Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Immunology and Infection

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Park, H. J., Oh, J. H., Ha, S. J. Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice. J. Vis. Exp. (112), e54138, doi:10.3791/54138 (2016).

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Abstract

Regulatory T (T reg) Zellen, die Foxp3 als Transkriptionsfaktor exprimieren, sind Untergruppen von CD4 + T - Zellen. T reg - Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Immuntoleranz und Homöostase Wartung durch die Immunantwort regulieren. Die primäre Rolle der T reg Zellen ist , die Proliferation von Effektor - T (T eff) Zellen und die Produktion von Zytokinen wie IFN-γ, TNF-α und IL-2 zu unterdrücken. Es wurde gezeigt , dass T reg Zellen die Fähigkeit , die Funktion von T - Zellen zu hemmen eff während persistent Pathogen - Infektion und der Entwicklung von Krebs verbessert. Um die Funktion von T reg Zellen unter ruhenden oder entzündeten Bedingungen, die eine Vielzahl von in - vitro - Unterdrückung Tests unter Verwendung von Maus oder humanen T - reg - Zellen klären entwickelt worden. Das Hauptziel dieser Studie ist es, ein Verfahren zu entwickeln , um die Unterschiede im Phänotyp und unterdrückende Funktion zwischen ruhenden und aktivierten T reg zu vergleichenZellen. Um aktivierten T - reg - Zellen wurden die Mäuse infiziert mit lymphatischer choriomeningitis Virus (LCMV) Klon 13 (CL13), eine chronische Belastung von LCMV isolieren. T reg Zellen aus der Milz von LCMV CL13-infizierten Mäusen isoliert zeigten sowohl die aktivierten Phänotyp und verbesserte suppressive Aktivität gegenüber T - Zellen aus naiven reg Mäusen isoliert ruht. Hier beschreiben wir die Basisprotokoll für ex vivo - Phänotyp - Analyse aktivierten T - reg - Zellen unterscheiden von T reg ruhenden Zellen. Weiterhin beschreiben wir ein Protokoll für die Messung der suppressive Aktivität von vollständig aktivierten T reg Zellen.

Introduction

Regulatorische T (T reg) Zellen exprimieren forkhead box P3 (Foxp3) als Transkriptionsfaktor für ihre Entwicklung und Funktion 1. Zusätzlich exprimieren T reg Zellen verschiedene andere Moleküle wie CD25 2, Lymphozytenaktivierung Gen 3 (LAG-3) 3, Glucocorticoid-induzierter Tumor necrosis factor receptor 4 und zytotoxische T-Lymphozyten assoziiertes Protein 4 (CTLA-4) 5 auf ihrer Oberfläche oder intrazelluläre Region. Während einer chronischen Infektion mit verschiedenen Arten von Krankheitserregern wie Viren 6,7, Bakterien 8,9 und Parasiten 10-12, oder im Verlauf der Krebsentwicklung 13,14 geworden T reg Zellen in aktivierten Zellen differenziert, verbesserte Unterdrückungsfunktion anzeigt Targeting - Effektor CD4 + und CD8 + T - Zellen. Eine Reihe von Arbeiten haben vorgeschlagen , dass erweitert und aktivierten T - reg - Zellen auf die Beeinträchtigung der CD8 + T - Zell - respons beitragene während Freund Retrovirus (FV) Infektion 15-17. FV-induzierte T - Zellen hemmen reg IFN-γ oder Granzym B Expression und zytotoxische Reaktivität von CD8 + T - Zellen 15-17. Darüber hinaus wurde in einem Herpes simplex - Virus - Infektionsmodell berichtet geführt , die Depletion von CD4 + CD25 + T - Zellen in reg Expansion der virusspezifischen CD8 + T - Zellen und schwere Gewebeschäden durch Infiltration von immunopathogenen CD4 + T - Zellen 18-20.

Mäuse chronisch mit dem 13 - Stamm von lymphatischer choriomeningitis Virusklon infiziert (LCMV CL13) 21-24 haben den Phänotyp und die Funktion der Effektor - T - Zellen (T eff) und T reg Zellen während der chronischen Virusinfektion weit verbreitet zu charakterisieren. Während persistent LCMV - Infektion, Virus-spezifischen T - Zellen eff schrittweise ihre Effektor - Funktion verlieren und erschöpft T (T exh) Zellen werden. Auf der anderen Seite, Treg Zellen verstärken ihre Fähigkeit , 25 Virus-spezifischen T - Zell - Antwort zu unterdrücken. Die Abnahme der Funktionsfähigkeit der T eff Zellen kann durch verschiedene Faktoren wie Aufregulation von inhibitorischen Rezeptoren auf T eff Zellen veränderte Funktion von Antigen-präsentierenden Zellen, die Herstellung von immunregulatorischen Zytokine und erhöhter Frequenz oder verstärkte Funktion von T reg erklärt Zellen 26. Unter den Faktoren , die bei T - Zell - Unterdrückung, den programmierten Zelltod - Protein-1 (PD-1) exprimierenden T exh Zellen und T - reg - Zellen wurden als Kennzeichen der Antigen Persistenz und unterdrückende Umwelt weit betrachtet. Vor kurzem wurde berichtet , dass die Blockade des PD-1 - Weg und Ablation von T reg Zellen verbesserte T - Zell - Funktion führen und Viruslast während LCMV chronischen Infektion 27 verringert. Darüber hinaus werden T reg Zellen während einer chronischen Infektion von Mäusen mit LCMV aktiviert 23,25 25 verstärkt. PD-1 ist stark auf T - Zellen exprimiert reg sowie T exh Zellen und der Grad der PD-1 durch T - Zellen exprimiert reg korreliert mit der Stärke ihrer suppressive Funktion T - Zell - Proliferation 25 zu hemmen.

Hier beschreiben wir ein Verfahren mit den Merkmalen von aktivierten T - reg - Zellen von Mäusen , infiziert mit LCMV CL13 und ruhenden T reg Zellen isoliert aus naiven Mäusen isoliert zu vergleichen. Weiterhin erläutern wir eine Reihe von Prozessen aktiviert T reg Zellen zu trennen und ihre ex vivo Phänotyp zu untersuchen, sowie ihre suppressive Aktivität in vitro zu messen.

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Protocol

In dieser Studie wurden die Mäuse in einem spezifischen Pathogen freie Einrichtung des Yonsei Laboratory Animal Research Center of Yonsei University gehalten. mit von der International genehmigten Protokollen Animal Care und Use Committee des Yonsei Laboratory Animal Research Center an der Yonsei University Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den koreanischen Food and Drug Administration Richtlinien durchgeführt.

1. Herstellung der Lösungen

  1. Bereiten 2% RPMI-Medium durch Verdünnen fötalem Rinderserum (FBS) und 2% Penicillin-Streptomycin und 1% in RPMI
  2. Bereiten komplettem RPMI-Medien. Zu RPMI Medien Hinzufügen 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, 1% L-Glutamin und 50 uM 2-Mercaptoethanol.
  3. Bereiten fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Puffer. so, Ergänzungs phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 2% FBS zu tun.
  4. Bereiten Sie T-Zell-Isolationspuffer. Dazu ergänzen PBS mit 2% FBS und 2 mM ethylenediaminetetraacetic Säure.

2. Isolierung von Milzlymphozyten

  1. Entfernen der Milzen von naiven oder LCMV CL13-infizierten Mäusen , wie zuvor beschrieben , 19 und legen sie in 60 mm x 15 mm Petrischalen , die 10 ml von 2% RPMI - Medien.
    HINWEIS: In dieser Studie Experimenten 5 bis 6 Wochen alten C57B1L / 6J weibliche Mäuse erhielten 2 x 10 6 plaquebildenden Einheiten (pfu) von LCMV CL13 durch intravenöse Injektion über die Schwanzvene. Opfern , um die Mäuse am Tag 16 nach der Infektion (16 d pi) 25. Analyse ge angepassten naive Mäuse wurden am selben Tag.
  2. Legen Sie eine Zelle Sieb in einen 50-ml-Röhrchen und spülen Sie ihn mit 2 ml 2% RPMI Medien. Legen Sie die Milz auf die 70 & mgr; m Zellsieb und schleifen den Kolben einer Spritze. Spülen Sie die Zelle Sieb mit 2 ml 2% RPMI Medien und entfernen Sie sie aus dem 50-ml-Tube.
  3. Füllen des Röhrchens mit 2% RPMI-Medium und Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und resuspendierenZellpellet in 1 ml Lysepuffer ACK. Inkubieren der Proben bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
    HINWEIS: Das Volumen der ACK Lysepuffer oben für eine Milz angegeben ist. Scale up das Volumen entsprechend für gepoolte Milzproben.
  4. Füllen des Röhrchens mit 2% RPMI-Medium und Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml in kompletten RPMI - Medium.
    HINWEIS: Für die Live-Zellzählung, Flecken Zellen mit Trypanblau und nur Zellen leben zählen, die nicht gefärbt werden mit Hämozytometer.

3. Phänotypisierung von Splenic Herkömmliche T (T conv) Zellen und T - Zellen reg

HINWEIS: Vor Isolierung T reg Zelle, untersuchen den Phänotyp splenic von naiven oder infizierten Mäusen isoliert Lymphozyten durch die Zellen mit verschiedenen Antikörpern Färbung und Durchflusszytometrie sie durch die Strömung zu analysieren.

  1. Dann werden 50 & mgr; l der Zellen(5 x 10 5 Zellen) unter insgesamt Milz- Lymphozyten in jede Vertiefung einer neuen U-Boden - 96-Well - Platte und fügen 150 ul Puffer FACS pro Vertiefung. Zentrifuge bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C.
  2. Überstand verwerfen. Rühre das Zellpellet und mit 200 & mgr; l FACS-Puffer pro Vertiefung. Zentrifuge bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C (2 mal).
  3. Bereiten Sie die Antikörper-Cocktail für die Färbung Zelloberflächenmarker in 50 & mgr; l FACS-Puffer pro Vertiefung mit den folgenden Antikörpern und Reagenzien. Anti-CD4 violetten Farbstoff, Anti-CD25 grünen Farbstoff, Anti-PD-1 violetten Farbstoff, Anti-CD8-PerCP Cy5.5 Farbstoff und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz nahen Infrarot (IR) fluoreszierenden Reaktivfarbstoff.
    HINWEIS: Um den Phänotyp von aktivierten T - reg - Zellen zu analysieren, anti-CD103 23,25 kann für Zelloberflächenmarker Färbung hinzugefügt werden.
  4. Zellpellet mit 50 ul Antikörper-Cocktail pro Vertiefung. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C. Wasche die Zellen zweimal mitFACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C.
  5. Nach dem letzten Waschschritt, dekantiert den Überstand und fixieren die Zellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C mit 100 ul Puffer Fixierung hergestellt gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit dem Permeabilisations-Waschpuffer (hergestellt nach dem Protokoll des Herstellers) durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C.
  7. Bereiten Sie die Antikörperlösung für die intrazelluläre Foxp3-Färbung und Zellpellet mit 50 ul Anti-Foxp3 Antikörperlösung.
    HINWEIS: weiter Um die Phänotypen von T conv und T reg Zellen analysieren, anti-CTLA kann in diesem Schritt hinzugefügt werden.
  8. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C und wiederholen Sie Schritt 3.6. Nach dem letzten Waschschritt, Resuspendieren des Zellpellets in 200 & mgr; l FACS - Puffer und den Phänotyp der Zellen durch Durchfluss - Zytometer 25 untersuchen.
  9. Tor der lebenden Zellen population. Um die Phänotypen von T conv Zellen während der LCMV - Infektion CL13 analysieren, untersuchen die Häufigkeit von Foxp3 - PD-1 + Zellen unter CD4 + oder CD8 + T - Zellen.
    HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der Foxp3 - PD-1 + mehr als 50% sowohl in CD4 + und CD8 + T - Zell - Populationen mit 16 d pi mit LCMV CL13.
    1. Um die Frequenz und Phänotypen von T reg Zellen analysieren, untersuchen Sie die Frequenzen von Foxp3 + oder Foxp3 + PD-1 + Zellen unter CD4 + T - Zellen.
      HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der Foxp3 + Foxp3 + bzw. PD-1 + Zellen ist mehr als 20% der CD4 + T - Zellpopulation, respectively.

4. Isolierung von CD4 + CD25 + T - Zellen reg

HINWEIS: Die Volumina aller Reagenzien unten angegeben sind für eineAusgangszellzahl von 1 x 10 7 gesamt Splenozyten.

  1. Bereiten Sie die Zellen, wie in Abschnitt 2 unter Verwendung von naiven und LCMV chronisch infizierten Mäusen beschrieben. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml der T-Zellisolierungspuffer. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Zellpellet in 40 ul Puffer.
  2. Für CD4 + T - Zell - Anreicherung der magnetischen Zellseparationssystem, 10 ul Biotin-Antikörper - Cocktail hinzufügen und gut mischen. Inkubieren für 10 min bei 4 ° C.
  3. Zugabe von 30 ul Puffer, 20 ul von Anti-Biotin - Mikrokügelchen für die Kennzeichnung von nicht-CD4 + T - Zellen und 10 & mgr; l von CD25-PE - Antikörpers zur Fluoreszenzmarkierung von CD25 + Zellen. Gut mischen und Inkubation für 15 min im Dunkeln.
  4. 2 ml Puffer und übergeben die Zellen durch ein 40 & mgr; m Zellsieb in ein neues 50 ml Rohrzelltrümmer zu entfernen. Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C.Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren des Zellpellets in 500 & mgr; l Puffer mit einer Dichte von bis zu 1,25 x 10 8 Zellen.
  5. Übernehmen Sie die Zellen auf die Säule und sammeln die nicht markierten Zellen, die die Säule passieren. Die Säule wird durch Zugabe von 2 ml Puffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der isolierten CD4 + T - Zellen in 90 ul Puffer.
  6. Für magnetische Markierung von CD25 + Zellen, mit 10 & mgr; l anti-PE - Mikrokügelchen, gut mischen und bei 4 ° C für 15 min im Dunkeln inkubiert.
  7. 2 ml Puffer und wasche die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren des Zellpellets in 500 & mgr; l Puffer mit einer Dichte von bis zu 1 x 10 8 Zellen.
  8. Um die CD4 + CD25 + T - reg - Zellen anreichern, gelten die Zellen auf die Säule für eine positive Selektion, und waschen Sie die column durch Zugabe von 2 ml Puffer. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
  9. Wenn die Säule nach dem letzten Waschschritt leer ist, fügen Sie 1 ml Puffer auf die Säule, und spülen Sie den Kolben der magnetisch markierten CD4 + CD25 + Zellen.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 4,8-4,9 um die Reinheit der isolierten CD4 + CD25 + T reg Zellen zu verbessern. Waschen der Zellen mit FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren der isolierten CD4 + CD25 + T reg Zellen bei einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml in kompletten RPMI - Medium.
  11. Um die Reinheit der isolierten CD4 + CD25 + T - reg - Zellen zu überprüfen, können 2 x 10 5 Zellen aus der Summe der isolierten CD4 + CD25 + T - reg - Zellen. Beflecken die Zellen mit 50 & mgr; l FACS-Puffer, enthaltend anti-CD4-FITC und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz nahen IR-fluoreszierenden Reaktivfarbstoff.
    HINWEIS: CD25 wurde bereits mit PE während der Isolierung gekennzeichnet.
  12. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C. Waschen der Zellen mit FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Nach dem Waschen des Zellpellets in 100 & mgr; l FACS-Puffer resuspendiert und die Reinheit mittels Durchflusszytometrie überprüfen.
  13. Tor der Live-Zellpopulation. Um die Reinheit von T reg Zellen analysieren, bestätigen den Prozentsatz der CD4 + CD25 + Zellen.
    HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der CD4 + CD25 + Zellen unter gereinigter Zellen über etwa 80%.

5. Isolierung von CD8 + T - Zellen und Labeling of CD8 + T - Zellen

HINWEIS: Die Volumina aller Reagenzien unten angegeben sind für eine Startzellzahl von 1 x 10 7 Splenozyten insgesamt.

  1. Vorbereitung der Zellen, wie in Kapitel 2 unter Verwendung von naiven Mäusen beschrieben. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 10 ml der T-Zellisolations Schwabbelscheibeer. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Zellpellet in 40 ul Puffer.
  2. Für CD8 + T - Zell - Isolierung der magnetischen Zellseparationssystem, 10 ul Biotin-Antikörper - Cocktail für Nicht-CD8 + T - Zell - Markierung hinzufügen und gut mischen. Inkubieren Sie für 5 min bei 4 ° C.
  3. Zugabe von 30 ul Puffer und 20 ul Anti-Biotin-Mikrokügelchen. Gut mischen und Inkubation für 10 min bei 4 ° C.
  4. Übernehmen Sie die Zellen auf die Säule und sammeln die nicht markierten Zellen, die die Säule passieren. Die Säule wird durch Zugabe von 2 ml Puffer dreimal.
  5. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der isolierten CD8 + T - Zellen in 2 ml Puffer.
  6. Um die Reinheit der isolierten Zellen kontrollieren, bereiten 50 ul Antikörperlösung in FACS-Puffer. Resuspendieren der 2 x 10 5 Zellen unter isolierten CD8 + T - cells in 50 ul Antikörperlösung.
    HINWEIS: Antikörper-Lösung herzustellen, fügen Anti-CD8-FITC, und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz (nahen IR-fluoreszierenden Reaktivfarbstoff) in FACS-Puffer.
  7. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C. Waschen der Zellen mit FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Nach dem Waschen Zellpellet in 100 ul FACS-Puffer, und überprüfen Sie die Reinheit der Zellen mittels Durchflusszytometrie.
  8. Tor der Live-Zellpopulation. Um die Reinheit von CD8 + T - Zellen zu überprüfen, bestätigen den Prozentsatz der CD8 + T - Zellen.
    HINWEIS: Basierend auf experimentellen Ergebnissen der Prozentsatz der CD8 + Zellen unter den Zellen gereinigt wird über etwa 90%.
  9. Hinzufügen PBS zu den isolierten CD8 + T - Zellen. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. Resuspendieren der isolierten CD8 + T - Zellen in einer Konzentration von 1 x 10 7 Zellen / ml in PBS.
  10. Um die CD8 + T CE - Kennzeichnunglls für die in vitro - Suppression Assay Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff in PBS verdünnen , um eine Konzentration von 5 uM bei RT zu erhalten.
    HINWEIS: Die ungefähre Anregungs- und Emissionspeaks des Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff in der Studie verwendet werden, sind 405 und 450 nm, respectively.
  11. Gut mischen gleiche Volumina der Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff (5 & mgr; M) und der Zellsuspension (1 x 10 7 Zellen / ml von CD8 + T - Zellen) in einem 15 ml - Röhrchen, und Inkubieren bei 20 min bei 37 ° C. Mischen Sie den Schlauch alle 10 min.
  12. Füllen Sie den Schlauch mit kaltem komplettem RPMI Medien auf, und lassen Sie das Röhrchen für 10 min bei RT. Zentrifuge bei 300 × g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen vollständig und Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml mit vorgewärmten RPMI Komplettmedium. Inkubieren der Zellen für 15 min bei RT.

6. Einrichten der In - vitro - Suppression - Test unter Verwendung CD4 + CD25 + T <sub> reg und CD8 + T - Zellen

  1. Zur Herstellung von anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen, übertragen das entsprechende Volumen von magnetischen Kügelchen auf ein 15 ml Röhrchen (2,5 ul / 1 x 10 5 Zellen). Fügen Sie ein gleiches Volumen von PBS und mischen. Waschen durch Zentrifugation bei 300 g für 2 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Verdünnen Sie die magnetischen Kügelchen in komplettem Medium (50 & mgr; l / Well).
  2. Aliquot von 50 & mgr; l CD4 + CD25 + T reg Zellen pro Vertiefung U-Boden 96-Well - Platte (1 x 10 5 Zellen / Vertiefung). Je 50 ul von CD8 + T - Zellen als Responder - T (T bzw.) Zellen pro Vertiefung (1 x 10 5 Zellen / Vertiefung). In 50 ul des verdünnten anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen in pro Vertiefung.
    HINWEIS: In diesem Schritt Etikett und Kontrollvertiefungen setzen sich wie folgt zusammen : "nicht - stimulierten CD8 + T - Zellen nur" ohne anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen; "CD8 + T - Zell - only" mit anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen; "CD8 + T - Zellen erst"Mit anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen;". T reg Zelle nur "mit anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen T reg Zellen können durch vollständige Medien und co-kultiviert mit T bzw. Zellen in einem anderen Verhältnis von T verdünnt werden , bzw. Zellen: T reg Zellen (1: 0,25-1: 1).
  3. Zugabe von 50 & mgr; l oder geeigneten Volumen Medium in alle Vertiefungen auf ein Gesamtvolumen von 200 ul. Die Platte mit Folie und Inkubation in einem CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 72 Stunden.

7. Analyse der CD8 + T - Zellproliferation und Cytokin - Produktion von CD8 + T - Zellen

  1. Für die Cytokinproduktion Analyse nach 3 Tagen Kultur, trennen den Überstand von jeder Vertiefung in eine andere Platte und führen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
    HINWEIS: Der Überstand kann bei -70 ° C aliquotiert und gelagert werden. In diesem Experiment wurde anti-Maus-IFN-γ Antikörper-beschichteten Platte verwendet IFN-γ Produktion Übereinstimmung zu erkennening des Herstellers s Protokoll. Zu IFN-γ Produktion von proliferierenden CD8 + T - Zellen auf einem Einzelzellebene, intrazelluläre Cytokin - Färbung bestimmen kann durchgeführt werden.
  2. Nach Abtrennen der Überstand aus jeder Vertiefung, waschen Sie die Platte, die Zellen mit FACS-Puffer und Zentrifuge bei 300 g für 2 min bei 4 ° C (3-mal) enthält.
  3. Nach dem Waschen den Überstand verwerfen. Resuspendieren des Zellpellets mit 50 ul Antikörper - Cocktail für die Färbung von proliferierten CD8 + T - Zellen. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C.
    HINWEIS: Antikörper-Cocktail vorzubereiten, fügen anti-CD4 FITC, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, und die Lebensfähigkeit der Zellen Nachweisreagenz (nahen IR-fluoreszierenden Reaktivfarbstoff) in FACS-Puffer.
    HINWEIS: Antikörper gegen verschiedene Marker wie CD44 oder CD69 können mit anderen Antikörpern kombiniert werden , um zu bestätigen , Aktivierung von CD8 + T - Zellen. Denken Sie daran , dass CD8 + T - Zellen haben bereits mit der Zellproliferation Tracking v markiert wordenIolet Farbstoff in Schritt 5.10.
  4. Wasche zweimal durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Nach dem letzten Waschschritt, den Überstand verwerfen, und fixieren die Zellen für 20 Minuten im Dunkeln bei 4 ° C mit 100 ul Fixierungspuffer.
  5. Wasche zweimal durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei 4 ° C. Die Proliferation der Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff-markierten CD8 + T - Zellen mittels Durchflusszytometrie resuspendieren der Zellen mit 200 & mgr; l FACS - Puffer und zu messen.
    1. Tor der CD8 + T - Zell - Population unter den lebenden Zellen. Messen Sie die Prozentsätze der geteilten und ungeteilten Zellen gemäß der Verdünnung der Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff und CD8 + T - Zell - Verdünnung nach der folgenden Gleichung. Inhibition% = [(% der proliferierten CD8 + T - Zellen in Abwesenheit von T - Zellen reg -% der proliferierten CD8 + T - Zellen in Gegenwart von T reg Zellen) / (% der proliferierten CD8 + T - Zellen indas Fehlen von T reg - Zellen)] x 100. Weitere Analyse der Daten durch die Durchflusszytometrie Software 25 verwendet wird .

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Representative Results

Wir erzeugten Mäuse mit persistenten Virusinfektion , indem sie mit 2 × 10 6 pfu von LCMV CL13 intravenös injiziert wird . Um die phänotypische Veränderungen in T reg Zellen und T conv Zellen während der chronischen Virusinfektion, Milzlymphozyten erhalten von naiven und infizierten Mäusen wurden gefärbt mit verschiedenen Antikörpern und analysiert mittels Durchflusszytometrie untersucht. CD4 + T conv (1A, oberes Feld) und Foxp3 - - CD8 + T conv (1B, obere Reihe) Zellen mit 16 d pi, PD-1 wurde in beide Foxp3 upregulated. Die Häufigkeit der Foxp3 + CD4 + T - Zellen reg war zweimal höher in den LCMV CL13-infizierten Mäusen als in den naiven Mäusen (1A). Insbesondere angezeigt meisten der Foxp3 + CD4 + T - Zellen reg des aktivierten Phänotyp exprimieren hohePD-1 zu diesem Zeitpunkt (1A).

Für die in vitro - Suppression Test wurden eine beträchtliche Anzahl von CD8 + T conv - Zellen und CD4 + CD25 + T - Zellen reg erforderlich. Zu erhalten , 1 x 10 7 Zellproliferation Tracking violetten Farbstoff-markierten CD8 + T - Zellen wurden Splenozyten von zwei Milzen von naiven Mäusen gepoolt. Zu erhalten , 2 x 10 6 bis 3 x 10 6 von CD4 + CD25 + T - Zellen reg mindestens drei Milzen von naiven und LCMV CL13-infizierten Mäuse wurden jeweils vereinigt. CD8 + T - Zellen als T bzw. Zellen wurden erfolgreich ohne nennenswerte Kontamination mit anderen Immunzellen (2A) getrennt. T reg Zellen könnte auch mit einer dominanten Population von CD25 + CD4 + T - Zellen , die mit mehr als 80% Reinheit (2B) isoliert werden.

Um die suppressive Funktion von naiven und chronische T reg Zellen, die isolierte T reg und T bzw. Zellen vergleichen wurden für 3 Tage bei 37 ° C zusammen unter Stimulation mit anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen inkubiert. % Inhibition der CD8 + T bzw. Zellproliferation wurde in einer T - Zelle reg dese abhängiger Weise (3A) erhöht. Wenn CD8 + T - Zellen bzw. mit Co-kultiviert wurden chronische T reg Zellen in einem Verhältnis von 1: 1, wurden Proliferation von CD8 + T - Zellen bzw. signifikant inhibiert (Abbildung 3B). IFN-γ - Produktion durch CD8 + T - Zellen bzw. waren ebenfalls signifikant gehemmt , wenn CD8 + T - Zellen bzw. mit Co-kultiviert wurden aus aktivierten T - Zellen reg chronisch infizierten Mäusen und nicht mit T reg Zellen aus naiven Mäusen in einer T reg ruhend (3C).

Abbildung 1
Abbildung 1: Phänotypen von CD4 + und CD8 + T - Zellen in der Milz von naiven Mäusen oder LCMV CL13-infizierten Mäuse mit 16 d pi (A) Expression von PD-1 oder CD25 auf Foxp3 - CD4 + T conv und Foxp3 + CD4 + T reg Zellen. (B) Die Expression von PD-1 oder CD25 auf Foxp3 - CD8 + T - Zellen konv. Milz-Lymphozyten wurden mit Antikörpern gegen CD4, CD8, CD25, PD-1 und Foxp3 gefärbt. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Panel A wurde von 25 als Referenz geändert. Bitte klicken hier, um eine größere Version dieser Figur sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Reinheiten von T bzw. Zellen isoliert von naiven Mäusen und T reg Zellen isoliert von naiven oder LCMV CL13-infizierten Mäusen (A) Prozentsatz der CD8 + T - Zellen nach der Isolierung.. (B) Prozentsatz der CD25-exprimierenden CD4 + T - reg - Zellen nach der Isolierung. Jeder Quadrant in (B) wurde durch die Expression von CD4 und CD25 bestimmt. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Figur 3: Wirkung der aktivierten T reg Zellen auf CD8 + T - Zell - Antwort (A)% Inhibition der CD8 + T - Zellen co-kultiviert mit T reg Zellen in einer T - Zelle reg dosisabhängig.. (B) Proliferation von CD8 + T - Zellen co-kultiviert mit T reg Zellen in 1: 1 - Verhältnis. (C) IFN-γ Produktion von CD8 + T - Zellen co-kultiviert mit T reg Zellen in einer T - Zelle reg dosisabhängig. Proliferation von CD8 + T - Zellen durch Verdünnen der Zellproliferation Verfolgungs violetten Farbstoff in proliferierten CD8 + T - Zellen und IFN-γ - Sekretion gemessen wurde , wurde durch ELISA bewertet. Zellproliferation Tracking violetten Farbstoff-markierten CD8 + T - Zellen wurden für 3 Tage mit anti-CD3 / CD28-beschichteten Kügelchen stimuliert in Abwesenheit oder Gegenwart von T + T - Zellen co-kultiviert mit und ohne T reg Zellen. Gefüllt grauen Peaks in dem Histogramm zeigen die Proliferation von CD8 + T - Zellen co-kultiviert , ohne T reg Zellen. Jede Gruppe wurde in dreifacher Ausführung gestaltet. Die Balken repräsentieren + SEM bedeuten. Diese Zahl hat sich von 25 als Referenz geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Obwohl nur eine kleine Anzahl von T reg Zellen in Mäusen und Menschen vorhanden sind , ist es wichtig , ihre Funktion zu verstehen , wie sie die Immunantwort bei der Regulierung und Aufrechterhaltung der Immuntoleranz eine wichtige Rolle spielen. Die Anzahl und die unterdrückenden Funktionen von T reg Zellen erhöht sich während einer chronischen Virusinfektion 15-20 sowie Krebsprogression 13,14. Dies ist wahrscheinlich aufgrund der fortgesetzten Antigen-Stimulation. Zur Auswertung muss die T - reg - Zellen funktionieren unter Antigen Persistenz und die Entwicklung der Krankheit, ihre unterdrückende Aktivität gemessen werden.

Hier beschreiben wir ein Protokoll der ex vivo Phänotyp von T reg Zellen und messen ihre suppressive Aktivität unter Verwendung eines in vitro Co-Kultursystem von CD8 + T - Zellen und T reg Zellen zu analysieren. Kritische Schritte im aktuellen Protokoll sind die Analyse und Isolierung von T - reg - Zellen. Wohnen und frisch isolierten T in vitro. Wir untersuchten auch die Phänotypen von T conv und T reg Zellen während einer chronischen Virusinfektion. T conv Zellen, dh, Foxp3 - CD4 + und CD8 + T - Zellen zeigte eine Abnahme der Zellaktivität nach der chronischen Virusinfektion (Abbildung 1). Der PD-1 - Expression wurde sowohl in der T conv Zellpopulationen nach oben reguliert. Erhöhen Sie in T reg Zellzahl und Hochregulation von PD-1 - Expression sind die Markenzeichen der Immunantwort während einer chronischen Virusinfektion. Zusätzlich Antikörper für andere inhibitorische Rezeptoren wie TIM-3 und CTLA-4 mit PD-1 in Kombination verwendet werden, um die T-Zell-Phänotyp durch FACS nach choric Virusinfektion zu untersuchen.

Um die suppressive Aktivität, T bzw. T - Zellen und reg Zellen zu untersuchen , wurden co-kultiviert in einem Verhältnis von 1 zu 1 Co-Kultur mit T regZellen aus chronisch infizierten Mäusen signifikant CD8 + T - Zell - Proliferation und IFN-γ - Sekretion vermindert , wenn zur T reg Zellen aus naiven Mäusen verglichen. Dies impliziert , dass die Proliferation und Cytokin - Produktion von CD8 + T - Zellen co-kultiviert mit T reg Zellen invers zum suppressive Funktion der T - Zellen reg verwandt sind. Obwohl dieses Protokoll die Verwendung eines magnetischen Zellseparationssystem für T reg Zellisolierung, eine Kontamination mit nicht-T - reg - Zellen ausgeschlossen werden kann , nicht empfiehlt. Die T - Zellen aus reg Foxp3-GFP reporter Mäusen erhalten 28-30 sind bessere Kandidaten genau die Funktion der T - Zellen als reg - Magnetzellseparationssystem zu untersuchen, wie CD25 oft auf aktivierten CD4 + T conv sowie T reg Zellen überexprimiert wird.

Die unterdrückende Funktion von T reg Zellen wurde von verschiedenen in vitro bewertet wordenUnterdrückung Assays 16,28,31-34. Der Vorteil des in vitro Suppression Test ist , dass es die direkte Wirkung von T reg Zellen auf der Inhibition der CD8 + T - Zell - Antwort bewertet wird , da nur Zellen bzw. T mit T reg Zellen co-kultiviert werden. Zusätzlich zu CD8 + T - Zellen, die CD25 - CD4 + T können Zellen anstelle von T - Zellen bzw. 25 verwendet werden. Die Wirkungen von T reg oder T conv Zellen auf Immunzellen , wie etwa dendritische Zellen oder natürlichen Killerzellen können durch Variation der experimentellen Bedingungen ausgewertet werden.

Moleküle wie die CD103 35, LAG-3 36, Glycoprotein mit einem Wiederholungen vorherrschend 37, 38 CD43, CD11a 38 oder Killerzellen - Lektin-ähnlichen Rezeptorunterfamilie G Element 1 38 haben als Marker von aktivierten T reg Zellen in bestimmten Krankheiten verwendet worden. In diesem Protokoll verwendeten wir PD-1 alsAnzeige identifizieren T reg Zellen während der chronischen Virusinfektion aktiviert. Dieses Protokoll kann für vielseitige Analysen (phänotypische und funktionelle) verwendet werden , von T - reg - Zellen unter bestimmten Bedingungen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
FITC Rat Anti-Mouse CD4 RM4-5 BD Biosciences 553047
Cytofix/Cytoperm BD Biosciences 554714
U-Bottom Tissue Culture Plates BD Biosciences 353077
Fixation buffer BD Biosciences 554655
FITC Rat Anti-Mouse CD25 7D4 BD Biosciences 553072
Cell strainer, 70 mm BD Biosciences 352350
Cell strainer, 40 mm BD Biosciences 352340
Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1) 29F.1A12 BioLegend 135217
Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4 RM4-5 Biolegend 100547
APC Anti-Mouse/Rat Foxp3  FJK-16s eBioscience 17-5773
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5223
PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a 53-6.7 eBiosicence 45-0081
Mouse IFN-gamma Platinum ELISA eBiosicence BMS606
RPMI 1640 GE Life Sciences SH30027
PBS (1x) GE Life Sciences SH30256
ACK Lysing Buffer Gibco A10492-01
L-Glutamine, 200 mM solution Gibco  25030
Penicillin-Streptomycin, 10,000 U/ml Gibco  10378-016
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life technologies L-34975
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-104-075
CD4+ CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyibiotec 130-091-041
MACS Separation Columns, LD columns Miltenyibiotec 130-042-901
MACS Separation Columns, LS columns Miltenyibiotec 130-042-401
EDTA, 0.5 M (pH 8.0) Promega V4231
2-Mercaptoethanol Sigma Life Science M7522
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30919.03
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Thermo Fisher Scientific C34557
BD Canto II flowcytometer BD Biosciences
Flowjo TreeStar
Hematocytomer Marienfeld superior

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