-LN4 prostate tumor cells in an orthotopic nude mouse model. Clin Cancer Res. 9, (14), 5161-5170 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics