Un regime Fenotipizzazione per topi geneticamente modificati utilizzati per studiare geni implicati in malattie umane di invecchiamento

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Patterson, V. L., Thompson, B. S., Cherry, C., Wang, S. b., Chen, B., Hoh, J. A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging. J. Vis. Exp. (113), e54136, doi:10.3791/54136 (2016).

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Abstract

Introduction

malattie età-associate stanno diventando sempre più diffusi nella società moderna. Come la scienza medica migliora e aumenta l'aspettativa di vita, la popolazione continua a invecchiare e l'onere di queste malattie cresce. sono necessarie per ridurre l'impatto di condizioni debilitanti trattamenti efficaci ma rimangono sfuggente, in molti casi. Solo attraverso la comprensione delle cause e patologia delle malattie associate con l'invecchiamento possono gli scienziati cominciare a identificare potenziali bersagli terapeutici e sviluppare strategie di intervento. Condizioni legate all'età comuni includono malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD) e la degenerazione maculare legata all'età (AMD). PD è il disturbo del movimento più comune causata da neurodegenerazione negli esseri umani. La maggior parte dei pazienti parkinsoniani mostrano sintomi come tremore a riposo, bradicinesia e la rigidità dopo 50 anni di età. esordio precoce è stato osservato anche in circa il 10% dei casi.

AMD è la principale causa di cecità neigli anziani, progressivamente danneggiando fotorecettori e dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) negli occhi. visione centrale è compromessa ma la visione periferica è generalmente inalterata. Ci sono due forme di AMD. Nella forma "a secco", depositi di proteine ​​extracellulari conosciuti come forma drusen tra l'RPE e la membrana di Bruch (BM), che porta alla atrofia geografica e offuscamento della visione centrale. I più gravi "wet" del modulo risultati di neovascolarizzazione della coroide attraverso BM negli strati RPE e fotorecettori e può portare a hamorrhaging sotto la retina che provoca danni permanenti al tessuto retinico. ampi studi di associazione Genome hanno precedentemente identificato loci che sono associati con una maggiore suscettibilità a questa malattia e ha identificato due regioni di interesse: fattore complemento H (CFH) sul cromosoma 1 e il 10q26 locus, dove l'età-correlate maculopatia suscettibilità 2 (ARMS2) e ad alta temperatura fattore requisito A1 (HtrA1) geni sono localizzati 1-5 3-6.

CFH agisce come regolatore negativo della via alternativa (AP) del sistema del complemento inibendo l'attivazione di C3. Un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) è stato collegato a un aumentato rischio di AMD, causando lo scambio di tirosina 402 in esone 9 con istidina a causa di una T di C sostituzione 1. In AMD si ritiene che l'AP è misregulated causa di una perdita di funzione di CFH ma se l'SNP svolge un ruolo causale è chiaro. Un'ipotesi è che l'istidina carica positiva è pensato per negare la capacità di CFH di legarsi a proteine ​​interagenti proteina C-reattiva ed eparina solfato 1,7. Gli studi in vitro di CFH Y402H di risultati contrastanti sulle differenze funzionali tra le varianti, e in vIVO lavoro in <em> CFH - / - topi che esprimono umanizzato CFH è in corso 8. ARMS2 si trova a monte del HtrA1 nel genoma primate, anche se il gene è assente nei topi. HtrA1 è una serina proteasi, ma ARMS2 è scarsamente caratterizzato. Il linkage disequilibrium fra SNPs nel locus AMD-associato ha reso difficile determinare i contributi al rischio delle singole mutazioni dei geni in questa regione, ma studi recenti hanno suggerito che è sovraespressione di HtrA1 piuttosto che ARMS2 che porta alla neovascolarizzazione e depositi di proteine ​​sottoretiniche 9-11. Tuttavia, la vicinanza dei geni in questo locus può consentire interazioni che non può essere studiata utilizzando transgeni inseriti in modo casuale.

Oltre a AMD, la famiglia HtrA di serina proteasi è stata associata a molte malattie umane. Tutte le proteine ​​HtrA contengono un dominio serina proteasi seguito da almeno un dominio PDZ C-terminale. HtrA1, HtrA3 e HtrA4 condividono la grmangerai omologia, costituito da un dominio peptide segnale, legame del fattore di crescita insulino-simile, un dominio inibitore della proteasi Kazal, il dominio serina proteasi e un dominio PDZ. HtrA2 ha un diverso N-terminale, costituito da una sequenza di localizzazione mitocondriale, dominio transmembrana e inibitore dell'apoptosi dominio di legame seguita dalle proteasi e PDZ domini 12-16. HtrA1 mammiferi è regolata da rimodellamento substrato indotta nel sito attivo della proteasi suo dominio 17-20, e HtrA2 può anche essere modulata dall'interazione tra la proteasi serina e domini PDZ che sopprime l'attività della proteasi 21. È interessante notare che il dominio PDZ non sembra conferire regolamento simile a HtrA3 16. Le proteasi HtrA possono anche essere regolati da fattori estrinseci: è stato recentemente dimostrato che esiste un'interazione regolamentare tra HtrA1 e protoporfirine 22 e HtrA2 possono essere regolati da fosforilazione dopo l'attivazione del p38 MAP chinasipercorso in maniera PINK1-dipendente 23. La cancellazione di singoli membri della famiglia HtrA nei topi è stato documentato, tuttavia gli effetti meccanicistici per lo più non sono chiare in parte a causa della mancanza di fenotipi visibili.

HtrA1 svolge una funzione importante nel controllo di qualità delle proteine ​​e la sua misregulation o mutazione è stata associata a molte malattie umane differenti tra cui l'artrite, cancro e un aumento del rischio di AMD 3,4,24-32. Perdita di funzione HtrA2 nei tessuti neurali è stata associata a fenotipi PD negli esseri umani e topi, mentre la perdita di tessuti risultati non-neuronali in invecchiamento accelerato 33-37. HtrA3 disregolazione è stata associata a malattie, tra cui la preeclampsia e alcuni tipi di cancro 38,39. Up-regolazione di HtrA4 è stato osservato nelle placente dei pazienti preeclampsia, ma topi knockout non visualizzare un fenotipo evidente 40,41. La mancanza di fenotipi osservato in alcuni topi knockout è statopostulato ad essere il risultato di una compensazione tra il membro della famiglia HtrA: si pensa che sia HtrA4 e HtrA1 interagiscono con la famiglia TGF-B di proteine, consentendo la compensazione da HtrA1 sulla cancellazione dei HtrA4 41. Analogamente, si pensa che poiché HtrA1 e HtrA3 hanno un alto grado di omologia dominio potrebbero avere funzioni complementari 42. Tuttavia, è stato suggerito che le proteine ​​HtrA possono avere ruoli parzialmente antagoniste, in competizione per regolare obiettivi comuni 43.

Per approfondire questi fattori di rischio tre linee di topi knock-in umanizzati sono stati generati. In CFH TM1 (CFH * 9) jhoh e CFH TM2 (CFH * 9) jhoh, esone 9 del gene CFH viene sostituito con esone 9 della omologo umano. CFH TM1 (CFH * 9) jhoh codifica per la non-malattia associata tirosina residuo alla posizione 402, mentre CFH TM2 (CFH * 9) jhoh porta il Y402H, SNP rischio associato. InARMS2 tm1jhoh la sequenza ARMS2 umana è stata mirata a una regione a monte del HtrA1. Una sequenza di STOP loxP-fiancheggiato posto a monte della sequenza genica ma valle del promotore UbiC inclusa stato asportato attraversando a topi OzCre, che esprimono Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore Rosa26, come descritto in precedenza 34. Oltre a questi knock-in linee, alleli knockout condizionali per CFH e HtrA1 (CFH tm1jhoh e HtrA1 tm1jhoh), così come gli altri membri della nota famiglia HtrA sono stati generati: HtrA2 (HtrA2 tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3 tm1jhoh) e HtrA4 ( HtrA4 tm1jhoh). I fori linea germinale sono state create da incrociando topi OzCre agli animali ingegnerizzati per affiancare esoni specifici con siti loxP, in modo tale che l'eliminazione provoca uno spostamento telaio e / o la cancellazione del dominio attiva (CFH; esone 3, HtrA1; esoni 2-3, HTRA2: esoni 2-4, HtrA3; esone 3, HtrA4; esoni 4-6) 34,41. Una delezione neurale della HtrA2, cancellato usando Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore Nestin (HtrA2 FLOX; Tg (Nes-cre) 1Kln / J), è stato anche descritto 34. Solo topi privi HtrA2, sia sistemico o nei tessuti neurali, visualizzati fenotipi chiari, presentando con fenotipi parkinsoniani.

Poiché alcuni di questi geni di interesse sono poste ad essere localizzata ai mitocondri 11,44-47, e la cancellazione di HtrA2 generato fenotipi parkinsoniani, un regime di fenotipizzazione con un focus mitocondriale e neurologico è descritto qui e risultati rappresentativi dei test di interesse sono forniti . Per esaminare topi geneticamente ingegnerizzati prodotti per indagare umana, malattie correlate all'età accuratamente e sistematicamente una pianificazione fenotipizzazione iniziale è avvenuta, consistente in una serie di test relativi alle due principalipatologie di interesse: AMD e il Parkinson.

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Protocol

Etica dichiarazione: studi su animali sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni del National Institutes of Salute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa (IACUC) presso la Yale University.

1. comportamentale test di topi geneticamente modificati

Nota: Tutti i topi devono essere sottoposti a test lo stesso regime per limitare le differenze di assuefazione alla manipolazione. I test devono essere eseguiti nello stesso momento della giornata ogni volta.

  1. Neonatale degli arti posteriori di prova
    Nota: Il test di arto posteriore è condotto tutti i giorni dalle giorno postnatale (P) da 4 a P10 per valutare prossimale forza muscolare degli arti posteriori, debolezza e affaticamento.
    1. topi di trasporto per zona test e permettono di riposare per 30 minuti prima del test.
    2. Preparare apparecchiatura di prova pulendo un tubo da 50 ml con etanolo al 70%, spingendo due (-P8 P4) o uno (P9-P10) batuffoli di cotone per il fondo del tube e fissaggio in posizione verticale.
    3. Rimuovere un cucciolo dalla gabbia e registrare il peso. Mantenere cucciolo in azienda vassoio sul rilievo di calore ogni volta che non prova.
    4. sospendere delicatamente gli arti posteriori del neonato sul bordo del tubo conico, in modo tale che sia rivolta verso i batuffoli di cotone. Contare il numero di tentativi di tiro fatte e la latenza misura rientri utilizzando un cronometro.
    5. Ripetere ancora una volta quindi etichettare il cucciolo con un pennarello. In seguito, identificare i cuccioli P6 da amputazione delle falangi. Strofinare delicatamente cuccioli con biancheria da gabbia a casa prima della sostituzione.
    6. Pulire tubo conico con il 70% di etanolo.
    7. Ripetere il test sul prossimo cucciolo fino a quando l'intera cucciolata è stato testato.
    8. Smaltire batuffolo di cotone e tubo conico. Pulire gli attrezzi con il 70% di etanolo.
  2. Weanling osservazione di prova
    Nota: Il test di osservazione weanling viene somministrato quotidianamente da P19 a P21 a segnare i livelli di movimento e l'attività generale.
    1. topi di trasporto per zona di collaudo di unnd lascia a riposo per 30 minuti prima del test.
    2. Preparare scatola test plexiglas segnato con una griglia 6x6 di 2 pollici quadrati sulla base pulendo con il 70% di etanolo. Impostare apparecchiature video al lato in modo tale che l'intera scatola è nel campo di visualizzazione. Tenere il set up e dintorni lo stesso ogni giorno per evitare di introdurre novità.
    3. Rimuovere una weanling dalla gabbia e posto in una tazza tenuta pulita. peso record.
    4. Iniziare la registrazione video riprese della carta di identificazione di prova, con il numero di identificazione del mouse, l'età e la data del test. Trasferire mouse dalla holding tazza alla piazza centrale. Tempo per tre minuti, contando il numero di linee percorse da entrambe le zampe anteriori del mouse durante la prova.
    5. Rientro mouse per una gabbia e fine registrazione video pulito.
    6. Pulire l'apparecchio di prova con il 70% di etanolo.
    7. Ripetere fino a quando tutti i rifiuti è testato, per poi tornare tutti i cuccioli alla gabbia casa.
    8. Pulire tutte le apparecchiature di prova con il 70% di etanolo.
  3. Rete metallica presa di forza di prova
    Nota: La prova di forza di presa è condotta a giorni alterni tra P22 e P26, per valutare la resistenza neuromuscolare.
    1. topi di trasporto per zona test e lasciar riposare in gabbia a casa per 30 minuti prima del test.
    2. Preparare apparecchiatura per la pulizia di una scatola e rete griglia di plexiglas con il 70% di etanolo. Mettere pluriball nella parte inferiore della scatola e coprire con carta.
    3. topi separati in gruppi di tre, ponendo in coppe individuali Holding.
    4. Posizionare primo mouse sul centro della rete metallica e invertire lentamente 10-20 cm sopra la superficie morbida nel fondo della scatola plexiglass. Misurare la latenza a cadere con un cronometro. Termina il test dopo 60 secondi sono trascorsi se il mouse non lo faautunno.
    5. Rientro mouse per tazza tenuta, pulire maglia con il 70% di etanolo e sostituire la carta sopra il pluriball. Eseguire il test sui rimanenti due topi nel gruppo prima di tornare al primo. Ripetere fino ogni topo è stato testato un totale di tre volte.
    6. Riportare il gruppo ad una gabbia pulita e proseguire con i gruppi rimanenti. Se ci sono meno di tre topi in qualsiasi gruppo, in modo che a 5 min inter-trial intervallo di recupero è permesso.
    7. Rientro tutti i topi alla gabbia casa, disporre di carta e attrezzature di prova pulita con il 70% di etanolo.

2. Esame della struttura della retina

  1. Anaesthetize animali a P30-35 mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Valutare profondità dell'anestesia pizzicando la zampa e procedere solo in assenza di una risposta, in linea con le linee guida IACUC. Profumato con il 4% PFA / PBS 48.
  2. Per rimuovere gli occhi, pulire la pelle al SI dell'incisioneTE con il 70% di etanolo, prima di tagliare attraverso la pelle alla base del cranio. Sbucciare indietro la pelle per esporre il cranio e pulita con il 70% di etanolo. Utilizzando strumenti puliti, con attenzione tagliare attraverso il cranio per raggiungere le orbite ed esporre gli occhi. Recidere il nervo ottico, rimuovere delicatamente l'occhio dalla presa e lavare in PBS.
  3. Fix occhi in 4% PFA / PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
  4. Mettere gli occhi in una piccola capsula di Petri contenente PBS. Fai una piccola incisione nel centro della cornea con le forbici di rimozione dei punti. Rimuovere la cornea tagliando il bordo tra la cornea e sclera. Usare pinze per rimuovere l'iride. Infine, staccare gli strati RPE, lasciando intatta la retina e la lente a posto.
    Nota: il 4% PFA / PBS fissaggio causerà RPE distacco consenta l'RPE di essere facilmente sfogliato dall'esterno della retina.
  5. Re-fix in 4% PFA / 30% di saccarosio / PBS per 15 minuti a temperatura ambiente prima di tornare l'occhio ad una piastra di Petri contenente PBS. Estrarre il lens usando pinze, portando il corpo vitreo con esso.
  6. Cryoprotect nel 30% di saccarosio notte a 4 ° C.
  7. occhi Cappotto in Optimum composto di taglio temperatura (OCT) e trasferimento in uno stampo embedding contenente fresco ottobre. Orientare lo sguardo che il piano sagittale è parallelo alla faccia di taglio, utilizzando come pochi movimenti possibili ed evitando l'introduzione di bolle d'aria. Flash freeze immergendo lo stampo in un bagno di ghiaccio / etanolo anidro. blocchi di conservare a -80 ° C.
  8. Utilizzando un criostato, tagliare 20 micron sezioni sagittali e raccogliere su vetrini predepurata.
  9. Sezioni macchia con ematossilina e eosina secondo protocolli standard 49. Immagine utilizzando un microscopio ottico attrezzato per la microscopia in campo chiaro.

3. istochimica colorazione

  1. Preparazione del campione
    1. Eutanasia animali a P30-35 utilizzando overdose isoflurano (30% in glicole propilenico) via aperta per inalazione goccia. Valutare l'eutanasia con la cessazionedel respiro, il battito cardiaco e la mancanza di risposta a pizzicare la zampa. Confermare la morte per dislocazione cervicale e prelievo di organi, in linea con gli orientamenti IACUC.
    2. Per rimuovere il cervello, pulire la pelle al sito di incisione con il 70% di etanolo, prima di tagliare attraverso la pelle alla base del cranio. Sbucciare indietro la pelle per esporre il cranio e pulita con il 70% di etanolo. Utilizzando gli strumenti puliti, accuratamente tagliate attraverso il cranio e rimuovere per esporre il cervello. Rimuovere le membrane, e rimuovere delicatamente il cervello dalla cavità del cranio. Sciacquare in PBS.
    3. Cappotto il cervello in OCT e trasferimento in uno stampo embedding contenente fresco ottobre Orientare il cervello che il piano sagittale è parallelo alla faccia di taglio, utilizzando come pochi movimenti possibili ed evitando l'introduzione di bolle d'aria. Flash congelamento immergendo lo stampo in un ghiaccio / bagno di etanolo secco e conservare a -80 ° C.
    4. Utilizzando un criostato, tagliare 10 micron sezioni sagittali e raccogliere su vetrini predepurata.
  2. <li> NADH diaforasi colorazione
    1. Preparare 0,05 M tampone Tris, pH 7,6 sciogliendo 5,72 g Tris-HCl e 1,66 g Tris base in acqua 1L-deionizzata. Conservare a 4 ° C per un massimo di sei settimane.
    2. Preparare la soluzione di NADH (2.25 mM NADH a 0,05 tampone M Tris). Aliquota e conservare a -20 ° C.
    3. Preparare la soluzione NBT (2,5 mm Nitro-Blue Tetrazolium a 0,05 tampone M Tris). Conservare a 4 ° C fino a sei settimane in una bottiglia di vetro.
    4. Combinare volumi uguali di soluzione di NADH e la soluzione NBT per rendere soluzione colorante e aggiungere 1 ml di ogni diapositiva. Incubare a 37 ° C in una camera umidificata per 30 min.
    5. Aspirare soluzione colorante e lavare tre volte con dH 2 O.
    6. Lavare tre volte ciascuno in ordine ascendente e discendente concentrazioni di acetone / DH 2 0 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) per 2 minuti a temperatura ambiente.
    7. Risciacquare tre volte in dH 2 O e montare sezioni con mezzo acquoso. Immagine utilizzando un microscopio ottico attrezzato per luminoso fmicroscopia ield. Blu colorazione corrisponde all'attività enzimatica.
  3. Succinato deidrogenasi istochimica colorazione
    1. Preparare 0.2 M sodio fosfato monobasico / DH 2 O e 0,2 M sodio fosfato bibasico / DH 2 O.
    2. Rendere 0,2 M tampone fosfato, pH 7,6 combinando 3 parti fosfato monobasico con 20 parti di sodio fosfato bibasico.
    3. Preparare la soluzione di colorazione (0,1 M di sodio succinato, 1,25 m NBT in 0.2 M tampone fosfato) e aggiungere 1 ml di ogni diapositiva. Incubare a 37 ° C in una camera umidificata per 60 min.
    4. Aspirare soluzione colorante e lavare tre volte in DH 2 O.
    5. Lavare tre volte ciascuno crescente e decrescente concentrazioni di acetone / dH 2 O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) per 2 minuti a temperatura ambiente.
    6. Risciacquare tre volte in dH 2 O e montare sezioni con mezzo acquoso. Immagine utilizzando un microscopio ottico attrezzato per la microscopia in campo chiaro. Blu colorazione corrisponde itl'attività enzimatico.

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Representative Results

Questa sezione descrive esempi dei risultati ottenibili utilizzando questi metodi. Nel test arto posteriore, il numero di tentativi di tiro fatto e la latenza di caduta sono cumulativamente su due test consecutivi per ogni giorno. Questo test può essere utilizzato per confrontare geneticamente diversi gruppi di distinguere topi con ridotta resistenza neuromuscolare tm1jhoh HtrA2 (HTRA2 KO) topi in Figura 1A -. B dimostrare alcun cambiamento nel numero di tira e la latenza di cadere da P4-6 seguita da una riduzione in forza neuromuscolare a P7-10, rispetto alla cucciolata (HTRA2 WT). Il previsto aumento della forza con l'età è anche osservabile negli animali wild-type. Per la prova di osservazione weanling, attività totale può essere valutata sommando tutti gli eventi (le linee percorse, di allevamento e di governare gli eventi), in media nei tre giorni consecutivi di test. In alternativa, ogni specifico tipo di evento può essere individually analizzato. Qui i risultati rappresentativi sono presentati, a dimostrazione ridotta attività di HTRA2 topi KO rispetto ai WT cucciolata. Questi dati dimostrano che l'attività totale può essere quantitativamente misurata e confrontata tra i gruppi (Figura 1C). È anche possibile quantificare differenze di forza di presa calcolando una media giornaliera dalle tre ripetizioni eseguite ogni giorno test. Quando i topi KO HTRA2 sono confrontati ai controlli littermate, riduzioni della forza si manifestano in una latenza più breve per cadere (Figura 1D).

H & E colorazione della retina genera immagini in cui la struttura della retina può essere esaminati e comparati (Figura 2). Gli strati di tipi di cellule che compongono la retina sono chiaramente delineati consentendo il confronto tra i gruppi genetici. Qui, HtrA2 tm1jhoh '; topi HtrA3 tm1jhoh non mostrano cambiamenti nella struttura della retina, rispetto a HtrA2 tm1jhoh topi a P35. Infine, colorazione istochimica per catena di trasporto degli elettroni attività complesso può essere utilizzato per identificare cambiamenti delle funzioni enzimatiche respiratorie, con aumenti di intensità di colorazione riflettono attività enzimatica aumento, come la riduzione osservata nel cervelletto e striato di HtrA2 flox / flox; Tg (Nes -cre) 1Kln / J (Nesko) del cervello rispetto a littermates WT (Figura 3).

Figura 1
Figura 1:. Fenotipizzazione comportamentale di topi geneticamente ingegnerizzati HtrA2 tm1jhoh (HTRA2 KO) topi sono stati sottoposti al test comportamentali descritto e confrontato con il tipo selvatico (WT) HTRA2 controlli littermate. (A - B) Il test di sospensione arto posteriore è stata effettuata su WT e KO neonati da P4-P10 e dimostra una riduzione neuromuscolareresistenza negli animali KO (WT: n = 28, KO: n = 19). Cuccioli (A) KO inizialmente fanno un numero simile di tentativi di pull come fratelli WT, ma mostrano una diminuzione tentativi effettuati in tempi successivi. Latenza (B) KO neonati 'a cadere è anche normale, ma inizialmente diminuisce da P7 in poi. (C) L'osservazione weanling punteggio attività totale è stata ridotta negli animali KO rispetto ai WT littermates, in linea con ridotta attività di questi topi WT (n = 19, KO: n = 12). Animali (D) KO avevano anche una latenza ridotta a cadere durante la prova di inversione maglia, dimostrando ridotta forza di presa di topi HTRA2 KO (WT: n = 17, KO: n = 9). Dati rappresenta media ± SEM (# 0.1 <p <0.05, * p <0.05, ** p <0,001, *** p <0,001 per t-test indipendenti). Questa cifra è stata modificata da Patterson et al. 34 Cliccate qui per vedereuna versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:. Colorazione H & E di retina sezioni retiniche colorazione con ematossilina eosina permette esame della struttura, delineando gli strati della retina. Qui sezioni da P35 HtrA2 WT; HtrA3 tm1jhoh (A) e HtrA2 tm1jhoh; HtrA3 tm1jhoh (B) di visualizzazione normale struttura della retina. RPE: dell'epitelio pigmentato retinico, OS: segmenti esterni, è: i segmenti interni, ONL: strato esterno nucleare, OPL: strato esterno plessiforme, INL: strato nucleare interno, IPL: strato plessiforme interno, GCL; strato di cellule gangliari. Barra di scala = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.


. Figura 3: respiratoria complessa attività istochimica colorazione per NADH diaforasi (complesso I) e succinato deidrogenasi (complesso II) l'attività è stata eseguita su sezioni di cervello trasversali di P25 HtrA2 flox / flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (Nesko) e HtrA2 + / flox; Tg (Nes-cre) 1Kln / J (NesWT) fratellini. NADH attività diaforasi enzimatica è ridotta in cerebellum (CRBL, B) e striato (D) di Nesko cerebrale rispetto ai controlli NesWT (A, C), ma non nella corteccia cerebrale (E - F). Attività SDH è altrettanto ridotta in cervelletto e striato di topi Nesko (H, J) rispetto ai controlli NesWT (G, I), ma non vi è alcun cambiamento nella corteccia cerebrale (K - L). Barra di scala = 200 micron. Questola figura è stata modificata da Patterson et al. 34 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

trattamenti robusti sono necessari per limitare l'impatto di condizioni legate all'invecchiamento umano debilitante, ma rimangono sfuggente per molte condizioni. Per identificare potenziali bersagli terapeutici e sviluppare strategie di intervento, le cause e la patologia di malattie associate con l'invecchiamento devono prima essere capiti. Non tutti i topi geneticamente modificati immediatamente presenti con fenotipi chiari che sono legati alla malattia di interesse, anche se questi geni sono stati precedentemente legati alla condizione negli studi sull'uomo. Pertanto le indagini più sistematiche sono necessari e topi geneticamente modificati devono essere sottoposti ad esperimenti appropriati per identificare i fenotipi che possono essere correlati alle malattie associate negli esseri umani.

Una miriade di test comportamentali esistono per saggiare la funzione neurologica nei topi 50,51. I test comportamentali descritti nel presente documento sono adatti per i fenotipi ipotizzati sulla base di reperti umani e fenotipi effettive observ ati nei topi. Inoltre, questi test sono semplici da eseguire in laboratorio con poca o addirittura nessuna esperienza nella conduzione di esperimenti comportamentali. Non vi è alcun obbligo per attrezzature sofisticate ma i risultati sono significativi e informativo se correttamente raccolti, che li rende utile come primo passo per esaminare il fenotipo di topi geneticamente modificati che si prevede di avere difetti neuromuscolari. I dati risultanti possono quindi essere utilizzati per indirizzare il fuoco di ulteriori test, potenzialmente con più sofisticate apparecchiature di test.

Allo stesso modo, esistono molte tecniche per la valutazione della funzione respiratoria nei tessuti 52. Misurare la velocità di sintesi dell'ATP, il consumo di ossigeno o variazioni del potenziale di membrana mitocondriale sono importanti letture di funzione mitocondriale ma possono essere complicato e richiede tempo per eseguire, richiedendo reagenti e apparecchiature 52-55 specifici. Inoltre, essi sono spesso limitati al livello del mitochondrion o cellulare, basandosi su cellule in coltura, lisati o mitocondri isolati. colorazione istochimica è un primo passo utile per identificare la disfunzione mitocondriale senza un grande investimento di tempo e risorse. Inoltre, la capacità di macchiare sezioni di tessuto si presta ad individuare rapidamente le differenze regionali che potrebbero non essere così evidenti con altre tecniche, per esempio, la perdita di colorazione enzimatica osservata nel cervello HtrA2 carenti aree specifiche. Mentre la tecnica è limitata nella sua capacità di misurare le variazioni di piegatura della capacità respiratoria, essa delinea regioni cerebrali definite che possono poi essere perseguiti con metodi più complessi.

Mentre le tecniche presentate in questo programma fenotipizzazione sono semplici da condurre, eseguendo alcuni passaggi correttamente è fondamentale per il successo degli esperimenti. Per il fenotipo comportamentale, grande cura deve essere presa per garantire i test vengono eseguiti nello stesso momento e nello stesso luogo ogni giorno per limitare la variazione introprodotta dalla novità di località o dalla differenza nel ritmo circadiano. L'apparecchiatura dovrebbe essere organizzata nello stesso modo ogni giorno per ragioni analoghe. La camera organizzazione è particolarmente critico per il test di attività, dove piccoli cambiamenti nella novità possono influenzare notevolmente l'attività del mouse. Quando si misura la forza di presa, gli investigatori dovrebbero accertare che i topi hanno una vera e propria presa di rete prima di inversione. Allo stesso modo, bisogna fare attenzione a sospendere correttamente il cucciolo prima di rilasciare nel test arti posteriori oi risultati dei test saranno sbilanciata verso una latenza più breve per cadere.

Per fenotipizzazione tessuto, ottenendo buoni sezioni è di vitale importanza. colorazione informativo della retina dipende dalla fissazione effettivo dinanzi sorgeranno dissezione o artefatti durante il sezionamento e la dissezione e distorcere la morfologia. colorazione istochimica richiede cervelli da congelare rapidamente dopo la dissezione, per preservare la funzione enzimatica, ma il tempo di incubazione è simile critical; piccole fluttuazioni nella temperatura o nella lunghezza di tempo può causare differenze di intensità di colorazione. Ove possibile, i campioni devono essere trattati contemporaneamente per permettere il confronto tra i gruppi.

Qui un regime di test utilizzato per studiare topi geneticamente modificati che ci si attende per visualizzare fenotipi sottili associate a malattie legate all'età, vale a dire AMD e PD, è descritto. Questo programma fenotipizzazione può essere utilizzato per identificare i deficit di forza e attività neuromuscolare, nonché identificare i difetti strutturali e funzionali all'interno dei tessuti di interesse. Questo programma fornisce un'analisi sistematica dei primi fenotipi nei giovani, topi geneticamente modificati. In futuro, questo metodo può essere applicato a qualsiasi topi geneticamente modificati che dovrebbero presentare un fenotipo AMD o PD correlati, così come quelli di eziologia sconosciuta che appaiono apertamente normale. La semplicità delle prove permette test senza investimento significativo, ma può essere utilizzato per informare ulteriori sTUDI. Combinando test comportamentali con fenotipizzazione cellulare, è possibile limitare il numero di topi utilizzati e confrontare direttamente prestazioni animale con la condizione fisiologica. Questa pianificazione fenotipizzazione fornisce una prima analisi che può essere utilizzato per indirizzare il fuoco di studi successivi.

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Acknowledgments

Il finanziamento per questa ricerca è venuto dal Rosebay Medical Foundation e un Fondo di ricerca di Yale Medical School Dean (JH). Ringraziamo il Dott Claire Koenig per un aiuto con esperimenti comportamentali. Geneticamente linee del mouse Engineered sono stati generati in Ozgene (Perth, Australia).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol Decon (Fisher Scientific) 435541
50 ml conical tube Fisher Scientific 1443222
cotton balls Walmart
heat mat Sunbeam 0000756-500-000
Holding tray (ice cube tray) Walmart
Electronic stopwatch GOGO PC396
Plexiglass box constructed in workshop 12" by 12" 
Vixia HF R400 Camcorder Canon 8155B004
9 oz Clear Cups Walmart
1/4 inch wire mesh Home Depot 204331884 (online) / 554219 (in store) 12" by 12" 
Bubble wrap VWR 470092-416
Straight specimen forceps VWR 82027-438
Fine-tip dissecting forceps VWR 82027-408
Fine scissors VWR 82027-578
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710
10x phosphate buffered saline pH 7.4 American Bioanalytical AB11072-04000
Sucrose JT Baker 4072-01
superfrost slides Fisher Scientific 12-550-15
Hematoxylin Stain Solution Fisher Scientific (Ricca) 353016
Eosin Y Stain Solution Fisher Scientific (Ricca) 2845-32
Tris hydrochloride Sigma T3253
Tris American Bioanalytical AB02000-01000
Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate Sigma N8129
Nitrotetrazolium Blue chloride Sigma N6876
Acetone JT Baker 9006-05
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma S9390
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma S2378
VectaMount aqueous mounting medium Vector Labs H-5501-60
Cover glass Fisher Scientific 12-545-M 60 mm x 24 mm
AxioImager A1 microscope Zeiss
Video camera tripod Amazon
Optimal Cutting Temperature (OCT) Fischer Scientific 23730571
Cryostat Sectioning  Machine Leica  CM1900 Discontinued but since replaced by CM1950

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