Måling av overlevelsestid i

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kaneko, G., Yoshinaga, T., Gribble, K. E., Welch, D. M., Ushio, H. Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions. J. Vis. Exp. (113), e54126, doi:10.3791/54126 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Rotatorier er mikroskopiske kosmopolitisk zooplankton (<1 mm) som utgjør phylum Rotifera en. De har en enkel plan legeme sammensatt av ca. 1000 somatiske celler, så vel som en karakteristisk hjullignende stråleapparat kalt korona, som brukes for bevegelse og mating. De fleste rotatorier tilhøre klasser Monogononta eller Bdelloidea, som inneholder ca 1600 og 500 arter, henholdsvis 2. Monogonont rotatorier generelt har både seksuelle og aseksuelle reproduktive faser (syklisk parthenogenesis), mens bdelloid rotatorier reprodusere ved obligatorisk parthenogenesis tre. Det er således mulig å oppnå genetisk identiske rotatorier individer, noe som sikrer høy reproduserbarhet i eksperimenter. I tillegg har de en rekke andre fordeler som modellorganismer, som for eksempel et kort levetid, enkel kultur, tilgjengelighet av genomiske og transcriptomic sekvensdata 4-7, og en unik fylogenetiske posisjon fjernt fra enrthropods og nematoder 8. Rotatorier er derfor lovende virvelløse modeller i økologiske, toksikologiske og aldring studier 9-12.

Overlevelsestiden etter eksponering for miljøstress eller kjemikalier er en ofte målt parameter i disse forskningsfelt 13-19. Men en utvise forsiktighet når du måler overlevelsestiden av rotatorier fordi det er utsatt for miljøforhold av sine mødre. Nemlig i monogonont rotatorier Brachionus manjavacas, kvinnelig avkom fra alderen mødre har kortere levetid enn de fra unge mødre; Men mors kalori begrensning (CR) oppveier delvis de skadelige effektene av avansert mors alder 20. I B. plicatilis, gir maternal CR avkom lang, lang overlevelsestid etter sult, og høy oksidativt stress motstand assosiert med økt uttrykk av antioksidant enzymer 21,22. Den mors alder effekthar også blitt observert i bdelloid rotatorier 23. Derfor bør betingelsene for eksperimentelle rotatorier være nøye synkroniseres over flere generasjoner før målinger av overlevelsestiden.

Her gir vi en protokoll for måling av overlevelsestid i Brachionus rotatorier etter synkronisering med dyrkningsforhold over flere generasjoner. Intermitterende faste (IF), en variasjon av CR hvor rotatorier tilføres med jevne mellomrom, ble påført for å vise effekten av synkroniseringen på grunn av de kjente virkninger av IF om levealder 22,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av Media

Merk: Bruk halv utvannet Brujewicz kunstig sjøvann av saltholdighet 16,5 ppt (PSU). Andre kunstige havvann blir også ofte brukt til kultur Brachionus rotatorier 25,26.

  1. Legg 454 mM NaCl, 26 mM MgCl2, 27 mM MgSO4, 10 mM KCl og 10 mM CaCl 2 til 4,5 l destillert vann (sluttvolum vil være 5 L). Alternativt kan bruke deionisert fortynning vann i stedet for destillert vann. Legg CaCl 2 etter oppløsning alle andre salter.
  2. Klargjør 0,48 M NaHCO3 stamløsning (200x konsentrasjon). Tilsett 25 ml av det til den ovennevnte løsning. Den endelige konsentrasjonen av NaHCO 3 er 2,4 mm.
  3. Klargjør 0,4 M NaBr stamløsning (500x konsentrasjon). Tilsett 10 ml av det til den ovennevnte løsning. Den endelige konsentrasjonen av NaBr er 0,8 mM. Fyll opp til 5 L med destillert vann.
  4. Filtrer løsningen med et 0,45 um membranfilter.Fortynne den to ganger med sterilt vann før bruk (v / v).
    Merk: Det er mulig å lage en 2x konsentrasjon av Brujewicz kunstig sjøvann som en stamløsning.

2. Generelle Kultur betingelser

  1. Kultur laboratorie hevet eller vill-fanget rotatorier i en steril 100 ml beger mellom 20 og 30 ° C. Høyere temperatur fører til kortere levetid og akselerert reproduksjon. Bruk 25 ° C for den praktiske eksperimenter. Den rotatorietetthet eller volum av kunstig sjøvann er ikke et stort problem her.
  2. Kultur kosttilskudd mikroalgearter i kunstig sjøvann 11. Se Snell et al. (2014) for detaljer 11. Vanligvis bruker Tetraselmis tetrathele (~ 2 x 10 5 celler / ml 27,28), T. suecica (~ 6 x 10 5 celler / ml 25,29) og Nannochloropsis oculata (~ 7 x 10 6 celler / ml 30,31). Ettersom diett alger (arter, kultur conditioner, biokjemiske komposisjoner) påvirker betydelig overlevelse på Brachionus rotatorier, bruker samme masse microalga i alle eksperimentelle grupper.
  3. Hold et lager populasjon av rotatorier i en batch kultur ved å mate og skifte media og til (f.eks mate hver 2 dager og vaksinere hver uke). Mange nyfødte og voksne som bærer 2-3 egg kan observeres når rotatorier er i optimale forhold.
    Merk: En alternativ måte å skaffe eksperimentelle rotatorier er å klekke hviler egg. Rotatorier klekket fra hviler egg anses å være godt synkronisert, og deres levetid er ikke signifikant forskjellig fra rotatorier klekket fra amictic egg 11. Men rotatorier fra hvile egg starte reproduksjon tidligere enn de fra amictic egg. Dermed er forsiktighet nødvendig for målinger av sine reproduktive egenskaper.

3. Synkronisering av rotatorier ved Pre-kultur

  1. Velg en enkelt rotatorier fra stflokken befolkning og kultur som beskrevet i 2.1 til 2.3 for å etablere et sub-populasjon som skal brukes til eksperimenter. Typisk kulturen i to uker.
  2. Samle egg bærende rotatorier fra sub-populasjon (samle en dobbel antall individer som vil bli benyttet for forsøket). Kultur dem som en enkelt kohort (densitet: ~ 50 individer / ml) i en 6-brønners kulturplate som beskrevet i 2.1 til 2.3 i et friskt medium i henhold til ad libitum foring. Kontrollere befolkningstetthet er viktig fordi den kondisjonerte mediet påvirker reproduktive fysiologi Brachionus rotatorier 32,33.
  3. Overfør nyfødte klekket fra de voksnes første egg til nypreparerte kulturmedier. Gjenta denne prosedyren i 2-3 generasjoner.
  4. Bruk nyfødte klekket innen en viss tidsperiode (for eksempel <3 timer) for å måle overlevelsestiden. For å unngå en mulig skjevhet i å velge det enkelte individ, men svært usannsynlig, sjekk reproduserbarhet ved hjelp av flere indehengige subpopulasjoner.
    Merk: Som rotatorier vanligvis reprodusere bare vegetativt under denne tilstanden, sikre at ingen menn er til stede gjennom hele forsøket. Hannen er mindre enn nyfødte og vanligvis bevege seg raskere enn kvinner. Mictic kvinner har forskjellige lifespans fra amictic kvinner under visse forhold 29.

4. Målinger av overlevelse

  1. Plasser nyfødte i plast plater (typisk 24- eller 48-brønners plater, med hver brønn inneholder 1 ml kunstig sjøvann).
  2. Ved 24 timers mellomrom, overføre rotatorier til nypreparerte kulturmedier eller 12 timers mellomrom hvis ved høyere temperatur (30 ° C eller høyere). Registrere antall avkom og om den enkelte er død eller levende. Noter rotatorier som død når flimmerhårene bevegelse av corona har stanset helt.
    Merk: rotatorier ofte fester seg til sideveggene av brønnene. Lett pipettering av vannet bidrar til å finne dem. Hvis rotatorier ikke blir funnet eller are uhell skadet av pipettering, ta dem som "sensurert", ikke som "død".
  3. Fjern nyfødte når eksperimentelle rotatorier er aktivt reprodusere. Nyfødte vokser raskt, og det er noen ganger vanskelig å skille dem fra eksperimentelle rotatorier.

5. Data Analysis

  1. Lag Kaplan-Meier overlevelseskurve (figur 1 og 2) ved å plotte kumulativ overlevelsesrate på Y-aksen og tid på X-aksen. Dette er den mest vanlige fremstilling av overlevelsesdata. Bruk ikke-para log-rank test (også kalt Mantel-Cox test) for statistisk sammenligning av overlevelsestiden 34. Den log-rank test er også inkludert i andre standard statistiske pakker som JMP og R.
    Merk: Ikke bruk t-test eller analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av para multippel sammenligning fordi normalfordeling er vanligvis ikke dekkes av overlevelsesdata 35. Også disse metods ikke ta sensurert personer i betraktning. Mann-Whitney U-test kan anvendes hvis det ikke er sensurert data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results


Figur 1 viser representative overlevelseskurver av dårlig synkronisert populasjoner (av to replikater). I dette eksperimentet, hjuldyr var enten matet hver dag [ad libitum (AL) gruppe] eller annenhver dag (IF gruppe). Median overlevelse var 13 og 18 dager i AL og hvis grupper, henholdsvis. Selv om det er velkjent at IF forlenger levetiden av rotatorier, dette eksperimentet ikke klarte å påvise en statistisk signifikant forskjell mellom lifespans av AL og hvis grupper. Erfaringsmessig utilstrekkelig synkroniserings resulterer i tidlig dødelighet og gradvis nedgang i overlevelse observert i dette forsøket. Skade på rotatorier forårsaket av upassende behandling eller lav vannkvaliteten til sub-befolkningen har en tendens til å gi tilsvarende resultater.

Når rotatorier forholdene er optimale og godt synkronisert, er tidlig dødelighet neppe observert og accordingly rotatorier har en tendens til å dø på en synkronisert måte i løpet av den senere fase av eksperimentet (figur 2). Median overlevelse var 13 og 20 dager i AL og hvis grupper, henholdsvis. Selv om færre dyr ble anvendt enn forsøket i figur 1, er forskjellen i levetid mellom disse gruppene var statistisk signifikant. Dette er de representative resultater fra mer enn fem eksperimenter som har blitt publisert tidligere 22.

Figur 1
Fig. 1: Kaplan-Meier-kurver for dårlig synkronisert individer som utsettes for intermitterende faste (IF) AL gruppe ble foret ad libitum gjennom hele forsøket, mens IF gruppen ble matet hver annen dag. N = 11 og N = 12 for AL og IF-grupper, henholdsvis (N viser til antall individuelle benyttet i forsøket). Forsøket ble PERFORMed ved 25 ° C. Det ble oppdaget ingen signifikant forskjell i levetid når log-rank test ble benyttet (P = 0,1207). Dette er imidlertid vanskelig å tolke dataene på grunn bør ikke brukes log-rank-test for å sammenligne to kryssende overlevelseskurver selv om testen er kjent for å være robust 36. Ingen etablerte metoder er for tiden tilgjengelig for krysset overlevelseskurver med sensurerte data. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Fig. 2: Kaplan-Meier-kurver for synkronisert individer som utsettes for hvis rotatorier kullet, oppnådd ved pre-kulturen, ble underkastet den samme IF plan (matet hver annen dag). N = 6 og N = 8 for AL og IF grupper, henholdsvis. Forsøket ble utført ved 25 ° C. Logg-rank test, P = 0,0057. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nåværende protokollen beskriver en fremgangsmåte for måling av overlevelsestiden i Brachionus rotatorier. Den kritiske trinnet er synkronisering av rotatorier forhold over flere generasjoner. Når eksperimentelle rotatorier er godt synkronisert, er en typisk type I overlevelseskurve observert med svært lite tidlig dødelighet som rapportert i flere tidligere studier 18,24,37,38. Standardavvik av deres overlevelse derfor blitt mindre i forhold til dårlig synkroniserte rotatorier, noe som resulterer i høy statistisk styrke. Synkronisering er også forventet å øke reproduserbarheten av overlevelsestidsmålinger - fordi mødre er dyrket under optimale forhold, oppveier den gjeldende protokollen mulige skadelige effekter av mors generasjoner. Hvis tidlig død er fremdeles observert etter nøye synkronisering, vurdere å bruke nypreparerte kultur media, en annen mye fôring alger, eller et nyetablert eksperimentell kohort (dvs.starte fra protokoll 3,1).

En begrensning av denne protokollen er at de godt synkronisert rotatorier er potensielt over-sensitive. For eksempel ved screening av kjemikalier som strekker levetid, kan enkelte kjemikalier er filtrert av denne protokollen ikke klarer å oppdage signifikante effekter på levetid for dårlig synkronisert rotatorier (f.eks personer fra vill og batch-kultivert populasjoner). Derfor bør resultatene av slike eksperimenter tolkes med forsiktighet.

Effekten av mors alder på avkom overlevelse er også rapportert i andre virvelløse modeller inkludert bananflue Drosophila melanogaster og nematode Caenorhabditis elegans 39,40. Selv om det er mer tidkrevende i disse varige modeller, vil synkroniseringsprosedyren over flere generasjoner være nyttige for disse dyrene å redusere eksperimentelle variasjoner i måling av overlevelsestid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Vi er takknemlige for George Jarvis, Martha Bock, og Bette Hecox-Lea, Marine Biological Laboratory, for deres hjelp i filming.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Wako 190-13921
Magnesium chloride Wako 136-03995
Magnesium sulfate Wako 131-00427
Potassium chloride Wako 168-22111
Calcium chloride Wako 035-00455
Sodium bicarbonate Wako 199-05985
Sodium bromide Wako 190-01515
Membrane filter (0.45 µm pore size) Millipore HAWP04700
Culture plate, 6-well, non-treated Thomas Scientific 6902D01 Flat bottom
Culture plate, 48-well, non-treated Thomas Scientific 6902D07 Flat bottom
Tetraselmis, Living Carolina Biological Supply Company 152610
PRISM 6 GraphPad Software Version 6.0d

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288, (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671 (2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108 (2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662, (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500, (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452, (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136, (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101, (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649, (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77, (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19, (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13, (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67, (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25, (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2, (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253, (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662, (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68, (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68, (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99, (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667, (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137 (2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8, (2), e57186 (2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6, (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56, (5), 927-935 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics